KR20120079080A - 형광 영상을 이용한 명시야 영상 생성 시스템 및 방법 - Google Patents
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Abstract
형광 영상을 이용하여 생물학적 샘플의 명시야 염색 프로토콜과 닮은 명시야 타입 영상을 생성하는 방법이 제공된다. 단계들은 생물학적 샘플의 고정된 영역의 둘 이상의 형광 영상을 획득하고, 상기 형광 영상을 명시야 색 공간에 맵핑하고, 명시야 영상을 생성하는 것을 포함한다. 또한, 형광 영상을 이용하여 생물학적 샘플의 명시야 타입 영상을 생성하는 영상 분석 시스템도 제공된다.
Description
본 발명은 일반적으로 형광현미경으로 획득한 한 세트의 생체표지자 영상을 새로운 색 공간에 맵핑(mapping)하는 방법에 관한 것이고, 여기서, 맵핑된 영상 강도 값은 명시야 모달리티(modality)를 나타낸다.
헤마톡실린 및 에오신(H&E)에 의한 전통적인 조직학적 염색에서는, 호염기성 염료인 헤마톡실린 (H)이 세포핵을 청색으로 염색하는 데 이용되고, 호산성 염료인 에오신(E)이 대조염색으로서 세포질, 결합조직(콜라겐), 근육섬유, 결합조직 및 적혈구 염색에 이용된다. 에오신은 조직의 상이한 세포 성분들과 상호작용하여 에오신이 결합하는 분자의 전하 성질에 기초하여 상이한 분홍색 그림자를 생성한다. 별법으로, 형광 염료와 함께 분자 표지자(염료 및 항체)를 이용하여 이들 세포 성분을 표지할 수 있다. 예를 들어, 세포핵은 DAPI(DNA에 특이적으로 결합하는 형광 염료)로 염색될 수 있고, 한편, 조직의 다른 영역들은 관심 분자가 직접 접합 항체에 의해 표적화되는 면역형광법에 의해 또는 일차 이차 증폭 검출에 의해 표지될 수 있다. 일부 구조, 예컨대 적혈구(RBC)의 경우에는, 한 세트의 필터에 의해 포착되는 조직 자가형광이 검출에 이용될 수 있다. 형광 영상화(imaging) 모달리티는 이들 각 조직 구조를 포착하여 정확한 위치파악 및 정량을 가능하게 한다는 이점을 가진다.
그러나, 형광 영상은 병리학자가 진단하는 데 필수적인 구조적 및 형태학적 세부 사항을 제공하지 않기 때문에, 형광 영상에 기초한 조직병리학적 진단은 흔한 관행은 아니다. 또한, 병리학 실험실에서 수 십년 동안 모은 명시야 H&E 염색 기술에 대한 대규모 지식이 존재하기 때문에, 종종 명시야 H&E 염색 기술을 선호한다.
병리학자가 동일한 세트의 형광 영상에 대해 정량 분석 뿐만 아니라 병리학적 진단도 수행할 수 있게 하기 위해서는 형광 영상을 명시야 영상과 닮은 색 도메인, 예컨대 H&E로 변환하는 방법이 바람직하다.
간단한 설명
아는 바와 같이, 이전에는 형광 표지자를 단독으로 이용하여 핵, 상피 및 간질을 식별하여 세포 구획에 대한 정보를 제공하였다. 이 방법은 형광 표지자의 형태학적 기능과 형광 생체표지자의 기능을 조합하고, 세포 형태학 및 생물학적 경로에 부분적으로 기초하여 조직에서의 단백질 발현 및 질환 경로를 식별하는 데 이용된다. 게재된 발명은 형광현미경으로 획득한 한 세트의 생체표지자 및 자가형광 영상을 새로운 색 공간에 맵핑하는 방법을 기술하고, 여기서 맵핑된 영상 강도 값은 명시야 모달리티, 예컨대 H&E 염색을 나타낸다.
한 실시양태에서는, 형광 영상을 이용하여 생물학적 샘플의 명시야 염색 프로토콜과 닮은 명시야 타입 영상을 생성하는 방법이 제공된다. 이 방법은 생물학적 샘플의 고정된 영역의 둘 이상의 형광 영상을 획득하는 단계, 상기 형광 영상을 명시야 색 공간에 맵핑하는 단계, 및 명시야 영상을 생성하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서는, 형광 영상을 이용하여 생물학적 샘플의 명시야 염색 프로토콜과 닮은 명시야 타입 영상을 생성하는 영상 분석 시스템이 제공된다. 이 시스템은 생물학적 샘플의 고정된 영역의 둘 이상의 형광 영상을 획득하도록 적합화된 디지털 영상화 장치, 및 맵핑 파라미터를 적용하여 둘 이상의 형광 영상을 명시야 타입 영상으로 변환하도록 적합화된 처리 장치를 포함한다.
다음 상세한 설명을 첨부 도면과 관련하여 읽을 때 본 발명의 이러한 특징, 측면 및 이점, 및 다른 특징, 측면 및 이점이 더 잘 이해될 것이고, 도면 전체에 걸쳐서 같은 부호는 같은 부분을 나타낸다.
도 1은 결장조직 샘플(샘플 A)의 5개의 형광 영상 및 대응하는 생성된 H&E 타입 영상의 단색 실시양태를 나타낸 도면이다.
도 2는 결장조직 샘플(샘플 B)의 5개의 형광 영상 및 대응하는 생성된 H&E 타입 영상의 단색 실시양태를 나타낸 도면이다.
도 3은 형광 영상으로부터 생성된 H&E 타입 영상과 비교하여 H&E 염색된 결장조직의 3-채널(적색, 녹색, 청색) 유색 영상의 단색 실시양태를 나타낸 도면이다.
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상세한 설명
청구된 발명의 주제를 더 명료하고 간결하게 기술하고 지적하기 위해, 하기 설명 및 여기에 첨부된 특허청구범위에서 사용되는 특이한 용어들에 대해 다음과 같은 정의를 제공한다.
본원에서 사용되는 "항체"라는 용어는 또 다른 분자의 특정 공간 및 극성 구조에 특이적으로 결합함으로써 그와 상보적인 것으로 정의되는 면역글로불린을 의미한다. 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있고, 당 업계에 잘 알려진 기술, 예컨대 숙주의 면역화 및 혈청(폴리클로날) 수거에 의해, 또는 연속 혼성세포주를 제조하여 분비된 단백질(모노클로날)을 수거함으로써, 또는 적어도 천연 항체의 특이적 결합에 요구되는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 돌연변이형을 클로닝하여 발현함으로써 제조될 수 있다. 항체는 완전한 면역글로불린 또는 그의 단편을 포함할 수 있고, 이 면역글로불린은 다양한 부류 및 이소타입, 예컨대 IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3, IgM을 포함한다. 기능성 항체 단편은 전체 길이 항체와 유사한 친화도로 결합을 보유할 수 있는 항체의 부분을 포함할 수 있다(예를 들어, Fab, Fv 및 F(ab')2 및 Fab'). 추가로, 한 특정 분자에 대한 결합 친화도가 실질적으로 유지되기만 한다면, 적당한 경우, 면역글로불린 또는 그의 단편의 응집체, 중합체, 및 접합체가 이용될 수 있다.
본원에서 사용되는 "결합제"라는 용어는 생물학적 샘플에서 하나 이상의 표적에 결합할 수 있는 분자를 의미한다. 결합제는 표적에 특이적으로 결합할 수 있다. 적당한 결합제는 천연 또는 변형 펩티드, 단백질(예를 들어, 항체, 애피바디(affibody) 또는 압타머(aptamer)), 핵산(예를 들어, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA 또는 압타머); 다당류(예를 들어, 렉틴, 당), 지질, 효소, 효소 기질 또는 억제인자, 리간드, 수용체, 항원 또는 햅텐 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 적당한 결합제는 분석할 샘플 및 검출에 이용할 수 있는 표적에 의존하여 선택할 수 있다. 예를 들어, 샘플 중의 표적이 리간드를 포함할 수 있고 결합제가 수용체를 포함할 수 있거나, 또는 표적이 수용체를 포함할 수 있고 결합제가 리간드를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 표적이 항원을 포함할 수 있고 결합제가 항체 또는 항체 단편을 포함할 수 있거나, 또는 그 역이다. 일부 실시양태에서는, 표적이 핵산을 포함할 수 있고 결합제가 상보적 핵산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서는, 표적 및 결합제 둘 모두가 서로 결합할 수 있는 단백질을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 "생물학적 샘플"이라는 용어는 생체내 또는 시험관내로부터 얻은 생물학적 조직 또는 체액 기원의 샘플을 포함하는 생물학적 대상체로부터 얻은 샘플을 의미한다. 이러한 샘플은 사람을 포함하는 포유동물로부터 단리된 체액(예를 들어, 혈액, 혈장, 혈청 또는 소변), 기관, 조직, 분획, 및 세포일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 또한, 생물학적 샘플은 조직을 포함하는 생물학적 샘플의 절편(예를 들어, 기관 또는 조직의 분할 부분)을 포함할 수 있다. 또한, 생물학적 샘플은 생물학적 샘플로부터의 추출물, 예를 들어, 생물학적 체액(예를 들어, 혈액 또는 소변)으로부터의 항체를 포함할 수 있다.
생물학적 샘플은 원핵세포 또는 진핵세포 기원(예를 들어, 곤충, 원생동물, 조류, 어류, 파충류)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 포유동물(예를 들어, 쥐, 마우스, 소, 개, 당나귀, 기니아피크 또는 토끼)이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 영장류 기원(예를 들어, 침팬치 또는 사람)이다.
본원에서 사용되는 "형광단" 또는 "형광 신호 발생 물질"은 빛의 특정 파장에 노출되어 여기될 때 상이한 파장의 빛을 방출하는 화학 화합물을 의미한다. 형광단은 그의 방출 프로필, 또는 "색"으로 기술할 수 있다. 녹색 형광단(예를 들어, Cy3, FITC 및 오레곤 그린)은 일반적으로 515 - 540 ㎚의 범위의 파장에서의 방출을 특징으로 할 수 있다. 적색 형광단(예를 들어, 텍사스 레드, Cy5 및 테트라메틸로다민)은 일반적으로 590 - 690 ㎚의 범위의 파장에서의 방출을 특징으로 할 수 있다. 형광단의 예는 4-아세트아미도-4'-이소티오시아네이토스틸벤-2,2'-디술폰산, 아크리딘, 아크리딘의 유도체 및 아크리딘 이소티오시아네이트, 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-술폰산(EDANS), 4-아미노-N-[3-비닐술포닐)페닐]나프탈이미드-3,5-디술포네이트(루시퍼(Lucifer) 옐로우 VS), N-(4-아닐리노-1-나프틸)말레이미드, 안트라닐아미드, 브릴리언트 옐로우, 쿠마린, 쿠마린 유도체, 7-아미노-4-메틸쿠마린(AMC, 쿠마린 120), 7-아미노-트리플루오로메틸쿠마린(쿠마란 151), 시아노신; 4',6-디아미니디노-2-페닐인돌(DAPI), 5',5"-디브로모피로갈롤-술폰프탈레인(브로모피로갈롤 레드), 7-디에틸아미노-3-(4'-이소티오시아네이토페닐)4-메틸쿠마린, 4,4'-디이소티오시아네이토디히드로스틸벤-2,2'-디술폰산, 4,4'-디이소티오시아네이토스틸벤-2,2'-디술폰산, 5-[디메틸아미노]나프탈렌-1-술포닐 클로라이드(DNS, 단실 클로라이드), 에오신, 에오신 유도체, 예컨대 에오신 이소티오시아네이트, 에리트로신, 에리트로신 유도체, 예컨대 에리트로신 B 및 에리트로신 이소티오시아네이트; 에티듐; 플루오레세인 및 유도체, 예컨대 5-카르복시플루오레세인(FAM), 5-(4,6-디클로로트리아진-2-일)아미노플루오레세인(DTAF), 2',7'-디메톡시-4',5'-디클로로-6-카르복시플루오레세인(JOE), 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), QFITC(XRITC); 플루오레스카민 유도체(아민과 반응할 때 형광성임), IR144; IR1446; 말라카이트 그린 이소티오시아네이트; 4-메틸엄벨리페론; 오르토 크레졸프탈레인; 니트로티로신; 파라로스아닐린; 페놀 레드, B-피코에리트린; o-프탈디알데히드 유도체(아민과 반응할 때 형광성임); 피렌 및 유도체, 예컨대 피렌, 피렌 부티레이트 및 숙신이미딜 1-피렌 부티레이트; 반응성 레드 4(시바크론.RTM. 브릴리언트 레드 3B-A), 로다민 및 유도체, 예컨대 6-카르복시-X-로다민(ROX), 6-카르복시로다민(R6G), 리사민 로다민 B 술포닐 클로라이드, 로다민(로드), 로다민 B, 로다민 123, 로다민 X 이소티오시아네이트, 술포로다민 B, 술포로다민 101 및 술포로다민 101의 술포닐 클로라이드 유도체(텍사스 레드); N,N,N',N'-테트라메틸-6-카르복시로다민(TAMRA); 테트라메틸 로다민, 테트라메틸 로다민 이소티오시아네이트(TRITC); 리보플라빈; 로졸산 및 라타니드 킬레이트 유도체, 양자점, 시아닌, 피렐륨 염료 및 스쿠아레인을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 "현장"이라는 용어는 일반적으로 어떤 사건이 원래 위치에서, 예를 들어 원상태의 기관 또는 조직에서 또는 기관 또는 조직의 대표적 세그먼트에서 일어나는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 표적의 현장 분석은 유기체, 기관, 조직 샘플 또는 세포 배양물을 포함하는 다양한 원천으로부터 유래된 세포에 대해 수행할 수 있다. 현장 분석은 표적이 그의 원래 위치로부터 제거될 때 잃을 수 있는 전후상황에 관한 정보를 제공한다. 따라서, 표적의 현장 분석은 표적에 결합한 프로브가 세포 내에 그대로 있는 곳에서 세포막이 완전히 원상태이건 또는 부분적으로 원상태이건 간에 전세포 또는 조직 샘플 내에 위치하는 표적 결합 프로브의 분석을 기술한다. 게다가, 본원에 게재된 방법은 고정된 또는 고정되지 않은 세포 또는 조직 샘플에서 현장에서 표적을 분석하는 데 이용될 수 있다.
본원에서 사용되는 "프로브"라는 용어는 결합제 및 표지자, 예컨대 신호 발생물질 또는 효소를 갖는 작용제를 의미한다. 일부 실시양태에서는, 결합제 및 표지자(신호 발생물질 또는 효소)가 단일 독립체로 구현된다. 결합제 및 표지자는 직접적으로(예를 들어, 결합제에 함입된 형광 분자에 의해) 또는 간접적으로(예를 들어, 절단 부위를 포함할 수 있는 연결자를 통해) 부착되어 한 단계로 생물학적 샘플에 적용될 수 있다. 다른 실시양태에서는, 결합제 및 표지자가 개개의 독립체(예를 들어, 표적에 결합할 수 있는 일차 항체 및 일차 항체에 결합할 수 있는 효소 또는 신호 발생 물질로 표지된 이차 항체)로 구현된다. 결합제 및 표지자(신호 발생 물질 또는 효소)가 개개의 독립체일 때, 그들은 생물학적 샘플에 한 단계로 또는 다단계로 적용될 수 있다. 본원에서 사용되는 "형광 프로브"라는 용어는 형광 신호 발생 물질에 커플링되는 결합제를 가지는 작용제이다.
본원에서 사용되는 "신호 발생 물질"이라는 용어는 하나 이상의 검출 기술(예를 들어, 스펙트럼 분석법, 열량 측정법, 분광법 또는 육안 검사법)을 이용하여 검출가능 신호를 제공할 수 있는 분자를 의미한다. 검출가능 신호의 적당한 예는 광학 신호 및 전기 신호, 또는 방사활성 신호를 포함할 수 있다. 신호 발생 물질의 예는 발색물질, 형광단, 라만 활성 태그, 또는 방사활성 표지자 중 하나 이상을 포함한다. 상기한 바와 같이, 프로브와 관련해서, 일부 실시양태에서는 신호 발생 물질 및 결합제가 단일 독립체(예를 들어, 형광 표지자를 갖는 표적 결합 단백질)로 존재할 수 있다. 별법으로, 결합제 및 신호 발생 물질은 샘플에 도입되기 전에 또는 샘플에 도입될 때 서로 회합하는 개개의 독립체(예를 들어, 수용체 단백질 및 그 특정 수용체 단백질에 대한 표지된 항체)일 수 있다.
본원에서 사용되는 "고체 지지체"라는 용어는 생물학적 샘플에 존재하는 표적이 고정화될 수 있고 이어서 본원에 게재된 방법으로 검출될 수 있는 물품을 의미한다. 표적은 물리 흡착, 공유 결합 형성 또는 그의 조합에 의해 고체 지지체에 고정화될 수 있다. 고체 지지체는 중합체, 유리 또는 금속 물질을 포함할 수 있다. 고체 지지체의 예는 막, 마이크로역가판, 비드, 필터, 시험 스트립, 슬라이드, 커버 슬립 및 시험관을 포함한다.
본원에서 사용되는 "특이적 결합"이라는 용어는 다른 분자를 실질적으로 덜 인식하는 것에 비해 상이한 두 분자 중 하나가 다른 하나를 특이적으로 인식하는 것을 의미한다. 분자들은 정전기적 상호작용, 수소결합, 또는 소수성 상호작용 중 하나 이상으로부터 생기는 두 분자 사이의 특이적 인식을 발생시키는 영역을 그의 표면에 또는 캐비티 안에 가질 수 있다. 특이적 결합의 예는 항체-항원 상호작용, 효소-기질 상호작용, 폴리뉴클레오티드 상호작용 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 결합제 분자는 주위 조건 하에서, 예컨대 약 6 내지 약 8의 pH 및 약 0 ℃ 내지 약 37 ℃의 범위의 온도에서 약 105 M-1 이상의 표적에 대한 고유 평형 회합 상수(KA)를 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 "표적"이라는 용어는 생물학적 샘플에 존재할 때 검출될 수 있는 생물학적 샘플의 성분을 의미한다. 표적은 자연 발생하는 특이적 결합제(예를 들어, 항체)가 존재하거나 또는 특이적 결합제가 제조될 수 있는(예를 들어, 작은 분자 결합제 또는 압타머) 어떠한 물질도 될 수 있다. 일반적으로, 결합제는 표적의 하나 이상의 개개의 화학적 모이어티 또는 표적의 3차원 구조 성분(예를 들어, 펩티드 접힘으로부터 얻어지는 3D 구조)을 통해 표적에 결합할 수 있다. 표적은 천연 또는 변형 펩티드, 단백질(예를 들어, 항체, 애피바디, 또는 압타머), 핵산(예를 들어, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA 또는 압타머), 다당류(예를 들어, 렉틴 또는 당), 지질, 효소, 효소 기질, 리간드, 수용체, 항원 또는 햅텐 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적은 단백질 또는 핵산을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 "가상 염색 영상"(VSI)이라는 용어는 명시야 염색 프로토콜로부터 얻어지는 영상을 모사하는 생물학적 샘플의 영상을 의미한다. 이 영상은 명시야 영상과 유사한 대비, 강도 및 색상을 가진다. 이것은 핵, 상피 또는 간질, 또는 세포외 기질 물질 특징 중 어떠한 유형도 포함하지만 이에 제한되지 않는 생물학적 샘플 내의 특징을 생물학적 샘플에 명시야 염색 프로토콜을 직접 사용한 것처럼 특성화할 수 있게 한다.
본 발명은 일반적으로 분석, 진단 또는 예후 예측 응용, 예컨대 분석물 검출, 조직화학, 면역조직화학, 또는 면역형광에 적용될 수 있는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본원에 게재된 방법은 조직화학, 면역염색, 면역조직화학, 면역검정 또는 면역형광에 특히 적용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 게재된 방법은 면역블롯팅 기술, 예를 들어, 웨스턴 블롯 또는 면역검정, 예컨대 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)에 특히 적용될 수 있다.
생물학적 샘플의 다수의 표적을 순차적으로 염색 및 검출하는 방법은 2007년 9월 28일에 출원된 미국 특허 출원 제11/864085호(발명의 명칭: "Sequential Analysis of Biological Samples")에 더 충분히 기술되어 있고, 이 문헌은 본원에 참고로 포함된다. 한 샘플에서 표적들을 동시에 위치파악하는 방법은 2007년 3월 15일에 출원된 미국 특허 출원 제11/686,649호(발명의 명칭: "System and Methods for Analyzing Images of Tissue Samples"); 2006년 8월 7일에 출원된 미국 특허 제11/500028호(발명의 명칭: "System and Method for Co-Registering Multi-Channel Images of a Tissue Micro Array"); 2006년 11월 30일에 출원된 미국 특허 출원 제11/606582호(발명의 명칭: "System and Methods for Scoring Images of a Tissue Micro Array"); 및 2007년 2월 28일에 출원된 미국 특허 출원 제11/680063호(발명의 명칭: "Automated Segmentation of Image Structures")에 기술되어 있고, 이들 각 문헌은 본원에 참고로 포함된다.
형광 영상을 슈도(pseudo) 명시야 영상으로 전환하는 방법이 알려져 있다. 그러나, 이들 방법은 대표적으로 특이적 색 공간(파장)을 각 형광 염료에 재지정함으로써 형광 영상을 명시야 공간으로 색 변경(recoloring)한다. 이 방법은 형광 영상을 명시된 명시야 염색 프로토콜, 예컨대 H&E를 생물학적 샘플에 대해 수행할 경우에 얻어지는 생물학적 샘플의 영상을 나타내는 영상으로 전환하지 못한다. 대조적으로, 본원에 기술된 발명은 형광 영상으로부터 명시야 영상을 생성하고, 여기서는 생물학적 샘플의 구조적 특징 및 세부 사항이 마치 영상이 명시된 명시야 염색 프로토콜로부터 직접 얻은 것처럼 식별된다. 명시야 염색 프로토콜과 닮은 영상을 가상 염색 영상(VSI)이라고 부를 수 있다.
게재된 발명은 형광현미경에 의해 획득한 한 세트의 생체표지자 영상을 새로운 색 공간에 맵핑하는 방법을 기술하고, 여기서, 맵핑된 영상 강도 값은 명시야 모달리티를 나타내고 VSI 생성에 이용될 수 있다. 이 방법은 생물학적 샘플의 둘 이상의 형광 영상 및 하나의 명시야 영상에서의 대응점으로부터 획득한 데이터를 이용하는 것을 포함한다. 데이터는 추정된 맵핑 파라미터 
를 이용하여 형광 영상을 명시야 색 공간에 맵핑하는 미지의 강도 변환을 추정하는 데 이용된다.
H&E 형태학적 염색을 이용하여 명시야 색 공간을 얻는 실시양태에서, 
는 다음과 같이 정의할 수 있다:
여기서, A는 미지의 맵핑 파라미터이고, HE 및 FL은 각각 기지의 대응하는 H&E 픽셀 및 형광 픽셀의 세트를 저장하는 행렬을 나타낸다. 더 구체적으로, HE는 H&E 영상의 색 채널에서 강도 값을 나타내고, FL은 형광 영상 색 공간에서 대응점에서 형광 표지자 또는 자가형광 중 적어도 하나의 강도 값이다. 추정된 맵핑 파라미터는 통상적 선형 최소 제곱(OLS), 일반화된 최소 제곱(GLS), 반복 재가중 최소 제곱(IRLS) 또는 직교 추정 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 회귀 분석 모델을 이용하여 계산할 수 있다.
선형 최소 제곱 추정이 이용되는 실시양태에서, 
는 추가로 다음 식에 의해 계산할 수 있다.
여기서, FLT은 FL 행렬의 전치행렬이고, (-1)은 역행렬을 나타낸다.
맵핑 파라미터를 계산하는 데 이용된 형광 영상 및 명시야 영상에서 점들의 대응성은 두 가지 방법에 의해 확립될 수 있다: 강도 기반 방법 및 특징 기반 방법.
특징 기반 방법에서는, 형광 영상 및 명시야 영상 둘 모두에 대해 핵, 상피, 간질, 또는 세포외 기질 물질의 어떠한 종류의 영상도 획득한다. 특징 기반 구조는 수동 방법을 이용하여 또는 자동으로 선택할 수 있다. 두 모달리티로부터의 영상에서 대응하는 구조를 선택한다. 형광 영상의 경우에는, 주어진 생체표지자에 맞춘 적당한 여기 에너지 원천 및 발광되는 빛을 모으는 데 적당한 필터와 함께 형광현미경을 이용하여 영상을 포착한다. 마찬가지로, 다수의 생체표지자를 현미경 하에서 샘플을 이동시키지 않고 동시에, 또는 순차적으로 영상화할 수 있다. 아는 바와 같이, 상이한 표지자에 대해 여기 파장 및 필터를 교체할 수 있다. 일부 실시양태에서는, 현미경을 그것이 명시야 영상 및 형광 영상 둘 모두를 획득할 수 있도록 설계할 수 있다. 이러한 현미경은 보정된 다수의 광경로 및 다수의 카메라를 포함할 수 있다. 이어서, 샘플의 명시야 영상을 얻을 수 있고, 이어서, 이 영상을 적색(R), 녹색(G) 및 청색(B) 채널로 분할할 수 있고, 특징 기반 구조의 색 및 강도를 측정할 수 있다.
강도 기반 방법에서는, 현미경 하에서 샘플 영역의 위치를 전자, 자기, 광학 또는 기계 센서로 조절할 수 있고, 이렇게 함으로써 샘플 영역을 다음 영상 획득을 위해 거의 동일 위치에 반복적으로 위치시킬 수 있다. 강도 기반 정합은 일반적으로 넓은 부류의 생체표지자에 적용될 수 있다. 일반적으로, 기재, 예컨대 비제한적으로 TMA, 슬라이드, 웰 또는 그리드에 고정되거나 또는 다른 방식으로 제공된 생물학적 샘플에 분자 생체표지자를 표지하고, 형광현미경을 통해 영상화한다.
한 실시양태에서는 다양한 분자 생체표지자, 예컨대 항체 또는 단백질에 결합된 형광 염료를 이용할 수 있다. 이어서, 샘플을 주어진 생체표지자에 맞춘 여기 에너지원을 이용하고 발광된 빛을 최적으로 모으도록 적합화된 다양한 필터를 이용하여 형광현미경 하에서 영상화한다. 다수의 생체표지자를 현미경 하에서 표본을 이동시키지 않고 동시에, 또는 순차적으로 영상화할 수 있다. 상이한 생체표지자에 대해서는 여기 파장 및 필터를 교체할 수 있다. 생체표지자는 각 표지자의 모든 기능을 설명해야 할 필요는 없지만 그의 하나 이상의 기능을 간단하게 설명하는 것을 포함하는 아래 목록의 표지자를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다:
Her2/neu: 유방암 및 위암에서 과다발현되는 상피 성장 인자; 모노클로날 항체에 의한 치료가 종양 성장을 둔화시킴.
EGF-R/erbB: 상피 성장 인자 수용체.
ER: 일부 유방암 종양 성장에 요구되는 에스트로겐 수용체; 핵에 위치하고, 양성 환자에서 에스트로겐을 제한하는 치료를 결정하기 위해 ISH로 검출됨.
PR: 프로게스테론 수용체; DNA와 결합하는 호르몬임.
AR: 안드로겐 수용체; 안드로겐 의존성 종양 성장에 관계함.
P53: 종양 억제인자 유전자; DNA 손상을 감지하고, 사람 암의 50%에서 불활성화됨.
β-카테닌: 암의 암유전자; 세포막으로부터 핵으로 전좌하고, 세포 부착에서 기능을 하고 잠재적 유전자 조절 단백질로도 기능함.
포스포-β-카테닌: β-카테닌의 인산화 형태; 세포질액에서 분해되고 핵으로 전좌하지 않음.
GSK3β: Wnt 경로에서의 글리코겐 합성효소 키나제-3β 단백질; 프로테아좀에서의 신속한 분해를 위해 포스포-β-카테닌을 표지하는 β-카테닌을 인산화함.
PKCβ: 매개체 G-단백질에 연결된 수용체.
NFΚβ: 핵으로 전좌될 때 염증의 핵인자 카파 B 표지자.
Bcl-2: B 세포 림프종 암유전자 2; 세포자멸 억제제로 작용함.
시클린D: 세포 주기 조절.
VEGF: 혈관 생성에 관련된 혈관 상피 성장 인자.
E-카드헤린: 상피세포에서 발현되는 세포-세포 상호작용 분자; 상피암에서 기능을 상실함.
c-met: 티로신 키나제 수용체.
구획 정보를 지니는 적어도 하나의 추가의 형광 형태학적 표지자도 이 단계에 포함될 수 있다. 이 표지자는 순차 염색이 관련된 경우이면 그것이 다음 단계와 공통 정보를 운반하고, 영상을 정합하는 데 이용되도록 선택된다. 이어서, 생물학적 샘플의 한 영역을 명시야 색 공간에서 눈에 보이는 하나 이상의 형태학적 표지자, 예컨대 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염료로 표지하고, 다시 영상화한다.
일부 실시양태에서, 형태학적 표지자는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
케라틴: 상피세포 표지자
판-카드헤린: 세포막 표지자
평활근 액틴: 근육 표지자
DAPI: 핵 표지자
헤마톡실린: DNA 표지자(청색 염색)
에오신: 세포질 표지자; pH 의존성(적색 염색)
이들 형태학적 표지자 중 일부는 명시야 현미경을 이용하여 영상화할 수 있고, 일부는 형광현미경으로 영상화할 수 있다. 어느 경우이든, 형태학적 표지자는 그것이 이전 단계와 공통 정보를 갖도록 선택된다. 예를 들어, DAPI가 이전 단계에서 핵을 영상화하는 데 이용되면, 두 번째 단계에서는 헤마톡실린이 명시야 현미경 하에서 핵을 영상화하는 데 이용될 수 있다. 그들은 둘 모두 동일한 구획을 염색하기 때문에, 영상 정합 기술에 의해 영상을 정렬할 수 있다. DAPI 핵 염색은 명시야 영상에서 헤마톡실린으로 염색된 핵을 형광 영상과 정합하기 위한 추가의 형광 형태학적 표지자로 이용할 수 있다. 샘플 영역의 영상을 하드웨어 및 소프트웨어 정합 기술을 이용하여 중첩하고, 정보를 저장하고, 여기서 기술적 효과는 샘플 영역의 다채널 영상을 정합하거나 또는 다른 방식으로 생성하는 것이다.
따라서, 강도 기반 방법은 순차적 영상화 및 동시 정합 기술을 이용하여 동일 생물학적 샘플로부터 분자 표지자 및 형태학적 표지자를 영상화할 수 있게 한다. 이어서, 형광 영상 및 명시야 영상에 대해 생물학적 샘플의 영역에서 주어진 점들에 대한 픽셀 강도를 정합하고 비교할 수 있다. 특징 기반 방법과 마찬가지로, 명시야 영상을 적색(R) 채널, 녹색(G) 채널 및 청색(B) 채널로 분할한다.
강도 기반 방법 또는 특징 기반 방법에서, 형광 영상으로부터 명시야 색 공간으로의 변환은 선형 변환 방정식에서 추정 맵핑 파라미터 
를 이용한다. 선형 변환 방정식은 H&E 염료를 이용할 때 HE = ·FL로 또는 다음과 같은 행렬 표현으로 나타낼 수 있다.
여기서, "a"는 추정할 필요가 있는 미지의 변환 파라미터를 나타낸다. 행렬 표현을 이용해서, 명시야 영상을 RGB 색 채널로 분할하고, 형광 채널의 수는 응용 특이적이고 특정 임무에 얼마나 많은 구획 및 단백질 회합이 필요한지를 기초로 한다. FL 행렬의 마지막 줄은 한 줄의 1을 포함하여 맵핑에서 상수항을 모델링한다. 보통은 3 또는 4 종의 형광 염료를 동시에 쉽게 적용할 수 있지만, 더 많이 이용할 수도 있다. 예를 들어, 100 개의 특징 점이 있고 형광 영상이 4 개의 상이한 표지자를 포함하면, FL 행렬의 크기는 5 x 100이고, 행렬 A의 크기는 3 x 5이고, HE 행렬의 크기는 3 x 100이다.
일단 변환 파라미터가 계산되면, 그 샘플의 하나 이상의 선택된 영역이 가상 H&E 맵핑을 이용하여 한 세트의 형광 영상으로부터 VSI로 변환하는 데 이용될 수 있다. 유리하게는, 분자 생체표지자는 명시야 영상만을 이용해서는 보이지 않는 기능 및 구획 정보를 제공한다. 예를 들어, 영상 분석 알고리즘은 병리학자 또는 외과의사에게 명시야 모달리티(H&E)를 나타내는 영상 강도 값을 여전히 제공하면서 샘플 구획들을 분리하는 첨가된 채널로부터 이익을 얻을 수 있다. 예를 들어, H&E 염색 프로토콜을 나타내는 VSI는 혈액 세포를 적색으로, 핵을 보라색으로, 결합조직을 분홍색으로 나타낼 것이다.
다른 실시양태에서는, 일단 맵핑 파라미터가 추정되면, 변환 알고리즘을 다른 형광 영상에 적용하여 VSI를 생성할 수 있다. 다른 형광 영상은 동일한 생물학적 샘플의 상이한 영역으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 생물학적 샘플의 원천은 신선한, 냉동된 및/또는 보존된 기관 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인으로부터 얻은 고체 조직; 혈액 또는 어떠한 혈액 구성성분; 체액, 예컨대 뇌척수액, 양수, 복수, 또는 간질액; 또는 대상체의 잉태 또는 발생 중의 어느 시점으로부터의 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플은 1차 또는 배양 세포 또는 세포주를 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, VSI를 생성하는 데 이용되는 다른 형광 영상은 상이한 생물학적 샘플로부터 얻을 수 있다. 상이한 생물학적 샘플은 유사한 기능을 가질 수 있는 생물학적 대상체의 조직으로부터 얻은 유사한 세포들의 집합을 포함할 수 있다. 사람 조직의 적당한 예는 (1) 상피; (2) 혈관, 뼈 및 연골을 포함하는 결합조직; (3) 근육조직; 및 (4) 신경조직을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 건강 또는 질병 조직 샘플로부터의 조직 절편(예를 들어, 결장, 유방조직, 전립선으로부터의 조직 절편)을 포함한다. 조직 절편은 조직 샘플의 한 부분 또는 한 조각, 예를 들어 조직 샘플로부터 잘라낸 얇은 조직 또는 세포 슬라이스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서는, 조직 샘플의 다수의 절편을 채취하여 분석할 수 있다.
본원에 게재된 방법은 생물학 및 의학에서의 분석, 진단 및 치료 응용에서 응용을 찾을 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 게재된 방법은 조직화학, 특히 면역조직화학에서 응용을 찾을 수 있다. 본원에 기술된 방법에 따르면, 환자로부터 얻은 세포 또는 조직 샘플의 분석은 진단(예를 들어, 특정 질환을 갖거나, 특정 독소에 노출되었거나 또는 특정 치료 또는 기관 이식에 잘 반응하고 있는 환자를 식별하기 위해) 및 예후 예측(예를 들어, 특정 질환이 발병할 가능성이 있거나, 특정 치료에 잘 반응할 가능성이 있거나, 또는 특정 기관 이식을 받아들일 가능성이 있는 환자를 식별하기 위해)에 이용될 수 있다. 본원에 게재된 방법은 동일한 생물학적 샘플로부터의 다수(예를 들어, 잠재적으로 무한한) 표적의 정확하고 신뢰성 있는 분석을 촉진할 수 있다.
특정 실시양태에서, 생성된 VSI는 병리학적 진단에 이용될 수 있고, 분자 표지자에 기초한 하나 이상의 분자 경로를 식별하는 단계를 더 포함할 수 있고, 여기서 분자 경로는 질환을 표시한다. 방법들은 다양한 질환에 이용될 수 있지만, 그 방법이 특히 적합한 한 종류는 상피암, 예컨대 비제한적으로 유방암, 전립선암 및 결장암을 포함하지만 이에 제한되지 않는 암이다.
특정 실시양태에서, 생성된 VSI는 분자 경로를 핵, 상피 및 간질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 형태학적 구조의 함수로서 분자 경로를 식별하는 것을 포함하는 정량 분석에 이용될 수 있다. 예를 들어, 염색된 형광 영상을 H&E 좌표계로 변환하고 함께 관찰하여 향상된 분석을 제공할 수 있다.
일반적으로, 이 방법을 수행하기 위한 영상 분석 시스템은 분자 표지자 및 형태학적 염색으로 염색된 디지털 영상을 형광 공간 및 명시야 공간 둘 모두에 적어도 일시적으로 저장하는 수단; 및 순차적 염색이 관련된 경우 하나 이상의 정합을 이용하여 영상을 동시 정합하기 위한 처리기를 포함한다. 또한, 처리기는 명시야 영상 및 둘 이상의 형광 영상의 특징 기반 정보 또는 픽셀 강도 데이터 정보를 적어도 부분적으로 분석하여 둘 이상의 형광 영상을 VSI로 변환함으로써 맵핑 파라미터를 계산하도록 구성된다.
이 시스템은 하나 이상의 영상을 표시하기 위한 수단; 상호작용적 뷰어; 가상 현미경; 및/또는 하나 이상의 영상을 의사소통망으로 전송하기 위한 수단을 더 포함할 수 있다. 또한, 처리기는 형태학적 특징의 분할에 적어도 부분적으로 기초하여 하나 이상의 영상을 서로 중첩할 수 있다.
일부 실시양태에서, 처리기는 또한 하나 이상의 이전에 분석된 생물학적 샘플로부터 맵핑 파라미터를 저장하도록 구성된다. 이것은 변환 알고리즘을 다른 형광 영상에 적용하여 VSI를 생성하는 수단을 제공한다. 다른 형광 영상은 동일한 생물학적 샘플의 상이한 영역으로부터 또는 상이한 생물학적 샘플로부터 얻을 수 있다. 또한, 시스템은 사용자가 많은 이용가능한 변환으로부터 선택할 수 있게 하고, 심지어 예상 산출물(생성된 VSI)의 육안 검사에 기초하여 상호작용적으로 변환 파라미터를 조정할 수 있게 한다.
일부 실시양태에서, 상기 중 하나 이상은 자동화될 수 있고, 자동화 시스템을 이용하여 수행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 모든 단계는 자동화된 시스템을 이용하여 수행할 수 있다.
실시예: 결장조직 샘플의 H&E 영상 비교
성인 결장조직 샘플(바이오체인(Biochain), T2234090)를 파라핀으로 포매된 조직 슬라이드로서 얻었다. 성인 조직의 파라핀 포매 슬라이드에 대해 면역조직화학 프로토콜을 수행하여 염색을 준비시켰다. 프로토콜은 탈파라핀, 재수화, 배양 및 세척을 포함하였다. 탈파라핀은 빈번하게 교반하면서 슬라이드를 히스토초이스(Histochoice)(또는 톨루엔)으로 10분 동안 세척함으로써 수행하였다. 탈파라핀 후, 슬라이드를 에탄올 용액으로 세척함으로써 조직 샘플을 재수화하였다. 세척은 농도를 감소시키면서 3개의 상이한 에탄올 용액으로 수행하였다. 사용된 에탄올 농도는 90 부피%, 70 부피% 및 50 부피%였다. 이어서, 슬라이드를 포스페이트 완충 염수(PBS, pH 7.4)로 세척하였다. 슬라이드를 트리톤 TX-100의 0.1 중량% 용액으로 세척함으로써 조직의 막 투과를 수행하였다. 항원 복원에는 시트레이트 완충제 pH 6.0(벡터 언마스킹 솔루션(Vector Unmasking Solution)를 이용하였다. 슬라이드를 고온고압고습 시험기(pressure cooker)에서 15분 동안 완충제에 노출시킨 후 실온에서 20분 동안 냉각시켰다. 이어서, 슬라이드를 37℃에서 PBS 및 900 ㎕의 3 부피% 소 혈청 알부민(BSA)으로 45분 동안 세척함으로써 비특이적 결합을 차단하였다. 이차 항체로 염색하기 위해(임의적임), 이차 항체 숙주 종으로부터의 100 ㎕의 혈청으로 슬라이드를 차단하였다.
준비된 결장 슬라이드를 미국 특허 출원(발명의 명칭: "Sequential Analysis of Biological Samples")에 기술된 절차를 이용하여 염색하고 영상화하였다. 도 1 및 도 2에 나타낸 DAPI, 케라틴(Cy3), 자가형광(Cy3), 자가형광(CFP) 및 자가형광(Cy5)을 포함하는 5개의 형광 영상을 생성하였다. 도 1 및 도 2는 상이한 결장 조직 샘플(샘플 A 및 B)로부터 얻은 영상을 나타낸다. 일반적으로, 결장 슬라이드의 염색 및 영상화는 37℃에서 45분 동안 3% BSA 중의 염료 접합 항체와 함께 배양하는 것을 포함하였다. 배양 후, 슬라이드를 광범위한 시리즈의 PBS 세척액으로 세척하였다. 슬라이드를 37℃에서 45분 동안 BSA 중에서 이차 항체와 함께 배양하였다. 배양 후, 슬라이드를 광범위한 시리즈의 PBS 세척액으로 세척하였다. 일차 항체 또는 이차 항체로 염색된 슬라이드를 형태학적 염색 DAPI로 대조염색하고 커버 슬립을 씌웠다.
커버 슬립을 씌운 슬라이드를 카메라를 이용하여 영상화하였다. 사용된 카메라는 레이카(Leica) DMRA2 형광현미경에 장착된 단색 레이카 DFC 350FX 단색 고해상도 카메라였다. 다르게 언급하지 않으면, 사용된 배율은 20x였다. 영상 획득 후, 커버 슬립을 제거하고 슬라이드를 PBS로 세척하여 신호 파괴를 준비시켰다.
또한, 도 1 및 2는 추정 맵핑 파라미터를 이용한 생성된 H&E 타입 영상의 현미경 사진을 나타낸다. 도 1은 한 결장조직 샘플의 5 개의 형광 영상 및 대응하는 생성된 H&E 타입 영상(VSI, 샘플 A)의 단색 실시양태를 나타낸다. 도 2는 결장조직 샘플의 5 개의 형광 영상 및 대응하는 생성된 H&E 타입 영상(VSI, 샘플 B)의 단색 실시양태를 나타낸다.
DAPI 영상, 막 표지자 영상, 및 Cy3, Cy5 및 CFP 필터 큐브를 이용하여 얻은 3 개의 형광 영상으로 이루어진 한 세트의 형광 영상 및 H&E 영상에 대해 수동으로 한 세트의 대응점을 식별하였다. 최소값을 0으로 정하고 최대값을 1로 정하도록 형광 영상을 정규화하였다. 게다가, 정규화된 형광 영상은 배경이 밝고 전경이 어둡도록 뒤바뀌었다. 자가형광 영상의 3개 채널은 매우 상관관계가 있었다. 모든 자가형광을 기하적으로 및 대수적으로 평균하여 맵핑에 이용될 수 있는 2 개의 새로운 영상을 생성할 수 있다. 이 샘플 데이터세트의 추정 변환 행렬은 다음과 같다:
형광 영상화 후, 슬라이드를 형태학적 염색 H&E로 염색하고, 명시야 설정을이용하여 영상을 획득하였다. 샘플 A 및 샘플 B 둘 모두의 영상을 도 1 및 도 2로부터의 생성된 VSI와 함께 도 3에 나타내었다.
이들 방법은 분자병리학 및 표준 해부 병리학을 융합한다. H&E 기반 염색은 표준 병리학에서 이용되는 가장 흔한 명시야 현미경 염색 기술이다. 상기한 바와 같이, 헤마톡실린은 세포핵을 청색으로 염색하고, 반면, 대조염색으로서 에오신은 세포질 및 결합조직을 분홍색으로 염색한다. 명시야 현미경 검사를 위해 대체 염색으로서 이용될 수 있는 다른 공지 염색 조합이 매우 많다. 예를 들어, 포일겐 염색을 이용하여 핵산을 영상화할 수 있거나, 또는 오르세인을 이용하여 결합조직 섬유를 영상화할 수 있다.
이러한 다채널 방법은 형태학적 염색 또는 형광 생체표지자 또는 심지어는 병리학에 제한되지 않는다. 생물학적 샘플의 일부 정보 측면 또는 특징을 그것이 디지털 영상화 및 처리될 수 있도록 가시화될 수 있게 하는 어떠한 염색도 이들 방법에 적당할 것이다. 적당한 염색은 세포학적 또는 형태학적 염색, 면역학적 염색, 예컨대 면역조직화학 염색 및 면역세포화학 염색, 세포유전학적 염색, 현장 혼성화 염색, 세포화학적 염색, DNA 및 염색체 표지자, 및 기질 결합 검정 염색을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 다른 의학 및 생명과학 응용은 연장된 다채널로부터 이득을 얻을 수 있다. 이러한 다채널 방법은 광학적, 화학적 및 생물학적 상호작용에 제한되지 않고 순차적으로 표지자를 영상화할 수 있는 융통성 있는 체제를 제공한다.
본원에서는 본 발명의 일부 특징만 도시하고 기술하였지만, 당 업계 숙련자에게는 많은 변형 및 변화가 떠오를 것이다. 따라서, 첨부된 특허청구범위가 본 발명의 범위 및 정신 내에 드는 이러한 모든 변형 및 변화를 망라하는 것을 의도한다는 것을 이해해야 한다.
Claims (17)
- 생물학적 샘플의 고정된 영역의 둘 이상의 형광 영상을 획득하는 단계,
상기 형광 영상을 명시야 색 공간에 맵핑하는 단계, 및
명시야 타입 영상을 생성하는 단계
를 포함하는, 형광 영상을 이용하여 생물학적 샘플의 명시야 염색 프로토콜과 닮은 명시야 타입 영상을 생성하는 방법. - 제1항에 있어서, 명시야 타입 영상이 적색, 녹색 및 청색 3 개 채널 색 공간을 갖는 H&E 타입 영상에 대응하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 둘 이상의 형광 영상 중 적어도 하나의 영상이 자가형광의 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 맵핑 단계가
생물학적 샘플의 고정된 영역의 명시야 영상을 획득하고,
특징 기반 정보 또는 픽셀 강도 데이터 정보를 적어도 부분적으로 이용하여 명시야 영상 및 둘 이상의 형광 영상의 영상 데이터를 분석하여 둘 이상의 형광 영상을 명시야 색 공간으로 변환하는 맵핑 파라미터를 생성하고,
상기 맵핑 파라미터를 둘 이상의 형광 영상에 적용하는
것을 포함하는 방법. - 제4항에 있어서, 명시야 영상 획득 단계가 생물학적 샘플을 헤마톡실린 및 에오신으로 순차적으로 염색하여 H&E 타입 영상을 생성하는 단계를 포함하는 방법.
- 제4항에 있어서, 특징 기반 정보가 핵, 상피 및 간질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 포함하는 것인 방법.
- 제4항에 있어서, 맵핑 파라미터 생성 단계가 선형 추정 모델을 이용하는 것을 포함하는 방법.
- 제7항에 있어서, 선형 추정 모델이 다음과 같이 정의되는 방법.
(여기서,는 추정된 맵핑 파라미터이고, HE는 H&E 영상의 색 채널에서의 강도 값을 나타내고, FL은 형광 영상의 둘 이상의 색 채널의 강도 값임)
- 제4항에 있어서, 맵핑 파라미터를 제2 고정된 영역의 둘 이상의 형광 영상에 적용하는 단계를 더 포함하고, 여기서 제2 고정된 영역은 동일한 또는 상이한 생물학적 샘플로부터의 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 명시야 타입 영상을 이용하는 병리학적 진단 단계를 더 포함하는 방법.
- 제10항에 있어서, 병리학적 진단이 암에 대한 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 명시야 타입 영상을 이용하는 정량 분석 단계를 더 포함하는 방법.
- 제12항에 있어서, 정량 분석 단계가 분자 경로를 핵, 상피 및 간질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 형태학적 구조의 함수로서 식별하는 것을 포함하는 방법.
- 생물학적 샘플의 고정된 영역의 둘 이상의 형광 영상을 획득하도록 적합화된 디지털 영상화 장치, 및
맵핑 파라미터를 적용하여 둘 이상의 형광 영상을 명시야 타입 영상으로 변환하도록 적합화된 처리 장치
를 포함하는, 형광 영상을 이용하여 생물학적 샘플의 명시야 염색 프로토콜과 닮은 명시야 타입 영상을 생성하는 영상 분석 시스템. - 제14항에 있어서, 처리 장치가
고정된 영역의 명시야 영상을 획득하고,
명시야 영상 및 둘 이상의 형광 영상의 특징 기반 정보 또는 픽셀 강도 데이터 정보를 적어도 부분적으로 분석하여 둘 이상의 형광 영상을 명시야 색 공간으로 변환함으로써
맵핑 파라미터를 계산하도록 추가로 구성된 것인 시스템. - 제15항에 있어서, 분석 단계가 선형 추정 모델을 포함하는 것인 시스템.
- 제15항에 있어서, 처리 장치가 하나 이상의 이전에 분석된 생물학적 샘플로부터의 맵핑 파라미터를 저장하도록 추가로 구성된 것인 시스템.
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