CN111116736A - 胶原蛋白及胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了胶原蛋白及胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料。所述胶原蛋白使用牛皮作为原料，制备方法包括两步骤：(一)牛皮预处理；(二)预处理后的牛皮酸法提取。本发明以富含Ⅰ型胶原的牛皮为原料，通过碳酸钠溶液涨发和酶处理结合法，利于脱毛和胶原纤维的松散，提取具有完整三股螺旋结构的Ⅰ型胶原，无毒无刺激性，和人体组织的相容性良好，适用于组织工程支架材料的制备。而所述胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料通过将胶原蛋白和羧甲基纤维素复合，以EDC/NHS为交联剂，使羧基和氨基发生酰胺化反应，再通过冷冻干燥法制备得到。本发明利用胶原蛋白和羧甲基纤维素体系，获得可降解且具有良好生物相容性的支架材料。

Description

胶原蛋白及胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料
技术领域
本发明涉及胶原蛋白及其制品技术领域，特别是涉及胶原蛋白及胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料。
背景技术
胶原蛋白是一种白色、不透明、无支链的三螺旋纤维蛋白质，其分子结构十分稳定，主要存在于动物的皮、骨、软骨、牙齿、肌键、韧带和血管中，约占哺乳动物体内蛋白质总量的25％～30％，是结缔组织极重要的结构蛋白质，起着支撑器官、保护机体的作用。有资料报道，胶原蛋白能有效增强人体皮肤组织细胞的储水能力，改善皮肤的弹性，舒缓皱纹；可促进骨的形成，增强低钙水平下的骨胶原结构，从而提高骨强度，预防骨质疏松症；可吸附肠道中的毒素和重金属，降低血清甘油三酯和胆固醇；可用于制备手术缝合线、止血纤维或海绵、代血浆、人工血管、心脏瓣膜和人工皮肤等。此外，胶原含有丰富的甘氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸等中性和酸性氨基酸，生物可降解，具有优良的生物相容性与加工适应性、低免疫原性，这些均使得其在食品领域、化妆品领域、生物医学领域得到了广泛的应用。目前，胶原蛋白制品主要是从一些陆生脊椎动物，如牛、猪、鸡等的皮肤、软骨、肌腱中提取。
申请号201611032604.X的发明公开一种从牛皮中提取胶原蛋白的方法，包括以下步骤：
(1)牛皮预处理：将新鲜牛皮刮毛，提出皮下的肉，用0.15～0.2％的生理盐水将牛皮浸泡25～30分钟，用清水冲洗牛皮10～15分钟，将牛皮剪成碎块，加入脱脂剂，浸泡35～40分钟，过滤，加入滤渣质量的3～5倍的酒石酸浸泡20～25分钟，用清水冲洗至滤渣水溶液pH值为6～7，得牛皮滤渣；
(2)熬合：将步骤(1)处理后的牛皮滤渣，烘干至含水量为5.5～7％，加水，在100℃下搅拌55～60分钟，冷却至40～50℃，采用水浴恒温加热，加入柠檬酸调节溶液pH值为4.5～5.5，恒温搅拌2～3小时，抽滤；
(3)精制：将步骤(2)中抽滤得滤液，加入滤液质量的60～70％的乙醇，在40～50℃下水浴浸提50～60分钟，减压蒸馏回收乙醇，得残留液，加入残留液4～5倍的二氯甲烷，恒温搅拌90～100分钟，减压蒸馏回收二氯甲烷，将水浴温度调至100～120℃，继续搅拌10～15分钟，即可。
发明内容
胶原蛋白是人体的“生命支架”，是哺乳动物细胞中最为丰富的蛋白质，具有支撑保护等作用。本发明所要解决的技术问题之一是提供一种胶原蛋白，使用牛皮作为原料，制备方法包括两步骤：(一)牛皮预处理；(二)预处理后的牛皮酸法提取。
进一步地，所述牛皮预处理过程为：
(1)修剪处理：将牛皮修剪成块，去除杂质及皮下组织后，用流动的水冲洗干净；
(2)碳酸钠溶液涨发：将修剪好的牛皮块以料液质量比1：(3～10)放入质量分数1～5％的碳酸钠溶液中，涨发10～30小时后，将牛皮块捞出，得到涨发后的牛皮；
(3)热烫脱毛：将涨发后的牛皮放入60～70℃水浴中热烫5～10分钟，然后捞出，得到热烫脱毛后的牛皮；
(4)酶处理：将热烫脱毛后的牛皮和质量分数0.3～0.5％的碱性蛋白酶液以料液质量比1:(3～10)混合，于35～55℃、pH9～11的条件下酶解1～5小时，将牛皮捞出，得到酶解后的牛皮；
(5)机械脱毛：将酶解后的牛皮使用脱毛机进行机械脱毛，得到机械脱毛后的牛皮；
(6)清洗：将机械脱毛后的牛皮用流动的水冲洗，得到清洗后的牛皮；
(7)食醋浸泡：用食醋对清洗后的牛皮以料液质量比1:(3～5)浸泡1～5小时，捞出，用流动的水冲洗至洗液呈中性，得到预处理后的牛皮。
进一步地，所述预处理后的牛皮酸法提取过程为：将预处理后的牛皮以料液质量比1：(10～30)加入到0.2～0.5mol/L的乙酸水溶液中，溶胀10～15小时；然后用高速组织捣碎机于转速7000～12000转/分钟匀浆20～40分钟，获得匀浆液；向上述匀浆液中加入0.2～0.5mol/L乙酸水溶液作为酸提介质，料液质量比1：(10～30)，调节溶液pH至2～3，于2～4℃搅拌24～64小时，离心分离，收集上清液A和沉淀；将沉淀回收，向沉淀中再次加入0.2～0.5mol/L乙酸水溶液作为酸提介质，料液质量比1：(10～30)，调节溶液pH至2～3，于2～4℃搅拌24～64小时，离心分离，收集上清液B；将上清液A和上清液B合并，加入食盐，使得食盐的最终浓度为0.6～0.9mol/L，并不断搅拌直至析出絮状沉淀；静置12～24小时，然后离心分离，收集絮状物；将絮状物用0.2～0.5mol/L的乙酸水溶液复溶，置于0.1～0.3mol/L的乙酸水溶液中透析24～48小时，然后用蒸馏水透析2～3天，真空冷冻干燥，得到所述胶原蛋白。
蛋白多糖是胶原纤维紧密连接的“胶黏剂”，组成蛋白多糖的硫酸皮肤素带有大量负电荷，通过静电引力和胶原纤维结合，蛋白多糖被水解去除越多，胶原纤维分散程度越好。本发明中使用碳酸钠溶液涨发和酶处理联合的方法：碳酸钠溶液促进毛孔进一步舒张，起到了松散膨胀牛皮和胶原纤维的作用，增强酶处理的效果；通过引入蛋白酶制剂和水溶助长性物质，蛋白酶通过水解核心蛋白来破坏蛋白多糖，从而达到分散纤维的目的。
本发明以富含Ⅰ型胶原的牛皮为原料，通过碳酸钠溶液涨发和酶处理结合法，利于脱毛和胶原纤维的松散，提取具有完整三股螺旋结构的Ⅰ型胶原，无毒无刺激性，和人体组织的形容性良好，适用于组织工程支架材料的制备。
本发明所要解决的技术问题之二是提供一种胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料。
本发明公开一种胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料，将胶原蛋白和羧甲基纤维素复合，以EDC/NHS为交联剂，使羧基和氨基发生酰胺化反应，再通过冷冻干燥法制备得到胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料。
在本发明的一些实施例中，胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料，其制备方法包括以下步骤：
(I)将5～10g胶原蛋白于2～4℃溶解于100～300mL的10～100mmol/L盐酸溶液中，得到胶原蛋白溶液；
(Ⅱ)将5～10g羧甲基纤维素于35～37℃溶解于100～300mL去离子水中，得到羧甲基纤维素溶液；
(Ⅲ)将胶原蛋白溶液与羧甲基纤维素溶液混合均匀，得混合溶液；
(Ⅳ)向混合溶液中加入0.1～0.5mol/L的Na2HPO4溶液，调节混合溶液pH至5.0～5.5，于25～30℃加入EDC/NHS交联剂，EDC/NHS交联剂占混合溶液体积的1～5％，搅拌均匀，于25～30℃继续交联反应24～48小时；
(Ⅴ)交联结束后，将反应产物装入透析袋中，于2～4℃置于Na2HPO4溶液中透析24～72小时；透析结束后，将透析液铺板至聚四氟乙烯孔板中，先置于-195至-180℃的液氮中预冷冻1～3小时，然后置于真空冷冻干燥机中于-70至-50℃冷冻干燥24～48小时，即得胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料。
本发明还公开一种胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料，将胶原蛋白和羧甲基纤维素复合，加入甲基丙烯酸酐从而使双键引入胶原蛋白分子结构，以EDC/NHS为交联剂，使羧基和氨基发生酰胺化反应，并添加光引发剂进而进行光化学交联，再通过冷冻干燥法制备得到胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料。
在本发明的一些实施例中，胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料，其制备方法包括以下步骤：
(I)将5～10g胶原蛋白于2～4℃溶解于100～300mL的10～100mmol/L盐酸溶液中，用0.1～0.5mol/L的Na2HPO4溶液调节pH至7～7.5，得到胶原蛋白溶液；
(Ⅱ)将5～10g羧甲基纤维素于35～37℃溶解于100～300mL去离子水中，得到羧甲基纤维素溶液；
(Ⅲ)在避光条件下，向胶原蛋白溶液中加入甲基丙烯酸酐，甲基丙烯酸酐占胶原蛋白溶液的体积比为0.1～10％，混合均匀后，继续于2～4℃搅拌反应5～10小时；反应结束后，将反应液装于透析袋中，置于10～100mmol/L盐酸溶液透析60～120小时，得到甲基丙烯酸酐修饰后的胶原蛋白溶液；
(Ⅳ)将甲基丙烯酸酐修饰后的胶原蛋白溶液与羧甲基纤维素溶液混合均匀，得混合溶液；
(Ⅴ)在避光条件下，向混合溶液中加入0.1～0.5mol/L的NaH2PO4溶液，调节pH至5.0～5.5，于25～30℃加入EDC/NHS交联剂，EDC/NHS交联剂占混合溶液体积的1～5％，最后在反应体系中加入光引发剂，光引发剂占胶原蛋白的质量比为0.3～1.2％，于25～30℃继续交联24～48小时；
(Ⅵ)交联结束后，将反应产物铺板至透明孔板中，将透明孔板置于紫外灯下，双面辐照20～60分钟；将辐照后产物于-195至-180℃的液氮中预冷冻1～3小时，然后置于真空冷冻干燥机中于-70至-50℃冷冻干燥24～48小时，即得胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料。
在上述任一种技术方案中，所述EDC/NHS交联剂为EDC/NHS(2:1)交联剂或者EDC/NHS(1:1)交联剂；
所述EDC/NHS(2:1)交联剂的制备过程为：在冰浴下溶解MES于去离子水中至饱和状态，用0.1mol/L的NaOH溶液调节pH至5～6，得到MES缓冲液；随后将EDC和NHS以c(EDC)＝50mmol/L，c(NHS)＝25mmol/L依次加入，搅拌均匀，得到EDC/NHS(2:1)交联剂；
所述EDC/NHS(1:1)交联剂的制备过程为：在冰浴下溶解MES于去离子水中至饱和状态，用0.1mol/L的NaOH溶液调节pH至5～6，得到MES缓冲液；随后将EDC和NHS以c(EDC)＝50mmol/L，c(NHS)＝50mmol/L依次加入，搅拌均匀，得到EDC/NHS(1:1)交联剂。
在本发明的一些实施例中，胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料，其制备方法包括以下步骤：
(I)将5～10g胶原蛋白于2～4℃溶解于100～300mL的10～100mmol/L盐酸溶液中，用0.1～0.5mol/L的Na2HPO4溶液调节pH至7～7.5，得到胶原蛋白溶液；
(Ⅱ)将5～10g羧甲基纤维素于35～37℃溶解于100～300mL去离子水中，用0.1～1mol/L的盐酸调节羧甲基纤维素溶液pH至5～5.5，得到羧甲基纤维素溶液；
(Ⅲ)在避光条件下，向胶原蛋白溶液中加入甲基丙烯酸酐，甲基丙烯酸酐占胶原蛋白溶液的体积比为0.1～10％，混合均匀后，继续于2～4℃搅拌反应5～10小时；反应结束后，将反应液装于透析袋中，置于10～100mmol/L盐酸溶液透析60～120小时，得到甲基丙烯酸酐修饰后的胶原蛋白溶液；
(Ⅳ)冰浴下溶解MES于去离子水中至饱和状态，用0.1～1mol/L氢氧化钠水溶液调节pH至5～6，得到MES缓冲液；将EDC和NHS以c(EDC)＝25～50mmol/L，c(NHS)＝25～50mmol/L分别加入MES缓冲液搅拌均匀，分别得到EDC溶液和NHS溶液；恒定反应温度25～30℃，将NHS溶液加入羧甲基纤维素溶液中，NHS溶液占混合溶液体积的1～5％，持续搅拌反应1～3小时，再加入EDC溶液，EDC溶液占混合溶液体积的1～5％，持续搅拌反应1～3小时，得到修饰过的羧甲基纤维素溶液；
(Ⅴ)将甲基丙烯酸酐修饰后的胶原蛋白溶液与修饰过的羧甲基纤维素溶液混合均匀，得混合溶液；
(Ⅵ)在避光条件下，将混合液置于35～37℃反应24～48小时后，透析36～72小时，得到胶原蛋白-羧甲基纤维素中间体；向胶原蛋白-羧甲基纤维素中间体中加入光引发剂，光引发剂占胶原蛋白的质量比为0.3～1.2％，于25～30℃继续交联24～48小时；
(Ⅶ)交联结束后，将反应液离心分离，弃上清，将所得沉淀水洗，即为交联反应产物；将交联反应产物铺板至透明孔板中，将透明孔板置于紫外灯下，双面辐照20～60分钟；将辐照后产物于-195至-180℃的液氮中预冷冻1～3小时，然后置于真空冷冻干燥机中于-70至-50℃冷冻干燥24～48小时，即得胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料。
在本发明的一些实施例中，胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料，其制备方法包括以下步骤：
(I)糖化：将胶原蛋白与还原糖按照质量比1：(1～8)混合，加入去离子水，制成胶原蛋白浓度2～10mg/mL的溶液，使用质量分数1～10％的盐酸调节pH值为6～7，于50～60℃反应12～24小时；真空冷冻干燥，得到糖化胶原蛋白；
(Ⅱ)将5～10g糖化胶原蛋白于2～4℃溶解于100～300mL的10～100mmol/L盐酸溶液中，用0.1～0.5mol/L的Na2HPO4溶液调节pH至7～7.5，得到胶原蛋白溶液；
(Ⅲ)将5～10g羧甲基纤维素于35～37℃溶解于100～300mL去离子水中，用0.1～1mol/L的盐酸调节羧甲基纤维素溶液pH至5～5.5，得到羧甲基纤维素溶液；
(Ⅳ)在避光条件下，向胶原蛋白溶液中加入甲基丙烯酸酐，甲基丙烯酸酐占胶原蛋白溶液的体积比为0.1～10％，混合均匀后，继续于2～4℃搅拌反应5～10小时；反应结束后，将反应液装于透析袋中，置于10～100mmol/L盐酸溶液透析60～120小时，得到甲基丙烯酸酐修饰后的胶原蛋白溶液；
(Ⅴ)冰浴下溶解MES于去离子水中至饱和状态，用0.1～1mol/L氢氧化钠水溶液调节pH至5～6，得到MES缓冲液；将EDC和NHS以c(EDC)＝25～50mmol/L，c(NHS)＝25～50mmol/L分别加入MES缓冲液搅拌均匀，分别得到EDC溶液和NHS溶液；恒定反应温度25～30℃，将NHS溶液加入羧甲基纤维素溶液中，NHS溶液占混合溶液体积的1～5％，持续搅拌反应1～3小时，再加入EDC溶液，EDC溶液占混合溶液体积的1～5％，持续搅拌反应1～3小时，得到修饰过的羧甲基纤维素溶液；
(Ⅵ)将甲基丙烯酸酐修饰后的胶原蛋白溶液与修饰过的羧甲基纤维素溶液混合均匀，得混合溶液；
(Ⅶ)在避光条件下，将混合液置于35～37℃反应24～48小时后，透析36～72小时，得到胶原蛋白-羧甲基纤维素中间体；向胶原蛋白-羧甲基纤维素中间体中加入光引发剂，光引发剂占胶原蛋白的质量比为0.3～1.2％，于25～30℃继续交联24～48小时；
(Ⅷ)交联结束后，将反应液离心分离，弃上清，将所得沉淀水洗，即为交联反应产物；将交联反应产物铺板至透明孔板中，将透明孔板置于紫外灯下，双面辐照20～60分钟；将辐照后产物于-195至-180℃的液氮中预冷冻1～3小时，然后置于真空冷冻干燥机中于-70至-50℃冷冻干燥24～48小时，即得胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料；
在上述过程中，所述还原糖为木糖和/或葡萄糖。作为优选，所述还原糖为木糖和葡萄糖以质量比1:1组成的混合物。
本发明利用胶原蛋白和羧甲基纤维素体系，获得可降解且具有良好生物相容性的支架材料。
具体实施方式
实施例中原料介绍如下：
牦牛皮，来自天祝藏族自治县鑫陇农畜产品购销专业合作社。
碳酸钠，购于潍坊海之源化工有限公司。
碱性蛋白酶，食品级，酶活力10万U/g，购于河南集美化工产品有限公司。
食醋，购于陕西聚源庆醋业有限公司。
羧甲基纤维素，购于上海柃市实业有限公司。
EDC，即1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，CAS号：25952-53-8。
NHS，即N-羟基琥珀酰亚胺，CAS号：6066-82-6。
甲基丙烯酸酐，CAS号：760-93-0。
光引发剂，具体使用光引发剂2595，购于巴斯夫。
MES，即2-吗啉乙磺酸，CAS号：4432-31-9。
木糖，CAS号：58-86-6。
葡萄糖，CAS号：58367-01-4。
在本发明未作具体说明的情况下，搅拌转速为100转/分钟。
在本发明未作具体说明的情况下，真空冷冻干燥的具体工艺条件为：预冻温度-80℃，预冻时间2小时，冷冻温度-70℃，绝对压强100Pa，干燥时间48小时。
力学性能测试：采用物性分析仪将复合材料进行压缩强度的表征。压缩强度测试前，将待测复合材料样品置于盛有硅胶的干燥器中48小时。工作参数如下：传感器量程为0～750kg，触发力为50g，下压速度为1.2mm/min，相变量为90％。每组样品均进行10次平行试验，取其平均值作为测试结果。
实施例1
胶原蛋白，使用牦牛皮作为原料，制备方法包括两步骤：(一)牦牛皮预处理；(二)预处理后的牦牛皮酸法提取。
所述牦牛皮预处理过程为：
(1)修剪处理：将牦牛皮修剪成30cm×30cm的牛皮块，去除杂质及皮下组织后，用流动的水冲洗干净；
(2)碳酸钠溶液涨发：将修剪好的牛皮块以料液质量比1：3放入质量分数4％的碳酸钠溶液中，涨发15小时后，将牛皮块捞出，得到涨发后的牦牛皮；
(3)热烫脱毛：将涨发后的牦牛皮放入65℃水浴中热烫8分钟，然后捞出，得到热烫脱毛后的牦牛皮；
(4)酶处理：将热烫脱毛后的牦牛皮和质量分数0.3％的碱性蛋白酶液以料液质量比1:3混合，于48℃、pH 9.7的条件下酶解3小时，将牛皮捞出，得到酶解后的牦牛皮；
(5)机械脱毛：将酶解后的牦牛皮使用脱毛机进行机械脱毛，得到机械脱毛后的牦牛皮；
(6)清洗：将机械脱毛后的牦牛皮用流动的水冲洗，得到清洗后的牦牛皮；
(7)食醋浸泡：用食醋对清洗后的牦牛皮以料液质量比1:3浸泡2小时，起到灭酶活以及回调pH的作用，捞出，用流动的水冲洗至洗液呈中性，得到预处理后的牦牛皮。
所述预处理后的牦牛皮酸法提取过程为：将预处理后的牦牛皮以料液质量比1：10加入到0.5mol/L的乙酸水溶液中，溶胀12小时；然后用高速组织捣碎机于转速12000转/分钟匀浆25分钟，获得匀浆液；向上述匀浆液中加入0.5mol/L乙酸水溶液作为酸提介质，料液质量比1：20，调节溶液pH至3，于2℃搅拌64小时，以8000转/分钟离心分离10分钟，收集上清液A和沉淀；将沉淀回收，向沉淀中再次加入0.5mol/L乙酸水溶液作为酸提介质，料液质量比1：20，调节溶液pH至3，于2℃搅拌64小时，以8000转/分钟离心分离10分钟，收集上清液B；将上清液A和上清液B合并，加入食盐，使得食盐的最终浓度为0.9mol/L，并不断搅拌直至析出絮状沉淀；静置12小时，然后以8000转/分钟离心分离20分钟，收集絮状物；将絮状物用0.5mol/L的乙酸水溶液复溶，置于0.1mol/L的乙酸水溶液中使用截留分子量10KDa的透析袋透析24小时，然后用蒸馏水透析3天，真空冷冻干燥，得到所述胶原蛋白。
实施例2
胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料，其制备方法包括以下步骤：
(I)将5g胶原蛋白(根据实施例1制备得到)于4℃溶解于100mL的100mmol/L盐酸溶液中，得到胶原蛋白溶液；
(Ⅱ)将5g羧甲基纤维素于37℃溶解于100mL去离子水中，得到羧甲基纤维素溶液；
(Ⅲ)将胶原蛋白溶液与羧甲基纤维素溶液混合均匀，得混合溶液；
(Ⅳ)向混合溶液中加入0.5mol/L的Na2HPO4溶液，调节混合溶液pH至5.5，于25℃加入EDC/NHS交联剂，EDC/NHS交联剂占混合溶液体积的2％，搅拌均匀，于25℃继续交联反应24小时；
(Ⅴ)交联结束后，将反应产物装入截流分子量500kDa的纤维素透析袋中，于4℃置于Na2HPO4溶液中透析24小时；透析结束后，将透析液铺板至聚四氟乙烯孔板中，先置于-195℃的液氮中预冷冻2小时，然后置于真空冷冻干燥机中于-50℃下冷冻干燥48小时，即得胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料。
所述EDC/NHS交联剂具体使用EDC/NHS(1:1)交联剂：冰浴下溶解MES于去离子水中至饱和状态，用0.1mol/L氢氧化钠水溶液调节pH至5，得到MES缓冲液；将EDC和NHS以c(EDC)＝50mmol/L，c(NHS)＝50mmol/L依次加入MES缓冲液搅拌均匀，得到EDC/NHS(1:1)交联剂。
对实施例2胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料的压缩强度进行测试，压缩强度为0.75MPa。
实施例3
胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料，其制备方法包括以下步骤：
(I)将5g胶原蛋白(根据实施例1制备得到)于4℃溶解于100mL的100mmol/L盐酸溶液中，得到胶原蛋白溶液；
(Ⅱ)将5g羧甲基纤维素于37℃溶解于100mL去离子水中，得到羧甲基纤维素溶液；
(Ⅲ)将胶原蛋白溶液与羧甲基纤维素溶液混合均匀，得混合溶液；
(Ⅳ)向混合溶液中加入0.5mol/L的Na2HPO4溶液，调节混合溶液pH至5.5，于25℃加入EDC/NHS交联剂，EDC/NHS交联剂占混合溶液体积的2％，搅拌均匀，于25℃继续交联反应24小时；
(Ⅴ)交联结束后，将反应产物装入截流分子量500kDa的纤维素透析袋中，于4℃置于Na2HPO4溶液中透析24小时；透析结束后，将透析液铺板至聚四氟乙烯孔板中，先置于-195℃的液氮中预冷冻2小时，然后置于真空冷冻干燥机中于-50℃下冷冻干燥48小时，即得胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料。
所述EDC/NHS交联剂具体使用EDC/NHS(2:1)交联剂：冰浴下溶解MES于去离子水中至饱和状态，用0.1mol/L氢氧化钠水溶液调节pH至5，得到MES缓冲液；将EDC和NHS以c(EDC)＝50mmol/L，c(NHS)＝25mmol/L依次加入MES缓冲液搅拌均匀，得到EDC/NHS(2:1)交联剂。
对实施例3胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料的压缩强度进行测试，压缩强度为1.1MPa。
从上述数据可以看出，交联剂比例为2:1时制备得到的复合材料压缩强度比交联剂比例1:1时制备得到的压缩强度大，推测是因为材料内部的规整度比较强。
对比例
纯胶原蛋白材料，其制备方法包括以下步骤：
(I)将5g胶原蛋白(根据实施例1制备得到)于4℃溶解于100mL的100mmol/L盐酸溶液中，得到胶原蛋白溶液；
(Ⅳ)向胶原蛋白溶液中加入0.5mol/L的Na2HPO4溶液，调节混合溶液pH至5.5，于25℃加入EDC/NHS交联剂，EDC/NHS交联剂占混合溶液体积的2％，搅拌均匀，于25℃继续交联反应24小时；
(Ⅴ)交联结束后，将反应产物装入截流分子量500kDa的纤维素透析袋中，于4℃置于Na2HPO4溶液中透析24小时；透析结束后，将透析液铺板至聚四氟乙烯孔板中，先置于-195℃的液氮中预冷冻2小时，然后置于真空冷冻干燥机中于-50℃下冷冻干燥48小时，即得纯胶原蛋白材料。
所述EDC/NHS交联剂具体使用EDC/NHS(2:1)交联剂：冰浴下溶解MES于去离子水中至饱和状态，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至5，得到MES缓冲液；将EDC和NHS以c(EDC)＝50mmol/L，c(NHS)＝25mmol/L依次加入MES缓冲液搅拌均匀，得到EDC/NHS(2:1)交联剂。
将对比例的纯胶原蛋白材料的压缩强度进行测试，压缩强度为0.55MPa。
结合实施例2～3和对比例的对照可以说明，胶原蛋白内部具有致密的连通型的三维多孔结构，当羧甲基纤维素和胶原蛋白复合后，羧甲基纤维素的纤维增强作用和胶原蛋白的层状多孔三维结构产生协同，从而使得复合材料的压缩强度增大。
实施例4
胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料，其制备方法包括以下步骤：
(I)将5g胶原蛋白(根据实施例1制备得到)于4℃溶解于100mL的100mmol/L盐酸溶液中，得到胶原蛋白溶液；
(Ⅱ)将5g羧甲基纤维素于37℃溶解于100mL去离子水中，得到羧甲基纤维素溶液；
(Ⅲ)在避光条件下，以滴加速度6滴/分钟向胶原蛋白溶液中加入甲基丙烯酸酐，混合均匀后，继续于4℃搅拌反应8小时；反应结束后，将反应液装于截流分子量500kDa的纤维素透析袋中，置于100mmol/L盐酸溶液透析120小时，得到甲基丙烯酸酐修饰后的胶原蛋白溶液；
(Ⅳ)将甲基丙烯酸酐修饰后的胶原蛋白溶液和羧甲基纤维素溶液混合均匀，得混合溶液；
(Ⅴ)在避光条件下，向混合溶液中加入0.5mol/L的NaH2PO4溶液，调节pH至5.5，于25℃加入EDC/NHS交联剂，EDC/NHS交联剂占混合溶液体积的2％，最后在反应体系中加入光引发剂，光引发剂占胶原蛋白质量的质量比为1％，于25℃继续交联48小时；
(Ⅵ)交联结束后，将反应产物铺板至透明孔板中，将透明孔板置于紫外灯下，在有效距离D＝1cm，波长365nm的条件下双面辐照30分钟；将辐照后产物于-195℃的液氮中预冷冻2小时，然后置于真空冷冻干燥机中于-50℃冷冻干燥48小时，即得胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料。
所述EDC/NHS交联剂具体使用EDC/NHS(2:1)交联剂：冰浴下溶解MES于去离子水中至饱和状态，用0.1mol/L氢氧化钠水溶液调节pH至5，得到MES缓冲液；将EDC和NHS以c(EDC)＝50mmol/L，c(NHS)＝25mmol/L依次加入MES缓冲液搅拌均匀，得到EDC/NHS(2:1)交联剂。
实施例4～8的区别在于，甲基丙烯酸酐占胶原蛋白溶液的体积比不同。
表1实施例4～8压缩强度测试表
Figure BDA0002332085740000151
从表1可以看出，当甲基丙烯酸酐占胶原蛋白溶液的体积比大于等于1％时，使用甲基丙烯酸酐改性的胶原蛋白的网络结构得到进一步增强。
实施例9～14
胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料，其制备方法包括以下步骤：
(I)将5g胶原蛋白(根据实施例1制备得到)于4℃溶解于100mL的100mmol/L盐酸溶液中，用0.1mol/L的Na2HPO4溶液调节pH至7.5，得到胶原蛋白溶液；
(Ⅱ)将5g羧甲基纤维素于37℃溶解于100mL去离子水中，用0.1mol/L的盐酸调节羧甲基纤维素溶液pH至5，得到羧甲基纤维素溶液；
(Ⅲ)在避光条件下，以滴加速度6滴/分钟向胶原蛋白溶液中加入甲基丙烯酸酐，混合均匀后，继续于4℃搅拌反应8小时；反应结束后，将反应液装于截流分子量500kDa的纤维素透析袋中，置于100mmol/L盐酸溶液透析120小时，得到甲基丙烯酸酐修饰后的胶原蛋白溶液；
(Ⅳ)冰浴下溶解MES于去离子水中至饱和状态，用0.1mol/L氢氧化钠水溶液调节pH至5，得到MES缓冲液；将EDC和NHS以c(EDC)＝50mmol/L，c(NHS)＝25mmol/L分别加入MES缓冲液搅拌均匀，分别得到EDC溶液和NHS溶液；恒定反应温度25℃，将NHS溶液加入羧甲基纤维素溶液中，NHS溶液占混合溶液体积的1％，持续搅拌反应1小时，再加入EDC溶液，EDC溶液占混合溶液体积的1％，持续搅拌反应1小时，得到修饰过的羧甲基纤维素溶液；
(Ⅴ)将甲基丙烯酸酐修饰后的胶原蛋白溶液与修饰过的羧甲基纤维素溶液混合均匀，得混合溶液；
(Ⅵ)在避光条件下，将混合液置于37℃反应24小时后，装入截流分子量500kDa的纤维素透析袋中，透析72小时除去未反应的小分子及杂质，得到胶原蛋白-羧甲基纤维素中间体；向胶原蛋白-羧甲基纤维素中间体中加入光引发剂，光引发剂占胶原蛋白的质量比为1％，于25℃继续交联24小时；
(Ⅶ)交联结束后，将反应液于转速5000转/分钟离心分离10分钟，弃上清，将所得沉淀用其重量100倍的去离子水洗涤，即为交联反应产物；将交联反应产物铺板至透明孔板中，将透明孔板置于紫外灯下，在有效距离D＝1cm，波长365nm的条件下双面辐照30分钟；将辐照后产物于-195℃的液氮中预冷冻2小时，然后置于真空冷冻干燥机中于-50℃冷冻干燥48小时，即得胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料。
所述EDC/NHS交联剂具体使用EDC/NHS(2:1)交联剂：冰浴下溶解MES于去离子水中至饱和状态，用0.1mol/L氢氧化钠水溶液调节pH至5，得到MES缓冲液；将EDC和NHS以c(EDC)＝50mmol/L，c(NHS)＝25mmol/L依次加入MES缓冲液搅拌均匀，得到EDC/NHS(2:1)交联剂。
实施例9～14的区别在于，甲基丙烯酸酐占胶原蛋白溶液的体积比不同。
表2实施例9～14压缩强度测试表
Figure BDA0002332085740000171
实施例15
胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料，其制备方法包括以下步骤：
(I)糖化：将胶原蛋白(根据实施例1制备得到)与木糖按照质量比1：4混合，加入去离子水，制成胶原蛋白浓度6mg/mL的溶液，使用质量分数1％的盐酸调节pH值为7，于60℃反应24小时；真空冷冻干燥，得到糖化胶原蛋白；
(Ⅱ)将5g糖化胶原蛋白于4℃溶解于100mL的100mmol/L盐酸溶液中，用0.1mol/L的Na2HPO4溶液调节pH至7.5，得到胶原蛋白溶液；
(Ⅲ)将5g羧甲基纤维素于37℃溶解于100mL去离子水中，用0.1mol/L的盐酸调节羧甲基纤维素溶液pH至5，得到羧甲基纤维素溶液；
(Ⅳ)在避光条件下，以滴加速度6滴/分钟向胶原蛋白溶液中加入甲基丙烯酸酐，甲基丙烯酸酐占胶原蛋白溶液的体积比为10％，混合均匀后，继续于4℃搅拌反应8小时；反应结束后，将反应液装于截流分子量500kDa的纤维素透析袋中，置于100mmol/L盐酸溶液透析120小时，得到甲基丙烯酸酐修饰后的胶原蛋白溶液；
(Ⅴ)冰浴下溶解MES于去离子水中至饱和状态，用0.1mol/L氢氧化钠水溶液调节pH至5，得到MES缓冲液；将EDC和NHS以c(EDC)＝50mmol/L，c(NHS)＝25mmol/L分别加入MES缓冲液搅拌均匀，分别得到EDC溶液和NHS溶液；恒定反应温度25℃，将NHS溶液加入羧甲基纤维素溶液中，NHS溶液占混合溶液体积的1％，持续搅拌反应1小时，再加入EDC溶液，EDC溶液占混合溶液体积的1％，持续搅拌反应1小时，得到修饰过的羧甲基纤维素溶液；
(Ⅵ)将甲基丙烯酸酐修饰后的胶原蛋白溶液与修饰过的羧甲基纤维素溶液混合均匀，得混合溶液；
(Ⅶ)在避光条件下，将混合液置于37℃反应24小时后，装入截流分子量500kDa的纤维素透析袋中，透析72小时除去未反应的小分子及杂质，得到胶原蛋白-羧甲基纤维素中间体；向胶原蛋白-羧甲基纤维素中间体中加入光引发剂，光引发剂占胶原蛋白的质量比为1％，于25℃继续交联24小时；
(Ⅷ)交联结束后，将反应液于转速5000转/分钟离心分离10分钟，弃上清，将所得沉淀用其重量100倍的去离子水洗涤，即为交联反应产物；将交联反应产物铺板至透明孔板中，将透明孔板置于紫外灯下，在有效距离D＝1cm，波长365nm的条件下双面辐照30分钟；将辐照后产物于-195℃的液氮中预冷冻2小时，然后置于真空冷冻干燥机中于-50℃冷冻干燥48小时，即得胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料。
所述EDC/NHS交联剂具体使用EDC/NHS(2:1)交联剂：冰浴下溶解MES于去离子水中至饱和状态，用0.1mol/L氢氧化钠水溶液调节pH至5，得到MES缓冲液；将EDC和NHS以c(EDC)＝50mmol/L，c(NHS)＝25mmol/L依次加入MES缓冲液搅拌均匀，得到EDC/NHS(2:1)交联剂。
实施例16
实施例16与实施例15基本相同，区别在于：将木糖替换为葡萄糖。
实施例17
实施例17与实施例15基本相同，区别在于：将木糖替换为葡萄糖和木糖以质量比1:1组成的混合物。
表3实施例15～17压缩强度测试表
Figure BDA0002332085740000191
Figure BDA0002332085740000201
本发明解决的技术问题是：胶原蛋白支架材料容易收缩并且降解速率过快，而羧甲基纤维素是一种直链型的纤维素衍生物－纤维素醚，其结构与纤维素相似，仍保留-β-葡萄糖特征结构单元，只是结构单元中的羟基被羧甲基取代，因此含有大量的羧基活性基团。本发明通过胶原蛋白进行交联并与羧甲基纤维素复合，将含有活性基团羧基的羧甲基纤维素引入胶原蛋白支架中，改善胶原支架材料的力学性能。
应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为了清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (10)

1.胶原蛋白，其特征在于，使用牛皮作为原料，制备方法包括两步骤：(一)牛皮预处理；(二)预处理后的牛皮酸法提取。
2.根据权利要求1所述的胶原蛋白，其特征在于，所述牛皮预处理过程为：
(1)修剪处理：将牛皮修剪成块，去除杂质及皮下组织后，用流动的水冲洗干净；
(2)碳酸钠溶液涨发：将修剪好的牛皮块以料液质量比1：(3～10)放入质量分数1～5％的碳酸钠溶液中，涨发10～30小时后，将牛皮块捞出，得到涨发后的牛皮；
(3)热烫脱毛：将涨发后的牛皮放入60～70℃水浴中热烫5～10分钟，然后捞出，得到热烫脱毛后的牛皮；
(4)酶处理：将热烫脱毛后的牛皮和质量分数0.3～0.5％的碱性蛋白酶液以料液质量比1:(3～10)混合，于35～55℃、pH9～11的条件下酶解1～5小时，将牛皮捞出，得到酶解后的牛皮；
(5)机械脱毛：将酶解后的牛皮使用脱毛机进行机械脱毛，得到机械脱毛后的牛皮；
(6)清洗：将机械脱毛后的牛皮用流动的水冲洗，得到清洗后的牛皮；
(7)食醋浸泡：用食醋对清洗后的牛皮以料液质量比1:(3～5)浸泡1～5小时，捞出，用流动的水冲洗至洗液呈中性，得到预处理后的牛皮。
3.根据权利要求1所述的胶原蛋白，其特征在于，所述预处理后的牛皮酸法提取过程为：将预处理后的牛皮以料液质量比1：(10～30)加入到0.2～0.5mol/L的乙酸水溶液中，溶胀10～15小时；然后用高速组织捣碎机于转速7000～12000转/分钟匀浆20～40分钟，获得匀浆液；向上述匀浆液中加入0.2～0.5mol/L乙酸水溶液作为酸提介质，料液质量比1：(10～30)，调节溶液pH至2～3，于2～4℃搅拌24～64小时，离心分离，收集上清液A和沉淀；将沉淀回收，向沉淀中再次加入0.2～0.5mol/L乙酸水溶液作为酸提介质，料液质量比1：(10～30)，调节溶液pH至2～3，于2～4℃搅拌24～64小时，离心分离，收集上清液B；将上清液A和上清液B合并，加入食盐，使得食盐的最终浓度为0.6～0.9mol/L，并不断搅拌直至析出絮状沉淀；静置12～24小时，然后离心分离，收集絮状物；将絮状物用0.2～0.5mol/L的乙酸水溶液复溶，置于0.1～0.3mol/L的乙酸水溶液中透析24～48小时，然后用蒸馏水透析2～3天，真空冷冻干燥，得到所述胶原蛋白。
4.胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料，其特征在于，将胶原蛋白和羧甲基纤维素复合，以EDC/NHS为交联剂，使羧基和氨基发生酰胺化反应，再通过冷冻干燥法制备得到胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料。
5.根据权利要求4所述的胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：
(I)将5～10g胶原蛋白于2～4℃溶解于100～300mL的10～100mmol/L盐酸溶液中，得到胶原蛋白溶液；
(Ⅱ)将5～10g羧甲基纤维素于35～37℃溶解于100～300mL去离子水中，得到羧甲基纤维素溶液；
(Ⅲ)将胶原蛋白溶液与羧甲基纤维素溶液混合均匀，得混合溶液；
(Ⅳ)向混合溶液中加入0.1～0.5mol/L的Na2HPO4溶液，调节混合溶液pH至5.0～5.5，于25～30℃加入EDC/NHS交联剂，EDC/NHS交联剂占混合溶液体积的1～5％，搅拌均匀，于25～30℃继续交联反应24～48小时；
(Ⅴ)交联结束后，将反应产物装入透析袋中，于2～4℃置于Na2HPO4溶液中透析24～72小时；透析结束后，将透析液铺板至聚四氟乙烯孔板中，先置于-195至-180℃的液氮中预冷冻1～3小时，然后置于真空冷冻干燥机中于-70至-50℃冷冻干燥24～48小时，即得胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料。
6.根据权利要求4所述的胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料，其特征在于，将胶原蛋白和羧甲基纤维素复合，加入甲基丙烯酸酐从而使双键引入胶原蛋白分子结构，以EDC/NHS为交联剂，使羧基和氨基发生酰胺化反应，并添加光引发剂进而进行光化学交联，再通过冷冻干燥法制备得到胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料。
7.根据权利要求6所述的胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：
(I)将5～10g胶原蛋白于2～4℃溶解于100～300mL的10～100mmol/L盐酸溶液中，用0.1～0.5mol/L的Na2HPO4溶液调节pH至7～7.5，得到胶原蛋白溶液；
(Ⅱ)将5～10g羧甲基纤维素于35～37℃溶解于100～300mL去离子水中，得到羧甲基纤维素溶液；
(Ⅲ)在避光条件下，向胶原蛋白溶液中加入甲基丙烯酸酐，甲基丙烯酸酐占胶原蛋白溶液的体积比为0.1～10％，混合均匀后，继续于2～4℃搅拌反应5～10小时；反应结束后，将反应液装于透析袋中，置于10～100mmol/L盐酸溶液透析60～120小时，得到甲基丙烯酸酐修饰后的胶原蛋白溶液；
(Ⅳ)将甲基丙烯酸酐修饰后的胶原蛋白溶液与羧甲基纤维素溶液混合均匀，得混合溶液；
(Ⅴ)在避光条件下，向混合溶液中加入0.1～0.5mol/L的NaH2PO4溶液，调节pH至5.0～5.5，于25～30℃加入EDC/NHS交联剂，EDC/NHS交联剂占混合溶液体积的1～5％，最后在反应体系中加入光引发剂，光引发剂占胶原蛋白的质量比为0.3～1.2％，于25～30℃继续交联24～48小时；
(Ⅵ)交联结束后，将反应产物铺板至透明孔板中，将透明孔板置于紫外灯下，双面辐照20～60分钟；将辐照后产物于-195至-180℃的液氮中预冷冻1～3小时，然后置于真空冷冻干燥机中于-70至-50℃冷冻干燥24～48小时，即得胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料。
8.根据权利要求4～7中任一项所述的胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料，其特征在于，所述EDC/NHS交联剂为EDC/NHS(2:1)交联剂或者EDC/NHS(1:1)交联剂；
所述EDC/NHS(2:1)交联剂的制备过程为：在冰浴下溶解MES于去离子水中至饱和状态，用0.1mol/L的NaOH溶液调节pH至5～6，得到MES缓冲液；随后将EDC和NHS以c(EDC)＝50mmol/L，c(NHS)＝25mmol/L依次加入，搅拌均匀，得到EDC/NHS(2:1)交联剂；
所述EDC/NHS(1:1)交联剂的制备过程为：在冰浴下溶解MES于去离子水中至饱和状态，用0.1mol/L的NaOH溶液调节pH至5～6，得到MES缓冲液；随后将EDC和NHS以c(EDC)＝50mmol/L，c(NHS)＝50mmol/L依次加入，搅拌均匀，得到EDC/NHS(1:1)交联剂。
9.根据权利要求4所述的胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：
(I)将5～10g胶原蛋白于2～4℃溶解于100～300mL的10～100mmol/L盐酸溶液中，用0.1～0.5mol/L的Na2HPO4溶液调节pH至7～7.5，得到胶原蛋白溶液；
(Ⅱ)将5～10g羧甲基纤维素于35～37℃溶解于100～300mL去离子水中，用0.1～1mol/L的盐酸调节羧甲基纤维素溶液pH至5～5.5，得到羧甲基纤维素溶液；
(Ⅲ)在避光条件下，向胶原蛋白溶液中加入甲基丙烯酸酐，甲基丙烯酸酐占胶原蛋白溶液的体积比为0.1～10％，混合均匀后，继续于2～4℃搅拌反应5～10小时；反应结束后，将反应液装于透析袋中，置于10～100mmol/L盐酸溶液透析60～120小时，得到甲基丙烯酸酐修饰后的胶原蛋白溶液；
(Ⅳ)冰浴下溶解MES于去离子水中至饱和状态，用0.1～1mol/L氢氧化钠水溶液调节pH至5～6，得到MES缓冲液；将EDC和NHS以c(EDC)＝25～50mmol/L，c(NHS)＝25～50mmol/L分别加入MES缓冲液搅拌均匀，分别得到EDC溶液和NHS溶液；恒定反应温度25～30℃，将NHS溶液加入羧甲基纤维素溶液中，NHS溶液占混合溶液体积的1～5％，持续搅拌反应1～3小时，再加入EDC溶液，EDC溶液占混合溶液体积的1～5％，持续搅拌反应1～3小时，得到修饰过的羧甲基纤维素溶液；
(Ⅴ)将甲基丙烯酸酐修饰后的胶原蛋白溶液与修饰过的羧甲基纤维素溶液混合均匀，得混合溶液；
(Ⅵ)在避光条件下，将混合液置于35～37℃反应24～48小时后，透析36～72小时，得到胶原蛋白-羧甲基纤维素中间体；向胶原蛋白-羧甲基纤维素中间体中加入光引发剂，光引发剂占胶原蛋白的质量比为0.3～1.2％，于25～30℃继续交联24～48小时；
(Ⅶ)交联结束后，将反应液离心分离，弃上清，将所得沉淀水洗，即为交联反应产物；将交联反应产物铺板至透明孔板中，将透明孔板置于紫外灯下，双面辐照20～60分钟；将辐照后产物于-195至-180℃的液氮中预冷冻1～3小时，然后置于真空冷冻干燥机中于-70至-50℃冷冻干燥24～48小时，即得胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料。
10.根据权利要求4所述的胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：
(I)糖化：将胶原蛋白与还原糖按照质量比1：(1～8)混合，加入去离子水，制成胶原蛋白浓度2～10mg/mL的溶液，使用质量分数1～10％的盐酸调节pH值为6～7，于50～60℃反应12～24小时；真空冷冻干燥，得到糖化胶原蛋白；
(Ⅱ)将5～10g糖化胶原蛋白于2～4℃溶解于100～300mL的10～100mmol/L盐酸溶液中，用0.1～0.5mol/L的Na2HPO4溶液调节pH至7～7.5，得到胶原蛋白溶液；
(Ⅲ)将5～10g羧甲基纤维素于35～37℃溶解于100～300mL去离子水中，用0.1～1mol/L的盐酸调节羧甲基纤维素溶液pH至5～5.5，得到羧甲基纤维素溶液；
(Ⅳ)在避光条件下，向胶原蛋白溶液中加入甲基丙烯酸酐，甲基丙烯酸酐占胶原蛋白溶液的体积比为0.1～10％，混合均匀后，继续于2～4℃搅拌反应5～10小时；反应结束后，将反应液装于透析袋中，置于10～100mmol/L盐酸溶液透析60～120小时，得到甲基丙烯酸酐修饰后的胶原蛋白溶液；
(Ⅴ)冰浴下溶解MES于去离子水中至饱和状态，用0.1～1mol/L氢氧化钠水溶液调节pH至5～6，得到MES缓冲液；将EDC和NHS以c(EDC)＝25～50mmol/L，c(NHS)＝25～50mmol/L分别加入MES缓冲液搅拌均匀，分别得到EDC溶液和NHS溶液；恒定反应温度25～30℃，将NHS溶液加入羧甲基纤维素溶液中，NHS溶液占混合溶液体积的1～5％，持续搅拌反应1～3小时，再加入EDC溶液，EDC溶液占混合溶液体积的1～5％，持续搅拌反应1～3小时，得到修饰过的羧甲基纤维素溶液；
(Ⅵ)将甲基丙烯酸酐修饰后的胶原蛋白溶液与修饰过的羧甲基纤维素溶液混合均匀，得混合溶液；
(Ⅶ)在避光条件下，将混合液置于35～37℃反应24～48小时后，透析36～72小时，得到胶原蛋白-羧甲基纤维素中间体；向胶原蛋白-羧甲基纤维素中间体中加入光引发剂，光引发剂占胶原蛋白的质量比为0.3～1.2％，于25～30℃继续交联24～48小时；
(Ⅷ)交联结束后，将反应液离心分离，弃上清，将所得沉淀水洗，即为交联反应产物；将交联反应产物铺板至透明孔板中，将透明孔板置于紫外灯下，双面辐照20～60分钟；将辐照后产物于-195至-180℃的液氮中预冷冻1～3小时，然后置于真空冷冻干燥机中于-70至-50℃冷冻干燥24～48小时，即得胶原蛋白与羧甲基纤维素的复合材料；
在上述过程中，所述还原糖为木糖和/或葡萄糖。
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