CN102575990A - 使用荧光图像产生明场图像的系统和方法 - Google Patents

Abstract

提供了使用荧光图像产生类似于生物样品的明场染色方案的明场型图像的方法。其步骤包括获取生物样品上固定区域的两种或更多种荧光图像，将所述荧光图像映射到明场色空间并产生明场图像。还提供了使用荧光图像产生生物样品的明场型图像的图像分析系统。

Description

使用荧光图像产生明场图像的系统和方法

背景

本发明总体上涉及将通过荧光显微镜获取的一组生物标志物图像映射到新色空间的方法，其中映射图像强度值代表明场模式(brightfield modality)。

在用苏木精和伊红(Hematoxylin & Eosin，H&E)的传统组织染色中，使用嗜碱性染料苏木精(H)以使细胞核染成蓝色，并且将嗜酸性染料伊红(E)用作复染剂以使细胞质、结缔组织(胶原)、肌纤维、结缔组织和红细胞染色。伊红与组织中的不同细胞组分相互作用，基于与伊红结合的分子的带电性质产生不同色调的粉红色。这些细胞组分可使用具有荧光染料的分子标志物(染料和抗体)替代地标记。例如，细胞核可用DAPI(特异性结合DNA的荧光染料)染色，而组织中的其他区域可免疫荧光标记，其中通过直接缀合的抗体或一级二级放大检测(primary secondary amplification detection)来靶向目标分子。对于一些结构诸如红细胞(RBC)，可使用通过一组滤波器捕获的组织自发荧光来检测。荧光成像模式的优势在于分别地捕获这些组织结构中的每一种，因此能够精确定位和定量。

然而，基于荧光图像的组织病理学诊断并非常规实践，因为荧光图像并不提供病理学家进行诊断所必需的结构和形态学细节。明场H&E染色技术常常也是受偏爱的，因为存在病理实验室中数十年来汇集的关于这些技术的大量知识。

需要将荧光图像变换为类似诸如H&E的明场图像的色域的方法以允许病理学家对同一组荧光图像进行定量分析以及病理学诊断。

发明简述

如所提到的，先前仅使用荧光标志物来鉴别胞核、上皮和基质以提供关于细胞区室的信息。所述方法结合了荧光标志物的形态学功能与荧光生物标志物的功能，其用以部分地基于细胞形态学和生物途径来鉴别组织中蛋白质表达和疾病途径。本发明描述了将通过荧光显微镜获取的一组生物标志物和自发荧光图像映射到新色空间的方法，其中映射图像强度值代表明场模式，诸如H&E染色。

在一个实施方案中，提供了使用荧光图像产生类似于生物样品的明场染色方案的明场型图像的方法。所述方法包括以下步骤：获取生物样品上固定区域的两种或更多种荧光图像；将所述荧光图像映射到明场色空间；和产生明场图像。

在另一实施方案中，提供了使用荧光图像产生类似于生物样品的明场染色方案的明场型图像的图像分析系统。所述系统包括适用于获取生物样品上固定区域的两种或更多种荧光图像的数字成像装置和适用于应用映射参数以将所述两种或更多种荧光图像变换为明场型图像的处理装置。

附图

在参考附图阅读以下详述时将更好地理解本发明的这些和其他特征、方面和优势，在整个附图中相同的符号表示相同的部分，其中：

图1表示结肠组织样品(样品A)的5种荧光图像和相应产生的H&E型图像的单色实施方案。

图2表示结肠组织样品(样品B)的5种荧光图像和相应产生的H&E型图像的单色实施方案。

图3表示，与由荧光图像产生的H&E型图像相比，经H&E染色的结肠组织的三通道(红色、绿色、蓝色)彩色图像的单色实施方案。

发明详述

为了更清楚且简明地描述并指出所要求保护发明的主题，对于在以下说明书及其所附权利要求书中使用的特定术语，提供以下定义。本文使用的术语“抗体”是指与另一分子特异性结合且由此定义为与该分子的特定空间和极性结构互补的免疫球蛋白。该抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体，且可通过以下制备：诸如使宿主免疫和收集血清(多克隆抗体)的本领域熟知的技术；或制备连续杂交细胞系和收集分泌的蛋白质(单克隆抗体)；或克隆并表达至少编码特异性结合天然抗体所需要的氨基酸序列的核苷酸序列或其诱变形式。抗体可包括完全免疫球蛋白或其片段，所述免疫球蛋白包括多种分类和同种型，诸如IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3、IgM。功能性抗体片段可包括能够以类似亲和性保持与全长抗体的结合的抗体部分(例如，Fab、Fv和F(ab′)2或Fab′)。另外，在适当的情况下，可使用免疫球蛋白或其片段的聚集体、聚合体和缀合物，只要基本保持对特定分子的结合亲和性即可。

本文使用的术语“结合剂”是指可与生物样品中的一个或多个靶标结合的分子。结合剂可与目标物特异性结合。合适的结合剂可包括以下一种或多种：天然或修饰的肽、蛋白质(例如，抗体、亲和体(affibody)或适配体(aptamer))、核酸(例如，多核苷酸、DNA、RNA或适配体)；多糖(例如，凝集素、糖)、脂质、酶、酶底物或抑制剂、配体、受体、抗原或半抗原。合适的结合剂可根据待分析的样品和可用于检测的目标物来选择。例如，在样品中的目标物可包括配体且结合剂可包括受体，或者目标物可包括受体且结合剂可包括配体。类似地，目标物可包括抗原且结合剂可包括抗体或抗体片段或反之亦然。在一些实施方案中，目标物可包括核酸且结合剂可包括互补核酸。在一些实施方案中，目标物和结合剂两者可包括能够彼此结合的蛋白质。

本文使用的术语“生物样品”是指从生物受试者获得的样品，包括体内或体外获得的生物组织或流体来源的样品。这类样品可为但不限于体液(例如，血液、血浆、血清或尿)、器官、组织、碎片(fractions)和从包括人在内的哺乳动物分离的细胞。生物样品还可包括含组织的生物样品的切片(例如，器官或组织的切片部分)。生物样品还可包括得自生物样品的提取物，例如得自生物流体(例如，血液或尿)的抗原。

生物样品可为原核来源或真核来源(例如，昆虫、原生动物、鸟、鱼、爬行动物)。在一些实施方案中，所述生物样品为哺乳动物(例如，大鼠、小鼠、奶牛、狗、驴、豚鼠或兔)。在某些实施方案中，所述生物样品可为灵长类动物来源(例如，黑猩猩或人)。

本文使用的术语“荧光团”或“荧光信号发生体(fluorescent signalgenerator)”是指如下化合物，当通过暴露于特定波长的光来激发时，所述化合物发射不同波长的光。荧光团可根据其发射特性或“颜色”描述。绿色荧光团(例如Cy3、FITC和Oregon Green)的特征可为其通常在515-540纳米范围的波长下发射。红色荧光团(例如Texas Red、Cy5和四甲基若丹明)的特征可为通常在590-690纳米范围的波长下发射。荧光团的实例包括但不限于4-乙酰氨基-4′-异硫氰酸根合芪-2，2′-二磺酸；吖啶；吖啶衍生物和异硫氰酸吖啶；5-(2′-氨乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)；4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘二甲酰亚胺-3，5-二磺酸酯(Lucifer Yellow VS)；N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺；氨基苯甲酰胺；亮黄；香豆素；香豆素衍生物；7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)；7-氨基-三氟甲基香豆素(Coumaran 151)；四氯四溴荧光素(cyanosine)、4′，6-二脒基(diaminidino)-2-苯基吲哚(DAPI)；5′，5”-二溴邻苯三酚-磺酞(溴邻苯三酚红)；7-二乙基氨基-3-(4′-异硫氰酸根合苯基)4-甲基香豆素；4，4′-二异硫氰酸根合二氢-芪-2，2′-二磺酸；4，4′-二异硫氰酸根合芪-2，2′-二磺酸；5-[二甲氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹磺酰氯)；伊红；伊红衍生物，诸如异硫氰酸伊红；赤藓红；赤藓红衍生物，诸如赤藓红B和异硫氰酸赤藓红；溴乙啶；荧光素和衍生物，诸如5-羧基荧光素(FAM)、5-(4，6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2′，7′-二甲氧基-4′，5′-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、QFITC(XRITC)；荧光胺衍生物(与胺反应时发荧光)；IR144；IR1446；异硫氰酸孔雀绿；4-甲基-7-羟基香豆素；邻甲酚酞；硝基酪氨酸；碱性副品红；酚红、B-藻红蛋白；邻苯二甲醛衍生物(与胺反应时发荧光)；芘和衍生物，诸如芘、芘丁酸酯(pyrene butyrate)和1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯(sucinimidyl 1-pyrene butyrate)；活性红4(Cibacron.RTM.亮红3B-A)；若丹明和衍生物，诸如6-羧基-X-若丹明(ROX)、6-羧基若丹明(R6G)、丽丝胺若丹明B磺酰氯、若丹明(Rhod)、若丹明B、若丹明123、异硫氰酸若丹明X、磺基若丹明B、磺基若丹明101和磺基若丹明101的磺酰氯衍生物(Texas Red)；N，N，N′，N′-四甲基-6-羧基若丹明(TAMRA)；四甲基若丹明、四甲基若丹明异硫氰酸酯(TRITC)；核黄素；玫红酸和镧系螯合物衍生物、量子点(quantum dots)、花菁、吡喃

染料(pyrelium dye)和方酸菁。

本文使用的术语“原位”通常指在原始位置，例如在完整器官或组织中或在器官或组织的代表性节段中发生的事件。在一些实施方案中，目标物的原位分析可在来源于各种来源的细胞上进行，所述来源包括生物体、器官、组织样品或细胞培养物。原位分析提供组织信息(contextual information)，该信息可在目标物从其来源位点除去时丢失。因此，目标物的原位分析描述对位于全细胞或组织样品中的结合有目标物的探针的分析，不管细胞膜是完全完整或部分完整的，其中结合有目标物的探针保持在细胞内。此外，本文公开的方法可用于分析固定或未固定的细胞或组织样品中的原位目标物。

本文使用的术语“探针”是指具有结合剂和标记例如信号发生体或酶的试剂。在一些实施方案中，所述结合剂和标记(信号发生体或酶)包含在单个实体中。所述结合剂和标记可直接连接(例如，经并入结合剂中的荧光分子)或间接连接(例如，经可包括裂解部位的接头)并且在单个步骤中施用到生物样品。在替代的实施方案中，所述结合剂和标记包含在离散实体中(例如，能够结合目标物和酶的第一抗体或能够结合第一抗体的信号发生体标记的第二抗体)。当结合剂和标记(信号发生体或酶)为单独的实体时，它们可在单个步骤或多个步骤中施用到生物样品。本文使用的术语“荧光探针”是指具有偶合到荧光信号发生体的结合剂的试剂。

本文使用的术语“信号发生体”是指能够通过使用一种或多种检测技术(例如，光谱法、热量测定法、分光镜检查或目测检查)提供可检测信号的分子。可检测信号的合适实例可包括光信号和电信号或放射性信号。信号发生体的实例包括发色团、荧光团、拉曼活性标签或放射性标记中的一种或多种。如上所述，关于探针，在一些实施方案中，信号发生体和结合剂可存在于单个实体(例如，具有荧光标记的目标物结合蛋白质)。或者，结合剂和信号发生体可为在引入到样品之前或引入到样品时彼此结合的离散实体(例如，受体蛋白和针对特定受体蛋白的标记抗体)。

本文使用的术语“固体载体”是指存在于生物样品中的目标物可固定于其上且随后通过本文公开的方法检测的制品。目标物可通过物理吸附、共价键形成或其组合固定在固体载体上。固体载体可包括聚合物、玻璃或金属材料。固体载体的实例包括膜、微量滴定板、珠、过滤器、测试条、载玻片、盖玻片和试管。

本文使用的术语“特异性结合”是指与其他分子的明显较低识别相比两种不同分子之一对另一分子的特异性识别。所述分子在其表面上或在空腔中可具有在两分子之间产生特异性识别的区域，所述特异性识别由静电相互作用、氢键或疏水性相互作用中的一种或多种引起。特异性结合的实例包括但不限于抗体-抗原相互作用、酶-底物相互作用、多核苷酸相互作用等。在一些实施方案中，结合剂分子在诸如约6-约8的pH和约0℃-约37℃的温度的环境条件下可对目标物具有不低于约10⁵M^-1的固有平衡结合常数(KA)。

本文使用的术语“目标物”是指在存在于生物样品中时可被检测的生物样品的组分。所述目标物可为任何物质，对该物质存在天然存在的特异性结合剂(例如，抗体)或可制备针对该物质的特异性结合剂(例如，小分子结合剂或适配体)。一般来讲，结合剂可经目标物的一种或多种离散化学部分或目标物的三维结构组分(例如，由肽折叠产生的三维结构)与目标物结合。所述目标物可包括以下一种或多种：天然或修饰的肽、蛋白质(例如，抗体、亲和体或适配体)、核酸(例如，多核苷酸、DNA、RNA或适配体)；多糖(例如，凝集素或糖)、脂质、酶、酶底物、配体、受体、抗原或半抗原。在一些实施方案中，目标物可包括蛋白质或核酸。

本文使用的术语“虚拟染色图像”(VSI)是指模拟由明场染色方案获得的图像的生物样品的图像。所述图像具有与明场图像类似的对比度、强度和着色。这允许通过生物样品内的特征来表征，包括但不限于胞核、上皮、基质或任何类型胞外基质材料特征，这就如同明场染色方案直接用于生物样品上所表征的。

本发明包括通常涉及可用于分析、诊断或预后应用例如分析检测、组织化学、免疫组织化学或免疫荧光的方法的实施方案。在一些实施方案中，本文公开的方法可特别适用于组织化学、免疫染色、免疫组织化学、免疫测定或免疫荧光。在一些实施方案中，本文公开的方法可特别适用于免疫印迹技术，例如蛋白质印迹或免疫测定，诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)。

用于连续染色并检测生物样品中的多种目标物的方法更全面地描述在2007年9月28日提交的题为“生物样品的连续分析(SequentialAnalysis of Biological Samples)”的美国专利申请序列号11/864085中，该专利申请通过引用结合到本文中。用于共定位样品中的目标物的方法描述在以下文献中：2007年3月15日提交的题为“用于分析组织样品的图像的系统和方法(System and Methods for Analyzing Images ofTissue Samples)”的美国专利申请序列号11/686,649；2006年8月7日提交的题为“共配准组织微阵列的多通道图像的系统和方法(Systemand Method for Co-Registering Multi-Channel Images of a Tissue MicroArray)”的美国专利申请序列号11/500028；2006年11月30日提交的题为“计分组织微阵列的图像的系统和方法(System and Methods forScoring Images of a Tissue Micro Array)”的美国专利申请序列号11/606582；和2007年2月28日提交的题为“图像结构的自动分割(Automated Segmentation of Image Structures)”的美国申请序列号11/680063，各文献通过引用结合到本文中。

已知将荧光图像转换为假明场图像的方法。然而，这些方法通常将特定色空间(波长)再指定到各荧光染料，使得荧光图像再着色到明场空间中。这些方法未将荧光图像转置为代表若将生物样品进行指定的明场染色方案例如H&E所获得图像的图像。相比之下，本文所述的发明由荧光图像产生明场图像，其中鉴别生物样品的结构特征和细节，正如图像自指定明场染色方案直接获得一样。类似明场染色方案的图像可称为虚拟染色图像(VSI)。

本发明描述了将通过荧光显微镜获取的一组生物标志物图像映射到新色空间的方法，其中映射图像强度值代表明场模式，且可用于产生VSI。所述方法涉及使用从生物样品的两种或更多种荧光图像和明场图像中的相应点获取的数据。该数据用于评估未知强度变换，该强度变换使用估计的映射参数

将荧光图像映射到明场色空间。

在其中使用H&E形态学染色来获得明场色空间的实施方案中，

可定义为：

$\hat{A}=\underset{A}{\arg \min }{(\mathrm{HE}-A\·\mathrm{FL})}^2$

其中A为未知的映射参数，且HE和FL分别代表储存相应H&E和荧光像素的已知组的矩阵。更具体地讲，HE代表H&E图像的色通道中的强度值且FL为在荧光图像色空间中的相应点处荧光标志物或自发荧光中至少一种的强度值。估计的映射参数可使用多种回归分析模型计算，所述回归分析模型包括但不限于普通线性最小二乘法(OLS)、广义最小二乘法(GLS)、迭代再加权最小二乘法(IRLS)或正交估计法。

在其中使用线性最小二乘法估计的实施方案中，

可通过以下来进一步计算：

$\hat{A}=(\mathrm{HE}\·F{L}^T){(\mathrm{FL}\·{\mathrm{FL}}^T)}^{-1}$

其中FL^T为FL矩阵的转置，且(-1)代表矩阵求逆。

用于计算映射参数的在荧光图像与明场图像中的点的对应可通过两种方法：基于强度的方法和基于特征的方法来建立。

在基于特征的方法中，对于荧光图像和明场图像二者获取胞核、上皮、基质或任何类型的胞外基质材料的图像。基于特征的结构可使用手工处理或自动选择。在来自两种模式的图像中选择相应结构。对于荧光图像，图像可使用具有调到给定生物标志物的适当激发能量来源和具有适合收集发射光的滤波器的荧光显微镜来捕获。类似地，多种生物标志物可在不移动显微镜下样品的情况下同时或连续成像。如所提到的，可对于不同标志物改变激发波长和滤波器。在某些实施方案中，可设计显微镜以使得其能获取明场图像和荧光图像两者。一种这样的显微镜可涉及校准的多光程和多个照相机。随后可获得样品的明场图像，其随后可分割成红色(R)通道、绿色(G)通道和蓝色(B)通道并且测量基于特征的结构的颜色和强度。

在基于强度的方法中，显微镜下样品区域的定位可用电子、磁性、光学或机械传感器控制，使得样品区域可接近相同位置重复定位以便接下来的图像获取。基于强度的配准通常适用于广泛种类的生物标志物。一般来说，固定或以其他方式提供在诸如但不限于TMA、载玻片、孔或载网的基底上的生物样品用分子生物标志物标记且通过荧光显微镜成像。

在一个实施方案中，可使用多种分子生物标志物，诸如与抗体或蛋白质结合的荧光染料。随后，在荧光显微镜下使用调到给定生物标志物的激发能量来源且使用适于最佳收集发射光的多种滤波器来使样品成像。多种生物标志物可在不移动显微镜下试样的情况下同时或连续成像。对于不同的生物标志物，可改变激发波长和滤波器。生物标志物可包括但不限于以下所列出的标志物，其包括各标志物的一种或多种但并非一定所有功能的简述：

Her2/neu：在乳腺癌和胃癌中过量表达的上皮生长因子，单克隆抗体的治疗减缓肿瘤生长

EGF-R/erbB：上皮生长因子受体

ER：一些乳腺癌肿瘤生长所需要的雌激素受体，位于胞核中且用ISH检测以决定限制阳性患者中雌激素的治疗

PR：孕酮受体为与DNA结合的激素

AR：雄激素受体参与雄激素依赖性肿瘤生长

P53：肿瘤抑制基因感应DNA破坏；在50％人类癌症中失活

β-联蛋白：癌症中的癌基因，从细胞膜易位到胞核，其在细胞粘着和作为潜在基因调节蛋白二者中起作用。

磷酸-β-联蛋白：在胞质溶胶中降解且不转运到胞核的β-联蛋白的磷酸化形式

GSK3β：在Wnt途径中的糖原合酶激酶-3β蛋白，使β-联蛋白磷酸化，标记磷酸-β-联蛋白以便在基因主体(protosome)中快速降解

PKCβ：介体G-蛋白偶联受体

NFKβ：当转运到胞核时炎症的核因子κB标志物

Bcl-2：B细胞淋巴瘤癌基因2，充当凋亡抑制剂

细胞周期蛋白D：细胞周期调控

VEGF：与血管生成有关的血管内皮生长因子

E-钙粘着蛋白：在上皮细胞上表达的细胞间相互作用分子，其功能在上皮癌中丧失

c-me：酪氨酸激酶受体。

带有区室信息的至少一种额外荧光形态学标志物也可包括在该步骤中。选择该标志物使得其带有与下一步的共同信息，且如果涉及连续染色，则用以配准图像。生物样品的区域随后用在明场色空间中可见的一种或多种形态学标志物诸如苏木精和伊红(H&E)染料重新标记，并再次成像。

在一些实施方案中，形态学标志物可包括但不限于以下：

角蛋白：上皮细胞的标志物

泛-钙粘着蛋白：细胞膜的标志物

平滑肌肌动蛋白：肌肉的标志物

DAPI：胞核的标志物

苏木精：DNA的标志物(蓝色染色)

伊红：胞质的标志物；取决于pH(红色染色)。

一些这样的形态学标志物可使用明场显微镜成像，而一些形态学标志物可使用荧光显微镜成像。在任何情况下，选择形态学标志物以使得其具有与较早步骤的共同信息。例如，如果在较早步骤中使用DAPI使胞核成像，则在第二步骤中可在明场显微镜下使用苏木精使胞核成像。因为它们两者均使相同区室染色，所以图像可通过图像配准技术对准。可将DAPI核染剂用作额外荧光形态学标志物以配准在明场图像与荧光图像中用苏木精染色的胞核。样品区域的图像使用硬件配准技术和软件配准技术两者重叠，并且储存信息，由此技术效果将是配准或以另外方式产生样品区域的多通道图像。

因此，基于强度的方法允许使用连续成像和共配准技术使来自相同生物样品的分子和形态学标志物二者成像。随后，对于荧光图像和明场图像二者，可对生物样品区域上给定点的像素强度进行配准和比较。与基于特征的方法类似，明场图像分割成红色(R)通道、绿色(G)通道和蓝色(B)通道。

在基于强度的方法或基于特征的方法中，从荧光图像到明场色空间的变换使用线性变换方程中估计的映射参数

当使用H&E染料时，该线性变换方程可表示为

或以矩阵符号表示为：

$\left[\begin{array}{c}{\mathrm{HE}}_{\mathrm{RED}}\\ {\mathrm{HE}}_{\mathrm{GREEN}}\\ {\mathrm{HE}}_{\mathrm{BLUE}}\end{array}\right]=\left[\begin{array}{ccccc}{a}_{\mathrm{1,1}}& a_{\mathrm{1,2}}& \·\·\·& a_{1,N}& a_{1,N+1}\\ a_{\mathrm{2,1}}& a_{\mathrm{2,2}}& \·\·\·& a_{2,N}& a_{2,N+1}\\ a_{\mathrm{3,1}}& a_{\mathrm{3,2}}& \·\·\·& a_{3,N}& a_{3,N+1}\end{array}\right]\left[\begin{array}{c}{\mathrm{FL}}_1\\ {\mathrm{FL}}_2\\ M\\ {\mathrm{FL}}_N\\ \stackrel{\mathrm{\ρ}}{1}\end{array}\right]$

其中“a”代表需要待估计的未知变换参数。使用该矩阵符号，明场图像分割成RGB色通道且荧光通道的数目为应用特异性的且基于特定任务所需的区室和蛋白质缔合数目。FL矩阵的最末行包括一行1以模拟映射中的常数项。通常可容易地同时应用三种或四种荧光染料，但也可使用更多种荧光染料。例如，如果存在100个特征点且荧光图像包括四种不同的标志物，则FL矩阵的大小为5×100，矩阵A的大小为3×5，且HE矩阵的大小为3×100。

只要计算出变换参数，则可通过用虚拟H&E映射，将样品的一个或多个所选区域用于从一组荧光图像变换到VSI。分子生物标志物有利地提供仅使用明场图像不可见的功能和区室信息。例如，图像分析算法可受益于额外通道以隔开样品区室，同时仍给病理学家或操作人员提供代表明场模式(H&E)的图像强度值。例如，代表H&E染色方案的VSI将血细胞显示为红色，胞核显示为紫色且结缔组织显示为粉红色。

在其它实施方案中，只要估算出映射参数，则可将变换算法应用到其它荧光图像以产生VSI。其他荧光图像可来自相同生物样品的不同区域。例如，生物样品的来源可为从新鲜、冷冻和/或保藏的器官或组织样品或活检或吸出物获得的实体组织；血液或任何血液组分；体液，诸如脑脊液、羊水、腹膜液或组织液；或来自受试者妊娠或发育中任何时间的细胞。在一些实施方案中，组织样品可包括原代或培养的细胞或细胞系。

在其他实施方案中，用于产生VSI的其他荧光图像可来自不同生物样品。所述不同生物样品可包括可具有相似功能的获自生物受试者组织的一系列相似细胞。人组织的合适实例包括但不限于(1)上皮；(2)结缔组织，包括血管、骨和软骨；(3)肌肉组织；和(4)神经组织。

在一些实施方案中，生物样品包括来自健康或病变组织样品的组织切片(例如，得自结肠、乳房组织、前列腺的组织切片)。组织切片可包括组织样品的单一部分或碎片，例如，从组织样品切下的组织或细胞薄片。在一些实施方案中，可取组织样品的多个切片并进行分析。

本文公开的方法可在生物学以及医学的分析、诊断和治疗应用中得到应用。在一些实施方案中，本文公开的方法可在组织化学、特别是免疫组织化学中得到应用。根据本文所述方法得自患者的细胞或组织样品的分析可在诊断上使用(例如，鉴别具有特定疾病、暴露于特定毒素或对特定治疗或器官移植反应良好的患者)和在预后上使用(例如，鉴别有可能发展特定疾病、对特定治疗反应良好或接受特定器官移植的患者)。本文公开的方法可有助于精确且可靠地分析得自相同生物样品的大量(例如，可能无限大的数量)目标物(例如，疾病标志物)。

在某些实施方案中，产生的VSI可用于病理诊断且还可包括基于分子标志物鉴别一种或多种分子途径的步骤，其中所述分子途径是疾病的指征。虽然所述方法可用于各种疾病，但所述方法特别适合的一种疾病为癌症，其包括但不限于上皮癌，诸如但不限于乳腺癌、前列腺癌和结肠癌。

在某些实施方案中，产生的VSI可用于定量分析，所述定量分析包括鉴别分子途径与选自胞核、上皮和基质的一种或多种形态结构之间的关系。例如，经染色的荧光图像可变换为H&E坐标系统且共同观察以提供增强的分析。

实施所述方法的图像分析系统通常包括：装置(means)，其用于至少暂时储存荧光空间和明场空间二者中用分子标志物和形态学染剂染色的数字图像；和处理装置(processor)，若涉及连续染色，则将该处理装置用于通过使用一种或多种配准来共同配准图像。所述处理装置还经配置以便如下计算映射参数：通过至少部分地分析明场图像和两种或更多种荧光图像的基于特征的信息或像素强度数据信息以将所述两种或更多种荧光图像变换为VSI。

所述系统还可包括：用于显示所述图像中的一种或多种的装置；交互式浏览器；虚拟显微镜；和/或经通信网络传输所述图像中的一种或多种的装置。所述处理装置也可至少部分地基于形态特征的分割使所述图像中的一种或多种彼此重叠。

在某些实施方案中，所述处理装置还经配置以从一个或多个先前分析的生物样品储存映射参数。这提供将变换算法应用到其他荧光图像以产生VSI的装置。其他荧光图像可来自相同生物样品的不同区域或来自不同生物样品。所述系统还可允许使用者从许多可用变换中选择并且甚至基于预期输出(产生的VSI)的目测检查交互式地调节变换参数。

在一些实施方案中，上述的一种或多种可自动操作且可使用自动系统进行。在一些实施方案中，所有步骤可使用自动系统进行。

实施例：比较结肠组织样品的H&E图像。

获得作为包埋在石蜡中的组织切片的成人结肠组织样品(Biochain，T2234090)。对成人组织的石蜡包埋切片进行免疫组织化学方案以备染色。该方案包括去石蜡化、再水合、温育和洗涤。在频繁搅拌下，通过用Histochoice(或甲苯)洗涤切片达10分钟的时间来进行去石蜡化。在去石蜡化之后，组织样品通过用乙醇溶液洗涤切片而再水合。洗涤用具有逐渐降低浓度的三种不同的乙醇溶液进行。乙醇的使用浓度为90体积％、70体积％和50体积％，随后将切片用磷酸缓冲盐水(PBS，pH 7.4)洗涤。组织的膜通透性通过用Triton TX-100的0.1重量％溶液洗涤切片来进行。将柠檬酸盐缓冲液pH 6.0(载体解掩蔽溶液(Vector Unmasking Solution))用于抗原修复。将切片暴露于在压力锅中的缓冲液达15分钟的时间，接着在室温下冷却20分钟。随后在37℃下，通过用PBS和900μL 3体积％牛血清白蛋白(BSA)洗涤45分钟来针对非特异性结合而封闭切片。为了用第二抗体(任选)染色，也将切片用来自第二抗体宿主物质的100μL血清封闭。

所制备的结肠切片使用在题为“生物样品的连续分析(SequentialAnalysis of Biological Samples)”的美国专利申请序列号   中描述的程序染色并成像。为了产生如图1和图2中所示的包括：DAPI、角蛋白(Cy3)、自发荧光(Cy3)、自发荧光(CFP)和自发荧光(Cy5)的五种荧光图像，图1和图2代表从不同结肠组织样品(样品A和B用于参考)获得的图像。一般来讲，结肠切片的染色和成像包括在37℃下用在3％BSA中染料缀合的抗体温育45分钟。在温育之后，对切片进行广泛系列的PBS洗涤。在37℃下将切片用在BSA中的第二抗体温育45分钟。在温育之后，对切片进行广泛系列的PBS洗涤。将第一抗体和第二抗体染色的切片用形态学染剂DAPI复染并用盖玻片盖上。

使用照相机对盖上盖玻片的切片成像。所使用的照相机为安装在Leica DMRA2荧光显微镜中的单色Leica DFC 350FX单色高分辨率照相机。除非另有说明，否则所用的放大率为20X。在获取图像之后，移出盖玻片并且将切片用PBS洗涤以防止信号破坏。

图1和图2还示出了使用估计的映射参数产生的H&E型图像的显微照片。图1示出了结肠组织样品的5种荧光图像和相应产生的H&E型图像(VSI，样品A)的单色实施方案。图2示出了结肠组织样品的5种荧光图像和相应产生的H&E型图像(VSI，样品B)的单色实施方案。

对于H&E图像和由DAPI图像、膜标志物图像和使用Cy3、Cy5和CFP滤色块(filter cube)得到的三种荧光图像组成的荧光图像组，手动鉴别一组相应点。将荧光图像标准化以使最小值调到0且最大值调到1。此外，将标准化荧光图像反转，以使得背景变亮且前景变暗。自发荧光图像的三种通道非常相关。所有自发荧光图像都可在几何上及代数上平均化以产生可用于映射中的两种新图像。该样品数据集的估计变换矩阵为：

$\hat{A}=\left[\begin{array}{ccccc}0.86& 0.00& 0.00& 0.10& -0.62\\ 1.05& 0.30& 0.19& 0.58& -3.10\\ 0.34& 0.16& 0.04& 0.12& -0.09\end{array}\right]$

在荧光成像之后，将切片用形态学染剂H&E染色且使用明场设置获取图像。样品A和样品B二者的图像连同来自图1和图2的产生的VSI示于图3中。

这些方法兼顾了分子病理学和标准解剖病理学。基于H&E的染色为在标准病理学中使用的最常见明场显微术染色技术。如上所述，苏木精使细胞核染成蓝色，而作为复染剂，伊红使胞质和结缔组织染成粉红色。存在可用作明场显微术的替代染剂的大量其他已知的染剂组合。例如，可使用福尔根染色使核酸成像，或者可使用地衣红使结缔组织纤维成像。

这些多通道方法不限于形态学染剂或荧光生物标志物或甚至病理学。能够使生物样品的某些信息性方面或特征显现以使得其可数字成像并处理的任何染剂将适用于这些方法。合适染剂包括但并不一定限于细胞学或形态学染剂、免疫染剂，诸如免疫组织化学和免疫细胞化学染剂、细胞遗传学染剂、原位杂交染剂、细胞化学染剂、DNA和染色体标志物和底物结合测定染剂。其他医学和生物科学应用可受益于扩展的多通道。这些多通道方法提供灵活的结构，其中标志物可在不限于光学、化学和生物相互作用的情况下连续成像。

虽然在本文中仅说明并描述了本发明的某些特征，但本领域技术人员将想到许多修改和变化。因此，应理解所附权利要求书意欲涵盖在本发明范围和精神内的所有这类修改和变化。

Claims (17)

1.使用荧光图像产生类似于生物样品的明场染色方案的明场型图像的方法，所述方法包括以下步骤：

获取生物样品上固定区域的两种或更多种荧光图像；

将所述荧光图像映射到明场色空间；和

产生明场型图像。

2.权利要求1的方法，其中所述明场型图像对应于具有红色、绿色和蓝色三通道色空间的H&E型图像。

3.权利要求1的方法，其中所述两种或更多种荧光图像中的至少一种图像为自发荧光型。

4.权利要求1的方法，其中所述映射步骤包括：

获取所述生物样品的固定区域的明场图像；

至少部分地利用基于特征的信息或像素强度数据信息分析所述明场图像和所述两种或更多种荧光图像的图像数据以产生映射参数以将所述两种或更多种荧光图像变换为明场色空间；和

将所述映射参数应用到所述两种或更多种荧光图像。

5.权利要求4的方法，其中所述获取明场图像的步骤包括用苏木精和伊红将所述生物样品连续染色以产生H&E型图像的步骤。

6.权利要求4的方法，其中所述基于特征的信息包括选自胞核、上皮和基质的一种或多种特征。

7.权利要求4的方法，其中所述产生映射参数的步骤包括使用线性估计模型。

8.权利要求7的方法，其中将所述线性估计模型定义为：

$\hat{A}=\underset{A}{\arg \min }{(\mathrm{HE}-A\·\mathrm{FL})}^2$

其中

为估计的映射参数，HE代表在H&E图像的色通道中的强度值，且FL为荧光图像的至少两个色通道的强度值。

9.权利要求4的方法，其还包括将所述映射参数应用到第二固定区域的两种或更多种荧光图像的步骤，其中所述第二固定区域来自相同或不同的生物样品。

10.权利要求1的方法，其还包括使用所述明场型图像进行病理诊断的步骤。

11.权利要求10的方法，其中所述病理诊断用于癌症。

12.权利要求1的方法，其还包括使用所述明场型图像进行定量分析的步骤。

13.权利要求12的方法，其中所述定量分析的步骤包括确定分子途径与选自胞核、上皮和基质的一种或多种形态学结构之间的关系。

14.使用荧光图像产生类似于生物样品的明场染色方案的明场型图像的图像分析系统，其包括：

适于获取生物样品上固定区域的两种或更多种荧光图像的数字成像装置；和

适于应用映射参数以将所述两种或更多种荧光图像变换为明场型图像的处理装置。

15.权利要求14的系统，其中所述处理装置进一步配置以通过以下步骤计算所述映射参数：

获取所述固定区域的明场图像；和

至少部分地分析所述明场图像和所述两种或更多种荧光图像的基于特征的信息或像素强度数据信息以将所述两种或更多种荧光图像变换为明场色空间。

16.权利要求15的系统，其中所述分析步骤包括线性估计模型。

17.权利要求15的系统，其中所述处理装置进一步配置以储存来自一个或多个先前分析的生物样品的映射参数。

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