RO126403B1 - Procedeu pentru extracţia şi purificarea atelocolagenului biologic activ - Google Patents

Description

Invenția se referă la un procedeu pentru extracția și purificarea atelocolagenului biologic activ, caracterizat prin aceea că asigură obținerea de soluții coloidale cu înalt conținut de specii colagenice cvasi-native, capabile de renaturare după solicitări slab denaturante și apte a reconstitui structuri fibrilare similare celor din țesuturile conjunctive. în virtutea acestor proprietăți, speciile colagenice citate pot fi încorporate rapid în țesuturile vii și pot susține, in vivo și in vitro, activitatea biologică a celulelor și a lanțurilor enzimatice specifice țesuturilor conjunctive. Procedeul descris permite obținerea unor cantități de soluții coloidale de atelocolagen biologic activ de ordinul zecilor sau sutelor de litri per șarjă, fiind aplicabil la nivel semiindustrial. Soluțiile coloidale obținute conform procedeului descris sunt destinate aplicațiilor din ingineria tisulară, medicina reconstitutivă și regenerativă, chirurgia plastică și cosmetica farmaceutică, de întreținere și curativă, precum și pentru includerea în compozite utile pentru realizarea de biomateriale cu componentă scleroproteică.

Caracterul de specie scleroproteică biologic activă al atelocolagenului obținut conform procedeului descris este asigurat prin starea minimal alterată fizico-chimic și structural a macromoleculelor colagenice, acestea aflându-se sub formă unimeră sau slab multimerizată în soluția coloidală rezultată în urma extracției și purificării avansate. Fiind lipsit de tronsoanele telopeptidice care consolidează edificiul triplu helical al colagenului nativ, atelocolagenul poate suferi procese de denaturare termică și fizico-chimică, transformându-se în forme biologic inactive, lipsite de abilitatea de a se asambla supramolecularîn structuri fibrilare. Procedeul descris reduce mult posibilitatea de denaturare a atelocolagenului pe durata proceselor de obținere și de purificare, asigurând randamente ridicate în specii biologic active, chiar atunci când se lucrează în șarje cu volum ridicat, iar procesarea se extinde mult în timp.

Din literatura de specialitate și din cea de brevete, este cunoscut faptul că formele colagenice aparținând tipurilor I, II și III sunt admise și utileîn aplicații biomedicale, farmaceutice și cosmetice [Lee C. H., Singla A., Lee Y - Biomedical applications of collagen Internațional Journal of Pharmaceutics, 221 (1-2), 2001, pp. 1-22], cu condiția respectării restricțiilor privind caracteristicile sursei tisulare [M inimising the risk of transmitting animal spongiform encephalopathy agents via human and veterinary medical products European Pharmacopoeia, 5th edition (publicată în 15 Iunie 2004, validă dini ianuarie 2005), capitolul 5.2.8, p. 463-471] și a reducerii drastice a potențialului imunogenic[Knapp T. R., Luck E., Daniels J. R., Behaviour of solubilized collaen as bioimplant - Journal of Surgical Research, 23 (2), 1977, pp. 96-105], La ora actuală, pentru obținerea de soluții coloidale ale speciilor colagenice biologic active, se practică două clase de procedee de extracție din surse tisulare: (i) solubilizarea fracției de colagen nereticulat, prezentă în țesuturile conjunctive sănătoase ori afectate de latirism indus pe cale chimică, respectiv (ii) solubilizarea hidrolitică protejată a colagenului fibrilar din structurile de agregare supramoleculară, consolidate prin punți de reticulare covalente. Prima clasă de procedee implică utilizarea unor volume ridicate de soluții ale unor electroliți salini sau slab acizi și furnizează forme colagenice intacte structural, asemănătoare tropocolagenului, darasigură randamente de extracție reduse [Chandrakasan G., Torchia D. A., Piez K. A. - Preparation of Intact Monomeric Collagen from Rat Tail Tendon and Skin and the Structure of the Nonhelical Ends in solution - The Journal of Biological Chemistry, 251 (19), 1976, p. 6062-6067], [Glimcher M. J., Seyer J., Brickley D. M. - The Solubilization of Collagen and Protein-Polysaccharides from the Developing Cartilage of Lathyritic Chicks Biochemical Journal, 115,1969, pp. 923-926], De aceea, respectivele procedee nu sunt fezabile decât la nivel de laborator. O variantă îmbunătățită prin prisma randamentelor de extracție face apel la agenți liotropi neionici [Xiong X., Ghosh R., Hiller E., Derpper F.,

RO 126403 Β1

Knapp B., Brunner H., Rupp S., A new procedure for rapid, high yield purifdication of 1

Type I collagen fortissue engineering, Process Biochemistry, 44,2009, pp. 1200-1212], dar impune lucrul cu concentrații ridicate ale acestora, fapt care creează probleme semnificative 3 la tratarea apelor uzate. Din acest motiv nici această variantă nu este fezabilă la nivel (semi)industrial. Cea de-a doua clasă de procedee implică scindarea hidrolitică a punților de 5 reticulare intermoleculară, ori a tronsoanelorîn care acestea sunt localizate, conducând întotdeauna la obținerea de forme colagenice cvasi-native, de regulă lipsite de telopeptide, numite 7 convențional atelocolagen. Macromoleculele de atelocolagen prezintă o relativă polidispersitate a caracteristicilor compoziționale, structurale și morfologice, urmare a gradului variabil în care 9 edificiul macromolecular le este afectat în cursul tratamentelor de scindare hidrolitică. Atunci când formele atelocolagenice au abilitatea de a se renatura, adică de a reface și menține 11 structura triplu-helicală pe întregul tronson central al macromoleculei, ele posedă un grad de cvasi-nativitate suficient pentru a deveni utile în aplicații biomedicale, farmaceutice și 13 cosmetice, precum și în ingineria tisulară. Solubilizarea pe cale hidrolitică a macromoleculelor de atelocolagen din agregatele supramoleculare fibrilare se poate realiza utilizând agenți 15 chimici energici, bazici și/sau reducători [US 4592864/1986], [US 4983721/1991], ori enzime proteolitice nespecifice colagenului [US 5316942/1994], [EP 1270672/2003], Accelerarea și 17 extinderea amplorii proceselor hidrolitice se poate realiza prin energizare ultrasonică [Li D.,

Mu C., Cai S., Lin W., Ultrasonic irradiation in the enzymatic extraction of collagen - 19

Ultrasonics Sonoche-mistry, 16,2009, pp. 605-609], astfel încât randamentele globale de solubilizare pot fi crescute fără diminuarea semnificativă a capacității de renaturare a atelocola- 21 genului. Dezavantajul major al procedeelor de obținere a atelocolagenului prin solubilizare hidrolitică rezidă în faptul că, atunci când sunt aplicate la nivel (semi)industrial, oferă randa- 23 mente deosebit de scăzute în forme biologic active, iar în plus, conduc la o polidispersitate ridicată a caracteristicilor macromoleculare ale atelocolagenului. Drept consecință, în vederea 25 separării eficiente și a purificării avansate a formelor de atelocolagen biologic active, trebuie să se pornească de la volume mari de soluții coloidale astfel obținute, fapt care diminuează 27 sever randamentele economice ale respectivelor procese.

O serie de tehnici și metode speciale pentru pregătirea surselor tisulare [Maier S. S., 29

MaierV., Bucișcanu I, Pruneanu M., Prelucrarea preliminară a surselor colagenice în vederea extracției colagenului minimal denaturat, Revista Medico-Chirurgicală a 31 Societății de Medici și Naturaliști din lași, 111 (2), 2007, pp. 544-548] și pentru izolarea [EP 1637037/2006; US 7498412/2009], solubilizarea [Etherington D. J. - The dissolution 33 of insoluble bovine collagens by cathepsin B1, collagenolytic cathepsin and pepsin.

The influence of collagen type, age and chemical purity on susceptibility - Connective 35 Tissue Research, 5 (3), 1977, pp. 135-145], extragerea și purificarea [RO 123256/2011] atelocolagenului sunt descrise în literatura științifică ori de brevete. Respectivele tehnici și 37 metode vizează preponderent colagenul dermic, urmăresc obținerea de forme solide decelularizate, recurg la agenți chimici agresivi ori costisitori, sau implică un număr mare de specii 39 chimice adjuvante, ceea ce impune operații speciale de izolare și purificare. De asemenea, ele fie sunt slab selective, fie includ serii lungi de operații, fapt ce conduce la randamente 41 satisfăcătoare doar la scară mică de procesare, în general la nivel de laborator.

Problema pe care o rezolvă invenția este legată de obținerea, în condiții de lucru la 43 nivel (semi)industrial, a unor soluții coloidale concentrate de atelocolagen biologic activ, care pot fi ușor purificate, astfel încât randamentele chimice de ansamblu ale proceselor de 45 extracție și purificare se apropie de cele atinse la nivel de laborator, iar randamentele economice de ansamblu sunt net superioare celor asigurate de alte procedee de extracție 47 prin solubilizarea hidrolitică a atelocolagenului.

RO 126403 Β1 în principiu, procedeul pentru extracția și purificarea atelocolagenului biologic activ pornind de la tendoane de bovine sau de păsări, procedeu care face obiectul prezentei invenții, implică parcurgerea următoarelor etape (acolo unde nu se specifică în mod expres, operațiile se efectuează la temperatura ambientală, care nu va depăși însă plaja 15-^25°C):

i - prelevarea sursei tisulare de colagen matur, reprezentată de tendoanele călcâiului bovinelor tinere sau de tendonul flexor al degetelor piciorului de găină;

ii - formarea de loturi cu mase egale, care vor parcurge apoi în paralel operațiile de preprocesare, solubilizare hidrolitică și purificare;

iii - tratarea loturilor cu agenți de sterilizare generală, în vederea stopării activității microorganismelor prezente în eșantioanele de țesut, utilizând antibiotice și/sau azidă de sodiu;

iv - congelarea în vederea stocării, realizată prin imersarea în amestec crioprotector, urmată de subrăcire la - 20°C, sau mai jos;

v - decongelarea în vederea procesării, prin imersare în soluție apoasă tamponată în plaja neutră sau slab alcalină;

vi - deshidratarea superficială controlată I, în vederea înlesnirii curățării fasciilor epitendonare, prin menținere în amestec de săruri solide, la rece, timp de 3-H5 h;

vii - îndepărtarea mecanică a fasciilor epitendonare, prin periere energică utilizând perii rotative cu fire din material plastic;

viii - spălarea cu soluție alcoolică 20%, în vederea îndepărtării aderențelor și a eventualelor materii grase;

ix - strivirea mecanică prin trecerea printre tamburi metalici, în vederea labilizării fasciculelor colagenice reținute în tecile epi- și endo-tenoanelor;

x - maturarea în stare strivită, la rece, în vederea relaxării mecanice a țesutului;

xi - destructurarea mecanică prin periere, utilizând perii rotative cu fire din oțel inoxidabil, soldată cu eliberarea fizică a fasciculelor de tendon;

xii - spălarea cu soluție alcoolică 20%, în vederea îndepărtării impurităților și a porțiunilor excesiv franjurate;

xiii - deshidratarea superficială controlată II, în vederea înlesnirii defibrării chimice a fasciculelor de fibre colagenice ale tendonului, realizată prin menținere în soluție de alcool etilic, și tensioactiv neionogen biotolerabil;

xiv - rehidratarea prin șocuri succesive hiper- și hipo-tone, în vederea inițierii defibrării chimice și a solubilizării componentelor necolagenice, prin tratamente repetate în soluție salină urmate de spălare abundentă în soluție de inhibitori enzimatici și antibiotice;

xv - solubilizarea proteinelor nestructurate și a colagenului denaturat, prin hidroliză enzimatică utilizând o protează nespecifică;

xvi - eliminarea debriurilor celulare și tisulare, prin tratament oxidant în mediu puternic acid și în prezența tensioactivilor neionogeni nondenaturanți;

xvii - defibrarea fizico-chimică prin relaxare tisulară sub salturi succesive de pH, realizată prin tratarea fasciculelor de tendon, alternant, în soluții tampon cu pH-uri slab alcaline și slab acide, situate în plaja pH-ului izoelectric al colagenului;

xviii - eliminarea glicoz-amino-glicanilor prin tratament enzimatic, utilizând condroitinaza ABC (EC 4.2.2.4, extrasă din Proteus vulgarisy, xix - umflarea acidă a fasciculelor de tendon, în vederea suprahidratării și a expandării maxim posibile a structurilor colagenice fibrilare, pentru pregătirea solubilizării rapide și eficiente a colagenului;

xx - obținerea atelocolagenului prin solubilizare enzimatică utilizând o protează nespecifică, de tipul pepsinei, papainei sau pronazei, aptă a scinda telopeptidele la nivelul cărora se regăsesc punțile covalente de reticulare intermoleculară în colagenul matur;

RO 126403 Β1 xxi - separarea avansată a atelocolagenului astfel obținut, prin tehnici de precipitare 1 selectivă, urmată de resuspendări și reprecipitări în condiții diferite, până la izolarea fracțiilor biologic active, de interes;3 xxii - purificarea avansată prin microfibrilare controlată, în vederea separării efective a fracțiilor atelocolagenice capabile de restructurare;5 xxiii - resolubilizarea atelocolagenului microfibrilat, pentru generarea de soluții coloidale cu caracteristicile impuse de gama de aplicații vizată;7 xxiv - condiționarea biochimică finală a soluției coloidale de atelocolagen biologic activ, în vederea stocării și/sau a pregătirii pentru utilizare în sferele ingineriei tisulare, 9 biomedicală, farmaceuticii ori cosmeticii.

Conform prezentei invenții, stabilirea concentrației de forme biologic active în soluția 11 atelocolagenică purificată, se realizează prin evaluarea abilității de reconstituire a edificiilor microfibrilare, precum și prin determinarea cantitativă a fracției de atelocolagen triplu-helical, 13 apelând la tehnica legării coloranților afini pentru colagenul nativ.

Formele de atelocolagen biologic activ, obținute conform descrierii din prezenta 15 invenție, își mențin neschimbate caracteristicile timp de cel puțin un an, dacă sunt stocate la 4+8°C, în condiții sterile, la întuneric și în absența vibrațiilor ori șocurilor mecanice intense. 17 Prezenta invenție descrie un procedeu pentru extracția și purificarea atelocolagenului biologic activ, aplicabil tendoanelor mamiferelor tinere, ce constă în parcurgerea succesivă 19 a următoarelor șase etape: (i) preprocesarea tendoanelor, ca surse tisulare de colagen, (ii) defibrarea avansată a tendoanelor anterior destructurate mecanic și decapate enzimatic și 21 chimic, (iii) solubilizarea enzimatică a atelocolagenului biologic activ, (iv) purificarea primară a atelocolagenului biologic activ, (v) purificarea avansată a atelocolagenului biologic activ, 23 (vi) condiționarea finală a formelor de atelocolagen biologic activ, funcție de aplicația vizată, caracterizat prin aceea că: 25

- preprocesarea tendoanelor se realizează în următoarea succesiune: destructurare mecanică, deshidratare controlată, rehidratare prin șocuri succesive hiper- și hipo-tone, 27 decaparea enzimatică a fasciculelor de fibre colagenice prin hidroliza proteinelor nefibrilare și a formelor denaturate, decaparea chimică a fasciculelor de fibre colagenice prin eliminarea 29 debriurilor celulare și a speciilor biochimice mic-moleculare, în mediu acid oxidant și în prezența tensioactivilor; 31

- defibrarea avansată a tendoanelor se realizează pe cale fizico-chimică, prin salturi succesive de pH în raport cu pH-ul izoelectric al colagenului nativ, pentru a rupe legăturile 33 de hidrogen înalt ordonate din structura fibrelor colagenice;

- purificarea avansată a atelocolagenului biologic activ se realizează prin microfibri- 35 lare, proces care selectează doar macromoleculele de atelocolagen intacte și capabile de agregare supramoleculară ordonată, separându-le de formele denaturate ori afectate de 37 hidroliză la nivelul domeniului triplu helical.

Procedeul de obținere a atelocolagenului biologic activ, conform prezentei invenții, 39 prezintă următoarele avantaje:

- asigură concentrații ale formelor atelocolagenice biologic active, triplu-helicale, de 41 peste 92% în soluția finală; valorile medii obținute uzual sunt de 95 ± 2,2%;

- asigură randamente masice de peste 21 %, calculate raportând substanța proteică 43 a soluției finale la substanța proteică a sursei colagenice (tendonul de la care se pornește); valorile medii uzuale ale randamentului masic pentru procedeul descris sunt de 24 ± 1,8%; 45

- asigură eliminarea fracțiilor proteice necolagenice, polizaharidice și lipidice prezente în țesutul de start; 47

RO 126403 Β1

- asigură eliminarea efectelor cito-toxice ale componentelor soluției finale, făcând-o aptă utilizărilor în ingineria tisulară și în medicina regenerativă;

- asigură eliminarea efectelor imunogene, patogene și inflamatorii ale soluției finale, făcând-o aptă utilizărilor biomedicale;

- asigură menținerea caracteristicilor formelor atelocolagenice triplu-helicale cvasinative pe o durată de cel puțin un an, în condiții adecvate de stocare.

Exemple de aplicare a procedeului descris în invenție

Descrierile ce urmează au titlu exemplificativ din următoarele puncte de vedere:

- natura și cantitățile de specii chimice (reactivi și/sau adjuvanți) utilizate;

- parametrii de operare (timpi, temperaturi, pH-uri, regimuri hidrodinamice ale agitării, condiții de precipitare, centrifugare, filtrare/diafiltrare, rapoartele de amestecare, modul de maturare, regimurile de termostatare);

- ordinea, cadența, repetarea proceselor și operațiilor din fluxul de procesare.

Toate elementele enumerate admit variații ce țin de preprocesarea surselor colagenice, de senile de specii chimice utilizate (similare acțiunii, rolului și eficacității în raport cu cele incluse în descrierile exemplificative) și de plajele uzuale de lucru.

Exemplele vizează procesarea la nivel semi-industrial și industrial a tendoanelor călcâiului mamiferelor tinere, în special al bovinelor sau cabalinelor tinere (cel puțin 2 luni, pentru a avea dimensiunile minime necesare prelucrării și cel mult 18 luni, pentru a avea un conținut redus de proteine necolagenice și de structuri morfologice rezistente la hidroliză). Se preferă tendoanele tendo calcaneus communis, tendo tricipitis surae, tendo peronei tertii, tendo flexoris digitorum superficialis, tendo flexoris digitorum lungus. Se evită utilizarea tendoanelor puternic dezvoltate, dată fiind fracția ridicată a structurilor morfologice de tipul epi- și endo-tenoanelor. Pentru asigurarea fezabilității procesării la nivel semiindustrial, loturile medii sunt de 20-430 kg per șarjă, funcție de dimensiunile medii ale tendoanelor prelevate. Pentru lucrul la nivel pilot, loturile medii vor reprezenta a cincea parte, iar pentru lucrul la nivel de laborator, acestea vor reprezenta a optzecea parte.

Exemplul 1. Obținerea soluțiilor col oi da le de atelocolagen tip I, biologic activ.

Exemplul 1.1. Fluxul operațiilor de preprocesare a tendoanelor.

Se pornește de la tendoane de mamifer tânăr, având masa totală, după prelevare, de circa 4 kg, împărțite în loturi de câte 0,5 kg, în vederea preprocesării. Acestea se supun spălării cu flotă de 400% soluție de sare industrială cu concentrația de 5 g/L, la 164-25°C, timp de 304-60 min, prin agitare în butoi tăbăcăresc din oțel inoxidabil. Dacă se prevede stocarea tendoanelor prelevate, într-o nouă flotă salină cu aceleași caracteristici, se adaugă 0,3 g/L Na₄EDTA, 10000 IU/L Penicilină G, 100 mg/L Streptomicină și 0,25 mg/L Amfotericină B complex cu polivinilpirolidonă, iar tratamentul se prelungește la 6 h, sub agitare. După scurgerea flotei, tendoanele, depuse pe grătare din oțel inoxidabil, se zvântă prin suflare cu aer rece, filtrat. în vederea stocării prin congelare, loturile de tendoane se închid sub vid, în pungi din polietilenă, alături de 100% v/m amestec crioprotector ce conține apă: glicerină: alcool etilic în rapoartele 50:30:20, urmând a fi subrăcite la - 20°C. în stare congelată, tendoanele astfel procesate se pot stoca 3 până la 6 luni. în vederea decongelării, loturile de tendoane se imersează în soluție de 7 g/L acetat de amoniu și se mențin la 4°C, timp de 364-48 h, după care se clătesc de trei ori cu 400% apă deionizată, iar apoi se zvântă, depuse fiind pe grătare din oțel inoxidabil, prin suflare cu aer rece, filtrat.

Tendoanele zvântate se curăță de porțiunile inutile ale capetelor și se presară abundent cu un amestec solid de 30% NaCI, 60% Na₂SO₄ și 10% acetat de amoniu, menținându-se apoi la 4°C, timp de 34-5 h. în continuare, fasciile superficiale ale tendoanelor se îndepărtează prin periere cu perii rotative având fire semirigide din material plastic.

RO 126403 Β1

Tendoanele curățate se spală apoi în 400% flotă de 20% alcool etilic, prin agitare timp de 1 30+45 min. Flota alcoolică se recuperează și se filtrează, în vederea utilizării în operația ulterioară. Tendoanele curățate se supun strivirii între valțuri metalice din oțel inoxidabil, sub 3 jet de flotă alcoolică recuperată, cu recircularea acesteia din urmă. Tendoanele astfel strivite se mențin 16+36 h, la 4°C, acoperite cu folie din polietilenă, iar apoi se zvântă prin suflare 5 cu aer rece, filtrat. Tendoanele zvântate se destructurează individual, prin periere energică, utilizând perii rotative cu fire din oțel inoxidabil, sub jet intens de apă răcită la 2+5°C. 7

Fasciculele rezultate în urma destructurării se spală abundent cu apă deionizată, pe site din oțel inoxidabil, iar apoi se presează, se cântăresc și se suspendă în 600% flotă de 20% 9 alcool etilic, menținându-se sub agitare lentă, la 4°C, timp de 3+6 h. în continuare, suspensia se decantează, se filtrează pe site din oțel inoxidabil, iar fracția reținută se spală pe sită 11 utilizând flota alcoolică recuperată, care, anterior, a fost filtrată peste filtre ceramice cu pori având diametrul echivalent de 200 microni. Aceeași soluție alcoolică se recuperează din nou, 13 se filtrează în aceleași condiții, i se ajustează volumul la 600% cu soluție alcoolică de 20%, i se adaugă 1% Triton X 100 și 0,8% Na₄EDTA și apoi în ea se introduc fasciculele 15 destructurate din tendon, suspensia menținându-se sub agitare moderată, timp de 3+9 h, la temperatura ambientală. 17

Exemplul 1.2. Fluxul operațiilor de defibrare fizico-chimică.

Suspensia obținută la finalul fluxului prezentatîn exemplul 1.1 se decantează, se 19 centrifughează, iar apoi fracției solide i se aplică șocuri hiper- și hipo-tone, prin repetarea de trei ori, sub agitare moderată, a tratamentului în 600% soluție salină ce conține 10% NaCl, 21 10% Na₂SO₄, 6% acetat de amoniu, urmat de spălare abundentă pe site din oțel inoxidabil și agitare moderatăîn 600% soluție de inhibitori enzimatici (4,5 g/L Na₄EDTA (CAS 8013-51-2), 23 g/Lacid 6-amino-hexanoic(CAS60-32-2), 0,6 g/L benzamidină (CAS618-39-3) și 1,25 g/L N-etil-maleimidă (CAS 128-53-0) și antibiotice (10000 IU/L Penicilină G sare de sodiu (CAS 25 69-57-8), 120001 U/L Streptomicină sulfat (CAS 3810-74-0)); ambele tratamente se întind pe durata a câte 12 h, la temperaturi de 2+8°C. La final, fasciculele destructurate se spală 27 abundent pe filtru, cu jet de apă deionizată ce se încălzește progresiv, până la 37°C.

în continuare, fasciculele destructurare se supun labilizării și curățării enzimatice într-o 29 flotă de 600%, anterior preparată, ce conține 0,05+0,15% m/v tripsină, 4% NaHCO₃ și 0,2% Na₄EDTA, încălzită la 32+35°C. Tratamentul durează 60+90 min, sub agitare eficientă și este 31 urmat de o spălare abundentă pe filtru, pe durata a 15+30 min, utilizând apă deionizată slab acidulată lapH 5, încălzită la 35+38°C. Soluția slab acidă se poate recircula. La final, fasciculele 33 destructurate se zvântă pe filtru ceramic, sub vid moderat.

în vederea eliminării debriurilor celulare, fasciculele de tendon se suspendă într-o 35 flotă de 600% ce conține 1,5% acid peracetic și 2% Triton X 100, agitîndu-se moderat, la 32+35°C, timp de 4 h. La final, fasciculele de tendon se aduc la pH neutru, prin spălare 37 abundentă pe filtru ceramic, urmată de agitare în flotă de 400% tampon fosfat, la pH 7,8, timp de 1 h. 39 în continuare, fasciculele de tendon se supun defibrării chimice sub salturi succesive depH, agitându-le lent, alternant, câte 3+8 h, în 400% soluție tampon fosfat cu pH 7,8 și apoi 41 în 400% soluție tampon citrat cu pH 3,4, intercalând clătiri eficiente cu apă deionizată. Se aplică 3+9 astfel de salturi de pH, ultimul efectuându-se în tampon fosfat. După o clătire 43 abundentă cu apă deionizată rece, fasciculele de tendon se mențin static în 600% apă deionizată, timp de 16+24 h, la temperatura de 4+10°C. 45

Pentru eliminarea glicoz-amino-glicanilor, fasciculele de tendon se introduc în 600% flotă de 8+24 g/L acetat de amoniu, cu pH-ul corectat la 7,3+8,0. Temperatura flotei se aduce 47 lent la 32+35°C, iar apoi se adaugă 60+1201 U/L condroitinază ABC. Tratamentul se conduce

RO 126403 Β1 pe durata a 3-45 h, sub agitare eficientă, urmărind menținerea constantă a valorii pH-ului flotei. La final, pentru inhibarea enzimei, în flota de tratare se adaugă 0,24-0,5 g/L ZnCI₂-2 H₂O, continuând agitarea încă o oră, după care fasciculele de tendon se clătesc abundent, cu 600% apă deionizată rece, timp de 1 h, schimbând flota de minimum patru ori în acest interval de timp. Din ultima flotă de clătire, fasciculele de tendon se decantează și apoi se zvântă pe filtru ceramic, sub vid moderat.

Exemplul 1.3. Fluxul operațiilor de solubilizare a atelocolagenului biologic activ.

Fasciculele de colagen avansat defibrate, rezultate la finalul fluxului prezentat în exemplul 1.2, se suspendă în 1000% soluție 0,01 M acid clorhidric chimic pur și se mențin sub agitare eficientă, la 4°C, pe durata a 484-72 h, cu eventuale corecții ale pH-ului la valoarea 2,0, prin adaos de soluție 1 M acid clorhidric chimic pur. La fiecare 12 h, suspensia vâscoasă ce rezultă se supune laminării prin trecere repetată peste site din fir de oțel inoxidabil cu ochiuri de 1,5 x 1,5 mm, urmată de filtrare repetată prin filtre ceramice cu pori având diametrul mediu de 200 microni. Filtratul acid se colectează succesiv și se reține, iar fracțiile gonflate se introducîntr-o nouă flotă acidă, cu aceleași caracteristici. Reziduul rămas după ultimul tratament gonflant se îndepărtează.

Filtratele acide reunite, ce conțin forme colagenice și debriuri tisulare cu dimensiuni coloidale, se supun tratamentului enzimaticîn vederea obținerii atelocolagenului. în acest sens, filtratul acid se termostatează la temperaturi între 20 și 35°C, sub agitare lentă, i se adaugă 0,01 % azidă de sodiu, iar apoi se dozeză, în fir subțire, sub agitare continuă, o soluție de 14-2,5 g/L pepsină, într-un volum care să asigure, la final, o concentrație de 64-18% pepsină activă în flota de solubilizare. Tratamentul enzimatic se conduce, în condiții de termostatare și agitare eficientă, timp de 64-36 h, funcție de temperatura de lucru. La final, flota se laminează prin trecere repetată peste site din fir de oțel inoxidabil cu ochiuri de 1,5 x 1,5 mm, apoi se filtrează repetat prin filtre ceramice cu pori având diametrul mediu de 200 microni. Soluției coloidale rezultate în urma filtrării i se adaugă, sub agitare eficientă, 50 g/L NaCI sub formă solidă și 6 g/L tris(hidroximetil)-aminometan (CAS 77-86-1), apoi se termostatează la 4-M 0°C și se aduce la pH 7,5 prin neutralizare lentă cu soluție 4 M NaOH. După stabilizarea pH-ului, sistemul coloidal format se menține static, la 44-10°C, timp de 44-12 h, pentru precipitarea pepsinei și pentru separarea fracțiilor proteice supraagregate. La final, sistemul coloidal se decantează, reținând supernatantul, iar suspensia se filtrează, în cascadă, peste filtre ceramice cu pori având diametrul echivalent de 200,100 și 30 microni, reținând filtratul. Supernatantului anterior separat i se aplică aceeași filtrare în cascadă, iar apoi cele două filtrate se reunesc și se supun centrifugării la 7000 g, îndepărtând sedimentul.

Exemplul 1.4. Fluxul operațiilor de purificare primară a atelocolagenului biologic activ.

Supernatantul rezultat la finalul fluxului prezentat în exemplul 1.3 se termostatează la 4-45°C, se aduce la pH 2,5, utilizând soluție 20% HCI în apă deionizată, iar apoi i se adaugă, sub agitare eficientă, 70 g/L NaCI sub formă solidă. Suspensia formată în urma solubilizării sării se supune maturării, la 4-45°C, timp de 64-18 h, iar apoi se centrifughează la 7000 g, îndepărtând sedimentul. Supernatantul se aduce la pH 7,5 utilizând soluție 20% NaOH și apoi i se adaugă, sub agitare eficientă, alte 30 g/L NaCI sub formă solidă. Suspensia formată se maturează și se centrifughează în aceleași condiții, reținând atât sedimentul, cât și supernatantul. Din sediment se poate recupera atelocolagenul de tip III. în supernatant se adaugă, sub agitare eficientă, alte 45 g/L NaCI sub formă solidă, iar suspensia formată se maturează și se centrifughează în aceleași condiții, reținând sedimentul, în vederea izolării atelocolagenului de tip I, sedimentul se suspendă și se dizolvă în 1000% soluție 0,1 M NaOH și 0,1 M Na₄EDTA, termostatată la 4-45°C, menținând sub agitare soluția

RO 126403 Β1 coloidală formată, timp de 60180 min. La final, soluția termostatată se acidifiază lent, până 1 la pH 2,5, adăugând în picături soluție 0,5-M,0 M HCI. în aceleași condiții de termostatare, în soluția acidă se adaugă o soluție saturată de NaCl, într-un volum egal cu o treime din cel 3 al soluției acide. Precipitatul format se supune maturării timp de 6-M2 h la temperaturi de 104-15°C, în condiții statice, iar apoi se separă prin centrifugare la 7000 g, reținând 5 sedimentul. Acesta din urmă se resuspendă în 1000% soluție 0,01 M HCI, preparată utilizând apă deionizată liberă de pirogeni, termostatată la 4-^10°C. După completa solubilizare a 7 atelocolagenului, soluția coloidală obținută se filtrează peste filtre sterile cu diametrul echivalent al porilor de 30 microni, iar apoi se supune diafiltrării prin membrane cu limita de 9 trecere de 100 kDa, asigurând schimbarea a 5-^9 volume de soluție 0,01 M HCI, preparată utilizând apă deionizată liberă de pirogeni, răcită la 4-M0°C. La final, soluția coloidală de 11 atelocolagen biologic activ se supune maturării statice, timp de 24-^36 h, la 4-M0°C, în condiții sterile. După maturare, din soluția coloidală se prelevă probe în vederea stabilirii 13 concentrației în atelocolagen și a fracției de atelocolagen cvasi-nativ, prin determinarea azotului total și, respectiv, pe cale polarimetrică sau fotocolorimetrică, în acest din urmă caz 15 utilizând kitul SIRCOL®. în funcție de concentrația efectivă în atelocolagen biologic activ, soluția purificată se aduce la un conținut de 1,2-M,6 g/L atelocolagen cvasi-nativ, prin diluare 17 cu soluție 0,01 M HCI, preparată utilizând apă deionizată liberă de pirogeni și răcită la 4-M0°C. La concentrațiile specificate, soluțiile astfel obținute se pot stoca, în condiții sterile, 19 la 44-8°C, timp de cel puțin un an. Dacă stocarea se realizează în vase cu volume mari, de peste 50 de litri, pe durate mai lungi decât un an, la fiecare patru luni depășire, se reco- 21 mandă o repurificare efectuată conform descrierilor din exemplul 2.

Exemplul 2. Purificarea prin microfibrilare a atelocolagenului biologic activ. 23 în vederea purificării avansate a soluțiilor coloidale de atelocolagen tip I, biologic activ sau pentru repurificarea acestora după perioade de stocare ce depășesc un an, cu mai mult 25 decât patru luni, volumul de soluție avut în vedere se împarte mai întâi în porții de 5+50 L, pentru a permite controlul precis al parametrilor de lucru. Apoi, soluția coloidală ce urmează 27 a fi purificată avansat se termostatează la 5 ± 1°C. în continuare, prin diafiltrare, aciditatea soluției se neutralizează lent, prin schimbarea progresivă a mediului de dispersie (care inițial 29 este soluția 0,01 M HCI) cu soluții ale aceluiași acid având însă pH-ul crescut cu câte o unitate la fiecare volum schimbat prin diafiltrare. Soluțiile utilizate se termostatează și ele la 31 5 ± 1°C. După ce se atinge valoarea 5 a pH-ului, mediul de dispersie se schimbă, prin diafiltrare cu tampon fosfat (1/15 M Na₂HPO₄ și 1/15 M KH₂PO₄) având pH-ul de 7,6 ± 0,2 33 unități și tăria ionică de 0,183 M. în ultimul volum de tampon, tăria ionică se ridică la 0,983 M, prin adaos de soluție 330 g/L NaCl într-un volum care asigură o concentrație de 0,8 M NaCl 35 în soluția tampon. Soluția coloidală de atelocolagen astfel condiționată chimic se supune, în condiții statice, încălzirii lente, cu o pantă de 0,01+TC/min, funcție de volumul luat în lucru, 37 până la 30 ± 2°C, urmărind formarea flocoanelor de atelocolagen microfibrilar reconstituit.

După atingerea temperaturii prescrise, sistemul coloidal se menține spre maturare statică, 39 sub termostatare, timp de 2-43 h. La final, temperatura suspensiei se reduce lent, cu aceeași pantă de 0,01+TC/min, până la 10 ± TC. La această temperatură atelocolagenul micro- 41 fibrilat se separă prin centrifugare la 7000 g, reținând sedimentul. Acesta din urmă se spală apoi, în centrifugă, cu soluție de tampon fosfat ce are pH-ul de 7,6 ± 0,2 unități și tăria ionică 43 de 1,43, similară celei anterior folosită, utilizând un volum egal cu cel al soluției coloidale de atelocolagen inițial luată în lucru. La final, sedimentul se ampastează și se resuspendă în 45 soluție 0,01 M HCI chimic pur, preparată utilizând apă demineralizată și liberă de pirogeni, asigurându-se atingerea unui volum egal cu cel al soluției coloidale de atelocolagen inițial 47 luată în lucru. După completa solubilizare a atelocolagenului purificat, soluția coloidală

RO 126403 Β1 obținută se filtrează peste filtre sterile cu diametrul echivalent al porilor de 30 microni, iar apoi se supune diafiltrării prin membrane cu limita de trecere de 100 kDa, asigurând schimbarea a 5+9 volume de soluție 0,01 M HCI, preparată utilizând apă deionizată liberă de pirogeni, răcită la 4+10°C și sterilizată prin ultrafiltrare.

Exemplul 3. Condiționarea finală a formelor de atelocolagen biologic activ.

Funcție de gama de aplicații întrevăzută pentru atelocolagenul biologic activ, soluțiile coloidale purificate, obținute conform descrierilor din exemplul 2, sau forme derivate din acestea, se supun condiționării chimice și biochimice.

Exemplul 3.1. Condiționarea în vederea utilizării în cosmetică.

Vizează pregătirea atelocolagenului biologic activ în vederea includerii sale în hidrogeluri sau creme emoliente, sub formă dispersată sau încapsulată în lipozomi. în acest sens, se pornește de la o formă atelocolagenică derivată din soluțiile coloidale obținute conform descrierilor din exemplul 2, respectiv, o pastă cu înalt conținut de apă. Aceasta se prepară prin microfibrilarea atelocolagenului biologic activ, urmând indicațiile din exemplul 2, până la spălarea sedimentului în centrifugă, cu soluție de tampon fosfat ce are pH-ul de 7,6 ± 0,2 unități și tăria ionică de 1,43. în continuare, sedimentul se separă, se depune în tăvi scunde din polipropilenă, anterior sterilizate, iar apoi se supune, în condiții sterile, vibrării cu frecvența de 30+150 Hz și amplitudinea de 0.1+0,5 mm, timp de 20+60 min, în vederea eliminării apei de imbibiție excesivă, care se îndepărtează continuu pe la un colț înclinat al tăvii. Pasta rezultată se supune maturării sub vid moderat, la 4+10°C, timp de 6+12 h, în condiții sterile. Apoi, pasta se cântărește și i se determină conținutul de substanță uscată, după care se introduce într-un malaxor steril și termostatat la 4+10°C, în care s-a dozat 6+18% glicerină pură, raportat la masa de pastă umedă. După o malaxare preliminară, în pasta omogenizată se dozează un amestec anterior preparat ce conține: 50+80% glicerină pură, 4+12% propilenglicol izostearat (CAS 32057-15-1), 9+18% propilenglicol dioleat (CAS 105-62-4), 10+25% decil-metil-sulfoxid (CAS 3079-28-5) și 1,5+5% 2-brom-2-nitropropan1,3-diol (CAS 52-51-7), amestec în care cantitățile s-au calculat prin raportare la substanța uscată a pastei luată în lucru. Se aplică apoi o malaxare eficientă, în condiții de termostatare la 10+15°C, timp de 45+120 min, îndepărtând apa care se separă. Pasta rezultată se ultrasonează sub termostatare eficientă, timp de 10+30 min, la 22 kHz și o putere ultrasonoră de 350 W, îndepărtând și de această dată apa care se separă. La final, pasta se supune maturării sub vid moderat, la 4+10°C, timp de 6+12 h, în condiții sterile. Produsul rezultat se împachetează, sub vid, în pungi din polietilenă de înaltă densitate, sterilizate anterior prin expunere la radiație ultravioletă germicidă (200+280 nm, 200 W), timp de 15+90 min. Pasta se poate stoca, la temperaturi de 10+15°C, timp de 30+90 de zile, iar la temperaturi pozitive de sub 5°C și în lipsa vibrațiilor excesive, timp de cel puțin un an.

Exemplul 3.2. Condiționarea în vederea utilizării în ingineria tisulară.

Vizează pregătirea soluțiilor coloidale de atelocolagen biologic activ pentru generarea de hidrogeluri și/sau de substraturi solide poroase, destinate obținerii de medii pentru cultivarea celulelor și liniilor celulare umane, specifice țesuturilor conjunctive. Se realizează pornind de la soluțiile coloidale obținute conform descrierilor din exemplele 1.4 și 2, cărora li se adaugă, prin dializă sau prin diafiltrare, specii de interes biochimic în sprijinirea dezvoltării ex vivo a celulelor. într-o primă etapă, soluția coloidală de atelocolagen biologic activ se termostatează la 5 ± 1°C și apoi mediul de dispersie se schimbă lent, prin diafiltrare, cu o soluție de tampon HEPES având pH-ul de 7,5 ± 0,3 unități, în care s-au dozat cantități de agenți de condiționare echivalente cu 120+160 mM NaCl, 2,5+5,2 mM KCI, 3+9 mM glucoză, 30+120 mM acid ascorbic (CAS 50-81-7) și 0,5+1,5 g/L hiclat de doxiciclină (CAS 24390-145). După o maturare de 6+18 h, la 4+10°C, în soluția coloidală se adaugă, sub agitare lentă

RO 126403 Β1 dar eficientă, cantități de agenți de condiționare biochimică echivalente cu 0,5-M ,5 g/L 1 hialuronat de sodiu (CAS 9067-32-7), 0,5-M,5 g/L condroitin sulfat (CAS 9007-28-7) și

0,1-^1,0 g/L modulatori ai metabolismului celular, aleși din gama celor activi în raport cu 3 celulele sau liniile celulare ce urmează a fi cultivate. Toți agenții de condiționare se prepară anterior, în condiții sterile, utilizând apă deionizată liberă de pirogeni, la concentrațiile maxim 5 posibile care le asigură solubilitatea. în continuare, soluția coloidală se supune maturării, prin menținere sub vid moderat (50-^150 Pa), la 4-^10°C, timp de 6-M8 h, în condiții sterile. La 7 final, soluția coloidală se ambalează în recipiente din sticlă, anterior sterilizate și clătite cu apă deionizată sterilă, liberă de pirogeni. Sub această formă, soluțiile de atelocolagen 9 biologic activ se pot stoca timp de cel puțin un an, la întuneric, în lipsa vibrațiilor excesive și la temperaturi de 4-^8°C. 11

Claims (6)

1. Revendicări

   1. Procedeu pentru extracția și purificarea atelocolagenului biologic activ, care se aplică tendoanelor mamiferelor tinere și constă în parcurgerea succesivă a următoarelor șase etape:

   - preprocesarea tendoanelor, ca surse tisulare de colagen;

   - defibrarea avansată a tendoanelor anterior destructurate mecanic și decapate enzimatic și chimic;

   - solubilizarea enzimatică a atelocolagenului biologic activ;

   - purificarea primară a atelocolagenului biologic activ;

   - purificarea avansată a atelocolagenului biologic activ;

   - condiționarea finală a formelor de atelocolagen biologic activ, în funcție de aplicația vizată, caracterizat prin aceea că:

   - preprocesarea tendoanelor se realizează în următoarea succesiune: destructurare mecanică, deshidratare controlată, rehidratare prin șocuri succesive hiper- și hipo-tone, decaparea enzimatică a fasciculelor de fibre colagenice prin hidroliza proteinelor nefibrilare și a formelor denaturate, decaparea chimică a fasciculelor de fibre colagenice prin eliminarea debriurilor celulare și a speciilor biochimice mic-moleculare, în mediu acid oxidant și în prezența tensioactivilor;

   - defibrarea avansată a tendoanelor se realizează pe cale fizico-chimică, prin salturi succesive de pH în raport cu pH-ul izoelectric al colagenului nativ, pentru a rupe legăturile de hidrogen înalt ordonate din structura fibrelor colagenice;

   - purificarea avansată a atelocolagenului biologic activ se realizează prin microfibrilare, proces care selectează doar macromoleculele de atelocolagen intacte și capabile de agregare supramoleculară ordonată, separându-le de formele denaturate ori afectate de hidroliză la nivelul domeniului triplu helical.
2. 2. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, în etapa de preprocesare a tendoanelor, acestea se împart în loturi egale, apoi se spală în flote de saramură, la temperatura ambientală, în prezența unui agent de chelatare a ionilor grei și a unui amestec de antibiotice; tendoanele spălate se zvântă și se ambalează sub vid, în 100% v/m amestec apă:glicerină:alcool etilic în rapoartele 50:30:20; tendoanele astfel ambalate se congelează la - 20°C, timp de maximum 6 luni; în vederea continuării prelucrării, loturi variabile de tendoane se decongelează prin imersare în soluții de 7 g/L acetat de amoniu, la 4°C, se spală cu apă deionizată, se zvântă, se presară abundent cu un amestec solid de 30% NaCI, 60% Na₂SO₄, și 10% acetat de amoniu, se curăță prin periere energică, se spală în 400% flotă de 20% alcool etilic, se strivesc între valțuri metalice din oțel inoxidabil, se supun maturării la rece, iar apoi se destructurează individual prin periere cu perii rotative cu fire din oțel inoxidabil, sub jet de apă rece; fasciculele destructurate ce rezultă se suspendă în 600% flotă de 20% alcool etilic, se separă și se spală pe filtre cu soluție 20% alcool etilic, iar apoi se maturează 3-H9 h, la temperatura ambientală, în 600% flotă de 20% alcool etilic în care s-au dozat 1% Triton X 100 și 0,8% Na₄EDTA.
3. 3. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, pentru defibrarea chimică a fasciculelor de tendon anterior destructurate, acestea sunt supuse unor șocuri succesive, hiper- și hipo-tone, în flote de 600% soluție salină de 10% NaCI, 10% Na₂SO₄, și 6% acetat de amoniu, respectiv, în flote apoase de 600%, în care s-au dozat agenți de chelatare a ionilor grei, inhibitori ai activității enzimatice a proteazelor și un amestec de antibiotice; ambele tratamente se întind pe durata a câte 12 h, la temperaturi de 2-4TC, fiind repetate alternativ de câte trei ori; după o spălare eficientă, se continuă cu o decapare enzimatică în

   RO 126403 Β1 flotă de 600% ce conține 0,05+0,15% m/v tripsină, 4% NaHCO₃ și 0,2% Na₄EDTA, la 32+35°C, 1 timp de 60-430 min, urmată de inactivarea enzimei prin spălare abundentă, pe filtru, cu soluție slab acidă caldă; în vederea eliminării debriurilor celulare, fasciculele de tendon se suspendă 3 în 600% flotă ce conține 1,5% acid peracetic și 2% Triton X100, sub agitare, la 32-435°C, timp de 4 h; fasciculelor de tendon li se aplică apoi 3+9 tratamente succesive, în 400% tampon 5 fosfat cu pH 7,8 și în 400% tampon citrat cu pH 3,4, pe durata a câte 3-43 h, intercalând clătiri eficiente; în continuare, din fasciculele de tendon se elimină glicoz-amino-glicanii, prin tratament 7 cu 60-M20 IU/L condroitinază ABC, în flotă de 600% în care s-au dozat mai întâi 8-424 g/L acetat de amoniu, iar pH-ul s-a reglat la 7,3-43,0; după 3-45 h, enzima este inhibată adăugând 9 0,2-43,5 g/L ZnCI₂-2H₂O și apoi clătind abundent.
4. 4. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, pentru solubilizarea 11 atelocolagenului biologic activ, fasciculele de tendon defibrate chimic se aduc în flotă de 1000% soluție 0,01 M HCI chimic pur și se supun umflării timp de 48+72 de h, la 4°C; sus- 13 pensia vâscoasă rezultată se supune laminării și filtrării, la fiecare 12 h, colectând filtratele și retratând fracția reținută; filtratele reunite se încălzesc la 20-435°C și li se adaugă 0,01% 15 azidă de sodiu și 1+2,5 g/L pepsină; după o agitare lentă pe durata a 6+36 h, soluția coloidală rezultată se laminează și se filtrează în mod repetat, iar apoi enzima se inactivează 17 dozând 50 g/L NaCI sub formă solidă și 6 g/L tris(hidroximetil)-aminometan; după termostatarea la 4-M 0°C, filtratul se aduce lent la pH 7,5, menținându-se spre maturare timp 19 de 4-M2 h; în continuare, soluția coloidală rezultată se filtrează, recirculând-o, în cascadă, prin filtre având pori cu diametrul echivalent de 200, 100 și, respectiv, 30 microni; la final, 21 filtratul se centrifughează la 7000 g, îndepărtând sedimentul.
5. 5. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, pentru purificarea 23 prin microfibrilare, soluția coloidală de atelocolagen biologic activ se termostatează la 5 ± 1 °C, apoi se neutralizează lent, prin diafiltrare, schimbând mediul de dispersie cu tampon fosfat 25 având pH-ul de 7,6 ± 0,2 și tăria ionică de 0,183 M; în ultimul volum schimbat, tăria ionică se crește până la 0,983 M, utilizând soluție saturată de NaCI în apă deionizată liberă de 27 pirogeni; soluția coloidală se încălzește apoi lent până la 30 ± 2°C și se maturează, în aceste condiții, timp de 2-43 h; apoi temperatura suspensiei formate se aduce lent până la 10 ± 1°C 29 și se supune centrifugării, reținând sedimentul; acesta se spalăîn centrifugă cu tampon fosfat cu pH-ul de 7,6 ± 0,2 unități, iar apoi se resuspendă în soluție 0,01 M HCI chimic pur, dizolvat 31 în apă deionizată sterilă, liberă de pirogeni; soluția coloidală obținută se diafiltreazăîn condiții sterile peste membrane cu limita de trecere de 100 kDa, asigurând schimbarea a 5-43 volume 33 de soluție 0,01 M HCI.
6. 6. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, pentru condiționarea 35 atelocolagenului biologic activ în vederea utilizării sale în aplicații cosmetice, acesta se microfibrilează urmând parțial procedura din revendicarea 5, până la obținerea sedimentului 37 prin centrifugare; sedimentul se eliberează apoi de excesul de apă de imbibiție, se maturează sub vid moderat, la 4-M0°C, timp de 6-M8 h, apoi i se adaugă, prin malaxare la 39 rece, în condiții sterile, 6+18% glicerină pură și apoi un amestec ce conține 50+80% glicerină pură, 4-M2% propilenglicol izostearat, 9-M8% propilenglicol dioleat, 10-425% decil-metil- 41 sulfoxid și 1,5-42,0% 2-brom-2-nitropropan-1,3-diol, amestec în care cantitățile s-au calculat prin raportare la substanța uscată a pastei luată în lucru; după o malaxare eficientă, la 43 10-M5°C, timp de 45-M20 min, pasta rezultată se ultrasoneazătimp de 10-430 min, la 22 kHz și la o putere ultrasonoră de 350 W; la final, pasta se maturează sub vid moderat, la rece, 45 timp de 6-M2 h, în condiții sterile, după care se împachetează sub vid, de asemenea în condiții sterile. 47

   RO 126403 Β1

   1 7. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, pentru condiționarea atelocolagenului biologic activ, în vederea utilizării sale în aplicații ale ingineriei tisulare, soluția

   3 coloidală obținută conform revendicării 5 se termostatează la 5 ± 1°C și apoi se diafiltrează în vederea schimbării mediului de dispersie cu o soluție de tampon HEPES având pH-ul de

   5 7,5 ± 0,3 unități, în care s-au dozat 120+160 mM NaCl, 2,5+5,2 mM KCI, 3+9 mM glucoză,

   30+120 mM acid ascorbic și 0,5+1,5 g/L hiclat de doxiciclină; după o maturare de 6+18 h, 7 la 4+10°C, în soluția coloidală se adaugă, sub agitare lentă, 0,5+1,5 g/L hialuronat de sodiu, 0,5+1,5 g/L condroitin sulfat și 0,1+1,0 g/L modulatori ai metabolismului celular; la final, soluția 9 coloidală se supune maturării, sub vid moderat, la4+10°C, timp de 6+18 h, în condiții sterile, după care se ambalează în recipiente din sticlă, anterior sterilizate.