ES2684856A2

ES2684856A2 - Método para producir una matriz de tejido descelularizado

Info

Publication number: ES2684856A2
Application number: ES201890038A
Authority: ES
Inventors: Iratxe Madarieta Pardo; Nerea GARCÍA URQUIA; Rubén FERNANDEZ GARCÍA
Original assignee: Fundacion Tecnalia Research and Innovation
Current assignee: Fundacion Tecnalia Research and Innovation
Priority date: 2015-12-30
Filing date: 2016-12-29
Publication date: 2018-10-04
Anticipated expiration: 2036-12-29
Also published as: ES2684856B1; WO2017114902A1; ES2684856R1

Abstract

Método para la producción de una matriz de tejido descelularizado. Se proporciona un método de descelularización de tejido adiposo que comprende las etapas de: a) laminar el tejido adiposo; b) tratar el tejido adiposo resultante de la etapa a) con una lipoproteína lipasa a 32-42 grados Celsius y a una concentración de 10-55 u/100 mg; y c) tratar el tejido adiposo resultante de la etapa b) con una nucleasa, a 32-42 grados Celsius y a una concentración de 709-1433 u/mg; durante un periodo de tiempo necesario para que el tejido adiposo tenga un contenido de ADN total igual o inferior a 50 ng/mg. También se proporciona el tejido adiposo descelularizado obtenible por el método, productos adicionales, tales como revestimientos y armazones que comprenden el tejido descelularizado y sus usos en ingeniería tisular y terapia regenerativa.

Description

La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente europea EP15203113.4 presentada el 30 de diciembre de 2015. La presente invención se refiere a un método para producir una matriz de tejido adiposo descelularizado, a la matriz de tejido adiposo descelularizado obtenible mediante el mismo y a sus usos. El tejido adiposo obtenible mediante el método tiene múltiples aplicaciones en ingeniería tisular y terapia regenerativa, especialmente en el tratamiento tópico de heridas.

TÉCNICA ANTERIOR

Las úlceras cutáneas son lesiones abiertas que generalmente implican la destrucción de la epidermis y la dermis. En el peor de los casos, las lesiones profundas también implican la destrucción de la hipodermis, la capa inferior de la piel. Cuando las úlceras tardan más de 6 semanas en cicatrizar, se clasifican como crónicas. Las úlceras crónicas pueden producirse por una variedad de diferentes patologías que van desde infecciones e isquemia local hasta disfunciones cardiovasculares. Estas tienen una alta prevalencia, ocasionan una pesada carga en los sistemas sanitarios en todo el mundo y en muchos casos no se gestionan fácilmente en los consultorios médicos.

Los tratamientos tópicos convencionales incluyen vendas basadas en hidrogeles hidrocoloides, espumas, alginatos, carbonos activos, siliconas y plata. Sin embargo, incluso cuando hay un diagnóstico preciso y se administra el tratamiento estándar habitual, hay un alto porcentaje de casos que siguen siendo resistentes y no responden positivamente.

Una de las terapias de última generación más prometedoras para las úlceras cutáneas crónicas se basa en la administración tópica de matrices biológicas

acelulares. Estas matrices son productos derivados de tejido animal, y que se pueden aplicar por vía tópica en el lugar de la herida para estimular y remplazar la matriz extracelular (MEC) alterada o faltante. Cuando se aplican por vía tópica, proporcionan un armazón rico en proteínas, glucolípidos y otros componentes de la MEC al cual migran las células y proliferan, lo que permite la regeneración tisular. Las matrices biológicas se están explorando actualmente en varias aplicaciones, no solo en terapia regenerativa sino también en ingeniería tisular, tal como implantes internos y dispositivos ortopédicos. En particular, una aplicación interesante, no relacionada con la terapia, es el uso de dichas matrices para dispositivos de cultivo in vitro. Estas matrices acelulares se asemejan a un tejido real y, por lo tanto, se pueden utilizar de manera apropiada en cualquier dispositivo de cultivo celular para promover el mantenimiento y el crecimiento de un cultivo celular.

Actualmente hay algunos productos comerciales que aprovechan dichas tecnologías en la cicatrización de heridas. Estos productos se obtienen de tejidos tanto de origen animal (Matriderm, Primatrix, Integra) como humano (Apligraf, Epicel, Graftjacket). Sin embargo, todos ellos actúan a nivel de la epidermis y la dermis. Por desgracia, todavía faltan matrices con capacidad de regenerar la hipodermis, tanto por sus propiedades subóptimas como porque no se obtienen de tejido adiposo subcutáneo.

La generación de una matriz biológica acelular terapéutica a partir de un tejido animal no es un proceso sencillo por diversas razones. Cualquier método para procesar un tejido inicial para producir una matriz acelular debe garantizar que el producto final esté dotado de una estructura general y de propiedades mecánicas que se asemejen a las de la matriz extracelular natural, también debe conservar las proteínas y otros componentes macromoleculares que permiten que la matriz se utilice como un armazón para que tengan lugar los procesos regenerativos, y lo más importante es que dicho producto debe carecer de cualquier componente nuclear, tal como desechos nucleares y ADN, que lo haga proinflamatorio e inmunogénico. Por tanto, cualquier método de producción de matriz acelular debe garantizar que la serie de tratamientos aplicados maximice la eliminación de los componentes inmunogénicos del tejido original y al mismo tiempo minimice la pérdida de

características estructurales que le permiten proporcionar una barrera a las infecciones y promover una actividad celular, una revascularización y una regeneración tisular óptimas. Este equilibrio no se consigue fácilmente.

En la técnica anterior se encuentran diversas descripciones de métodos para descelularizar un tejido para producir una matriz acelular. La mayoría se compone de una serie de etapas de tratamiento consecutivas en las que se aplica una diversidad de tratamientos mecánicos y/o químicos y/o bioquímicos (enzimáticos). Gilbert TW., et. al. “Strategies for tissue and organ decellularization” J. Cell. Biochem. 2012, vol. 113, págs. 2217-2222, resumen los tratamientos típicos implementados en la descelularización de tejidos en medicina regenerativa. Los tratamientos enzimáticos típicos incluyen tripsina, ADNasa, lipasa y α-galactosidasa. Por lo general, se combinan con una variedad de tratamientos físicos y químicos para facilitar la eliminación de componentes no deseables y reforzar los efectos de las enzimas degradantes. Los tratamientos químicos se dividen en diferentes categorías, tales como detergentes, disolventes orgánicos, soluciones ácidas y alcalinas, etc. Como se desvela en esta referencia, es extremadamente raro basarse solo en un único tratamiento químico para descelularizar un tejido, y generalmente se considera más ventajoso combinar numerosos productos químicos y bioquímicos en una serie de lavados cortos para garantizar la eficacia de los tratamientos y, por lo tanto, una descelularización adecuada. Sin embargo, el uso de productos químicos implica un riesgo en términos de contaminación con residuos no deseables que no son aptos para aplicaciones biofarmacéuticas en el producto final. Idealmente, sería deseable encontrar métodos que no impliquen el uso de ningún tratamiento químico que pueda plantear problemas de seguridad.

En el documento US2012/0264190 se desvela una matriz extracelular descelularizada y deslipidizada producida a partir de tejido adiposo, y métodos para producirla, que puede estar compuesta por una serie de tratamientos que incluyen la deslipidación con lipasas, digestión con proteínas con una serie de proteasas tales como pepsina, papaína, metaloproteasas de la matriz (MMP) y tripsina, digestión con ácidos nucleicos con endonucleasas, exonucleasas, ADNasas y ARNasas. Sin

embargo, este método se caracteriza por una etapa en el que se utilizan detergentes tales como desoxicolato sódico, dodecil sulfato sódico o Tritón X-100.

El documento US2011/0151011 desvela un método para descelularizar tejido

5 adiposo que comprende someter el tejido adiposo a una serie de digestiones enzimáticas y a una serie de extracciones con disolventes de modo que el tejido adiposo acelular final tiene una estructura 3D bien conservada para terapia regenerativa. Los métodos descritos pueden implicar protocolos en los que se puede combinar una serie de tratamientos, que incluyen tratamientos con proteasas,

10 ADNasa y ARNasa, agentes quelantes tales como EDTA, detergentes tales como Tritón-X100 y lipasas.

El documento US2013/0202563 desvela un método para producir un armazón de crecimiento celular a partir de tejido adiposo que comprende una etapa de lavado

15 con n-propanol, isopropanol o una mezcla de los mismos. El tratamiento no implica el uso de enzimas para la degradación de los componentes del tejido original, y se basa principalmente en el uso de alcoholes.

El documento WO2011/132089 desvela un método para descelularizar tejidos que

20 comprende poner en contacto el tejido original con diferentes soluciones químicas y tensioactivos y después tratar los tejidos resultantes tratados con tensioactivo bioquímicamente con una serie de enzimas degradantes tales como nucleasas.

El uso prometedor de matrices biológicas para la terapia regenerativa garantiza el

25 desarrollo de nuevos métodos de producción, más seguros y más eficaces. El desarrollo de métodos en los que se obtiene una alteración mínima de la estructura general original y la eliminación máxima de los componentes proinflamatorios e inmunogénicos, sigue siendo un campo de investigación en activo.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Los inventores han ideado un método sencillo, pero muy eficaz, de descelularización de tejido adiposo. El método de la invención comprende un número reducido de

5 etapas que hace que sea sustancialmente más sencillo que muchos métodos encontrados en la técnica, gracias a las condiciones particulares que se ha descubierto que son óptimas en cuanto a rendimiento. El método implica el uso de tan solo dos etapas de tratamiento bioquímico (enzimático), es decir, la lipoproteína lipasa y una nucleasa de alta calidad (biofarmacéutica).

10 Extraordinariamente el método no implica una serie de tratamientos químicos prolongados y en serie, lo que garantiza que puede aplicarse sin plantear preocupaciones relacionadas con la seguridad de la matriz descelularizada final. Los dos tratamientos enzimáticos se realizan en condiciones de concentración, duración

15 y temperatura muy específicas, y únicamente con enzimas de calidad biofarmacéutica, lo cual garantiza la calidad de la matriz descelularizada obtenida. Cabe destacar, que el método generalmente conllevará el uso de tejido resecado (aunque también podría aplicarse a lipoaspirados), que no presenta una combinación de tratamientos químicos exhaustivos y que no implica el uso de

20 reactivos de origen animal, disolventes orgánicos o cualquier tratamiento mecánico agresivo.

Por lo tanto, un primer aspecto de la presente invención es un método de descelularización de tejido adiposo que comprende las etapas de: a) laminar el tejido 25 adiposo; b) tratar el tejido adiposo resultante de la etapa a) con una lipoproteína lipasa a 32-42 grados Celsius y a una concentración de 10-55 u/100 mg, y c) tratar el tejido adiposo resultante de la etapa b) con una nucleasa, a 32-42 grados Celsius y a una concentración de 709-1433 u/mg; durante un periodo de tiempo necesario para que el tejido adiposo tenga un contenido de ADN total igual o inferior a

30 50 ng/mg.

En la presente invención el contenido de ADN se refiere a la cantidad de ng de ADN por mg de tejido adiposo humano descelularizado en peso seco, como se describe en los ejemplos.

La matriz descelularizada obtenida mediante el método está dotada de propiedades esperadas para aplicaciones terapéuticas ya que tiene un contenido de ADN muy bajo (habitualmente muy por debajo de 50 ng/mg, que es el umbral por encima del cual se han descrito reacciones inmunitarias in vivo según Crapo, PM., et. al. “An overview of tissue and whole organ decellularization processes” Biomaterials 2011, vol. 32, págs. 3233-3243), un porcentaje deseable de proteína de matriz extracelular (en particular perlecan, elastina, colágeno de tipo I y IV) y una morfología general sorprendentemente bien conservada. Este último punto es clave. La matriz tiene una estructura global que se asemeja a la del tejido original, lo que maximiza la probabilidad del éxito en medicina regenerativa. Por lo tanto, los inventores han encontrado un método que establece claramente un equilibrio entre la eliminación de componentes indeseados, tales como desechos nucleares y otro ADN inmunogénico y la conservación de la integridad estructural del tejido original.

Cabe destacar que el método puede aplicarse con variaciones sutiles que permiten obtener una matriz descelularizada con las cualidades deseadas pero con grados variables de contenido en triglicéridos, lo que supone una ventaja ya que dependiendo de la aplicación final la matriz puede necesitar un contenido mayor o menor de lípidos.

Por lo tanto, un segundo aspecto de la presente invención es una matriz de tejido adiposo descelularizado obtenible por el método del primer aspecto de la invención.

Debido al bajo contenido de componentes no deseables y a su estructura morfológica general, la matriz obtenible mediante el método puede encontrar una miríada de aplicaciones diferentes, incluyendo las más restrictivas y exigentes, tales como la cicatrización de heridas profundas y úlceras que afectan a la hipodermis. La conservación maximizada de la morfología original junto con la composición final de

la matriz tratada garantiza un máximo rendimiento con fines regenerativos. La matriz obtenible por el primer aspecto se caracteriza por una ausencia de disolventes orgánicos, bajo contenido residual en cuanto a componentes inmunogénicos, lo que garantiza una respuesta mínima del hospedador cuando se aplica en terapia, similitudes estructurales y funciones notables con el tejido endógeno, rico en proteínas de membrana basal y arquitectura general conservada.

Un tercer aspecto de la presente invención es un polvo, una espuma, una partícula o un hidrogel que comprende el tejido adiposo descelularizado según el segundo aspecto de la invención.

Un cuarto aspecto de la invención es un armazón o revestimiento biocompatible que comprende el tejido adiposo descelularizado según el segundo aspecto de la invención o el polvo, la espuma, la partícula o el hidrogel del tercer aspecto de la invención.

Un quinto aspecto de la invención es el tejido adiposo descelularizado según el segundo aspecto de la invención, el polvo, la espuma, la partícula o el hidrogel según el tercer aspecto de la invención, o el armazón o revestimiento biocompatible según el cuarto aspecto de la invención, para su uso en ingeniería tisular y terapia regenerativa.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

FIG. 1: secciones teñidas con HyE de TAh normal y descelularizado (TAh y TAhd-LM4). Se muestran adipocitos (columna a), regiones fibrilares (columna b, asterisco) y estructuras vasculares (columna c, flechas). La barra de escala representa 200 μm.

FIG. 2: análisis IHC de Colágeno de tipo I (región fibrilar, columna a), colágeno de tipo IV (región de adipocitos, columna b), colágeno de tipo IV (estructuras vasculares, columna c), laminina (columna d) y HSPG2 (columna e) de TAh normal y

descelularizado (TAh y TAhd-LM4). Se han identificado estructuras vasculares (flechas). La barra de escala representa 200 μm.

FIG. 3: tinción con HyE (columna a) y análisis IHC de colágeno de tipo I (columna b),

5 colágeno de tipo IV (columna c), laminina (columna d) y HSPG2 (columna e) de TAhd obtenidos con diferentes tratamientos con lipasa (LM3 y LM5). La barra de escala representa 100 μm o 200 μm.

FIG. 4: tinción con HyE y análisis IHC de colágeno de tipo I de TAhd tratados y no

10 tratados con la nucleasa de alta calidad Benzonasa (LM3 y M8 respectivamente). Columna a, región de adipocitos. Columna b, región fibrilar. Columna c, colágeno de tipo I. La barra de escala representa 200 μm.

FIG. 5: tinción con HyE y análisis IHC de colágeno de tipo I (a), colágeno de tipo IV

15 (b), laminina (c) y HSPG2 (d) de TAhd no tratados con tripsina/tritón-x100 (M7). Se muestran regiones adipocíticas (I), fibrilares (II, asterisco) y estructuras vasculares (III, flecha). Para fines comparativos con TAhd tratado, véase la Figura 3 (TAhd LM3). La barra de escala representa 200 μm.

20 FIG. 6: imágenes macroscópicas y contenido relativo de triglicéridos (%) de TAh y TAhd originales obtenidos con diferentes condiciones de incubación con Lipasa en el proceso de descelularización (LM1-LM5, condiciones descritas en la Tabla 1). Los resultados se muestran como contenido relativo de triglicéridos (%) considerando el TAh original como un 100 %.

25 FIG. 7: imágenes macroscópicas y contenido relativo de triglicéridos (%) de TAh y TAhd originales obtenidos con el proceso de descelularización sin tratamiento previo con tripsina/tritón-x100 (M7) o tratamiento con Benzonasa (LM8). Los resultados se muestran como contenido relativo de triglicéridos (%) considerando el TAh original

30 como un 100 %.

FIG. 8: imágenes macroscópicas y microscópicas de TAhd procesado de la invención: a) imagen macroscópica de un polvo obtenido por micronización, b) imagen microscópica del polvo obtenida por Microscopía Electrónica de Barrido. Barra de escala 100 μm, c) imagen macroscópica de un armazón poroso obtenido por liofilización, d) imagen microscópica de un armazón poroso obtenida por Microscopía Electrónica de Barrido, e) imagen macroscópica de la aplicación de compresión plástica, f) imagen macroscópica de una lámina obtenida por compresión plástica, g) imagen macroscópica de la lámina comprimida enrollada y h) imagen macroscópica de una forma cilíndrica obtenida al enrollar la lámina comprimida.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Para su entendimiento, se incluyen las siguientes definiciones y se espera que se apliquen a lo largo de la descripción, reivindicaciones y dibujos.

En el presente documento los términos “acelular” y “descelularizado” se utilizan indistintamente.

El término “descelularización”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a un proceso mediante el cual un tejido se somete a uno o más tratamientos para maximizar la eliminación de células presentes en él, dejando solo la matriz extracelular (MEC) que es rica en proteínas estructurales tales como colágenos, elastina, factores de crecimiento y glucolípidos.

La expresión “armazón biocompatible”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a una sustancia con estabilidad estructural suficiente para proporcionar un sustrato para soportar, propiciar y promover el crecimiento de células vivas que constituyen un tejido. Dicho armazón puede utilizarse para la recuperación de un tejido dañado. El armazón llena el espacio dejado por una herida, dando una estructura para ser colonizada por células y nuevos vasos sanguíneos, lo que finalmente conduce a la regeneración tisular.

Como se ha mencionado anteriormente, un primer aspecto de la presente invención es un método de descelularización de tejido adiposo que comprende las etapas de: a) laminar el tejido adiposo; b) tratar el tejido adiposo resultante de la etapa a) con una lipoproteína lipasa a 32-42 grados Celsius y a una concentración de 1055 u/100 mg, y c) tratar el tejido adiposo resultante de la etapa b) con una nucleasa, a 32-42 grados Celsius y a una concentración de 709-1433 u/mg; durante un periodo de tiempo necesario para que el tejido adiposo tenga un contenido de ADN total igual o inferior a 50 ng/mg.

En una realización particular del primer aspecto de la invención, el método de descelularización de tejido adiposo es un método en el que el tratamiento con lipasa b) se lleva a cabo: a una concentración de 10-30 u/100 mg durante 39-49 horas a 32-42 grados Celsius o a una concentración de 45-55 u/100 mg durante 18-28 horas a 32-42 grados Celsius; y el tratamiento con nucleasa c) se lleva a cabo a una concentración de 709-719 u/mg durante 67-77 horas a 32-42 grados Celsius o a una concentración de 1423-1433 u/mg durante 35-45 horas a 32-42 grados Celsius o a una concentración de 1423-1433 u/mg durante 67-77 horas a 32-42 grados Celsius.

En otra realización particular del primer aspecto de la invención, el método de descelularización de tejido adiposo es un método en el que en la etapa b) el tratamiento es a una concentración de 25 u/100 mg durante 44 horas a 37 grados Celsius o a una concentración de 50 u/100 mg durante 23 horas a 37 grados Celsius, y la etapa c) se lleva a cabo a una concentración de 709-719 u/mg durante 67-77 horas a 32-42 grados Celsius o a una concentración de 1423-1433 u/mg durante 35-45 horas a 32-42 grados Celsius o a una concentración de 14231433 u/mg durante 67-77 horas a 32-42 grados Celsius.

En otra realización particular del primer aspecto de la invención, el método de descelularización de tejido adiposo es un método en el que en la etapa b) se lleva a cabo a una concentración de 10-30 u/100 mg durante 39-49 horas a 32-42 grados Celsius o a una concentración de 45-55 u/100 mg durante 18-28 horas a 32-42 grados Celsius, y en la etapa c) el tratamiento es a una concentración de 714 u/mg

durante 72 horas a 37 grados Celsius o a una concentración de 1428 u/mg durante 40 horas a 37 grados Celsius o a una concentración de 1428 u/mg durante 72 horas a 32-42 grados Celsius.

En otra realización particular del primer aspecto de la invención, el método de descelularización de tejido adiposo es un método en el que en la etapa b) el tratamiento es a una concentración de 25 u/100 mg durante 4 horas a 37 grados Celsius.

En otra realización particular del primer aspecto de la invención, el método de descelularización de tejido adiposo es un método en el que en la etapa b) el tratamiento es a una concentración de 50 u/100 mg durante 23 horas a 37 grados Celsius. En otra realización particular del primer aspecto de la invención, el método de descelularización de tejido adiposo es un método en el que en la etapa c) el tratamiento es a una concentración de 714 u/mg durante 72 horas a 37 grados Celsius.

En otra realización particular del primer aspecto de la invención, el método de descelularización de tejido adiposo es un método en el que en la etapa c) el tratamiento es a una concentración de 1428 u/mg durante 40 horas a 37 grados Celsius.

En otra realización particular del primer aspecto de la invención, el método de descelularización de tejido adiposo es un método en el que en la etapa c) el tratamiento es a una concentración de 1428 u/mg durante 72 horas a 37 grados Celsius.

En otra realización particular del primer aspecto de la invención, el método de descelularización de tejido adiposo comprende adicionalmente una etapa entre las etapas a) y b), en el que el tejido adiposo resultante de la etapa a) se trata con tripsina y tritón-X100. En otra realización particular, la última etapa se caracteriza por

que el tratamiento con tripsina-tritónX100 comprende adicionalmente EDTA y se lleva a cabo a 37 grados Celsius durante la noche y el Tritón-X100 está al 1 % en v/v (1 ml/100 ml).

Esta etapa adicional no es obligatoria, como puede observarse en los datos experimentales que se indican a continuación, donde la matriz descelularizada con las mejores propiedades se obtiene sin ella (M7). Sin embargo, si desea que el producto final tenga un contenido menor de lípidos (como el encontrado para LM3 o LM4), entonces se puede emplear esta etapa de tratamiento opcional de tripsina+tritón-X100.

En otra realización particular del primer aspecto de la invención, el método comprende adicionalmente una etapa d) que comprende congelar o liofilizar y esterilizar el tejido adiposo resultante de la etapa c).

En otra realización particular del primer aspecto de la invención, la esterilización se lleva a cabo con dicloruro de etileno. En otra realización particular, la esterilización se lleva a cabo con luz ultravioleta. En otra realización particular, el método se lleva a cabo en condiciones asépticas.

En otra realización particular del primer aspecto de la invención, el método de descelularización de tejido adiposo es un método en el que en las etapas b) y c) los tratamientos son tratamientos al vacío y con agitación a 100-150 rpm.

En otra realización particular, la agitación a 100-150 rpm es agitación orbital.

En otra realización particular del primer aspecto de la invención, el método de descelularización de tejido adiposo es un método en el que después de las etapas a), b) y c), hay una etapa de lavado con tampón a temperatura ambiente, al vacío y con agitación a 100-150 rpm, y en el que la etapa de lavado después de la etapa a), el tampón comprende adicionalmente al menos un antibiótico, al menos un antimicótico y al menos un inhibidor de proteasa, en la etapa de lavado después de

la etapa b) el tampón comprende al menos un antibiótico, al menos un antimicótico, al menos un inhibidor de proteasa y al menos un inhibidor de lipasa y en el que la etapa de lavado después de la etapa c) el tampón comprende adicionalmente al menos un antibiótico, al menos un antimicótico, al menos un inhibidor de proteasa y al menos un inhibidor de nucleasa.

En otra realización particular del primer aspecto de la invención, el método de descelularización de tejido adiposo es un método en el que en la etapa b), el tratamiento con lipoproteína lipasa comprende Tritón-X100 al 0,5 % y un cofactor en tampón de fosfato. En otra realización particular del primer aspecto de la invención, el método de descelularización de tejido adiposo es un método en el que en la etapa b), el tratamiento con lipoproteína lipasa que comprende Tritón-X100 al 0,1 % y un cofactor en tampón fosfato.

En otra realización particular, las etapas b) y c) se llevan a cabo en presencia de un cofactor. En otra realización particular, el cofactor es magnesio (Mg+2).

En otra realización particular del primer aspecto de la invención, el método de descelularización de tejido adiposo es un método en el que en la etapa a), la laminación de tejido adiposo es manual. En otra realización particular del primer aspecto de la invención, el método de descelularización de tejido adiposo es un método en el que en la etapa a), el bloque laminado tiene un tamaño de 1-15 cm de longitud, 0,5-8 cm de anchura y 0,3-2 cm de espesor.

En otra realización particular del primer aspecto de la invención, el método de descelularización de tejido adiposo es un método en el que en la etapa b), la lipoproteína lipasa se selecciona del grupo que consiste en lipasa y fosfolipasa de origen bacteriano (géneros Pseudomonas, Staphyloccus, Bacillus, etc.), de origen de levadura (especies Candida aldicans, Candida Antarctica, Candida rugosa, Geotrichum asteroids, Geotrichum candidium, Trichosporon fermentans, Saccharomycopsis lipolytica, Yarrowia lipolytica), de origen fúngico (géneros Penicillum, Rhizopus, Rhizomucor, etc.) y de origen mamífero (porcino, bovino,

equino, humano, etc.). En este último grupo se incluye la lipoproteína lipasa, la acilglicerol lipasa, la triacilglicerol lipasa, a lipasa sensible a hormonas, la lipasa pancreática, la lipasa activada por sales biliares, la proteína 1 relacionada con la lipasa pancreática, la proteína 2 relacionada con la lipasa pancreática, la fosfolipasa A2, la fosfolipasa A2 independiente de calcio, la lipasa endotelial, la fosfatidilinositol fosfolipasa A2, la fosfolipasa C endógena, la fosfoinositida fosfolipasa C, la fosfolipasa C, la lisofosfolipasa D y la fosfolipasa D.

En otra realización particular del primer aspecto de la invención, el método de descelularización de tejido adiposo es un método en el que en la etapa c), la nucleasa es Benzonasa®. La Benzonasa es una endonucleasa con calidad farmacéutica muy alta y es suministrada por Merck-Millipore, que en sus especificaciones técnicas indica: la Benzonasa® es una endonucleasa única, modificada por ingeniería genética, que solo está disponible en Merck Millipore. Producida en E. coli, esta endonucleasa recombinante inespecífica, escinde todo tipo de variantes de ADN y ARN en fragmentos que comprenden <8 pares de bases solubles. Esto conduce a un mínimo extremo de carga de ácido nucleico.

En otra realización particular del primer aspecto de la invención, el método de descelularización de tejido adiposo es un método en el que en la etapa c), la nucleasa se selecciona del grupo que consiste en nucleasas de origen bacteriano (Serratia marcescens, Clostridium), de origen de levadura, de origen fúngico (Asperguillus) y de origen mamífero (porcino, bovino, equino, humano, etc.) incluyendo desoxirribonucleasas (DNasas) y ribonucleasas (RNasas) tales como DNasa I, DNasa II, DNasa V, nucleasa microcócica, DNasa específica de sitio de tipo I, RNasa I, RNasa H, RNasa III, RNasa L, RNasa P, nucleasa S1, RNasa de levadura, RNasa U2, RNasa T2, RNasa T1, RNasa P4, RNasa M5, RNasa IX, RNasa E, RNasa D, RNasa alfa, RNasa PH, RNasa AS, RNasa Fitb, RNasa J1, RNasa pancreática, nanoRNasa.

Como se ha mencionado anteriormente, un segundo aspecto de la presente invención es una matriz de tejido adiposo descelularizada obtenible mediante el

método del primer aspecto de la invención.

En una realización particular del segundo aspecto de la invención, el tejido adiposo a tratar es de origen subcutáneo, tal como mamario o abdominal.

En una realización particular del segundo aspecto de la invención, el tejido adiposo a tratar se obtiene de lipoaspirado.

En otra realización particular del segundo aspecto de la invención, el tejido adiposo a tratar se obtiene por resección.

En otra realización particular del segundo aspecto de la invención, el tejido adiposo procede del epiplón o del omento.

En una realización particular del segundo aspecto de la invención, el tejido adiposo es tejido adiposo de mamífero.

En una realización particular del segundo aspecto de la invención, el tejido adiposo es tejido adiposo humano.

En una realización particular del segundo aspecto de la invención, el tejido adiposo obtenible mediante el método del primer aspecto tiene un contenido de ADN total de 0,015-0,306 ng/mg. Este intervalo de contenido de ADN se considera como muy aceptable por los inventores ya que está muy por debajo del umbral de 50 ng/mg descrito anteriormente. Por tanto, el primer aspecto de la invención permite obtener una matriz descelularizada que, aunque se caracteriza por una morfología muy conservada en comparación con el tejido original, tiene un contenido residual nuclear que minimiza la probabilidad de que se produzcan reacciones inmunitarias adversas

in vivo.

En una realización particular del segundo aspecto de la invención, la matriz de tejido adiposo comprende adicionalmente moléculas bioactivas exógenas. En una

realización particular del segundo aspecto de la invención, las moléculas bioactivas naturales o sintéticas se seleccionan del grupo que consiste en factores de crecimiento, hormonas, vitaminas, agentes antioxidantes, antiinflamatorios, antibacterianos, antifúngicos, aceleradores/promotores de cicatrización de heridas, o mezclas de los mismos.

En una realización particular del segundo aspecto de la invención, la matriz de tejido adiposo comprende adicionalmente i) polímeros sintéticos (PEG, poli(α-hidroxi ésteres), poliestireno, poliuretano y copolímeros y mezclas) y ii) polímeros naturales (basados en proteínas, elastina, colágeno, fibrina; o basados en polisacáridos, colágeno, quitosano, ácido hialurónico, beta-glucanos, gelatina, microcelulosa y nanocelulosa y sus derivados).

En una realización particular del segundo aspecto de la invención, la matriz de tejido adiposo comprende adicionalmente células vivas de ser humano o de animales (dentro o encima del material): células somáticas (adipocitos, fibroblastos, osteocitos, osteoblastos, condrocitos, condroblastos, mioepitelio, médula ósea, macrófagos, etc.), células endoteliales, células madre o células madre pluripotentes inducidas.

En una realización particular del segundo aspecto de la invención, el tejido adiposo descelularizado tiene un contenido de proteína total de 100-931 μg/mg y un contenido de triglicéridos de 25-65% del tejido original (p/p).

Dependiendo de la aplicación final, el segundo aspecto de la invención puede procesarse adicionalmente por micronización, compresión plástica, disolución, secado por congelación, autoensamblaje, reticulación química y/o interacciones físicas inducidas, electrohilado, recubrimiento giratorio o impresión en 3D.

Como se mencionó anteriormente, un tercer aspecto de la invención es un polvo, una espuma, una partícula o un hidrogel que comprende el tejido adiposo descelularizado según el segundo aspecto de la invención.

En una realización particular del tercer aspecto de la invención, el polvo, la espuma, la partícula o el hidrogel que comprende el tejido adiposo descelularizado, se mezcla con otros componentes bioactivos tales como factores de crecimiento, proteínas estructurales exógenas o agentes cicatrizantes. La mezcla compuesta resultante tiene ventajas adicionales en cuanto a regeneración tisular.

Como se mencionó anteriormente, un quinto aspecto de la invención es el tejido adiposo descelularizado según el segundo aspecto de la invención, el polvo, la espuma, la partícula o el hidrogel según el tercer aspecto de la invención, o el armazón biocompatible o el recubrimiento biocompatible según el cuarto aspecto de la invención para su uso en ingeniería tisular y terapia regenerativa.

En una realización particular del quinto aspecto, el uso es en combinación con una matriz seleccionada del grupo que consiste en Matriderm, Primatrix, Integra, Apligraf, Epicel y Graftjacket.

En una realización particular del quinto aspecto, el uso es en combinación con cualquier otra matriz disponible en medicina regenerativa.

En una realización particular del quinto aspecto, la terapia es una terapia de cicatrización de heridas. En particular, las múltiples aplicaciones del primer aspecto de la invención comprenden: cicatrización de heridas, ingeniería tisular, medicina regenerativa, terapias aditivas y soportes celulares para el tratamiento de enfermedades o de tejidos y órganos dañados, curación o prevención de enfermedades y restauración, corrección o alteración de las funciones fisiológicas de: i) tejido conectivo (tejido adiposo, piel, vasos sanguíneos, cartílago, hueso, etc.), ii) tejido epitelial y endotelial (epidermis, epitelio intestinal, endotelio vascular, etc.), iii) tejido muscular y iv) tejido nervioso.

En una realización particular, la cicatrización de heridas es la cicatrización de heridas de heridas profundas (de tipo III y IV) de la hipodermis. En una realización particular, la cicatrización de heridas es la cicatrización de heridas de úlcera de pie

diabético, úlcera venosa o úlcera por presión.

En una realización particular del quinto aspecto, el uso es un uso autólogo, es decir, se extrae tejido adiposo de un paciente, se aplica el método de la invención a dicho tejido adiposo y después la matriz descelularizada resultante se aplica al mismo paciente con fines de terapia regenerativa o ingeniería tisular.

En una realización particular del quinto aspecto, el uso es un uso alogénico, es decir, se extrae tejido adiposo de un primer donante, se aplica el método de la invención a dicho tejido adiposo y después la matriz descelularizada resultante se aplica a un segundo sujeto con fines de terapia regenerativa o ingeniería tisular.

En una realización particular del quinto aspecto, el uso es un uso xenogénico, es decir, se extrae tejido adiposo de un primer donante animal, se aplica el método de la invención a dicho tejido adiposo y después la matriz descelularizada resultante se aplica a un segundo sujeto que pertenece a una especie diferente de la del primer donante animal.

En una realización particular del quinto aspecto, el uso en ingeniería tisular es para un dispositivo ortopédico.

También es parte de la invención, el uso del segundo aspecto de la invención para el cultivo de células in vitro. La matriz que puede obtenerse mediante el primer aspecto de la invención puede utilizarse como un soporte en cualquier dispositivo de cultivo celular in vitro, ofreciendo así un soporte biocompatible que fomenta el crecimiento y la diferenciación celular.

Por lo tanto, el segundo aspecto de la invención puede encontrar aplicaciones para el cultivo de células en 2D y 3D in vitro normales y enfermas para obtener: i) un entorno análogo al tejido in vivo; ii) transportadores celulares y iii) síntesis de órganos para investigación, diagnóstico, detección de fármacos o implantación. También puede encontrar aplicaciones en materiales de vendaje, transportadores

celulares, recubrimientos, rellenos, partículas en polvo fluidas para la administración de fármacos, biotintas, armazones (espumas, hidrogeles micro y macro porosos, hidrogeles termoinductores), láminas, parches de forma cilíndrica o tubular, pulverización.

A lo largo de la descripción y reivindicaciones, la palabra “comprende” y variaciones de la palabra, no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o etapas. Además, la palabra “comprende” y sus variaciones incluyen la expresión “que consiste en”. Objetos, ventajas y características adicionales de la invención serán obvias para los expertos en la técnica tras examinar la descripción o pueden aprenderse llevando a la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan como ilustrativos y no pretenden limitar la presente invención. Además, la presente invención incluye todas las posibles combinaciones de realizaciones particulares y preferidas descritas en este documento.

EJEMPLOS

Materiales y Métodos

1 Donación de tejido adiposo humano

El tejido adiposo humano (TAh) fue donado por pacientes que se sometieron a cirugía plástica en el hospital Policlínico de Guipúzcoa según la ley 1301/2006 del Ministerio de España del 10 de noviembre, que establece estándares de calidad y seguridad para la donación, adquisición, ensayo, procesamiento, preservación, almacenamiento y distribución de células y tejidos humanos. La investigación se realizó con la aprobación previa de la Comisión Ética del País Vasco (Comité Ético de Investigación Clínica, CEIC).

Los tejidos se limpiaron con agua destilada ultrapura (Millipore), se fraccionaron manualmente con una cuchilla en aproximadamente 25 cm3 y se congelaron a 30 ºC hasta su uso. Los TAh se trataron siguiendo los procesos de descelularización

descritos a continuación. Todos los procesos se realizaron en condiciones asépticas.

2 Descelularización de tejido adiposo humano Las fracciones tisulares se descongelaron a temperatura ambiente (TA) y se

5 cortaron manualmente con una cuchilla en trozos de aproximadamente 0,3 x 0,5 x 1 cm y se trataron con Tripsina y Tritón-x100, Lipoproteína lipasa y ADNasa para la descelularización tisular.

Para eliminar los reactivos residuales, entre los tratamientos, se llevaron a cabo

10 etapas de lavado con un tampón fosfato (PBS – solución salina tamponada con fosfato) compuesto por hidrógeno fosfato disódico dihidrato (1,2 mg/l, EMPROVE® bio, Merck Millipore), dihidrógeno fosfato de sodio dihidrato (0,885 mg/l, EMPROVE® bio, Merck Millipore), penicilina-estreptomicina 10 ml/l (según cGMP, LONZA), fungizona 10 ml/l (Fungizone® Antimicótico, ThermoFisher Scientific) y cóctel

15 inhibidor de proteasa III 1,25 ml/l (sin EDTA, Merck Millipore). Para el lavado, a cada fracción tisular, se añadieron 5 ml de tampón fosfato reciente y se mantuvieron al vacío y con agitación orbital (100 rpm) a TA durante 10 min. Esta etapa de aclarado se repitió al menos 5 veces y podría incluir cofactores para la inactivación de las enzimas.

20 Para ajustar el proceso de descelularización y analizar el efecto de cada tratamiento sobre la efectividad de la descelularización y la conservación de proteínas de la MEC nativa, los tejidos se trataron en diversas condiciones: i) evitando uno de los tratamientos (tripsina y tritón-x100, lipasa o DNAsa), ii) aplicando diversas

25 concentraciones enzimáticas así como tiempos de incubación (tanto lipasa como DNAsa) y iii) aplicando una enzima de menor calidad (DNAsa para uso en investigación). A continuación en la Tabla 1 se muestra una descripción de las condiciones de tratamiento de descelularización para cada muestra.

CONDICIONES DE DESCELULARIZACIÓN

ID: TRIPSINA + TRITÓN-X100 LIPASA DNASA

BM1: 30 min. Tripsina/EDTA a 37 ºC y Tritón-x al 1 % durante la noche a TA 50 u./100 mg 23 h 37 ºC SIN TRATAR

BM2: Benzonasa EMPROVE® bio 714 u./mg 40 h. / 37 ºC

BM3: Benzonasa EMPROVE® bio 714 u./mg 72 h./ 37 ºC

BM4: Benzonasa EMPROVE® bio 1428 u./mg 40 h./ 37 ºC

BM5: Benzonasa EMPROVE® bio 1428 u./mg 72 h./ 37 ºC

BM6: 50 u/100 mg 23 h 37 ºC DNAsa para uso en investigación 1428 u./mg 72 h. / 37 ºC

LM1: SIN TRATAR Benzonasa EMPROVE® bio (Merck Millipore) 1428 u./mg 72 h. / 37 ºC

LM2: 25 u/100 mg 23 h 37 ºC

LM3: 25 u/100 mg 44 h 37 ºC

LM4: 50 u/100 mg 23 h 37 ºC

LM5: 50 u/100 mg 44 h 37 ºC

M7: SIN TRATAR 25 u/100 mg 44 h 37 ºC Benzonasa EMPROVE® bio 1428 u./mg 72 h./37 ºC

M8: 30 min. T/E a 37 ºC y Tritón-x al 1 % durante la noche a TA SIN TRATAR

Tabla 1: Descripción de las condiciones del proceso de descelularización e ID de la muestra

La mayoría de los tejidos, aunque no todos, se sometieron a un tratamiento previo con tripsina (CTS™ TrypLE™ 1X para su uso en la Fabricación de productos basados en tejido, Thermofishcer Scientific) y tritón-X100 (EMPROVE® bio Merck Millipore). Para ello, se añadió tripsina (3 ml/fracción tisular) y se mantuvo durante un corto periodo de tiempo (30 min) agitado con barras magnéticas (50 rpm) a 37 ºC. Después de aclarar, se añadió tritón-x100 al 1% en el tampón descrito anteriormente (8 ml/fracción tisular) y se mantuvo durante la noche a TA. Como se indica en la Tabla 1, algunos tejidos no se trataron con tripsina ni tritón-x100 (M7) con el fin de analizar el efecto de esta proteasa y el tratamiento con detergente en la conservación de la morfología del tejido y de las proteínas de la MEC.

Después de aclarar, los tejidos se trataron con una Lipoproteína lipasa (calidad IVD, Roche) a diversas concentraciones enzimáticas y tiempos de incubación (2550 u/100 mg durante 23 h o 44 h a 37 ºC, 100 rpm, con agitación orbital y al vacío, Tabla 1). La enzima se disolvió en el tampón descrito anteriormente (3 ml) en tritónx100 al 0,5 % (EMPROVE® bio, Merck Millipore).

Después de aclarar, los tejidos se trataron con una DNasa (Benzonasa EMPROVE® bio Merck Millipore) a diversas concentraciones enzimáticas y tiempos de incubación (714 u-1428 u/mg, durante 23 o 44 horas, a una temperatura de 37 ºC y a 100 rpm, con agitación orbital y al vacio). La enzima se disolvió en el tampón descrito anteriormente (3 ml) con la adición de cloruro de magnesio hexahidrato 2 mM EMPROVE® Merck Millipore) utilizado como cofactor enzimático. Algunos tejidos se trataron con DNAsa I de calidad para su uso en investigación (Sigma Aldrich Chemical) en condiciones específicas de Lipasa y DNAsa (50 u/100 mg y 714 u/mg a 72 h respectivamente).

Los TAhd se utilizaron recientes o liofilizados antes de la congelación para la caracterización del efecto de tratamiento sobre ADN residual, morfología tisular,

observación de núcleos celulares (Hematoxilina y Eosina) y expresión proteica y disposición de la MEC (inmunohistoquímica). Finalmente, algunos TAhd se sometieron a cuantificación del contenido total de triglicéridos y proteínas. La composición proteica se analizó por cromatografía en uno de los TAd (LM4).

3 Cuantificación del ADN residual El ADN mono y bicatenario residual, se analizó por Reacción en Cadena de la Polimerasa cuantitativa en Tiempo Real (qRT-PCR). El ADN se extrajo de los TAhd liofilizados con el kit QiAmp (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Para la cuantificación absoluta, se obtuvo una curva patrón de muestras de ADN de sangre humana de concentración conocida Para hacerlo, la extracción de ADN se realizó con el MiniKit Qiamp DNA Blood (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Se obtuvo una solución de ADN de 50 ng/ml y se analizó mediante un espectrofotómetro ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, USA) y se prepararon diluciones en serie. La detección se realizó a través de la secuencia específica del gen de la beta hemoglobina humana (HBB, 11p.15.5) y se analizó utilizando LightCycler 480II (Roche).

Las reacciones se realizaron por triplicado; los datos se mostraron como ADN residual (ng) por TAhd en peso seco (mg) y se sometieron a análisis estadístico como se describe más adelante. El límite de detección de la técnica se calculó en aproximadamente 20 pg de ADN. La cuantificación del ADN se realizó en DNAdata, un Centro de Diagnóstico de Enfermedades Genéticas autorizado por el Gobierno del País Vasco.

4 Análisis histológico Los TAhd recientes, conservados, se sometieron a análisis histológico de morfología tisular y observación de núcleos celulares mediante tinción con Hematoxilina y Eosina (HyE) y análisis inmunohistoquímico de proteínas de la MEC.

Para ello, los TAhd se introdujeron en formalina (Bellés Diagnóstic i Investigació), se incluyeron en parafina (Histowax LEICA) con un procesador automático de tejidos

(ASP300, Leica Microsystems) y se seccionaron a un tamaño de 3,5 μm. Algunas de las secciones se tiñeron con HyE siguiendo procedimientos propios. En resumen, las secciones se trataron con xileno (Bellés Diagnostics, S.L), alcohol (Citoscan, Bellés Diagnostics) y agua corriente antes del tratamiento con hematoxilina durante 4

5 7 min. (Hematoxilina Harris GURR® sin mercurio, VWR). Después de esto, las secciones se trataron con agua corriente y alcohol ácido (99:1, etanol: ácido hidroclorhídrico al 37 %, VWR) y Eosina durante 5-30 segundos (solución de azur eosina azul de metileno de Giemsa, VWR). Finalmente, las secciones se trataron con alcohol, xileno y medios de montaje DPX (Casa Álvarez).

10 La inmunohistoquímica se realizó para la detección de proteínas de colágeno de tipo I, colágeno de tipo-IV, laminina y proteoglucano de heparán sulfato 2 (HSPG2 o perlecan) con el sistema automático Benchmark XT (Roche Diagnostics). La metodología consistió en las siguientes etapas: i) desparafinado ii) recuperación

15 antigénica, iii) dilución e incubación con un anticuerpo monoclonal apropiado, iv) amplificación, detección y visualización con el Kit de Amplificación (Roche) y el Kit de Detección Ultraview Universal DAB (Roche). La tinción se optimizó para cada proteína utilizando como controles tejido de riñón, piel, colon, placenta y adiposo y las condiciones específicas que se detallaron en la Tabla 1. Las muestras se

20 visualizaron con un microscopio BX-51 (Olympus) y se digitalizaron utilizando un escáner RS Nanozoomer 2.0 RS (Hamamatzu). En la Tabla 2 (a continuación) se describen las condiciones IHC específicas para cada proteína.

Condiciones IHC y controles

Proteína: Recuperación antigénica Anticuerpo, dilución e incubación Control positivo

Colágeno de tipo I: Solución 1 de acondicionamiento celular (CC1, Roche) ph = 8,3 30 min. Anticuerpo Anticuerpo monoclonal de ratón contra colágeno de tipo I clon COL-I (Abcam) Riñón

Dilución: 1:200

Incubación: 37 ºC/32 min

Condiciones IHC y controles

Colágeno de tipo IV: CC1 (pH = 8,3) 30 min. Anticuerpo Anticuerpo monoclonal de ratón contra colágeno de tipo IV clon CIV22 (Roche) Riñón

Dilución: No se requiere dilución

Incubación: 37 ºC/32 min

Laminina: Pepsina-HCl 0,2 M (Sigma) TA 30 min. Anticuerpo Anticuerpo monoclonal de ratón contra laminina humana, clon 4C7 (Dako) Riñón

Dilución: 1:10

Incubación: TA/60 min

HSPG2/Perlecan: CC1 (pH = 8,3) 30 min. Anticuerpo Anticuerpo monoclonal de ratón contra proteoglucano de heparán sulfato 2, clon A74, (Abcam) Colon

Dilución: 1:10

Incubación: 37 ºC/32 min

Tabla 2: Condiciones específicas de análisis IHC para el colágeno de tipo I, colágeno de tipo IV, laminina y HSPG2.

5 Estas evaluaciones histológicas se realizaron en Althia Health, S.L. (Althia), una compañía acreditada por la Entidad Nacional de Acreditación (ENAC) de España para ensayos de Patología y Patología Molecular y como competencia técnica según los criterios de la norma UNE-EN-ISO 15189:2007 (número de referencia de

10 laboratorio 1029 / LE2012).

5 Cuantificación del contenido de triglicéridos La cuantificación de triglicéridos se realizó con el Kit de Cuantificación de

Triglicéridos (Biovision) según las instrucciones del fabricante. En resumen, se prepararon muestras de TAhd de 100 mg mediante homogeneización en una solución de 1 ml que contenía NP-40 al 5 % (Biovision) en agua y se calentó lentamente a 80-90 ºC en un baño de agua durante 5 min. Después de enfriar a temperatura ambiente, el proceso de calentamiento se repitió una vez más y el material insoluble se eliminó por centrifugación con velocidad durante 2 min. Las muestras extraídas se diluyeron 10 veces con agua desionizada. La absorbancia (570 nm) se midió por triplicado en muestras y patrones de triglicéridos en un espectrofotómetro de múltiples pocillos (Power Wave Xs, Biotek). La concentración de triglicéridos se obtuvo a partir de la curva patrón y se muestra como un porcentaje relativo considerando que el TAh original no tratado es el 100 % de contenido de triglicéridos.

6 Cuantificación del contenido de proteína total Para la cuantificación de proteína total, los TAhd se digirieron en primer lugar con pepsina ácida fría. Se preparó pepsina al 1 % (Sigma Aldrich) en solución de ácido acético 0,5 M (Panreac) y se añadió 1 ml/mg a los TAhd. La digestión se obtuvo con agitación orbital durante 48 h a TA. El pH ácido se neutralizó y las soluciones digeridas se centrifugaron a 4000 rpm durante 5 min. Los sobrenadantes se conservaron a -30 ºC hasta su uso.

El contenido de proteína total se analizó con el Kit PierceTM de Ensayo de Proteínas BCA (Thermoficher Scientific) según las instrucciones del fabricante. Se obtuvo una curva patrón con patrones de albúmina de suero bovino (BSA) incluidos en el kit. La absorbancia (580 nm) se midió por triplicado en muestras y patrones en un espectrofotómetro de múltiples pocillos (Power Wave Xs, Biotek). Los resultados se muestran como contenido de proteína (μg) por TAhd seco (mg).

7 Cromatografía líquida con análisis de espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) La composición proteica de un TAhd (LM4) se analizó mediante LC-MS/MS. Para la extracción de proteínas, el TAhd se homogeneizó en urea 8 M utilizando un

homogeneizador Precellys®24 (Bertin Technologies) con perlas de circonia/sílice de 1,0 mm de diámetro (BioSpect). El homogeneizado se sometió a ultrasonido durante 3 min para reducir la viscosidad y el extracto bruto se clarificó después por centrifugación a 16.000 x g durante 10 min, se transfirió a tubos nuevos y se conservó a -20 ºC. Después de esto, se realizó la digestión proteica diluyendo la muestra 5 veces con NH4HCO3 50 mM. En resumen, las proteínas se redujeron (DTT 5 mM, temperatura ambiente, 25 min), se alquilaron (yodoacetamida 15 mM, temperatura ambiente, 30 min) y se digirieron con tripsina (0,01 μg/μl, 37 ºC, 16 horas, Roche Diagnostics). Los péptidos resultantes se desalinizaron utilizando Columnas Micro Spin C-18 (Equipo Harvard).

El análisis LC-MS/MS se realizó utilizando un Q Exactive (Thermo Scientific) interconectado con un Sistema nanoUPLC Easy-nLC 1000 (Thermo Scientific). Los péptidos digeridos se cargaron en una precolumna Acclaim PepMap100 (75 μm x 2 cm, Thermo Scientific) conectada a una columna analítica Acclaim PepMap RSLC (50 μm x 15 cm, Thermo Scientific). Los péptidos se eluyeron directamente en el emisor nanoES (Thermo Scientific) con un gradiente lineal de acetonitrilo del 3 % al 30 % durante 45 min en ácido fórmico al 0,1 % a un caudal de 300 nl/min. El Q Exactive funcionó en un modo de Adquisición Dependiente de Datos FullMS/dd-MS2 (Top10). Los escáneres de estudio se adquirieron a una resolución de 70000 (m/z 200) y los espectros de fragmentación a 17500 (m/z 200). La selección de péptidos se realizó con una ventana de aislamiento de 2,0 Th y se aplicó una energía de colisión normalizada de 28 para la fragmentación de péptidos. El tiempo máximo de inyección fue de 120 ms para escáneres de estudio y MS/MS y se utilizaron valores AGC diana de 3E6 para los escáneres de estudio y de 5E5 para los escáneres MS/MS. Se procesaron los archivos originales y se investigaron con el programa informático MaxQuant1 (versión 1.5.3.17) y el motor de búsqueda Andromeda2. Las tolerancias de masa de precursores y fragmentos se establecieron en 4,5 y 20 ppm respectivamente y se permitieron hasta 2 escisiones omitidas. La carbamidometilación de Cys se estableció como modificación fija, la oxidación de Met y la acetilación en el N terminal de la proteína como modificaciones variables y se utilizó una base de datos UniProtKB-SwissProt humana (versión 2015_09). Se

requirió una tasa de falso descubrimiento (FDR, false discovery rate) de 0,01 para péptidos y proteínas y una longitud peptídica mínima de 7 aminoácidos. Los resultados obtenidos se exportaron a Microsoft Office Excel (Microsoft) para su análisis posterior.

5 El análisis de espectrometría de masas se realizó en el Proteomics Core Facility-SGIKER (miembro de ProteoRed-ISCIII) en la Universidad del País Vasco.

8 Análisis estadístico

10 Los resultados cuantitativos se refirieron como media  desviación típica y se realizó un análisis estadístico de los datos de ADN residual utilizando la prueba de la t de Student (p > 0,05, p ≥ 0,01 y p ≥ 0,001).

Resultados y Comentarios

15 1 Cuantificación del ADN residual

Todos los TAhd analizados, excepto el BM1 (no tratado con Benzonasa), mostraron un ADN residual muy bajo (Tabla 3, más adelante) y cumplieron con los criterios

20 generales de descelularización (ADN ≤ 50 ng/mg), un umbral por encima del cual se han descrito reacciones inmunitarias in vivo (Crapo PM., et. al., mencionado anteriormente). BM1 mostró un peso seco de 365,506 ± 78,105 ng/mg mientras que los TAhd obtenidos con diferentes condiciones de incubación de la Benzonasa, mostraron un ADN residual entre 0,004-0,613 ng/mg en peso seco (BM2-BM5). El

25 ADN residual en los TAhd fue significativamente más bajo tanto a mayor concentración enzimática (B2 frente a BM4) como a mayor tiempo de incubación (BM2 frente a BM3 y BM4 frente a BM5). Las diferencias fueron bajas (0,5-0,6 ng/mg en peso seco) aunque hasta el límite de detección de la técnica (20 pg).

ADN RESIDUAL

ID: PROMEDIO  DESVIACIÓN TÍPICA ng de ADN/mg de TAhd en peso seco T de Student frente a BM1 T de Student frente a BM2

BM1: 356,506 ± 78,102 *

ADN RESIDUAL

BM2: 0,613 ± 0,050 *

BM3: 0,004 ± 0,002 * **

BM4: 0,109 ± 0,015 * **

BM5: 0,047 ± 0,005 * **

BM6: 4,150 ± 0,187 T de Student frente a BM3

**

LM1: 0,0002 ± 0,0003 T de Student frente a LM1

LM3: 0,306 ± 0,005 **

LM4: 0,045 ± 0,017 *

LM5: 0,212 ± 0,023 **

M7: 0,015 ± 0,004 *

Tabla 3: Resultados de la cuantificación de ADN residual en los TAhd. El análisis estadístico de la t de Student de las diferencias significativas entre el ADN residual obtenido con diferentes condiciones de descelularización *(p>=0,01) y **(p>=0,001).

5 Cuando se modificaron las calidades de los reactivos, se encontraron mayores diferencias en el ADN residual. Se compararon los tratamientos con DNAsa (BM6) de calidad para investigación y Benzonasa Emprove BIO (BM3) y BM6 mostró un ADN residual inferior estadísticamente significativo de 4,146 ng/mg en peso seco

10 (Tabla 3).

El ADN residual en los TAhd mostró diferencias también según el tratamiento con lipasa. LM1 (no tratado con Lipasa) mostró un ADN residual inferior estadísticamente significativo (0,2-0,3 ng/mg) en comparación con LM3 y LM5 (tratado durante 44 h

15 con 25 u/100 mg y 50 u/100 mg respectivamente). Este efecto podría atribuirse a interacciones entre las enzimas en los procesos de descelularización. Cuando se aplicó un tratamiento de 23 h con lipasa (LM4), el efecto de la enzima sobre el ADN residual fue irrelevante (0,045 ng/mg).

20 El TAhd no tratado con tripsina ni tritón-x100 (M7) mostró un ADN residual estadísticamente inferior (0,015 ng/mg) que el obtenido con el tratamiento previo con tripsina y tritón-x100 (LM3, 0,306 ng/mg). Las diferencias fueron bajas (0,29 ng/mg)

aunque hasta el límite de detección de la técnica (20 pg).

2 Análisis histológico e IHC Morfológicamente, la tinción con HyE de los TAhd mostró un tejido adiposo maduro en el que destaca la ausencia de núcleos celulares, pero donde se observa la conservación de la estructura tisular: se reconoce el espacio citoplasmático de los adipocitos y el tejido fibroso más denso así como las estructuras vasculares. La FIG. 1 muestra una tinción comparativa con HyE de TAh y TAhd (como ejemplo, LM4). El TAh contiene varias proteínas de la MEC y de la Membrana Basal (MB), entre las que se incluye colágeno de tipo I-IV, laminina, fibronectina, elastina y glucosaminoglucanos (GAG). En esta investigación, el colágeno de tipo I, el colágeno de tipo IV, la laminina y un proteoglucano de heparán sulfato específico de la MB (HSPG2) se han analizado por IHC. La FIG. 2 muestra la conservación de un patrón de expresión muy similar de las proteínas de la MEC y de la MB de TAh en TAhd procesado (LM4 como ejemplo). El colágeno de tipo I se expresó principalmente en la región fibrótica, el colágeno de tipo IV y la laminina se observaron principalmente alrededor de los adipocitos (también se observó laminina en la región fibrilar, no colágeno de tipo IV). El patrón de expresión específico de la proteína HSPG2 también se ha conservado durante el procesamiento, HSPG2 se expresó en la región fibrilar y menos heterogéneamente en las regiones adipocíticas. Finalmente, las estructuras vasculares también se han conservado y las proteínas de la MB se expresaron de manera similar en el TAh original.

Sin embargo, se observaron variaciones en las estructuras tisulares y en la expresión de proteínas en los TAhd obtenidos en diferentes condiciones del proceso de descelularización. En relación con el tratamiento de lipasa, determinada concentración de lipasa y el tiempo de incubación afectaron a la morfología y a las proteínas de los TAhd resultantes. En particular, el TAhd LM5 (tratado con 50 u/100 mg y 44 h de incubación a 37 ºC) mostró alteraciones en la morfología tisular: estructuras vasculares no visibles y destrucción de la estructura de la MEC en las regiones fibrilares observadas por tinción con HyE y disminución de la expresión del colágeno de tipo I (FIG. 3, comparativa entre LM3 y LM5). No se

observaron alteraciones significativas en la expresión de colágeno de tipo IV, laminina y HSPG2. Estos resultados mostraron un límite en el tratamiento con lipasa relacionado con la conservación de la morfología tisular original y con la expresión de proteínas, lo que podía considerarse como que las condiciones de descelularización eran inferiores a las del TAhd LM5.

También se observaron algunas diferencias relacionadas con los tratamientos con nucleasa (Benzonasa). En el TAhd M8 (no tratado con Benzonasa) se observaron algunos núcleos celulares tanto en las regiones adipocíticas como en las fibrosas. Como se muestra con el tratamiento con lipasa, la Benzonasa también produce alteraciones en las estructuras fibrilares del tejido y una disminución de la expresión del colágeno de tipo I (FIG. 4). No se observaron alteraciones significativas en la expresión de colágeno de tipo IV, laminina y HSPG2. Estos resultados mostraron que el tratamiento con Benzonasa debe determinarse por el ADN residual (en nuestras investigaciones, el límite mostrado en el tratamiento con Benzonasa fue las condiciones del TAhd BM3).

El efecto del tratamiento previo con tripsina/tritón-x 100 se analizó a través de observación histológica de los TAhd obtenidos con y sin tratamiento previo (LM3 frente a M7). El TAhd M7 mostró una conservación histológica claramente superior de la morfología tisular original y la expresión de proteínas siendo el TAhd analizado en esta investigación el más conservado (FIG. 5). Aunque el tratamiento con tripsina fue muy corto y el tritón x-100 se añadió en un porcentaje muy bajo (1 %), estos resultados mostraron un efecto adverso considerable de los tratamientos con detergentes no iónicos y tripsina sobre la conservación de la morfología tisular y proteínas de la MEC en la descelularización de TAh.

3 Cuantificación del contenido de triglicéridos La cuantificación de triglicéridos mostró la eficacia del tratamiento con lipasa sobre la deslipidación de TAh observada también macroscópicamente (FIG. 6). El aumento de la concentración y del tiempo de incubación de la lipasa mostró un TAhd con un contenido de triglicéridos disminuido (que variaba del 70 10% a 15  10%) en

comparación con el TAh original (considerado como contenido de triglicéridos al 100 %). Los resultados también mostraron diferencias entre el TAhd no tratado con un tratamiento previo de tripsina/tritón-x 100 y tratamiento con Benzonasa. La ausencia de estos tratamientos da como resultado una menor cantidad de TAhd

5 deslipidados (LM3 frente a M7).

4 Cuantificación del contenido de proteína total En la Tabla 4 (a continuación) se muestran los resultados del contenido de proteína total de los TAhd y se muestran las diferencian entre los TAhd investigados. Se

10 observaron algunas diferencias en los TAhd obtenidos por diferentes tratamientos con lipasa. Cuando el contenido de proteína LM1 no tratada se comparó con los TAhd LM2 y LM4 tratados con lipasa, se observó un contenido de proteína total más bajo. Sin embargo, en los obtenidos durante un tiempo de incubación más prolongado con lipasa (LM5), se observó un mayor contenido de proteína total y

15 podría atribuirse a un TAhd más deslipidado. Se necesita una caracterización más específica para determinar el efecto de los tratamientos sobre el contenido proteico que dependería del intervalo de deslidipidización.

CONTENIDO DE PROTEÍNA TOTAL

ID: PROMEDIO  DESVIACIÓNTÍPICA (μg de proteína/mg de TAhd en peso seco)

LM1: 759,1 ± 17,0

LM2: 565,2 ± 22,3

LM3: 931,5 ± 21,5

LM4: 693,6 ± 6,5

LM5: 820,6 ± 14,5

M7: 796,3 ± 20,6

M8: 824,12 ± 12,5

20 Tabla 4. Resultados del contenido de proteína total de algunos TAhd obtenidos durante la investigación

5.-Análisis LC-MS/MS El análisis específico de proteínas se llevó a cabo para el TAhd LM4. Los resultados mostraron una composición de 136 proteínas humanas conservadas después del proceso de descelularización (tasa de falso descubrimiento: 1 % y descartando las proteínas detectadas por 1 péptido).

La Tabla 5 (más adelante) muestra algunas de las proteínas conservadas después del proceso de descelularización con especial relevancia en la composición, interacciones y ensamblaje de proteínas de la MEC y de la MB. Los resultados incluyen colágenos (I, IV, VI, XV y XVIII), glucoproteínas (familias de las proteínas laminina, fibulina, emilina, tenascina y fibrina), proteoglucanos (lumicano, decorina, mimecano y biglicano) y un proteoglucano sulfatado específico de la MB (HSPG2). También se han identificado otros ligandos así como proteínas de fosforilación y de anclaje (Nidógeno, Periostina, Prolargina, proteína s-100).

Los colágenos intervienen en procesos biológicos esenciales tales como angiogénesis, organización de la membrana basal, morfogénesis de los vasos sanguíneos, adhesión y migración celular, proceso biosintético del colágeno, proceso catabólico del colágeno, diferenciación celular endodérmica, morfogénesis de células endoteliales, diferenciación de células epiteliales, organización de las fibrillas extracelulares, desensamblaje de la matriz extracelular, organización de la matriz extracelular, modelado de vasos sanguíneos, regulación de la organización de componentes celulares, desarrollo de la piel, cicatrización de heridas, diseminación epidérmica, diferenciación de osteoblastos, homeostasis de diversas células dentro de un tejido, adhesión entre células de un solo organismo, morfogénesis de órganos, regulación positiva de la proliferación celular, respuesta a la presión hidrostática.

Las glucoproteínas (familias de las proteínas laminina, fibulina, emilina, tenascina y fibrina) intervienen en procesos biológicos entre los que se incluyen la organización del citoesqueleto de actina, adhesión celular, adhesión de la matriz celular, organización de las fibrillas de colágeno, proceso metabólico del colágeno,

ensamblaje de fibras elásticas, desarrollo del endodermo, diferenciación celular del endodermo, organización de las fibrillas extracelulares, desensamblaje de la matriz extracelular, organización de la matriz extracelular, proceso metabólico de ácidos grasos, regulación de la adhesión celular, regulación de la migración celular, regulación del desarrollo embrionario, regulación positiva de la proliferación de células epiteliales, diseminación celular dependiente de la adhesión al sustrato, ruta de señalización del receptor del factor de crecimiento epidérmico, localización de proteínas en la superficie celular, regulación del crecimiento celular, regulación de la eliminación de radicales superóxido, secreción, proceso metabólico de triglicéridos.

Los proteoglucanos (lumicano, decorina, mimecano y biglicano) intervienen en procesos biológicos entre los que se incluyen procesos metabólicos de hidratos de carbono, desarrollo de cartílago, proceso biosintético de condroitín sulfato, proceso catabólico de condroitín sulfato, proceso metabólico de condroitín sulfato, organización de fibrillas de colágeno, proceso metabólico de dermatán sulfato, desensamblaje de la matriz extracelular, organización de la matriz extracelular, proceso metabólico de glucosaminoglucanos, proceso biosintético de queratán sulfato, proceso catabólico de queratán sulfato, proceso metabólico de queratán sulfato, morfogénesis de órganos, reticulación de péptidos a través del glucosaminoglucano condroitín 4-sulfato, regulación positiva de la producción de factor de crecimiento transformante beta 1, respuesta a factores de crecimiento, respuestas a estímulos mecánicos, en el desarrollo de tejido musculoesquelético, en el proceso metabólico de moléculas pequeñas y en la cicatrización de heridas.

El proteoglucano de heparán sulfato 2 (HSPG2) específico de la BM, interviene en la angiogénesis, en el desarrollo del cerebro, en el proceso metabólico de hidratos de carbono, en el desarrollo de tejido del músculo cardíaco, en el desarrollo de cartílago involucrado en morfogénesis ósea endocondral, en la diferenciación de condrocitos, en el proceso metabólico de condroitín sulfato, en la morfogénesis del sistema esquelético embrionario, en la osificación endocondral, en el desensamblaje de la matriz extracelular, en la organización de la matriz extracelular, en el proceso biosintético de glucosaminoglucanos, en el proceso catabólico de

glucosaminoglucanos, en el proceso metabólico de glucosaminoglucanos, en el proceso metabólico de lipoproteínas, en la fototransducción, luz visible, localización de proteínas, en el proceso metabólico de retinoides y en el proceso metabólico de moléculas pequeñas.

5 Las proteínas Nidógeno, Periostina, Prolargina, proteína s-100, son proteínas de fosforilación de ligando y de anclaje, que intervienen en la organización de la membrana basal, en el proceso metabólico de hidratos de carbono, en el envejecimiento celular, adhesión celular, desensamblaje de la matriz celular,

10 establecimiento de la localización de proteínas en la membrana plasmática, organización de la matriz extracelular, proceso metabólico de glucosaminoglucanos, proceso biosintético de queratán sulfato, proceso catabólico de queratán sulfato, proceso metabólico de queratán sulfato, gemación de membrana, ensamblaje de balsas de membrana, regulación positiva de unión, regulación positiva de adhesión

15 de la célula al sustrato, regulación positiva de ensamblaje de adhesión focal, regulación positiva de la actividad GTPasa, regulación positiva del ensamblaje de fibras de estrés, regulación positiva de diseminación celular dependiente de la adhesión al sustrato, heterotramerización de proteínas, proceso metabólico de moléculas pequeñas, desarrollo del sistema esquelético y desarrollo de tejido.

ID DE PROTEÍNAS: NOMBRES DE PROTEÍNAS NOMBRES DE GENES PÉPTIDOS PÉPTIDOS ÚNICOS

P98160: Proteína núcleo del proteoglucano heparán sulfato específico de la membrana basal HSPG2 21 21

P21810: Biglicano BGN 5 5

P27797: Calreticulina CALR 2 2

P02452: Cadena alfa-1(I) de colágeno (I) COL1A1 12 12

P02462-2;P02462: Cadena alfa-1 de colágeno (IV); Arresten COL4A1 4 4

P12109: Cadena alfa-1 de colágeno (VI) COL6A1 13 13

P39059: Cadena alfa-1(XV) de colágeno; COL15A1 2 2

Restina; Restina2;Restina3;Restina-4

P39060-2;P390601;P39060: Cadena alfa-1de colágeno (XVIII); Endostatina COL18A1 2 2

P08123: Cadena alfa-2 de colágeno (I) COL1A2 6 6

P08572: Cadena alfa-2 de colágeno (IV); Canstatina COL4A2 4 4

P12110;P12110-3; P12110-2: Cadena alfa-2 de colágeno (VI) COL6A2 10 10

P12111-4;P121112;P12111;P121113;P12111-5: Cadena alfa-3 de colágeno (VI) COL6A3 52 52

P07585;P07585-4; P07585-2;P07585-3: Decorina DCN 10 10

Q12805-2;Q128054;Q12805;Q128053;Q12805-5: Proteína 1 de la matriz extracelular similar a fibulina que contiene EGF EFEMP1 9 9

Q07507: Dermatopontina DPT 4 4

Q9Y6C2;Q9Y6C2-2: EMILINA-1 EMILIN1 4 4

P35555;P35556: Fibrillina-1 FBN1 31 31

Q9UBX5: Fibulina-5 FBLN5 2 2

P02675; CON__P02676: Cadena beta de Fibrinógeno; Fibrinopéptido B; cadena beta de Fibrinógeno FGB 3 3

P09382: Galectina-1 LGALS1 6 6

Q16363-2;Q16363: Subunidad alfa-4 de laminina LAMA4 5 5

P07942: Subunidad beta-1 de laminina LAMB1 3 3

P55268: Subunidad beta-2 de laminina LAMB2 6 6

P11047: Subunidad gamma-1 de laminina LAMC1 10 10

P51884;CON__Q05443: Lumicano LUM 9 9

P55083; P55083-2: Glucoproteína 4 asociada a microfibrillas MFAP4 2 2

P20774: Mimecano OGN 4 4

P14543-2;P14543: Nidógeno-1 NID1 9 9

Q14112;Q14112-2: Nidógeno-2 NID2 12 12

Q15063-4;Q150632;Q15063-3;Q150635;Q15063;Q150637;Q150636;CON__Q2KJC7: Periostina POSTN 6 6

P02545-2;P025456;P02545;P025453;P02545-5;P02545-4: Prelamina-A/C;Lamina-A/C LMNA 11 11

P51888: Prolargina PRELP 5 5

P60903: Proteína S100-A10 S100A10 2 2

P22105;P22105-3; P22105-4: Tenascina-X TNXB 2 2

Tabla 5: Proteínas de la MEC y de la membrana basal conservadas en TAhd (ML4) e identificadas por LC-MS/MS.

5 Como puede observarse en los análisis presentados anteriormente, la composición de las matrices descelularizadas obtenidas, es rica en todos los componentes, lo que garantiza un aprovechamiento satisfactorio en todas las aplicaciones deseadas.

Finalmente, ha de añadirse que los inventores han comenzado estudios preliminares

10 de diferentes técnicas de procesamiento de materiales con el fin de descubrir si las matrices descelularizadas de la presente invención son fácilmente susceptibles de manipulación con el objetivo de producir diferentes productos finales para una variedad de aplicaciones. Como puede observarse en la FIG. 8, las matrices permiten su procesamiento con diversas tecnologías: podrían disolverse y liofilizarse

15 satisfactoriamente, micronizarse en nitrógeno líquido, comprimirse y enrollarse para obtener un armazón poroso, formatos en polvo, laminares y cilíndricos que permitirían aplicar perfectamente el material a las aplicaciones descritas.

REFERENCIAS CITADAS EN LA SOLICITUD

20 Gilbert TW., et. al. “Strategies for tissue and organ decellularization” J. Cell. Biochem. 2012, vol. 113, págs. 2217-2222

Crapo, PM., et. al. “An overview of tissue and whole processes” Biomaterials 2011, vol. 32, págs. 3233-3243: organ decellularization

5: US2012/0264190 US2011/0151011

US2013/0202563

10: WO2011/132089

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un método de descelularización de tejido adiposo que comprende las etapas de: a) Laminar el tejido adiposo; b) Tratar el tejido adiposo resultante de la etapa a) con una lipoproteína lipasa: a una concentración de 10-30 u/100 mg durante 39-49 horas a 32-42 grados Celsius o a una concentración de 45-55 u/100 mg durante 18-28 horas a 32-42 grados Celsius; y c) Tratar el tejido adiposo resultante de la etapa b) con una nucleasa: a una concentración de 709-719 u/mg durante 67-77 horas a 32-42 grados Celsius o a una concentración de 1423-1433 u/mg durante 35-45 horas a 32-42 grados Celsius o a una concentración de 1423-1433 u/mg durante 67-77 horas a 32-42 grados Celsius; para que el tejido adiposo tenga un contenido de ADN total igual o inferior a 50 ng/mg.
2.

El método de descelularización de tejido adiposo según la reivindicación 1, en el que dicho método no comprende el uso de disolventes orgánicos.
3.

El método de descelularización de tejido adiposo según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que: en la etapa b) el tratamiento se realiza a una concentración de 25 u/100 mg durante 44 horas a 37 grados Celsius o una a una concentración de 50 u/100 mg durante 23 horas a 37 grados Celsius, y la etapa c) se realiza a una concentración de 709719 u/mg durante 67-77 horas a 32-42 grados Celsius o a una concentración de 1423-1433 u/mg durante 35-45 horas a 32-42 grados Celsius o a una concentración de 1423-1433 u/mg durante 67-77 horas a 32-42 grados Celsius.
4.

El método de descelularización de tejido adiposo según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que: la etapa b) se realiza a una concentración de 10-30 u/100 mg durante 39-49 horas a 32-42 grados Celsius o a una concentración de 45-55 u/100 mg durante 18-28 horas a 32-42 grados Celsius, y en la etapa c) el tratamiento se realiza a una concentración de 714 u/mg durante 72 horas a 37 grados Celsius o a una concentración de 1428 u/mg durante 40 horas a 37 grados Celsius o a una concentración de 1428 u/mg durante 72 horas a 37 grados Celsius.
5.

El método de descelularización de tejido adiposo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que adicionalmente comprende una etapa entre las etapas a) y b), en el que el tejido adiposo resultante de la etapa a) se trata con tripsina y tritón-X100.
6.

El método de descelularización de tejido adiposo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que adicionalmente comprende una etapa d) que comprende congelar o liofilizar y esterilizar el tejido adiposo resultante de la etapa c).
7.

El método de descelularización de tejido adiposo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que en las etapas b) y c), los tratamientos se realizan al vacío y con agitación a 100-150 rpm.
8.

El método de descelularización de tejido adiposo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que después de las etapas a), b) y c), hay una etapa de lavado con tampón a temperatura ambiente, al vacío y con agitación a 100-150 rpm, y en el que en la etapa de lavado después de la etapa a) el tampón comprende adicionalmente al menos un antibiótico, al menos un antimicótico y al menos un inhibidor de proteasa, en la etapa de lavado después de la etapa b) el tampón comprende al menos un antibiótico, al menos un antimicótico, al menos un inhibidor de proteasa y al menos un inhibidor de lipasa y en el que en la etapa de lavado después de la etapa c) el tampón comprende adicionalmente al menos un antibiótico, al menos un antimicótico, al menos un inhibidor de proteasa y al menos

un inhibidor de nucleasa.
9. Un matriz de tejido adiposo descelularizado obtenible mediante el método según

cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8. 5
10.

El tejido adiposo descelularizado según la reivindicación 9, en el que el tejido adiposo tiene un contenido de ADN total de 0,015 a 0,306 ng/mg.
11.

El tejido adiposo descelularizado según cualquiera de las reivindicaciones 9 a

10 10, en el que el tejido adiposo tiene un contenido de proteína total de 100-931 ug/mg y un contenido de proteína total de 100-931 ug/mg y un contenido de triglicéridos total de 25-75 % en peso.
12. Un polvo, una espuma, una partícula o un hidrogel que comprende el tejido 15 adiposo descelularizado según cualquiera de las reivindicaciones 9-11.
13. Un armazón biocompatible o un revestimiento biocompatible que comprende el tejido adiposo descelularizado según cualquiera de las reivindicaciones 9-11 o el polvo, la espuma, la partícula o el hidrogel según la reivindicación 12.
14. El tejido adiposo descelularizado según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, el polvo, la espuma, la partícula o el hidrogel según la reivindicación 12, o el armazón biocompatible o el revestimiento biocompatible según la reivindicación 13 para su uso en ingeniería tisular y terapia regenerativa.
15. El tejido adiposo descelularizado para su uso según la reivindicación 14, en el que la terapia es una terapia de cicatrización de heridas.