KR20180013664A

KR20180013664A - 핵산 및 키토산을 포함하는 회전근개 파열 수복용 조성물

Info

Publication number: KR20180013664A
Application number: KR1020160183334A
Authority: KR
Inventors: 김익수; 김한규; 홍철암; 이수연
Original assignee: 주식회사 파마리서치프로덕트
Priority date: 2016-07-29
Filing date: 2016-12-30
Publication date: 2018-02-07
Also published as: KR101871673B1

Abstract

본 발명은 핵산 및 키토산을 포함하는 회전근개 파열 수복용 조성물에 관한 것으로, 보다 자세하게는 핵산 및 키토산의 혼합을 통해 제조된 회전근개 파열 수복용 조성물은 온도에 따라 졸-겔 전이가 일어나는 것을 확인하였고, 기존의 단일 조성물 보다 조직 수복 효과가 높고, 조성물의 분해 속도를 늦추고, 파열 부위에서의 조성물의 체류 시간을 증가시킴으로써 조직 수복 효과가 지속되는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 핵산 및 키토산을 포함하는 회전근개 파열 수복용 조성물을 이용하여 파열된 회전근개 조직의 수복 효과가 현저히 높은 치료용 조성물로의 개발이 가능할 것으로 기대된다.

Description

핵산 및 키토산을 포함하는 회전근개 파열 수복용 조성물{Composition comprising nucleic acid and chitosan for repair of rotator cuff tear}

본 발명은 핵산 및 키토산을 포함하는 회전근개 파열 수복용 조성물에 관한 것이다.

어깨 속에는 어깨를 움직이는 데 꼭 필요한 4개의 근육(극상근, 극하근, 견갑하근, 소원근)이 있으며, 이를 회전근개라고 한다. 회전근개는 강력한 삼각근의 수직 전단력을 원활한 외전 전단력으로 전환시키며, 상완골두가 견봉하부와 접촉하지 않도록 하는 보호막의 역할을 한다(Kang J.D., et al., 2007).

회전근개의 손상은 급성 외상으로 발생하는 경우도 있으나 대부분이 환자에서 특별한 외상력 없이 발생되어 서서히 진행되는 것으로 알려져 있다. 즉, 회전근개 질환은 기본적으로는 노화 현상에 따른 퇴행성 질환이지만 외적인 요인으로 견관절의 불안정성, 견봉 쇄골 관절의 관절염, 견봉 골(osacromiale), 오구 견봉 인대 충돌, 오구 돌기 충돌, 후상방 관절과 충돌 등이 원인이 되어 발생될 수 있다. 또한 회전근개 손상은 단지 견봉 하부에서의 충돌(충돌 증후군)에 의한 외부 압박에 의해 발생하는 것뿐만 아니라 회전근개 자체의 내부 변성(intrinsic degeneration)이나 염증 반응의 영향 등 여러 요인이 복합적으로 작용하는 것으로 알려져 있다. 이러한 병적 변화는 팔을 무리하게 쓰거나 가벼운 외상이 동반될 경우 회전근개의 파열로 진행되어 일상생활 및 작업 활동에 심각한 장애를 유발할 수 있다(Cho N.S., et al., 2012).

회전근개 손상의 증상으로는 통증, 근육 위축, 관절 운동의 제한, 견관절 근력 약화, 견관절 전외측부의 압통 등이 있다. 파열의 정도가 심하면 파열된 부분이 외부에서 촉진된다. 또한 건측 팔로 아픈 팔을 올리려고 시도하면 올라가지나 파열로 인해 힘이 약해져 올린 팔을 유지하지 못하고 아픈 팔이 툭 떨어지거나 어깨 통증을 호소하게 된다.

견관절의 회전근개 손상은 초기 1단계에서 말기 3단계까지 각 단계에 따라 그 임상적 특징과 치료에 차이가 있다. 1단계는 회전근개의 부종 및 출혈이 나타나고, 25세 이하의 연령층에 많으며 보존적 치료로 완치가 가능하다. 2단계는 회전근개의 섬유화 및 건염이 나타나는 단계로 25세에서 40세 사이의 연령층에 많으며 활동량에 따라 증상이 재발한다. 보존적 치료로 호전될 수 있으나 증상이 심할 경우에는 수술을 필요로 한다. 3단계는 퇴행성 골극 형성 및 회전근개가 파열된 단계로, 40세 이상의 연령층에 많으며 증상이 계속적으로 악화되어 수술을 필요로 한다.

회전근개 파열의 치료는 보존적 치료와 수술적 치료가 있으며, 국내에서는 수술적 치료가 많이 시행되고 있는데, 수술 방법으로는 내시경 관절 봉합술과 개방적 봉합술이 있다. 수술 치료는 기법과 관계없이 수술 실패 및 감염 등 후유증 가능성이 항시 있으며, 삼각근에 수술 반흔이 남는 문제가 있다. 또한 수술 이후에도 수개월간의 재활훈련이 필요하며, 수술로 통증이 완전히 없어지지 않고 남아 있거나 관절의 강직으로 움직임이 완전히 회복되지 않는 경우도 있다(Lee J.H., et al., 2011).

보존적 치료의 방법은 크게 염증과 통증의 완화를 위한 방법으로서 휴식, 진통 소염제 복용, 국소 스테로이드 주사제의 사용, 물리 요법 등을 사용할 수 있으며, 연부조직의 유연성 회복을 위한 스트레칭 운동과 기능의 회복을 위한 근력 강화 운동을 시행할 수 있다(Jung H.J., et al., 2012). 약물치료의 경우 비스테로이드성 소염진통제를 경구투여하거나 국소 적용하는 방법, 또는 스테로이드 주사용법이 사용되어 왔으나, 이러한 약물치료법은 단기적인 효과는 크나 재발률이 높고 부작용을 수반하는 문제가 있었다. 이외에도, 초음파 온열치료, 전기치료와 같은 물리적인 치료 방법과 같은 비수술적 치료방법들의 경우에는 통증을 감소시키는 등의 증상 완화에 국한되어, 원인을 적극적으로 해결하기 위한 치료법이 되지 못하는 한계가 있었다.

이에, 최근 비수술적 치료방법의 일환으로서, 혈소판풍부혈장(platelet-rich plasma) 주사치료와 같은 조직 재생 효과에 기반을 둔 새로운 치료법이 소개되어 있으며 실제로 회전근개 파열에서 치료 효과가 있는 것으로 보고되고 있다.

이에, 본 발명자는 회전근개 파열 수복용 조성물을 연구하는 과정에서, 핵산 및 키토산을 포함하는 조성물이 회전근개 파열에 의한 통증 완화 및 파열된 회전근개의 수복 효과가 우수한 것을 확인함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.

종래 선행기술로서 한국등록특허 제2015-0131864호에는 디엔에이 단편 혼합물을 함유하는 회전근개 파열의 예방 또는 치료용 약학 조성물이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1536134호에는 회전근개를 포함하는 연부조직 수복용 매트릭스를 기재하고 있으나, 핵산 및 키토산을 포함하는 회전근개 파열 수복용 조성물에 대해 기재된 바가 없어 그 구성에 있어서 본 발명과 차이가 있다.

한국공개특허 제2015-0131864호, 어류의 정액 또는 정소로부터 분리된 디엔에이 단편 혼합물을 함유하는 회전근개 파열의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 2015. 11. 25. 공개. 한국등록특허 제1536134호, 연부조직 수복용 매트릭스의 제조방법, 2015. 07. 07. 등록.

Cho N.S., et al., Impingement Syndrome & Rotator Cuff Tear:Etiology, Journal of Korean Arthroscopy Society, 16(1), 72-78, 2012. Jung H.J., et al., Conservative Treatment of Impingement Syndrome and Rotator Cuff Tear, Journal of Korean Arthroscopy Society, 16(1), 79-86, 2012. Kang J.D., et al., Rotator Cuff Tears Syndrome, Korean J. Orthop. Manu. Ther., 12(1), 67-72, 2007. Lee J.H., et al., Case Report of Acute Traumatic Rotator Cuff Tear Treatment in Traditional Korean Medicine, Journal of Pharmacopuncture, 14(4), 53-58, 2011.

본 발명의 목적은 핵산 및 키토산을 포함하는 회전근개 파열 수복용 조성물을 제공하는 데 있다.

또 다른 본 발명의 목적은 핵산 및 키토산을 포함하는 회전근개 파열 수복용 조성물의 제조방법을 제공하는 데 있다.

상기 핵산은 함량이 조성물 총 중량을 기준으로 0.1중량% 내지 3중량%일 수 있다.

상기 키토산은 함량이 조성물 총 중량을 기준으로 0.001중량% 내지 0.1중량%일 수 있다.

상기 핵산 및 키토산은 1:1 내지 3000:1 중량비율일 수 있다.

상기 핵산은 디옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA), 리보핵산(ribonucleic acid, RNA) 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 바람직하게는 디옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA)이다.

상기 디옥시리보핵산은 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide), 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide) 및 폴리디옥시리보뉴클레오타이드(polydeoxyribonucleotide)에서 선택될 수 있다.

상기 핵산은 분자량이 1kDa 내지 100,000kDa일 수 있다. 바람직하게는 10kDa 내지 10,000kDa이고, 더욱 바람직하게는 50kDa 내지 3,500kDa이다.

상기 키토산은 분자량이 3kDa 내지 1,000kDa일 수 있다.

상기 조성물은 수용성 고분자를 추가성분으로 함유할 수 있다.

상기 수용성 고분자는 히알루론산(hyaluronic acid), 콘드로이틴황산(chondroitin sulfate), 글리코겐(glycogen), 덱스트린(dextrin), 덱스트란(dextran), 덱스트란 황산(dextran sulfate), 히드록시프로필메틸셀룰로스(hydroxypropyl methylcellulose), 알긴산(alginic acid), 키틴(chitin), 풀루란(pullulan), 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin) 및 이들의 가수분해물, 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 폴리아크릴산(polyacrylic acid) 및 카르복시비닐 중합체(carboxylvinylpolymer)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 바람직하게는 히알루론산(hyaluronic acid)이다.

상기 조성물은 주사기를 통해 주입할 수 있다.

상기 조성물은 온도에 따라 졸-겔 전이가 일어나는 하이드로겔 일 수 있다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

상기 핵산 및 키토산을 포함하는 회전근개 파열 수복용 조성물은 i) 핵산을 완충용액(buffer)에 넣고 40℃ 내지 70℃에서 교반하면서 30분 내지 1시간 동안 용해시켜 핵산 저장용액을 제조하는 단계; ii) 키토산을 산성 완충용액에 용해시켜 키토산 저장용액을 제조하는 단계; iii) 상기 i) 단계의 핵산 저장용액 및 상기 ii) 단계의 키토산 저장용액을 핵산 및 키토산의 중량비율이 1:1 내지 3000:1이 되도록 혼합하여 40℃ 내지 70℃에서 30분 내지 1시간 동안 교반하는 단계; 및 iv) 상기 iii) 단계의 핵산-키토산 혼합액을 교반하면서 상온으로 낮추는 단계; 를 포함할 수 있다.

상기 핵산 저장용액 제조 시 이용할 수 있는 완충용액으로는 소듐 포스페이트 디베이직 도데카하이드레이트(sodium phosphate dibasic dodecahydrate), 염화나트륨(sodium chloride), 염화마그네슘(magnesium chloride), 염화칼륨(potassium chloride), 인산 완충 식염수(phosphate buffer saline) 또는 HEPES(N-(2-hydroxyethyl)-piperazine-N′-2-ethanesulfonic acid) 완충용액이 있으며, 바람직하게는 소듐 포스페이트 디베이직 도데카하이드레이트(sodium phosphate dibasic dodecahydrate)이며, 가장 바람직하게는 5~300mM의 소듐 포스페이트 디베이직 도데카하이드레이트를 이용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

상기 키토산 저장용액 제조 시 이용할 수 있는 산성 완충용액으로는 아세트산(acetic acid), 염산(hydrochloric acid), 아스코르브산(ascorbic acid), 젖산(lactic acid), 질산(nitric acid), 글루탐산(glutamic acid) 또는 포름산(formic acid)이 있으며, 바람직하게는 아세트산(acetic acid)이며, 가장 바람직하게는 10~300mM의 아세트산을 이용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

상기 핵산 및 키토산을 포함하는 회전근개 파열 수복용 조성물은 온도에 따라 졸-겔 전이가 일어나는 온도감응성 하이드로겔 일 수 있다.

상기 온도감응성 하이드로겔은 온도에 따라 졸(sol)이 겔(gel)로 또는 겔이 졸로 상전이(phase transition)가 일어나는 것으로, 졸이 겔로 변하는 현상을 겔화(gelation)라고 하며, 본 발명에서의 겔화는 점탄성을 가지며 온도가 증가함에 따라 고분자가 3차원 그물 구조를 형성하여 용매에 녹지 않고 잔류하는 상태가 되는 것으로 정의한다.

상기 온도감응성 하이드로겔 성질을 가지고 있는 회전근개 파열 수복용 조성물을 파열 부위에 주입하여 체온에 의해 점탄성이 회복되어 겔화됨으로써 파열 부위에 상기 조성물의 잔류 시간이 증가되어 조직 수복 효과를 증진 시킬 수 있다. 또한, 조성물의 겔화로 인해 조성물의 분해 속도를 늦춤으로써 장기간의 치료 효과를 얻을 수 있다.

상기 핵산 및 키토산을 포함하는 회전근개 파열 수복용 조성물은 균일한(homogeneous) 상태를 유지하면서 층 분리가 일어나지 않는 안정성(stability)이 높은 것으로, 핵산 및 키토산은 1:1 내지 3000:1 중량비율일 수 있다. 바람직하게는 10:1 내지 300:1 이다. 더욱 바람직하게는 10:1 내지 100:1 이다.

상기 핵산은 함량이 조성물 총 중량을 기준으로 0.1중량% 내지 3중량%일 수 있다. 바람직하게는 1중량% 내지 2중량%이다.

상기 핵산은 분자량이 10kDa 내지 100,000kDa 일 수 있고, 바람직하게는 10kDa 내지 10,000kDa 일 수 있고, 가장 바람직하게는 50kD 내지 3,500kDa 일 수 있다. 핵산의 분자량이 10kDa 미만인 경우에는 겔의 분해속도를 조절하기가 어려우며, 100,000kDa 초과인 경우에는 겔의 점성 조절이 어려워 사용에 문제가 있다.

상기 핵산은 디옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA), 리보핵산(ribonucleic acid, RNA) 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 바람직하게는 디옥시리보핵산이다.

또한, 상기 디옥시리보핵산은 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide), 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide) 및 폴리디옥시리보뉴클레오타이드(polydeoxyribonucleotide)일 수 있다.

또한, 상기 키토산의 함량은 조성물의 총 중량을 기준으로 0.001중량% 내지 0.1중량%일 수 있고, 바람직하게는 0.01중량% 내지 0.1중량%이다.

상기 키토산은 분자량이 3kDa 내지 1,000kDa인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 핵산 및 키토산의 혼합은 핵산 및 키토산의 중량비율이 1:1 내지 3000:1이 되도록 혼합하며, 이때, 핵산의 함량이 조성물의 총 중량을 기준으로 0.1중량% 내지 3중량%가 되고, 키토산의 함량이 조성물의 총 중량을 기준으로 0.001중량% 내지 0.1중량%이 되도록 하는 것이 바람직하다.

상기 핵산 및 키토산을 포함하는 회전근개 파열 수복용 조성물은 수용성 고분자를 추가성분으로 함유할 수 있다.

상기 수용성 고분자는 핵산 및 키토산을 포함하는 회전근개 파열 수복용 조성물로서 분해 속도 조절 및 치료 효과를 공고히 하기 위해 추가할 수 있다

상기 수용성 고분자는 생체 내에서 용해 또는 분해 가능한 것으로, 히알루론산(hyaluronic acid), 콘드로이틴황산(chondroitin sulfate), 글리코겐(glycogen), 덱스트린(dextrin), 덱스트란(dextran), 덱스트란 황산(dextran sulfate), 히드록시프로필메틸셀룰로스(hydroxypropyl methylcellulose), 알긴산(alginic acid), 키틴(chitin), 풀루란(pullulan) 등의 다당류나 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin) 및 이들의 가수분해물 등의 단백질, 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 카르복시비닐 중합체(carboxylvinylpolymer) 등의 합성 고분자 화합물을 사용할 수 있으며, 바람직한 것은 히알루론산이다.

상기 수용성 고분자를 추가 성분으로 포함하는 핵산 및 키토산을 포함하는 회전근개 파열 수복용 조성물은 핵산, 키토산 및 수용성 고분자가 1~3000 : 1 : 1~3000 중량비율로 혼합된 것일 수 있다. 바람직하게는 10~1,000 : 1 : 10~1,000 중량비율이고, 더 바람직하게는 25~100 : 1 : 25~100 중량비율이다.

상기 히알루론산은 선형 또는 가교된 형태를 포함하며, 분자량이 20kDa 내지 10,000kDa일 수 있으며, 500kDa 내지 3,000kDa이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 핵산 및 키토산을 포함하는 회전근개 파열 수복용 조성물은 회전근개 파열에 따른 지방 변성과 염증 반응을 억제시킬 수 있고, 회전근개 조직의 콜라겐 섬유의 연속성 및 평행성을 향상시켜 회전근개 조직 수복 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명은 핵산 및 키토산을 포함하는 회전근개 파열 수복용 조성물에 관한 것으로, 보다 자세하게는 핵산 및 키토산의 혼합을 통해 제조된 회전근개 파열 수복용 조성물은 온도에 따라 졸-겔 전이가 일어나는 것을 확인하였고, 기존의 단일 조성물 보다 조직 수복 효과가 높고, 조성물의 분해 속도를 늦추어 조직 수복 효과가 지속되는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 회전근개 파열 수복용 조성물은 치료가 필요한 파열 부위에 직접적인 주입이 가능하고, 주입된 부위에서 겔화를 통해 조성물의 분해 속도를 늦추고, 파열 부위에 대한 약물의 체류 시간이 증가함에 따라 조직 수복 효과가 충분히 발휘될 수 있어 뛰어난 치료 효과를 얻을 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 회전근개 파열 수복용 조성물의 물성 상태를 확인한 결과이다. 각각의 회전근개 파열 수복용 조성물을 제조하고 3일 동안 방치한 후, 조성물의 투명도와 침전물 생성 및 층 분리 여부를 확인하였다.
도 2는 본 발명의 실시예 1-1의 회전근개 파열 수복용 조성물의 온도에 따른 졸-겔 전이가 일어나는 하이드로겔 형성을 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 3은 본 발명의 회전근개 파열 수복용 조성물이 처리된 회전근개가 파열 될 때의 최대 인장 강도를 측정하는 방법을 보여주고 있다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<실시예 1. 핵산 및 키토산을 포함하는 회전근개 파열 수복용 조성물 제조>

핵산 저장용액(stock solution)의 경우 핵산을 190mM 소듐 포스페이트 디베이직 도데카하이드레이트(sodium phosphate dibasic dodecahydrate) 완충용액에 넣고 70℃의 열교반기를 이용하여 30분 이상 용해하여 제조하였다.

키토산 저장용액은 100mM 아세트산(acetic acid)을 이용하여 제조하였다.

제조한 핵산 및 키토산 저장용액을 혼합하여 70℃의 열교반기에서 30분 동안 교반하였다. 그 후, 온도를 상온으로 낮추며 1시간 동안 교반하여 핵산 및 키토산을 포함하는 회전근개 파열 수복용 조성물을 제조하였다. 이때, 핵산 및 키토산의 농도가 하기 표 1의 농도가 되도록 혼합하였다.

구성	최종 농도(중량%)		혼합비율(중량비율)
구성	핵산	키토산	핵산	키토산
실시예 1-1	1.5	0.015	100	1
실시예 1-2	0.1	0.001	100	1
실시예 1-3	0.1	0.1	1	1
실시예 1-4	3	0.001	3000	1
실시예 1-5	3	0.1	30	1

< 실시예 2. 핵산, 키토산 및 히알루론산을 포함하는 회전근개 파열 수복용 조성물 제조>

핵산 저장용액의 경우 핵산을 190mM 소듐 포스페이트 디베이직 도데카하이드레이트(sodium phosphate dibasic dodecahydrate) 완충용액에 넣고 70℃의 열교반기를 이용하여 30분 이상 용해하여 제조하였다.

제조한 핵산 및 키토산 저장용액을 혼합하여 70℃의 열교반기에서 30분간 교반하였다. 핵산 및 키토산 혼합 용액에 히알루론산 원료를 추가 혼합하여 60℃의 열교반기에서 1시간 교반 후, 3시간 동안 상온에서 교반하여 핵산, 키토산 및 히알루론산을 포함하는 회전근개 파열 수복용 조성물을 제조하였다. 이때, 핵산, 키토산 및 히알루론산의 농도가 하기 표 2의 농도가 되도록 혼합하였다.

구성	최종 농도(중량%)			혼합비율(중량비율)
구성	핵산	키토산	히알루론산	핵산	키토산	히알루론산
실시예 2-1	1.5	0.03	1.5	50	1	50
실시예 2-2	0.1	0.001	0.1	100	1	100
실시예 2-3	0.1	0.001	3	100	1	3000
실시예 2-4	0.1	0.1	0.1	1	1	1
실시예 2-5	0.1	0.1	3	1	1	30
실시예 2-6	3	0.001	0.1	3000	1	100
실시예 2-7	3	0.001	3	3000	1	3000
실시예 2-8	3	0.1	0.1	30	1	1
실시예 2-9	3	0.1	3	30	1	30

상기 히알루론산은 분자량이 1,000kDa인 것을 사용하였으나, 분자량이 20kDa 내지 10,000kDa 인 것을 사용해도 무방하다.

<비교예 1. 비교 대상의 회전근개 파열 수복용 조성물 제조>

하기 표 3에 해당되는 성분과 이의 함량 및 혼합비율에 따라 비교대상의 회전근개 파열 수복용 조성물을 제조하였다. 제조방법은 상기 실시예 1 및 실시예 2와 동일한 방법을 이용하였다.

구성	최종 농도(중량%)			혼합비율 (중량비율)
구성	핵산	키토산	히알루론산	핵산	키토산	히알루론산
비교예 1-1	2	0	0	1	0	0
비교예 1-2	0	1	0	0	1	0
비교예 1-3	1.5	0	1.5	1	0	1
비교예 1-4	1.5	0.0001	0	15000	1	0
비교예 1-5	1.5	1	0	1.5	1	0
비교예 1-6	0.001	0.0001	0.001	10	1	10
비교예 1-7	0.001	0.000001	0.001	1000	1	1000
비교예 1-8	1.5	0.5	1.5	3	1	3
비교예 1-9	1.5	0.00075	1.5	2000	1	2000
비교예 1-10	6	0.03	1.5	200	1	50
비교예 1-11	6	0.03	6	200	1	200
비교예 1-12	0	0.03	1.5	0	1	50
비교예 1-13	0	0.03	6	0	1	200

< 실험예 1. 회전근개 파열 수복용 조성물의 물성 확인>

상기 실시예 1(실시예 1-1 내지 실시예 1-5), 실시예 2(실시예 2-1 내지 실시예 2-9) 및 비교예 1(비교예 1-1 내지 비교예 1-13)의 회전근개 파열 수복용 조성물을 이용하여 겔화, 겔의 안정성 및 용해성 여부를 확인하였다.

각각의 조성물을 혼합하고, 3일 동안 방치한 후 조성물의 투명도와 겔화 상태를 육안으로 관찰하였고, 겔화 정도는 레오미터(rheometer)를 이용하여 24℃부터 40℃까지 1℃씩 올려주면서 1분간 유지시켜 점탄성 측정값의 증가 변화를 확인하였으며, 겔의 안정성은 침전물 생성 및 층 분리 여부로 확인하였다. 겔의 용해성 여부는 37.5℃의 수용액에 실시예 1, 실시예 2 및 비교예 1의 회전근개 파열 수복용 조성물을 점적하여 겔화시킨 후 온도를 37.5℃로 유지하면서, 400rpm으로 5분 동안 교반하면서 겔의 용해 여부를 확인하였고, 그 결과를 표 4 및 도 1에 나타내었다.

구성	3일 경과 후 결과			37.5℃에서 5분 동안 교반 결과
구성	점탄성	침전물 생성	층 분리	겔의 용해
실시예 1-1	○	×	×	×
실시예 1-2	○	×	×	×
실시예 1-3	○	×	×	×
실시예 1-4	○	×	×	×
실시예 1-5	○	×	×	×
실시예 2-1	○	×	×	×
실시예 2-2	○	×	×	×
실시예 2-3	○	×	×	×
실시예 2-4	○	×	×	×
실시예 2-5	○	×	×	×
실시예 2-6	○	×	×	×
실시예 2-7	○	×	×	×
실시예 2-8	○	×	×	×
실시예 2-9	○	×	×	×
비교예 1-1	○	×	×	○
비교예 1-2	×	×	×	○
비교예 1-3	○	×	×	○
비교예 1-4	○	×	×	○
비교예 1-5	×	○	×	○
비교예 1-6	×	×	×	○
비교예 1-7	×	×	×	○
비교예 1-8	○	○	×	○
비교예 1-9	○	×	×	○
비교예 1-10	×	○	×	×
비교예 1-11	×	○	×	×
비교예 1-12	○	○	○	○
비교예 1-13	○	○	○	○

상기 표 4 및 도 1을 살펴보면, 실시예 1 및 실시예 2의 회전근개 파열 수복용 조성물의 경우에는 3일이 경과하여도 침전물 생성 및 층 분리 현상이 나타나지 않으면서도 점탄성을 유지하고 있는 것을 알 수 있으며, 겔의 용해성의 경우, 37.5℃에서 겔을 형성하고, 형성된 겔이 지속적으로 유지되는 것을 관찰하였다.

그러나 비교예 1의 비교 대상의 회전근개 파열 수복용 조성물의 경우에는 침전물이 생성되거나, 층 분리가 일어나거나 부분적으로 덩어리가 생성되어 점탄성의 측정이 불가능하였으며, 겔의 용해성의 경우 37.5℃에서 겔화 되지 않거나 겔화가 되더라도 5분 이내에 모두 용해되는 것으로 확인되었다. 특히나, 비교예 1-12 및 비교예 1-13의 비교 대상의 회전근개 파열 수복용 조성물과 같이 핵산이 포함되지 않은 경우에는 조성물이 점탄성을 가지지만 침전물 생성 및 층 분리 현상이 나타나며 37.5℃에서 겔이 형성 된 후 5분 이내에 모두 용해되어 안정성이 떨어지는 것을 확인하였다(표 4 참조).

이를 통해, 본 발명의 회전근개 수복용 조성물은 온도 변화에 따라 온도감응성을 나타내고, 겔화된 후에도 겔의 형태를 지속적으로 유지한다는 것을 알 수 있었으며, 이에 따라, 주입된 본 발명의 조성물이 파열된 회전근개 부위에서 겔화되어 조성물의 분해 속도가 늦어지고, 약물 체류성이 증가되어 손상된 회전근개 부위의 치료 효과를 증대시킴으로써 우수한 회전근개 파열 치료 효과를 나타낼 수 있음을 예상할 수 있다.

<실험예 2. 온도에 따른 졸-겔 전이(sol-gel transition) 확인>

상기 실시예 1, 실시예 2 및 비교예 1의 회전근개 파열 수복용 조성물의 온도 변화에 따른 졸-겔 전이가 일어나는 하이드로겔 형성을 확인하였다.

졸-겔 전이를 확인하기 위해서 레오미터(rheometer)를 이용하였다. 이때 사용한 측정조건은 PU20, 간격(Gap) 0.5㎜, 0.1Hz, 1% 응력-변형률(stress strain)로 24℃부터 40℃까지 1℃씩 올려주면서 1분간 유지시켜 G'(탄성) 및 G"(점성)의 변화를 측정하였다. 또한, 각각의 조성물에 온도를 가하여 36℃ 전·후의 졸-겔 상변화를 육안으로 관찰하여 도 2에 나타내었다.

도 2에서 보여주듯이, 실시예 1-1의 회전근개 파열 수복용 조성물이 36℃ 미만의 온도에서는 졸의 형태를 띠는 반면에 36℃가 넘으면 겔화 되는 것을 관찰하였다. 이러한 결과는 실시예 1 및 실시예 2의 회전근개 파열 수복용 조성물 모두에서 동일하게 나타나는 것을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 회전근개 파열 수복용 조성물이 온도에 따라 졸-겔 전이가 일어나는 온도감응성 성질을 갖고 있어, 회전근개 파열 부위에 주입된 후, 체온에 의해 겔화 되어 약물의 체류 시간이 증가됨으로써 조직 수복 효과를 극대화 시킬 수 있을 것으로 예상할 수 있다.

<실험예 3. 회전근개 파열 동물모델의 제조>

Sprague-Dawley계 수컷 쥐(rat)를 실험군별로 무작위적으로 배정하였다. 정상군을 제외한 실험군의 쥐에 대하여 우측 어깨 부위를 개복하고 회전근개의 하나인 극하근(infraspinatus)을 잘라 펜로즈 드레인(penrose drain)으로 감싼 뒤 피부를 봉합하고 4주 동안 사육하여 만성 회전근개 파열(chronic rotator cuff tear) 모델을 만들었다.

<실험예 4. 회전근개 파열 수복용 조성물의 주입 및 조직검사>

상기 실험예 3에서 제조된 만성 회전근개 파열 동물 모델의 우측 어깨 부위를 개복하여 파열된 회전근개를 봉합수술 한 뒤, 본 발명의 회전근개 파열 수복용 조성물을 0.5㎖씩 주입하고 3주 또는 6주 동안 사육하였다. 3주 또는 6주 후에 각 군의 동물모델의 회전근개 부위에 대해 조직검사를 수행하였다. 조직 검사는 10% 중성 완충포르말린(neutral buffered formalin)에 채취된 조직을 24시간 이상 고정화시킨 후, 탈수 및 파라핀 침습을 통해, 근육-힘줄 경계부(musculotendinous junction)의 근위 0.3㎝ 부위를 확인하였다.

<실험예 5. 조직병리학적 관찰>

실험예 5-1. 지방변성(fatty degeneration)과 염증반응의 조직검사를 통한 회전근개 파열 수복용 조성물의 생체적합성과 치유 정도 확인

회전근개에 파열과 같은 손상이 일어나면 회전근개 부위의 내부변성 및 염증반응이 나타나고, 회전근개 파열의 봉합이 실패할 경우에도 회전근개의 지방변성과 염증반응이 현저하게 나타나고, 회전근개의 재파열 가능성이 높다. 이에 따라, 본 발명의 회전근개 파열 수복용 조성물을 처리한 후, 회전근개 파열의 수복정도를 확인하기 위해 지방변성과 염증반응의 변화를 관찰하였다.

조직 절편의 지방변성을 확인하기 위해 지방세포의 개수 변화를 S100으로, 염증반응을 확인하기 위해 대식세포의 개수 변화를 CD68으로 염색하여, 염색된 세포 수를 통계 처리한 결과를 표 5에 나타냈다.

구분	지방세포 (S100)		대식세포 (CD68)
구분	3 주	6 주	3 주	6 주
실시예 1-1	67.1±14.0	44.4±21.0	14.2±21	10.7±17
실시예 2-1	53.7±24.0	36.7±28	11.6±18	8.5±12
비교예 1-1	102.1±27.0	92.6±33	18.6±19	17.5±18
비교예 1-2	139.4±36.0	176.7±42.0	22.1±15.0	21.4±21.0
비교예 1-3	94.3±21.0	81.1±25	17.4±17	16.7±20
무처리군	150.3±54.0	193.7±51.0	24.5±17.0	23.6±14.0
정상군	0.0±0.0	0.0±0.0	0.0±0.0	0.0±0.0

상기 표 5에서 보여주듯이, 회전근개 파열 동물모델(무처리군)에서 시간이 경과함에 따라 지방세포와 대식세포의 수가 증가하여 병변이 악화되고 있음을 알 수 있다. 반면, 실시예 1-1, 실시예 2-1, 비교예 1-1 및 비교예 1-3의 회전근개 파열 수복용 조성물을 처리한 군에서는 시간이 경과함에 따라 지방세포와 대식세포의 수가 감소하였으나, 비교예 1-2의 회전근개 파열 수복용 조성물을 처리한 군에서는 무처리군과 유사하게 지방세포와 대식세포의 수가 증가하면서 병변의 조직 수복 효과가 없었다. 나아가, 실시예 1-1 및 실시예 2-1의 회전근개 파열 수복용 조성물을 처리한 군의 경우에는 비교예 1-1 및 비교예 1-3의 회전근개 파열 수복용 조성물을 처리한 군 보다 지방세포 및 대식세포의 수의 감소율이 더 큰 것을 알 수 있었다.

이에 따라, 본 발명의 회전근개 파열 수복용 조성물은 생체적합성이 우수하고, 회전근개 파열 부위에서 약물 체류성이 증가되어 조직 수복 효과가 현저하게 향상됨을 예상할 수 있었다.

실험예 5-2. 콜라겐 섬유의 조직검사를 통한 파열된 회전근개 치유 정도 확인

파열된 회전근개 치유 정도는 뼈-힘줄 결합부의 콜라겐 섬유(collagen fiber)의 연속성 및 규칙적인 평행성에 대한 조직검사를 통해 확인하였다.

조직 절편의 콜라겐 섬유 연속성 및 규칙적인 평행성 정도을 확인하기 위해 메이슨 트리크롬(Masson's trichrome) 염색과 H&E(hematoxyline and eosin) 염색을 이용하여 확인하였다. 염색된 조직 절편의 콜라겐 섬유 연속성 및 규칙적인 평행성 정도에 따라 0 내지 3단계(0: 25%, 1: 25~50%, 2: 50~75%, 3: >75%)로 나눈 후 각 단계에 해당되는 쥐의 마리 수를 확인하여 파열된 회전근개 치유 정도를 평가하였고, 그 결과를 표 6에 나타내었다.

구분	뼈-힘줄 경계부의 콜라겐 섬유의 연속성								뼈-힘줄 경계부의 콜라겐 섬유의 평행성
	3주				6주				3주				6주
	0 단계	1 단계	2 단계	3 단계	0 단계	1 단계	2 단계	3 단계	0 단계	1 단계	2 단계	3 단계	0 단계	1 단계	2 단계	3 단계
실시예 1-1	0	2	2	0	0	0	2	2	0	1	1	2	0	0	2	2
실시예 2-1	0	1	2	1	0	0	1	3	0	0	2	2	0	0	1	3
비교예 1-1	0	3	1	0	0	2	2	0	0	3	1	0	0	2	2	0
비교예 1-3	0	2	2	0	0	1	3	0	0	1	2	1	0	0	3	1
무 처리군	2	2	0	0	1	3	0	0	1	3	0	0	0	4	0	0

상기 표 6에서 보여주듯이, 회전근개 파열이 있는 동물모델(무처리군)에서 뼈-힘줄 경계부의 콜라겐 섬유의 연속성 및 평행성 변화의 정도가 6주까지 0과 1단계에 있는 것을 알 수 있었다. 그러나 실시예 1-1과 실시예 2-1, 및 비교예 1-1과 비교예 1-3의 회전근개 파열 수복용 조성물은 뼈-힘줄 경계부의 콜라겐 섬유의 연속성 및 평행성 변화의 정도가 6주까지 1, 2, 3단계에 있었다. 특히, 실시예 1-1 및 실시예 2-1은 비교예 1-1 및 비교예 1-3보다 콜라겐 섬유의 연속성 및 평행성 변화의 정도가 높은 단계로 나타나는 것을 알 수 있었다.

이에 따라, 본 발명의 회전근개 파열 수복용 조성물은 회전근개 파열 부위의 약물 체류성을 증가시켜 콜라겐 섬유의 연속성 및 평행성이 향상되어 조직 수복 효과가 나타남을 확인하였다.

<실험예 6. 회전근개의 인장 강도 측정>

본 발명의 실시예 1 및 실시예 2의 회전근개 파열 수복용 조성물이 처리된 회전근개가 파열될 때의 인장 강도를 도 3의 Instron 3343 장비를 사용하여 확인하였다.

공기식 집게(Pneumatic grip)를 이용하여 쥐의 회전근개을 고정하고 인장하중(tensile load)을 주어 파열될 때의 최대 장력을 측정하였다. 이 때 파열의 패턴은 뼈와 힘줄(tendon)의 연결부에서 발생하는 삽입 파열(insertional tear)과 힘줄의 중간부에서 발생하는 중간 파열(midsubstance tear)의 두 가지 형태로 나타난다. 파열의 형태는 결합의 강약 정도에 의해 구분되는데, 중간 파열(Midsubstance Tear)은 뼈-힘줄에서 강한 결합이 있을 때 나타나며, 삽입 파열(Insertional Tear)은 뼈-힘줄에서 비교적 약한 결합이 있을 때 나타나는 것으로 알려져 있어, 중간 파열(midsubstance tear)이 나타났을 때 조직이 강화된 것으로 판단하였다.

장력 시험을 실시하기 전 1N의 전 부하를 주고 0.1㎜/s 속도에서 5%의 strain으로 10 cycle의 반복 하중을 가하여 전처리를 하였다. 전처리 후 스트레스-이완 반응(stress-relaxation response)이 2.5%/s 변형속도(strain rate)에서 5%의 기울기로 시험되었고, 300초간을 기다린 뒤 다시 1N의 전 부하로 돌아간 뒤, 준정적 파괴하중 시험(quasi-static load-to-failure test)을 0.1㎜/s에서 시행하였다. 하중(Load) 및 변위(displacement)는 100Hz로 기록하였다.

검정력 분석(Power analysis)은 파괴하중정도(peak failure load)의 비율(ratio)에서 20%의 차이(difference)를 감지하는데 필요한 최소의 샘플 수를 4마리로 하였으며, 0.8의 파워(power)와 0.05의 알파(alpha)값으로 예상되는 표준편차(SD)를 10%로 하였다. 두 군 사이의 각각의 매개변수(parameter)의 차이를 비교하기 위해 비모수 분석을 사용하였으며, 독립 샘플(independent samples)에 대한 Mann-Whitney test를 이용하였으며, SPSS version 13.0(SPSS, Chicago, IL) 통계 프로그램을 사용하였다. 그 결과를 표 7에 나타내었다.

구분	파괴하중		파열패턴(삽입파열:중간파열)
구분	우측	좌측	우측	좌측
실시예 1-1	20.24±3.72	23.34±4.85	2:5	0:7
실시예 1-3	19.47±4.21	23.64±4.41	3:4	0:7
실시예 1-4	19.71±3.87	23.38±4.29	2:5	0:7
실시예 2-1	21.12±3.62	22.94±6.51	1:6	0:7
실시예 2-7	20.94±4.34	23.34±5.34	2:5	0:7
비교예 1-1	14.84±6.55	23.02±6.04	5:2	0:7
비교예 1-3	15.42±6.57	23.14±4.61	4:3	0:7
무처리군	9.59±6.44	23.58±4.36	6:1	0:7
정상군	24.06±5.97	23.11±4.12	0:7	0:7
우측: 회전근개 파열의 동물모델(우측어깨) 좌측: 정상군 동물모델(좌측어깨)

상기 표 7에서, 실시예 1-1, 실시예 1-3, 실시예 1-4, 실시예 2-1 및 실시예 2-7의 회전근개 파열 수복용 조성물이 처리된 군의 경우, 회전근개 파열이 있는 우측 어깨의 회전근개 파괴하중과 파열패턴은 6주 경과한 후에 정상 어깨의 파괴하중 및 파열패턴과 유사한 측정값이 나타나는 것으로 확인되었고, 비교예 1-1 및 비교예 1-3의 회전근개 파열 수복용 조성물을 처리한 군 보다 그 수치가 현저히 증가되는 것으로 나타났다.

또한, 실시예 1-1, 실시예 1-3, 실시예 1-4, 실시예 2-1 및 실시예 2-7의 회전근개 파열 수복용 조성물이 처리된 군에서의 회전근개 파열패턴은 약한 결합을 나타내는 삽입파열 패턴보다 강한 결합을 나타내는 중간파열 패턴의 비율이 높다는 것을 통해 회전근개의 인장 강도가 강화되어 회전근개 파열이 수복되었다는 것을 알 수 있었다.

이를 통해, 본 발명의 회전근개 파열 수복용 조성물을 처리한 경우, 처리 시간이 경과함에 따라 회전근개의 인장강도가 증가하고, 파열된 회전근개의 조직이 수복됨으로써 우수한 회전근개 파열 수복 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

Claims

핵산 및 키토산을 포함하는 회전근개 파열 수복용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 핵산은 함량이 조성물 총 중량을 기준으로 0.1중량% 내지 3중량%인 것을 특징으로 하는 회전근개 파열 수복용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 키토산은 함량이 조성물 총 중량을 기준으로 0.001중량% 내지 0.1중량%인 것을 특징으로 하는 회전근개 파열 수복용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 핵산 및 키토산은 1:1 내지 3000:1 중량비율인 것을 특징으로 하는 회전근개 파열 수복용 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 핵산은 디옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA), 리보핵산(ribonucleic acid, RNA) 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 회전근개 파열 수복용 조성물.
제5항에 있어서,
상기 핵산은 디옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA) 인 것을 특징으로 하는 회전근개 파열 수복용 조성물.
제6항에 있어서,
상기 디옥시리보핵산은 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide), 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide) 및 폴리디옥시리보뉴클레오타이드(polydeoxyribonucleotide)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 회전근개 파열 수복용 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 핵산은 분자량이 1kDa 내지 100,000kDa인 것을 특징으로 하는 회전근개 파열 수복용 조성물.
제8항에 있어서,
상기 핵산은 분자량이 10kDa 내지 10,000kDa인 것을 특징으로 하는 회전근개 파열 수복용 조성물.
제9항에 있어서,
상기 핵산은 분자량이 50kDa 내지 3,500kDa인 것을 특징으로 하는 회전근개 파열 수복용 조성물.
제1항 또는 제3항에 있어서,
상기 키토산은 분자량이 3kDa 내지 1,000kDa인 것 특징으로 하는 회전근개 파열 수복용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 수용성 고분자를 추가성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 회전근개 파열 수복용 조성물.
제12항에 있어서,
상기 수용성 고분자는 히알루론산(hyaluronic acid), 콘드로이틴황산(chondroitin sulfate), 글리코겐(glycogen), 덱스트린(dextrin), 덱스트란(dextran), 덱스트란 황산(dextran sulfate), 히드록시프로필메틸셀룰로스(hydroxypropyl methylcellulose), 알긴산(alginic acid), 키틴(chitin), 풀루란(pullulan), 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin) 및 이들의 가수분해물, 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 폴리아크릴산(polyacrylic acid) 및 카르복시비닐 중합체(carboxylvinylpolymer)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 회전근개 파열 수복용 조성물.
제13항에 있어서,
상기 수용성 고분자는 히알루론산(hyaluronic acid)인 것을 특징으로 하는 회전근개 파열 수복용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 주사기를 통해 주입하는 것을 특징으로 하는 회전근개 파열 수복용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 온도에 따라 졸-겔 전이가 일어나는 하이드로겔인 것을 특징으로 하는 회전근개 파열 수복용 조성물.