JP2000014385A - フィブロネクチン遺伝子の発現を抑制するタンパク質をコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 フィブロネクチン遺伝子の発現を抑制するタ
ンパク質、およびそのタンパク質をコードするＤＮＡの
提供、並びに該タンパク質を認識する抗体の提供。 【解決手段】 フィブロネクチン遺伝子の発現を抑制す
るタンパク質をコードするＤＮＡであって特定の塩基配
列を有するＤＮＡ；該ＤＮＡがコードするタンパク質；
該タンパク質を認識する抗体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、フィブロネクチン
遺伝子の発現を抑制するタンパク質をコードするＤＮ
Ａ、該ＤＮＡによりコードされるタンパク質、並びに該
タンパク質を認識する抗体に関する。さらに詳細には、
本発明は、フィブロネクチン遺伝子の転写制御配列に含
まれるＧリッチ配列に結合することによりフィブロネク
チン遺伝子の発現を抑制するタンパク質コードするＤＮ
Ａ、該ＤＮＡによりコードされるタンパク質、並びに該
タンパク質を認識する抗体に関する。

【０００２】

【従来技術】フィブロネクチン（ＦＮ）は、細胞外マト
リックスの大型糖タンパク質であり、二量体としてイン
テグリンスーパーファミリーの一員である細胞表面受容
体α５β１に結合する（Buck他、1987, Annu.Rev.Cell
Biol.3:179-205;Hynes他、1982, J.Cell Biol.95:369-3
77; Rouslahti 、1988, Annu.Rev.Biochem.57:375-413
）。フィブロネクチンは複数のロッド状のドメインか
ら構成され、各ドメインはコラーゲンやヘパリン等の細
胞外マトリックスの成分またはその受容体に結合する
（Hynes 、1985, Annu.Rev.Cell Biol. 1:67-90 ）。受
容体の細胞質ドメインは、付着タンパク質への結合を通
じて間接的にストレス繊維として知られるアクチンフィ
ラメントの束に結合する（Horowitz他、1986, Nature.
320:531-533）。フィブロネクチンがその受容体に結合
することにより、細胞骨格は細胞外マトリックスに接続
して（Burridge他、1988, Annu.Rev.CellBiol. 4:487-5
26; Hynes、1987, Cell.48:549-554; Jockush他、1995,
Annu.Rev.Cell.Dev. Biol.11:379-416; Ruoslahti 、1
988. Annu.Rev.Biochem. 57:375-413）、細胞の形態、
接着および移動を支配する。フィブロネクチンはまた、
細胞外マトリックスと細胞骨格との組織化を通じて細胞
の増殖と分化の調節にも関与している（Dufour他、198
8, TIG 4:198-207; Hynes他、1982, J.Cell Biol.95:36
9-377）。

【０００３】フィブロネクチンの発現量は細胞の増殖力
と密接に関係しており、細胞が増殖を停止する傾向にあ
るときにフィブロネクチンの発現量は増加する。したが
って、老化した細胞はフィブロネクチンを多量に発現し
ている（Hara他、1993. Anal.Biochem.214:58-64; Kuma
zaki他、1991, Exp.Cell Res.195:13-19; Murano他、19
91, Mol.Cell.Biol. 11:3905-3914 ）。これとは対照的
に、フィブロネクチンの発現は形質転換によって著しく
抑制される（Fagen 他、1981, J.Biol.Chem.256:520-52
5; Jichemsen他、1986, J.Virol.59:684-691; Nakamura
他、1992, J.Virol.66:6436-6450）。例えば、アデノウ
イルスＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子で形質転換したラット
３Ｙ１誘導細胞株ＸｈｏＣは、フィブロネクチンをごく
わずかしか発現しない（Nakamura他、1992, J.Virol.6
6:6436-6450 ）。また、大多数の腫瘍細胞でもほとんど
フィブロネクチンが発現しないために、細胞骨格と細胞
外マトリックスの組織が崩壊して腫瘍転移を促進してし
まう。

【０００４】ＦＮプロモーターには、Ｇ残基のみからな
るＧ１０ストレッチ（転写開始点の上流−２３９塩基か
ら−２３０塩基）と、Ｇ１０ストレッチにＣ残基が挿入
された２つのＧＣボックス（転写開始点の上流−１０５
塩基から−９５塩基のＧＣｕと、−５４塩基から−４４
塩基のＧＣｄ）が存在する。正の転写調節因子であるＳ
ｐ１はこれらのＧリッチ配列に結合することが知られて
いる。また、ＸｈｏＣ細胞から取得されたアデノウイル
スＥ１Ａ誘導性の負の転写調節因子Ｇ１０ＢＰも、Ｇリ
ッチ配列に結合する（Suzuki他、1995, Mol.Cell.Biol.
15:5423-5433）。豊富なＳｐ１を含有するＨｅＬａ細
胞抽出物中におけるＦＮプロモーター−ＣＡＴ（クロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）融合遺伝
子の転写活性は、精製Ｇ１０ＢＰを添加することによっ
て阻害されることが確認されている。

【０００５】フィブロネクチンの発現を有効に制御する
ことができる調節因子が提供されれば、フィブロネクチ
ンの発現と細胞増殖、癌、細胞老化などとの関係をより
明確化することができるものと考えられる。その結果、
さまざまな疾患の治療方法や治療薬、検査方法や検査薬
の開発がなされ得るものと期待される。また、このよう
な調節因子は、フィブロネクチン発現抑制のみならずよ
り広範囲な遺伝子の発現抑制に関与している可能性もあ
り、応用範囲の拡大も期待される。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】このような従来技術の
水準を考慮して、本発明は、フィブロネクチンの転写を
効果的に抑制することができる調節因子をコードする遺
伝子を単離し、該遺伝子を含む組み換えベクターおよび
その組み換えベクターを含む形質転換体を提供すること
によって、調節因子を容易に調製できるようにすること
を解決すべき課題とした。また本発明は、その調節因子
のアミノ酸配列を解明することによって、構造的特徴を
明らかにすることも解決すべき課題とした。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、本発明者らは、ＦＮプロモーターのＧ１０ストレッ
チに結合し、かつフィブロネクチン遺伝子の発現を抑制
するタンパク質をコードするＤＮＡのクローニングを種
々試行錯誤して試みた。その結果、ｃＤＮＡライブラリ
ーを使用したワン・ハイブリッドスクリーニング法を用
いれば、目的ＤＮＡをクローニングすることができるこ
とを見出した。ここでいうワン・ハイブリッド・スクリ
ーニング法とは、目的とする転写因子と結合する配列
（Ｘ）をレポーター遺伝子の上流に組み込み、スクリー
ニングの対象となる遺伝子産物（Ｙ）をある転写因子の
転写活性化部位に融合させた形で発現させ、結合配列
（Ｘ）と遺伝子産物（Ｙ）の相互作用をレポーター遺伝
子の発現量を指標にして検出する方法である（Daniel
他、1992、Nucleic Acids Research. 20:1425; James
他、1991, Nucleic Acids Research. 19:5791; Siewek
e, 他、1996, Cell. 85:49-60）。

【０００８】本発明者らは、ＨＩＳ３遺伝子とｌａｃＺ
遺伝子の最小プロモーターにＧ１０ストレッチを融合さ
せた遺伝子を含む試験株を、ｃＤＮＡによりコードされ
たポリペプチドとＧａｌ４の転写活性化ドメインからな
る融合タンパク質の合成を指令するｐＧＡＤ−ＸｈｏＣ
細胞ｃＤＮＡライブラリーで形質転換することにより、
Ｇリッチ配列結合性調節因子ＧＢＰ−１を見出して、本
発明を完成するに至った。

【０００９】本発明の第１の側面によれば、配列表の配
列番号１に記載の塩基配列またはその一部を有するＤＮ
Ａであって、フィブロネクチン遺伝子の発現を抑制する
タンパク質をコードするＤＮＡが提供される。また、こ
れらのＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡであって、フ
ィブロネクチン遺伝子の発現を抑制するタンパク質をコ
ードするＤＮＡも提供される。本発明の一つの態様にお
いては、本発明のＤＮＡはラット由来の遺伝子である。
本発明によれば、本発明の上記ＤＮＡを含む組み換えベ
クター、好ましくは発現用組み換えベクター、並びに、
上記組み換えベクターを含む形質転換体も提供される。
また本発明によれば、配列表の配列番号１に記載の塩基
配列のうちの連続する１２以上の塩基配列を有するオリ
ゴヌクレオチド、並びに、配列表の配列番号１に記載の
塩基配列に相補的な塩基配列のうちの連続する１２以上
の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドも提供される。

【００１０】本発明の第２の側面によれば、本発明のＤ
ＮＡが導入された形質転換体により産生されるタンパク
質であって、配列表の配列番号３から５に記載の塩基配
列に結合し、かつフィブロネクチン遺伝子の発現を抑制
することを特徴とするタンパク質、並びに、配列表の配
列番号２に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列にお
いて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加
されたアミノ酸配列を有するタンパク質が提供される。
本発明の第３の側面によれば、本発明の上記タンパク質
を認識する抗体が提供される。抗体はモノクローナル抗
体でもポリクローナル抗体でもよい。

【００１１】

【発明の実施の形態】以下において、本発明を実施する
ための方法および実施形態について説明する。本発明の
第１の側面により提供されるＤＮＡは、フィブロネクチ
ン遺伝子の発現を抑制するタンパク質をコードする。本
発明のＤＮＡには、配列表の配列番号１に記載の塩基配
列またはその一部を有するものが含まれる。配列番号１
に記載の塩基配列の一部を有する場合は、フィブロネク
チン遺伝子の発現を抑制するタンパク質をコードする限
り、その配列の長さと選択部分は制限されない。

【００１２】また、本発明には、これらのＤＮＡにハイ
ブリダイズするＤＮＡも含まれる。その配列の長さと塩
基配列も、フィブロネクチン遺伝子の発現を抑制するタ
ンパク質をコードする限り制限されない。ハイブリダイ
ゼーションの条件は特に制限されないが、プローブＤＮ
Ａ配列と検出されるＤＮＡ配列との間の相同性が比較的
高くなるような条件を選択するのが一般的である。ハイ
ブリダイゼーションの条件は、ハイブリダイゼーション
溶液中のホルムアミド濃度および／または塩濃度、ハイ
ブリダイゼーション温度またはハイブリダイゼーション
時間などによって調節することができる。また、ハイブ
リダイゼーション後の洗浄条件（洗浄液の塩濃度等）に
よって調節することもできる。これらの条件は、プロー
ブの長さおよび／または塩基組成、並びに検出すべき塩
基配列とプローブの塩基配列との相同性の設定に応じ
て、当業者ならば適宜選択することができる。

【００１３】ハイブリダイゼーションは、好ましくは配
列番号２に記載のアミノ酸をコードする塩基配列と７０
％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましく
は９０％、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは
９８％以上の相同性を有する塩基配列を検出できる程度
の条件で行う。好ましいハイブリダイゼーションの条件
例として、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミ
ド濃度５０％、ＳＳＣ濃度５×ＳＳＣ〜６×ＳＳＣ、ハ
イブリダイゼーション温度３７〜４２℃を例示すること
ができる。

【００１４】本発明のＤＮＡがコードするフィブロネク
チン遺伝子の発現を抑制するタンパク質の一例として
は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するものが挙
げられる。組み換え遺伝子技術を使用してタンパク質を
宿主中において産生することを意図する場合、目的タン
パク質をコードする天然の遺伝子で使用されているコド
ンが使用する宿主中で使用頻度が低い場合にはタンパク
質の発現量が低くなる可能性がある。このような場合
は、コードされているアミノ酸配列を変化させることな
く、そのコドンを宿主での使用の頻度が高いコドンに変
化させることによって目的タンパク質の発現量を増大さ
せることが好ましい。

【００１５】従って、本発明のＤＮＡは、コードされる
タンパク質がフィブロネクチン遺伝子の発現を抑制する
限り、配列番号２に記載のアミノ酸配列またはそれに対
して１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加
されているアミノ酸配列をコードするＤＮＡの全てを包
含する。配列番号１に記載の塩基配列はその好ましい一
態様を示すものである。

【００１６】本発明によれば、本発明のＤＮＡを含む組
み換えベクターが提供される。組み換えベクターの種類
は特に限定されず、その後の操作の目的に応じて適当な
ベクターを選択できる。一般的にはプラスミドベクタ
ー、ファージベクターなどが使用でき、これらは多くの
業者から市販されている。また、本発明のＤＮＡがコー
ドする組み換えタンパク質を産生させたい場合には、発
現ベクターが使用される。

【００１７】本発明によれば、上記組み換えベクターを
宿主に形質転換することによって作製される形質転換体
が提供される。宿主としては任意の好適な生物体を選択
でき、例えば微生物であり、真核微生物（動物細胞、植
物細胞、酵母など）でも原核微生物（大腸菌など）でも
よい。形質転換の方法は当業者に公知の方法を使用する
ことができ、具体的には、リン酸カルシウム法、エレク
トロポレーション、マイクロインジェクション、リポフ
ェクション法などを適宜使用できる。

【００１８】本発明によれば、配列表の配列番号１に記
載の塩基配列のうちの連続する１２以上の塩基配列を有
するオリゴヌクレオチド、並びに、配列表の配列番号１
に記載の塩基配列に相補的な塩基配列のうちの連続する
１２以上の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドも提供
される。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば適当な
標識で標識化することによってプローブとして利用する
ことができる。標識の種類は特に制限されるものではな
く、放射性同位元素（例えば³²Ｐや¹²⁵Ｉ ）、蛍光物質
（例えばフルオレセイン）、酵素基質などを使用目的に
応じて選択して用いることができる。こうして調製した
プローブは、例えば検体から取得した染色体やゲノムＤ
ＮＡなどとハイブリダイズさせることによって疾患の診
断に利用することができる。ハイブリダイゼーションの
程度を測定するためには、サザンハイブリダイゼーショ
ン、ＦＩＳＨ法、ＰＣＲなどを利用することができる。
また、配列表の配列番号１に記載の塩基配列に相補的な
塩基配列のうちの連続する１２以上の塩基配列を有する
オリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号１に記載の塩
基配列からなるＤＮＡに添加されることによって、該Ｄ
ＮＡから蛋白質が生合成されるのを抑制する働きを行う
こともある。

【００１９】本発明の第２の側面により提供されるタン
パク質は、フィブロネクチン遺伝子の発現を抑制する作
用を有している。本発明のタンパク質は、ＦＮプロモー
ターの下流ＧＣボックス（ＧＣｄ）に比較的強く結合す
る。また、Ｇ１０ストレッチおよび上流ＣＧボックス
（ＧＣｕ）にも結合する。本発明のタンパク質のフィブ
ロネクチン発現抑制作用は、これらのＧリッチ配列に結
合することによって発現するものと考えられる。特に下
流ＧＣボックス（ＧＣｄ）はフィブロネクチン転写効率
に大きな影響を与えることから、本発明のタンパク質は
効果的に転写を抑制することができる。このため、ＦＮ
プロモーターの正の調節因子であるＳｐ１との共存下に
おいても、本発明のタンパク質はフィブロネクチンの発
現を十分に抑制し得る。

【００２０】配列番号２に記載のアミノ酸配列は、本明
細書の実施例でクローニングされた遺伝子の塩基配列に
基づいて誘導されたアミノ酸配列であり、本発明のタン
パク質の好ましい態様を示したものである。一般に、天
然に存在するタンパク質の中には、それをコードする遺
伝子の多形性や変異のために、あるいはタンパク質生成
後の修飾反応などによって、アミノ酸配列中に１若しく
は数個のアミノ酸残基の欠失、付加、置換などの変異が
生じる場合があるが、それにも関わらずそのような変異
が生じないタンパク質と実質的に同等の生理学的活性を
有するものがある。あるいはまた、タンパク質組み換え
工学の技術を使用して人工的にタンパク質に変異を施す
ことも可能であり、この場合にも該タンパク質の生理学
的活性に実質的に変化を生じさせることなく変異させる
ことが可能である。これらの変異を有するタンパク質も
フィブロネクチン遺伝子の発現を抑制するという機能を
有する限り、本発明のタンパク質の範囲に含まれる。

【００２１】また、本発明のタンパク質は、天然のタン
パク質でも組み換えタンパク質でも、あるいは化学合成
タンパク質でもよく、その起源は特に限定されない。天
然のタンパク質を得たい場合には、目的タンパク質を発
現している組織または培養細胞の培養物を出発原料とし
て、塩析、アフィニティ−クロマトグラフィー、イオン
交換クロマトグラフィーまたはゲル濾過などのタンパク
質の精製のための公知の方法を適宜組み合わせて精製す
ることが可能である。例えば、アフィニティ−クロマト
グラフィーを利用する場合には、本発明のタンパク質に
対する抗体を結合させた担体を用いることにより目的タ
ンパク質を精製することができる。

【００２２】また、組み換えタンパク質を得たい場合に
は、上記のように目的タンパク質をコードする本発明の
遺伝子を好適な発現ベクター中にクローニングして得ら
れた組み換え発現ベクターを宿主（大腸菌、酵母など）
に形質転換し、形質転換体を好適な条件下で培養するこ
とにより目的とするタンパク質を産生させることができ
る。目的タンパク質の単離のためには、目的タンパク質
を培養上清中に分泌させることが一般には好ましく、こ
れは、組み換えベクター／宿主の組み合わせや培養条件
などを適宜選択することによって行うことができる。ま
た、所望のアミノ酸配列を有するタンパク質を化学合成
的に製造することも当業者ならば適宜行うことができ
る。

【００２３】本発明の第３の側面により提供される抗体
は、本発明のタンパク質を認識する抗体である。本発明
の抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナ
ル抗体であってもよい。本発明の抗体は、通常用いられ
る方法によって製造することができる。例えば、本発明
のタンパク質をウシ血清アルブミンなどの適当な担体と
ともに動物体内（例えばラット、マウス、ウサギ、ヤ
ギ、ヒツジなど）に注射し、一定期間経過後に血清を精
製することによって本発明の抗体を得ることができる。
本発明の抗体を利用すれば、本発明のタンパク質の検出
を行うことができる。本発明の抗体を利用したタンパク
質の認識は、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティ
ング、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降、蛍光抗体法な
どによって行うことができる。これらの方法を利用すれ
ば、本発明の抗体をフィブロネクチンの発現制御の研究
や疾患治療に役立てることができるものと期待される。

【００２４】

【実施例】以下に具体例を記載して、本発明をさらに詳
細に説明する。以下の例に記載される材料、割合、手順
等は、本発明の精神から逸脱しない限り適宜変更するこ
とができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す具
体例に制限されるものではない。

【００２５】以下の具体例で使用した３Ｙ１細胞は、Fi
scher ラット胚繊維芽細胞のクローン化株である（Kimu
ra他、1975, Int. J. Cancer 15:694-706）。またＸｈ
ｏＣ細胞は、アデノウイルス２型Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺
伝子による３Ｙ１細胞の形質転換によって樹立した（Na
kamura他、1992, J.Biol.66:6436-6450 ）。またｇ１２
細胞は、アデノウイルス２型Ｅ１Ａ_12SｃＤＮＡ（Zerle
r他、1986, Mol.Cell.Biol. 6:887-899）がマウス乳癌
ウイルス長末端反復配列（Lee 他、1981, Nature 294:2
28-232）の下流に存在するＰＭ１２ＳＧを３Ｙ１細胞株
にトランスフェクションすることによって樹立した。さ
らにＹＧ１細胞は、３Ｙ１細胞中にｐＣＭＶ−ＧＢＰ−
１およびｐＳＶ２ｎｅｏ（Southern他、1982, J.Mol.Ap
pl.Genet., 1:327-341）を導入することによって樹立し
たものであり、ＧＢＰ−１を発現する。これらの細胞株
は１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したダルベッコ
改変イーグル最小必須培地中で３７℃で培養した。

【００２６】例１：ＧＢＰ−１の調製と構造解析 （１）ｐＧＡＤ−ＸｈｏＣｃＤＮＡライブラリーの構築 本発明者は、ＦＮプロモーターのＧリッチ配列と結合
し、かつフィブロネクチン遺伝子の発現を抑制するタン
パク質をコードするＤＮＡのクローニングを種々試行錯
誤して試みた結果、以下に述べるｃＤＮＡライブラリー
を使用したワン・ハイブリッドスクリーニングによる方
法を用いることによって目的ＤＮＡのクローニングに成
功した。Okayama 他の方法（Okayama 他、1987, Method
s in ENZYMOLOGY 154:3-28）に従ってＸｈｏＣ細胞から
全細胞ＲＮＡを調製し、ＸｈｏＩ部位を有するオリゴｄ
Ｔプライマーを使用してポリＡ＋ＲＮＡを逆転写した。
合成したｃＤＮＡの両末端を平滑末端化した後にＥｃｏ
ＲＩリンカーにライゲートした。ＥｃｏＲＩおよびＸｈ
ｏＩで切断した後、ｃＤＮＡ（１００ｎｇ）をＥｃｏＲ
Ｉ／ＳａｌＩで切断した酵母発現プラスミドｐＧＡＤ４
２４（Clontech）（１００ｎｇ）に１６℃で４８時間ラ
イゲートした。ライゲートしたｃＤＮＡをフェノール／
クロロホルムで抽出し、マイクロン１０（MILLIPORE ）
で超遠心し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ遺伝子パルサーを使用して
大腸菌ＤＨ１０Ｂにエレクトロホレーションすることに
よって、ｐＧＡＤ−ＸｈｏＣｃＤＮＡライブラリーを作
製した（図１）。このライブラリーは、Ｇａｌ４の転写
活性化ドメイン（ＡＤ）とｃＤＮＡでコードされたポリ
ペプチドからなる融合タンパク質の発現を、ＡＤＨ１プ
ロモーターから指令し、酵母中でプラスミドとして自律
的に複製する。このライブラリーは、約０．９ｋｂの平
均ｃＤＮＡサイズを有する３．１×１０⁵ 個の一次組み
換え体を含んでいた。

【００２７】（２）ワン・ハイブリッド・スクリーニン
グ ５’末端にＥｃｏＲＩ認識配列を有する２４ｂｐのオリ
ゴヌクレオチドＡＣＣＡＡＡＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＡ
ＧＴＴＣＴＣ（配列番号３）を同じ方向に３個連結した
コピーを、ＨＩＳ３プロモーターの上流に位置するｐＨ
ＩＳｉのＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩ部位に挿入することによ
って、リポータープラスミドｐＨＩＳｉ−Ｇ１０を構築
した。同様にして、該オリゴヌクレオチドを同じ方向に
３個連結したコピーを、ＣＹＣ１プロモーターの上流に
位置するｐＬａｃＺのＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩ部位に挿入
することによって、リポータープラスミドｐＬａｃＺ−
Ｇ１０を構築した（図１）。該オリゴヌクレオチドは、
フィブロネクチン遺伝子の転写開始点の上流−２４５塩
基から−２２２塩基に位置するＦＮプロモーター配列で
あり、下線で示すＧ１０ストレッチを含んでいる。Sacc
haromyces cerevisiae株ＹＭ４２７１（Ｈｉｓ−、Ｕｒ
ａ−、Ｌｅｕ−）をこれらの２つのプラスミドで形質転
換し、ＳＤ培地（Ｈｉｓ−）上に置いた。ＨＩＳ３遺伝
子の残存発現のためにゆっくりと生育するが、６０ｍＭ
の３−アミノトリアゾール（３−ＡＴ）の存在下では生
育できなかったクローンを選択した。これらのクローン
をさらに以下に記載する手順でβ−ガラクトシダーゼの
残存発現について試験し、スクリーニングに適した形で
２つのリポータープラスミドが組み込まれているクロー
ンＹＭＨＬ−Ｇ１０を最終的に樹立した。

【００２８】ＹＭＨＬ−Ｇ１０株をｐＧＡＤ−ＸｈｏＣ
ｃＤＮＡライブラリー（約２×１０⁶ のＬｅｕ＋コロニ
ーを産生するもの）で形質転換し、３０ｍＭの３−ＡＴ
を含有するＳＤ培地（ロイシンとヒスチジンを欠く）中
で生育したＨｉｓ＋ Ｌｅｕ＋形質転換体のβ−ガラク
トシダーゼ活性を測定した。生育したコロニー（Ｈｉｓ
＋ コロニー；１１６コロニー）を、トリプトファンと
ロイシンを含有する培地上に置いたナイロンフィルター
上にストリークし、フィルターを３０ｍＭの３−ＡＴを
含有する寒天ＳＤ培地（Ｈｉｓ−）上にて３０℃で２日
間インキュベートした。次いで、フィルターを液体窒素
に浸し、コロニーを３回凍結融解した。フィルターを、
０．０１％のＸ−ｇａｌを含有するＺ緩衝液（６０ｍＭ
のＮａ₂ＨＰＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ、６０ｍＭのＮａＨ₂ ＰＯ₄
・７Ｈ₂ Ｏ、１０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＳＯ₄・
７Ｈ₂Ｏ、５０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、ｐＨ
７．０）中に浸しておいたワットマン３ＭＭフィルター
上に３０℃で１〜２時間重ねた。青色を呈してβ−ガラ
クトシダーゼを発現しているクローン３個を単離した。

【００２９】単離した各クローンからライブラリープラ
スミドを以下の手順で回収した。先ず、陽性クローンを
５ｍｌのＳＤ−ＬＥＵ培地に植菌し、２４時間培養し
た。培養液１．５ｍｌをマイクロ遠心チューブに取っ
て、１０，０００ｒｐｍで１０秒間遠心して菌体を回収
した。上清を捨て、菌体を０．１ｍｌのＴＥＬＴ溶液に
懸濁した。０．１ｍｌのフェノール：クロロホルム
（１：１）と酸洗浄ガラスビーズを約０．２ｇ加え、２
分間激しくボルテックスにかけた。１２，０００ｒｐｍ
で１分間遠心して中間層を取らないように上層を別のチ
ューブに取り、０．２ｍｌのエタノールを加えてエタノ
ール沈殿してＤＮＡを回収した。７０％エタノールで洗
浄した後、十分乾燥して３０μｌのＴＥ緩衝液に溶解し
た。得られたＤＮＡ溶液を大腸菌ＨＢ１０１株にエレク
トロポレーション法で導入した。この大腸菌をＭ９培地
で培養し、得られた形質転換体からプラスミドを回収し
た。

【００３０】回収したプラスミドを、試験株の再形質転
換のために使用した。コロニー（Ｈｉｓ＋ 、β−ｇａ
ｌ＋ ）の単離をさらに２回繰り返し、２個のクローン
を最終的に選択した。このプラスミドをキアウェル８プ
ラス（ＱＩＡｗｅｌｌ ８ ｐｌｕｓ（登録商標、キア
ゲン社））キットを用いて、取扱説明書に従って調製
し、プラスミドのインサートの塩基配列をパーキンエル
マー社製ＤＮＡシークエンサー３７３Ａを用い、Ｔａｑ
サイクルシークエンシング法（Biotechniques, 7,494-4
99 ）により決定した。６．６ｋｂのｃＤＮＡインサー
トを含有する一つのクローンはヒトエラスチン遺伝子と
相同性を有し、１．７ｋｂのインサートを含有する他方
のクローンは、後述するように塩基性領域−ロイシンジ
ッパーモチーフを伴う配列を有していた。

【００３１】（３）λＺａｐＩＩｃＤＮＡライブラリー
のスクリーニング ＧＢＰ−１をコードするｃＤＮＡクローンを、Ｇ１０ス
トレッチを含有する³²Ｐ標識オリゴヌクレオチドをプロ
ーブとして使用して、λＺａｐＩＩＸｈｏＣ細胞ｃＤＮ
ＡλＺａｐＩＩからの約５×１０⁵個の組み換えファー
ジをスクリーニングすることによって単離した。先ずｃ
ＤＮＡライブラリーを、クローニングベクターとしてλ
ＺａｐＩＩを使用してＸｈｏＣ細胞から構築した。ｍＲ
ＮＡ（５μｇ）をλＺａｐＩＩクローニングキット（ST
RATAGENE）を使用して逆転写し、５’末端にＥｃｏＲＩ
部位を有し、３’末端にＸｈｏＩ部位を有するｃＤＮＡ
を１００ｎｇのλＺａｐＩＩアームに挿入した。組み換
えＤＮＡをGigapackII Packaging Extract（STRATAGEN
E）を使用してパッケージングし、λＺａｐＩＩ−Ｘｈ
ｏＣｃＤＮＡライブラリーを作製した。

【００３２】ｃＤＮＡライブラリーを、１３７ｍｍのデ
ィッシュ当たりの組み換え体が約５×１０⁴ 個になるよ
うにＬＢアガープレート上にプレートし、プラークが確
認できるまで４２℃で３〜４時間インキュベートした。
２０ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノ
シド（ＩＰＴＧ）で浸したニトロセルロースフィルター
をプレート上に重ね、タンパク質の発現を３７℃で一晩
誘導した。フィルターを結合緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰ
ＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２
−エタンスルホン酸）、ｐＨ７．９、４０ｍＭのＫＣ
ｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂ 、１ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍ
ＭのＺｎＳＯ₄）中で洗浄し、６Ｍの塩酸グアニジンを
含む５０ｍｌの結合緩衝液中でフィルターを４℃で１５
分間インキュベートすることによってタンパク質を変性
させた。タンパク質を、１：２の割合で連続希釈して調
製した６〜０．１８７５Ｍの塩酸グアニジンをぞれぞれ
含む結合緩衝液中にて４℃で５分間戻させた。フィルタ
ーを、滅菌５％スキムミルクを加えた結合緩衝液中にて
４℃で３０分間ブロッキングし、１０μｇ／ｍｌのポリ
（ｄＩ−ｄＣ）ポリ（ｄＩ−ｄＣ）と、Ｇ１０ストレッ
チを含む１×１０⁶ｃｐｍ／ｍｌの³²Ｐ標識２７ｂｐオ
リゴヌクレオチドとを含有する結合緩衝液中でインキュ
ベートした。フィルターを結合緩衝液中で洗浄し、−８
０℃で増強スクリーンを使用してオートラジオグラフィ
ーをとった。

【００３３】一つの陽性クローンは１．６ｋｂのｃＤＮ
Ａインサートを含んでおり、その配列はｐＧＡＤ−Ｘｈ
ｏＣｃＤＮＡライブラリーからクローニングされた１．
７ｋｂのｃＤＮＡの配列と同一であった。このｃＤＮＡ
によってコードされるＧリッチ配列結合タンパク質をＧ
ＢＰ−１と命名した。

【００３４】（４）ＧＢＰ−１の構造解析 λＺａｐＩＩクローンのＧＢＰ−１ｃＤＮＡインサート
の配列を図２に示すとおりに決定した（配列番号２）。
オープンリーディングフレームからの推定アミノ酸配列
は３８５個のアミノ酸からなる。黒ボックスで示される
塩基性領域がコード領域の中央およびＣ末端寄りに位置
している。中央の塩基性領域中では、２４残基のうち９
個のアミノ酸がアルギニンおよびリジンである。プロリ
ンに隣接する４個の塩基性アミノ酸のストレッチ（ボッ
クス中に下線で示す）は核局在化シグナルである可能性
がある。４個の疎水性アミノ酸が７アミノ酸ごとに存在
するロイシンジッパー領域が中央の塩基性領域の下流に
位置している。Ｃ末端寄りの塩基性領域は２６残基から
構成され、１１種類の塩基性アミノ酸を含む。オープン
ボックスで示したＧＢＰ−１のＣ末端部分は通常とは異
なり酸性であり、４９残基のうち１７個のアミノ酸はグ
ルタミン酸とアスパラギン酸である。この推定アミノ酸
配列をタンパク質データバンク（GenBank ）で検索した
結果、コドン１から２３５のＧＢＰ−１のＮ末端側半分
がレジニフェラトキシン（resiniferatoxin ）結合タン
パク質（Ninkina 他、1994, Mol.Bran Res.22:39-48 ）
のアミノ酸配列と同一であることが判明した。

【００３５】ＧＢＰ−１ｃＤＮＡインサートをプラスミ
ドpBluescript SK- に挿入し、該プラスミドを大腸菌Ｘ
ＬＩ−ｂｌｕｅに導入して形質転換体を作製した。この
形質転換体をＲａｔ−ＧＢＰ−１と名付け、平成１０年
６月１９日に工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託
した。該形質転換体の受託番号は、ＦＥＲＭ Ｐ−１６
８５６である。

【００３６】例２：ＧＢＰ−１発現ベクターの構築 ｐＣＭＶ−ＧＢＰ−１の構築のために、Bluescript SK
(-)ＧＢＰ−１を、ＸＬ−１ブルー細胞を組み換え体お
よびヘルパーファージで製造業者（STRATAGENE）の指示
に従って同時感染させた後に、λＺａｐＩＩ組み換え体
から切り出した。ＤＮＡをＡｐａＩおよびＢａｍＨＩで
切断し、ＧＢＰ−１ｃＤＮＡを含有する１．５ｋｂのフ
ラグメントをｐＣＭＶのＡｐａＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿
入してｐＣＭＶ−ＧＢＰ−１を作製した。

【００３７】ｐＧＥＸ−ＧＢＰ−１をポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）産物を使用して構築した。ＧＢＰ−１ｃ
ＤＮＡをｐＣＭＶ−ＧＢＰ−１ＤＮＡを鋳型として使用
し、ＢａｍＨＩ認識配列に融合した位置１〜１８の上流
センスプライマーと、ＥｃｏＲＩ認識配列に融合した位
置１１４４〜１１６３の下流アンチセンスプライマーを
使用して合成した。ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩとＥｃｏＲ
Ｉで切断し、ｐＧＥＸ−２ＴＫのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲ
Ｉ部位に挿入してｐＧＥＸ−ＧＢＰ−１を作製した。Ｇ
ＢＰ−１ｃＤＮＡのＮ末端部分およびＣ末端部分の２つ
のＰＣＲ産物を結合することによってｐＧＥＸ−ＧＢＰ
−１△ｂ−Ｚｉｐを構築した。ＧＢＰ−１ｃＤＮＡのＮ
末端部分を、ＢａｍＨＩ認識配列に融合した位置１〜１
８の上流センスプライマーと、ＳｍａＩ認識配列に融合
した位置４９７〜５１７の下流アンチセンスプライマー
を使用して合成し、ｐＧＥＸ−２ＴＫのＢａｍＨＩ−Ｓ
ｍａＩ部位に挿入してｐＧＥＸ−ＧＢＰ−１Ｎを作製し
た。ＧＢＰ−１ｃＤＮＡのＣ末端部分を、ＳｍａＩ認識
配列に融合した位置７３８〜７５６の上流センスプライ
マーと、ＥｃｏＲＩ認識配列に融合した位置１１４４〜
１１６３の下流アンチセンスプライマーを使用して合成
し、ｐＧＥＸ−ＧＢＰ−１ＮのＳｍａＩ−ＥｃｏＲＩ部
位に挿入してｐＧＥＸ−ＧＢＰ−１△ｂ−Ｚｉｐを作製
した。

【００３８】例３：ＦＮプロモーター活性に対するＧＢ
Ｐ−１の作用 ＦＮプロモーター活性化の要因とＧＢＰ−１の影響につ
いて検討した。３Ｙ１細胞のコンフルエント前の培養物
を３群に分けてトランスフェクションした。１群は、−
１９０８塩基までのＦＮプロモーターを含むｐＦ１９０
０ＣＡＴのみでトランスフェクションした。別の１群
は、該ｐＦ１９００ＣＡＴと、Ｓｐ１をコードする発現
ベクターｐＲＳＶ−Ｓｐ１とを同時トランスフェクショ
ンした。最後の１群は、該ｐＦ１９００ＣＡＴと、ＧＢ
Ｐ−１をコードする発現ベクターｐＣＭＶ−ＧＢＰ−１
とを同時トランスフェクションした。各トランスフェク
ションは、ChenとOkayamaにより改良されたリン酸カル
シウム共沈殿法（Chen他、1987, Mol.Cell.Biol.7:2745
-2752 ）にしたがって行った。トランスフェクションし
たＤＮＡの全量は径９ｃｍの皿当たり２０μｇに調整し
た。各群を２つに分けて、一方を１０％ＦＣＳを含む培
地中で、他方を０．５％ＦＣＳを含む培地中で３７℃で
培養した。ｐＦ１９００ＣＡＴのみでトランスフェクシ
ョンした群について、皿あたりの細胞数と、酸不溶性画
分中への〔³Ｈ〕チミジン取り込み速度を２４時間間隔
で測定した。

【００３９】また、全ての群について、２４時間間隔で
細胞抽出物を調製し、ｐＦ１９００ＣＡＴのＦＮプロモ
ーター活性（ＣＡＴ活性）を以下の手順で測定した。す
なわち、コンフルエント前の単層の３Ｙ１およびＹＧ細
胞を、Ｇリッチ配列中の塩基を置換したＦＮプロモータ
ー／ルシフェラーゼ構築物（２０μｇ）でトランスフェ
クションし（Gorman他、1982, Mol.Cell.Biol.2:1044-1
051 ）、０．５％ＦＣＳを含む低血清培地中に４８時間
維持した。次いで、培地を１０％のＦＣＳを含有する新
たな培地に交換することによって、細胞の生育を刺激し
た。細胞抽出物から取得した１２０μｇのタンパク質と
１００μｌのルシフェラーゼ基質（Nippongene）を用い
て、細胞のルシフェラーゼ活性をＬＢ９５０１ルミノメ
ーター（Berthold）で測定した。結果は、ｐＦ１９００
ＣＡＴのみでトランスフェクションした群の最低値を１
とした相対値で示した。

【００４０】結果を図３にまとめて示す。図３Ａに示す
通り、細胞数は、１０％ＦＣＳで培養した場合には約４
倍に増加し、０．５％ＦＣＳで培養した場合には約２．
５倍に増加した。〔³Ｈ〕チミジンの取り込み速度は時
間経過とともに少しずつ減少し、１２０時間後には極わ
ずかしか取り込まれなくなった。速度の減少は０．５％
ＦＣＳの培地の場合の方が、１０％ＦＣＳの培地の場合
よりも早かった。ｐＦ１９００ＣＡＴのみをトランスフ
ェクションした場合のＦＮプロモーター活性は直線的に
増大し、細胞を０．５％ＦＣＳで培養したときの方が、
１０％ＦＣＳで培養したときよりも活性は約２倍高かっ
た（図３Ｂ）。これらの結果は、ＦＮプロモーターの活
性化が細胞密度よりも細胞増殖の低下に依存しているこ
とを示している。ｐＲＳＶ−Ｓｐ１を同時トランスフェ
クションした群は、細胞増殖の低下の程度に依存して、
両培地の細胞ともＦＮプロモーター活性が刺激された。
逆に、ｐＣＭＶ−ＧＢＰ−１を同時トランスフェクショ
ンした群は、両培地の細胞ともＦＮプロモーター活性が
抑制された。細胞を１０％ＦＣＳで培養した場合には活
性の抑制がより大きかった。これらの結果は、ＦＮプロ
モーター活性はＳｐ１によって刺激され、ＧＢＰ−１に
よって抑制されることを示唆している。

【００４１】例４：ＦＮプロモーター中のＧリッチ配列
とＧＢＰ−１作用の関係 細胞周期進行中のＦＮプロモーター活性に対するＧＢＰ
−１の抑制作用、およびこの作用の発現とプロモーター
中の３種のＧリッチ配列の関係を検討した。３Ｙ１およ
びＹＧ１細胞のコンフルエント前の培養物を４群に分
け、（１）各１０μｇのｐＦＧＧＧｌｕｃおよびｐＲＳ
Ｖ−Ｓｐ１、（２）各１０μｇのｐＦＧＧＧｌｕｃおよ
びｐＲＳＶ０、（３）各１０μｇのｐＦｇｇｇｌｕｃお
よびｐＲＳＶ０、または（４）各１０μｇのｐＦｇｇＧ
ｌｕｃおよびｐＲＳＶ０でそれぞれをトランスフェクシ
ョンした。ここで、ＹＧ１細胞は、上記のようにｐＣＭ
Ｖ−ＧＢＰ−１を３Ｙ１細胞に導入することによって樹
立した細胞であり、ＧＢＰ−１を発現する。ｌｕｃ構築
物は、−４１４塩基までのＦＮプロモーター配列を含ん
でいる。また、ｐＦＧＧＧｌｕｃ、ｐＦｇｇｇｌｕｃ、
ｐＦｇｇＧｌｕｃの「Ｇ」または「ｇ」は、順にＧ１０
ストレッチ、上流ＧＣボックス（ＧＣｕ）、下流ＧＣボ
ックス（ＧＣｄ）の塩基置換の有無を示す。すなわち、
「Ｇ」は野生型配列を示し、「ｇ」は塩基置換した配列
を示す。なお、Ｇ１０ストレッチ、ＧＣｕ、Ｇｃｄの塩
基配列をそれぞれ配列表の配列番号３、４、５に示す。
トランスフェクションした細胞を０．５％ＦＣＳを含む
低血清培地中に４８時間維持し、細胞を休止状態にし
た。次いで、培地を１０％ＦＣＳを含有する新しい培地
に交換することによって細胞を増殖刺激した。細胞を４
時間間隔で採取し、細胞抽出物からの１２０μｇのタン
パク質を使用して例３に記載される方法でルシフェラー
ゼ活性を分析した。未刺激ＹＧ１細胞からの０時間抽出
物によって発現した活性を１とした。

【００４２】酸可溶性画分への〔³Ｈ〕チミジンの取り
込みは、Ｇ１期とＳ期の境界である刺激後１３〜１４時
間で増加し始めた。３Ｙ１細胞をｐＦＧＧＧｌｕｃでト
ランスフェクションした場合、プロモーター活性はＧ１
からＳへの細胞周期の進行に伴って減少し、２４時間で
最小のレベルに達した（図４Ａ）。ｐＲＳＶ−Ｓｐ１で
同時にトランスフェクションしても減少にほとんど影響
しなかったが、活性は有意に増加した。ＹＧ１細胞で
は、ｐＦＧＧＧｌｕｃのプロモーター活性は、ｐＲＳＶ
−Ｓｐ１による同時トランスフェクションにも係わら
ず、休止状態（時間０）でさえ非常に低く、外来的に発
現したＧＢＰ−１がプロモーター活性をほぼ完全に抑制
したことが示された。３Ｙ１およびＹＧ１細胞を、全Ｇ
リッチ配列中に塩基置換を有するｐＦｇｇｇｌｕｃでト
ランスフェクションした場合、プロモーター活性は細胞
周期の進行全体を通じて両細胞とも低かった（図４
Ｂ）。３Ｙ１細胞とＹＧ１細胞の間で有意な相違は見ら
れなかったので、ＧＢＰ−１は塩基置換したＧリッチ配
列のいずれにも結合できないことが示唆された。Ｓｐ１
モチーフＧＧＧＣＧＣを損なうことなく置換したにもか
かわらず、この置換によって休止状態の３Ｙ１細胞で発
現したプロモーター活性は減少した。

【００４３】しかし、３Ｙ１細胞をｐＦｇｇＧｌｕｃで
トランスフェクションすると（図４Ｃ）、休止状態で高
いプロモーター活性が発現し、プロモーター活性は、ｐ
ＦＧＧＧｌｕｃを使用した場合に観察されたのと同様に
（図４Ａ）、Ｇ１からＳ期への進行に伴って減少した。
ＹＧ１細胞で発現した活性は細胞周期の進行全体を通じ
て非常に低かった。一方、ＧＣｄ中に塩基置換を有する
ｐＦｇＧｇＣＡＴのプロモーター活性は、ｐＦｇｇｇＣ
ＡＴにより発現されたものと同様に、３Ｙ１細胞および
ＹＧ１細胞の両方で低レベルの活性を発現した（データ
は示さず）。これらの結果は、下流ＧＣボックス（ＧＣ
ｄ）が、ＦＮプロモーター活性並びにＧＢＰ−１による
活性の抑制のために最も重要な部位であることを示して
いる。

【００４４】例５：Ｓｐ１とＧＢＰ−１の競合 細胞周期がＧ１期からＳ期へ進行する間のＦＮプロモー
ターの活性の変化と、ＧＢＰ−１とＳｐ１の発現レベル
の関係を調べた。３Ｙ１細胞とＹＧ細胞を、０．５％Ｆ
ＣＳを含む低血清培地中に４８時間維持することによっ
て細胞を休止状態にした。次いで、培地を１０％ＦＣＳ
を含有する新しい培地に交換することによって細胞を増
殖刺激した。４時間間隔で細胞をＳＤＳ含有緩衝液中に
溶解することによって全細胞抽出物を調製し、得られた
抽出物の一部を電気泳動し、ＧＢＰ−１およびＳｐ１の
量をウエスタンブロッティングによって分析した。この
際、全細胞抽出物の調製とウエスタンブロッティングは
以下に記載する手順で行った。

【００４５】全細胞抽出物は、Manley他（Manley他、19
80, Proc. Natl. Aacd. Sci. USA,77:3855-3859 ）の
方法にならって調製した。すなわち、細胞を、０．５ｍ
ＭのＭｇＣｌ2 を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢ
Ｓ）中で洗浄し、４倍容量の高張緩衝液（１０ｍＭのト
リス塩酸、ｐＨ７．９（４℃）、１ｍＭのＥＤＴＡ、５
ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、０．５ｍＭのフ
ェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ））中
に懸濁した。２０分後に、細胞をホモジナイズし、４倍
容量のスクロース／グリセロール溶液（５０ｍＭのトリ
ス塩酸、ｐＨ７．９（４℃）、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂ 、
２５％（ｗｔ／ｖｏｌ）のスクロース、５０％（ｖｏｌ
／ｖｏｌ）のグリセロール、２ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍ
ＭのＰＭＳＦ）を添加した。穏やかに攪拌した後、１倍
容量の飽和（ＮＨ₄）₂ ＳＯ₄を滴下し、ホモジネートを
日立ＲＰ６５Ｔローター中で４℃で３時間５３，０００
ｒｐｍで遠心した。上清に固体（ＮＨ₄）₂ ＳＯ₄を最終
濃度０．３３ｇ／ｍｌの濃度で添加し、上清を日立ＲＰ
６５Ｔローター中で３０分間遠心した。沈殿を最小容量
のＨＭ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロ
キシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン
酸）、ｐＨ７．９、１００ｍＭのＫＣｌ、１２．５ｍＭ
のＭｇＣｌ₂、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１７％（ｖｏｌ
／ｖｏｌ）グリセロール、２ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭ
のＰＭＳＦ）中に溶解した。試料を１リットルのＨＭ緩
衝液の２回の交換に対して少なくとも１０時間透析し、
日立ＲＰ１００ＡＴローター中にて３７，０００ｒｐｍ
で１時間遠心した。上清を乾燥冷却エタノール中で急速
に凍結し、−８０℃で保存した。タンパク質濃度を染料
結合アッセイ（Bio-Rad Laboratories）で測定した。

【００４６】また、ウエスタンブロッティングは、以下
の手順で行った。すなわち、抗−ＧＢＰ−１抗体の調製
のために、大腸菌中で産生した全長のＧＳＴ−ＧＢＰ−
１をグルタチオン−セファロースカラムを使用して精製
し、これを使用してウサギを免疫した。得られたウサギ
の抗血清を、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
（ＧＳＴ）を予め添加したグルタチオン−セファロース
カラムに通し、流出画分を回収した。この画分を、ＧＳ
Ｔ−ＧＢＰ−１をＣＮＢｒセファロース４Ｂ（Pharmaci
a LKB Biotechnology ）に結合させたカラムに添加し、
抗血清を１ＭのＫＣｌを含有する５０％のエチレングリ
コールで溶出した。

【００４７】１０μｇ（ＧＢＰ−１アッセイ用）または
８μｇ（Ｓｐ１アッセイ用）の細胞抽出物を、Laemmli
泳動緩衝液（２５ｍＭのトリス・グリシン、ｐＨ８．
３、０．１％のＳＤＳ）を使用して１５％および８％の
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。タ
ンパク質を電気泳動的にニトロセルロース膜（ＢＡ８
５、Schleicher & Schuell）に移し、免疫ブロッティン
グ希釈溶液（５％のスキムミルク、５％のＦＣＳ、１％
のＴｗｅｅｎ２０、ＰＢＳ中）中で室温で１時間インキ
ュベートして、抗体の非特異的結合を最小化した。抗Ｇ
ＢＰ−１ウサギポリクローナル抗体および抗Ｓｐ１ウサ
ギポリクローナル抗体（PEP2, Santa Cruz Biotechnolo
gy）を各々１：１００００および１：１５０００に希釈
した一次抗体とともに、フィルターを室温で１時間イン
キュベートした。１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢ
Ｓ中で１５分間３回洗浄し、ＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧ
ヤギ抗体を１：１００００に希釈した二次抗体とともに
フィルターを室温で１時間インキュベートした。その
後、１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ中で１５分間
３回洗浄した。膜を製造業者（Amersham）の指示に従っ
てＥＣＬ−検出システムで処理してＸ線フィルムに露出
することによって、免疫複合体を増強化学発光（ＥＣ
Ｌ）によって検出した。

【００４８】結果を図５にまとめて示した。図５から明
らかなように、ＧＢＰ−１は、休止状態（０時間）およ
び初期Ｇ１期（４時間）の３Ｙ１細胞から調製した抽出
物中には検出されなかったが、Ｇ中期では検出された
（図５Ａ）。そのレベルは、Ｇ１後期（１２時間）で最
大に達し、高レベルがＳ中期まで維持された後、急激に
減少した。ＹＧ１細胞では（図５Ｂ）、外来的に導入し
たＧＢＰ−１ｃＤＮＡが常に発現しており、有意量のＧ
ＢＰ−１が休止およびＧ１初期の細胞で検出された。外
来的ＧＢＰ−１の発現は３Ｙ１細胞で観察されたように
Ｇ１中期後に増加し始めた。内因的に発現したＧＢＰ−
１のレベルは、外来的に発現したものより高かった。対
照的に、Ｓｐ１は３Ｙ１およびＹＧ１細胞の両方で発現
し（図５Ｃ、Ｄ）、細胞周期の進行全体を通じて有意な
変化は認められなかった。これらの結果から、ＧＢＰ−
１の発現の誘導とＦＮプロモーター活性の減少との間に
良好な相関関係が存在することが示され、ＧＢＰ−１の
機能発現によってＳｐ１の機能が妨げられることが示さ
れた。

【００４９】例６：アデノウイルスＥ１ＡによるＧＢＰ
−１の誘導 アデノウイルスＥ１ＡによるＧＢＰ−１の誘導を検討し
た。デキサメタゾン（ｄｅｘ）に応答してＥ１Ａ_12S を
発現する３Ｙ１誘導細胞株ｇ１２を使用した（Ishii
他、1993, Exp.Cell.Res.208:407-414）。ｇ１２細胞の
コンフルエント前の培養物を、０．５％のＦＣＳを含む
低血清培地中で４８時間維持することによって休止状態
にした。その後、１０−６Ｍのｄｅｘを添加して細胞周
期の進行を誘導した。ｄｅｘ添加前、ｄｅｘ添加後７、
９、１２、１６、２０および２４時間経過後に全細胞抽
出物を調製し、Ｅ１ＡおよびＧＢＰ−１の量の変動をウ
エスタンブロッティングによって確認した。ウエスタン
ブロッティングは、一次抗体として抗−Ｅ１Ａ（１３ｓ
−５、Santa Cruz Biotechnology）抗体を１：１０００
０で希釈したもの、または抗ＧＢＰ−１ウサギポリクロ
ーナル抗体を１：１５０００に希釈したものを使用し、
二次抗体としてＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧヤギ抗体を
１：１００００で希釈したものを使用して、例５に記載
される方法で行った。タンパク質１０μｇのアリコート
を１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動
した結果を図６に示す。

【００５０】この条件下で、酸可溶性画分への〔³Ｈ〕
チミジンの取り込みは約８時間後に増加し始めた。Ｅ１
Ａの発現は７時間以内に十分に誘導され、そのレベルは
細胞周期の進行全体を通じて維持された（図６Ａ）。Ｇ
ＢＰ−１は休止状態（０時間）では発現しなかったが、
Ｅ１Ａの発現に付随して７時間以内に最大に誘導された
（図６Ｂ）。そのレベルは細胞周期の進行に伴って少し
ずつ減少した。これらの結果はＧＢＰ−１遺伝子がＥ１
Ａの標的であることを示している。

【００５１】例７：ＦＮプロモーター中の３種のＧリッ
チ配列によるＧＢＰ−１の複合体形成 ＦＮプロモーター中の３種のＧリッチ配列とＧＢＰ−１
とで形成したＤＮＡ−タンパク質複合体を分析するため
に、Ｇリッチ配列や塩基置換Ｇリッチ配列を含む２４ｂ
ｐのオリゴヌクレオチドを使用して電気泳動移動度シフ
トアッセイ（ＥＭＳＡ）を下記の通りに行った。３Ｙ１
細胞とＹＧ細胞を、０．５％ＦＣＳを含む低血清培地中
に４８時間維持することによって細胞を休止状態にし
た。また、これらの細胞の培地を１０％ＦＣＳを含有す
る新しい培地に交換することによって細胞を増殖刺激
し、２４時間経過した後の細胞を血清刺激した細胞とし
た。休止状態の３Ｙ１細胞、血清刺激した３Ｙ１細胞、
休止状態のＹＧ１細胞、血清刺激したＹＧ１細胞、およ
びＸｈｏＣ細胞から、それぞれ全細胞抽出物を調製し
た。

【００５２】各全細胞抽出物、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩
衝液（ｐＨ７．９）、１００ｍＭのＫＣｌ、１２．５ｍ
ＭのＭｇＣｌ2 、１ｍＭのＥＤＴＡ、２０％（ｖｏｌ／
ｖｏｌ）グリセロール、２ｍＭのジチオトレイトール、
０．５ｍＭのＰＭＳＦ、１μｇのポリ（ｄＩ−ｄＣ）ポ
リ（ｄＩ−ｄＣ）、および０．５ｆｍｏｌ（約５×１０
³ ｃｐｍ）の³²Ｐ標識Ｇ１０オリゴヌクレオチド（図
８）を混合することによって、全量１０μｌの反応混合
物（Matsuno 他、1989, J.Biol.Chem.264:18707-1871
3）を調製し、０℃に３０分間維持することによってＤ
ＮＡ−タンパク質複合体を形成した。また、図８に記載
されるＧ１０ストレッチ（Ｇ１０）、上流ＧＣボックス
（ＧＣｕ）、下流ＧＣボックス（ＧＣｄ）、およびこれ
らのＧリッチ配列の一部の塩基を置換した配列（Ｇ１０
ｍ、ＧＣｕｍ、ＧＣｄｍ）のいずれかの配列を有する³²
Ｐ標識２４ｂｐオリゴヌクレオチドを、血清刺激したＹ
Ｇ１全細胞抽出物から得たタンパク質（５μｇ）ととも
にインキュベートした。

【００５３】形成された各複合体を、ＴＧＥ緩衝液（２
５ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１９２ｍＭのグリ
シン、２ｍＭのＥＤＴＡ）中にて５％ポリアクリルアミ
ド上で電気泳動することによって分析した（２５０Ｖ、
４℃、２．５時間）。ゲルを乾燥し、−８０℃で増強ス
クリーンによってオートラジオグラフィーをとった。得
られた結果を図７に示す。図７Ａに示す通り、Ｇ１０オ
リゴヌクレオチドはＸｈｏＣ抽出物と３種の複合体Ｉ、
ＩＩおよびＩＩＩを形成した（レーン６）。休止状態の
３Ｙ１抽出物とは複合体を形成しなかったが、血清刺激
した３Ｙ１抽出物とは複合体ＩおよびＩＩを形成した
（レーン３）。休止状態のＹＧ１抽出物とは複合体Ｉお
よびＩＩを形成したが（レーン４）、これらの複合体の
量は血清刺激したＹＧ１抽出物の方がかなり大きかった
（レーン５）。また、血清刺激したＹＧ１抽出物とは複
合体ＩＩＩを形成した。形成されたこれらの複合体の量
は、ウエスタンブロッティングによって定量したＧＢＰ
−１の量（図５）と相関していた。

【００５４】図７Ｂに示すように、複合体Ｉ、ＩＩおよ
びＩＩＩが、ＧＣｄオリゴヌクレオチドを使用した場合
に多量に形成したが（レーン２）、ＧＣｕオリゴヌクレ
オチドを使用した場合は僅かしか形成されなかった（レ
ーン１）。Ｇ１０ｍ、ＧＣｕｍおよびＧＣｄｍオリゴヌ
クレオチドを使用した場合には、複合体の形成は認めら
れなかった。オリゴヌクレオチドおよびＧＢＰ−１を使
用したこれらの複合体形成パターンは、λＺａｐＩＩ組
み換え体により発現したＧＢＰ−１−β−ｇａｌ融合タ
ンパク質を使用した場合の複合体形成パターンと同一で
あった。

【００５５】例８：ＧＢＰ−１のホモダイマー化 ロイシンジッパーモチーフの存在により、ＧＢＰ−１が
ホモ−および／またはヘテロ−ダイマーを形成すること
が示唆された。そこで、ホモダイマーの形成およびダイ
マー化における塩基性ジッパーモチーフの関与を調べる
ために、１７２〜２４４のコドンを欠くＧＢＰ−１△ｂ
−ＺｉｐｃＤＮＡをｐＧＥＸ−２ＴＫベクターにクロー
ニングした（Kaelin他、1992, Cell.70:351-364 ）。こ
のベクターのＧＳＴ配列とｃＤＮＡクローニング部位の
間には、ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ（Ａキナー
ゼ）の触媒サブユニットによる認識のためのアミノ酸配
列ＲＲＡＳＶに対応するヌクレオチド配列（Blanar他、
1992, Science 256:1014-1018; Rashidbaigi 他、198
5, J.Biol.Chem.260:8514-8519 ）が存在している。大
腸菌で産生したＧＳＴ−ＧＢＰ−１△ｂ−Ｚｉｐを精製
し、得られたタンパク質５μｇを１５％ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル上で電気泳動し（１５０Ｖ、３時
間）、ニトロセルロースフィルターに移した。フィルタ
ーを６Ｍの塩酸グアニジンを含有する５０ｍｌのＨＢＢ
緩衝液中で４℃で５分間インキュベートすることによっ
てタンパク質を変性させた。次いで、タンパク質を、６
Ｍから０．１８７５Ｍの塩酸グアニジンの１：２の連続
希釈を各々含むＨＢＢ緩衝液中で４℃で５分間連続的に
再生させた。フィルターを５％の滅菌スキムミルク（Di
fco）で４℃で３０分間ブロッキングし、１％のスキム
ミルクを補充したＢＢ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−
ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭ
ｇＣｌ2 、１ｍＭのＤＴＴ、０．１％のNonident P40）
中で２．５×１０⁵ ｃｐｍの³²Ｐ標識ＧＳＴ融合タンパ
ク質と４℃で１０分間反応させ、増強スクリーンを使用
して−８０℃でオートラジオグラフィーをとった。ＧＳ
Ｔ−ＧＢＰ−１△ｂ−Ｚｉｐの代わりに、ＧＳＴ単独お
よびＧＳＴ−ＧＢＰ−１についても同じ処理を行い、オ
ートラジオグラフィーをとった。結果を図９Ａに示す。

【００５６】なお、ここで使用した³²Ｐ標識ＧＳＴ融合
タンパク質の以下の方法で調製した。すなわち、大腸菌
中で産生したＧＳＴ融合タンパク質を、既知の方法（Sm
ith他、1988, Gene.67:31-40 ）によりグルタチオン−
セファロース上で精製した。融合タンパク質を、ＨＭＫ
緩衝液（２０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１００
ｍＭのＮａＣｌ、１２ｍＭのＭｇＣｌ2 ）、１０μｇの
ＧＳＴ融合タンパク質、１８５ｋＢｑの［γ−³²Ｐ］Ａ
ＴＰ、１ｍＭのＤＴＴ、５０ＵのｃＡＭＰ依存性タンパ
ク質キナーゼの触媒サブユニット（Sigma ）を含む６０
μｌの反応混合物中にて室温で３０分間リン酸化した。
４０μｌの停止緩衝液（１０ｍＭのリン酸ナトリウム
（ｐＨ８．０）、１０ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１
０ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ））を添加することによって反応を停止し、混
合物をSephadex-G50カラム上に添加した。カラムを４℃
で５分間遠心することによって³²Ｐ標識ＧＳＴ融合タン
パク質を溶出させた。大腸菌中のＧＳＴ融合タンパク質
の発現およびグルタチオン−セファロース上での精製は
文献記載の方法（Kaelin他、1992, Cell.70:351-364 ）
にしたがって行った。

【００５７】図９Ａに示される通り、プローブはＧＳＴ
−ＧＢＰ−１に結合したが、ＧＳＴ−ＧＢＰ−１△ｂ−
ＺｉｐおよびＧＳＴ単独には結合しなかった。この結果
は、ＧＢＰ−１はその塩基性ジッパー領域を通じてホモ
ダイマーを形成していることを示している。

【００５８】さらに、ＧＢＰ−１が、ＸｈｏＣ細胞中で
以前に同定されたＧ１０ＢＰ（Suzuki他、Mol.Cell.Bio
l. 15:5423-5433 ）とヘテロダイマーおよびダイマーを
形成するか否かを検討した。休止状態の３Ｙ１、血清刺
激した３Ｙ１、休止状態のＹＧ１、血清刺激したＹＧ
１、ＸｈｏＣの各細胞から調製した抽出物のタンパク質
（１０μｇ）を電気泳動し、ＧＢＰ−１に結合するタン
パク質の種類を³²Ｐ標識ＧＳＴ−ＧＢＰ−１を使用して
ｆａｒ−ウエスタンブロッティングによって分析した。
その結果を図９Ｂに示す。図９Ｂに示されるように、Ｇ
ＢＰ−１を休止状態の３Ｙ１抽出物以外の抽出物ではバ
ンドが１つだけ検出された。トロンビンでＧＳＴ−ＧＢ
Ｐ−１を切断して調製したＧＢＰ−１（１０μｇ）につ
いても同じ位置にバンドが検出された。これらの結果
は、ＧＢＰ−１が、採用した条件下ではホモダイマーを
形成するがヘテロダイマーを形成しないことを示してい
る。

【００５９】

【発明の効果】本発明のＤＮＡは、フィブロネクチン遺
伝子の転写制御領域に存在するＧリッチ配列に結合する
ことによりフィブロネクチン遺伝子の発現を効果的に制
御するタンパク質をコードする。従って、本発明のＤＮ
Ａ、そのＤＮＡによりコードされるタンパク質およびそ
の抗体は、細胞増殖、癌、細胞老化に関わるフィブロネ
クチンの発現制御の研究に有効に用いられる。また、組
み換えベクターおよび形質転換体を用いれば、本発明の
タンパク質を容易に調製することができる。

【００６０】

【配列表】 配列番号１ 配列の長さ：１１５５ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ATG GCG CTT GAA GCT GGC GAC ATG GAA GAG GGA CAG CTT TCC GAC 45 TCG GAT TCC GAC ATG ACG GTC GTC CCC AGC GAT AGG CCT CTG CAA 90 ATG GCG AAA GTA CTA GGT GGG GGC GGT GCT GCA TGC GCA CCA GTG 135 TCA AAC TAT CGG ACT GTT AAA CAT GTG GAC TCC AGT GAG GAG AGT 180 CTG GAT TCC GAT GAC GAT TGC TCT CTT TGG AAA CGT AAG CGG CAG 225 AAA TGT CAC AGT CCT CCT CCC AAG CCA GAG CCT TTC CCA TTT GGA 270 CAG AGC GGT CAG AAA CAA GCT CTC AAC GGT GGG AAG AAG GTG AAC 315 AAC ATC TGG GGT GCT GTG CTA CAG GAA CAG AAC CAA GAT GCT GTG 360 GCC ACT GAG CTC GGC ATC TTG GGA ATG GAA GGC ACC ATC GAC AGA 405 AGC AGG CAG TCT GAG ACC TAT AAT TAT TTG CTT GCT AAG AAA CTT 450 GCT AAG AAG GAA TCT CAA GAG TAT ACA AAA GAA TTA GAC AAA GAT 495 CTG GAT GAG TAT ATG CAT GGC GAC AAA AAA CCT GGG TCA AAG GAA 540 GAG GAG AAT GGG CAA GGT CAT CTC AAA CGG AAA CGG CCT GTC CGA 585 GAC AGA CTG GGT AAC AGA GTA GAA ATG AAC TAC AAA GGC CGC TAC 530 GAC ATC ACA GAG GAG GAT TCT CCC GAG AAA GTG GCT GAT GAG ATT 575 GCC TTC AGG TTA CAG GAA CCG AAG AAG GAC CTG ATA GCC CGA GTA 720 GTG ACG ATA CTT GGG AAC AAA AAG GCC ATT GAA CTT CTG ATG GAG 765 ACG GCT GAG GTT GAG CAA AAT GGT GGC CTT TTC ATA ATG AAT GGA 810 AGC CGA AGG AGA ACG CCG GGT GGG GTT TTC CTC AAT CTC CTG AAG 855 AAC ACG CCC AGC ATC AGC GAA GAG CAG ATC AAG GAT ATT TTC TAC 900 ATT GAA AAT CAA AAA GAA TAT GAA AAT AAA AAA GCT GCT AGA AAA 945 AGA AGA ACA CAA CTA TTG GGG AAG AAA ATG AAA GAA GCT ATT AAA 990 AGT CTA AAT TTC CAG GAA GAT GAT GAC ACA TCT CGA GAA ACG TTT 1035 GCA AGT GAC ACT AAT GAG GCC CTG GCC TCT CTT GAC GAA GCC CAG 1080 GAA GGA CCC GGT GAA ACC AAG CTG GAT GCT GAG GAG GCC ATC GAG 1125 GTG GAC CAC CCT CAG GAT TTG GAC ATC TTT 1155

【００６１】 配列番号２ 配列の長さ：３８５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Ala Leu Glu Ala Gly Asp Met Glu Glu Gly Gln Leu Ser Asp 1 5 10 15 Ser Asp Ser Asp Met Thr Val Val Pro Ser Asp Arg Pro Leu Gln 20 25 30 Met Ala Lys Val Leu Gly Gly Gly Gly Ala Ala Cys Ala Pro Val 35 40 45 Ser Asn Tyr Arg Thr Val Lys His Val Asp Ser Ser Glu Glu Ser 50 55 60 Leu Asp Ser Asp Asp Asp Cys Ser Leu Trp Lys Arg Lys Arg Gln 65 70 75 Lys Cys His Ser Pro Pro Pro Lys Pro Glu Pro Phe Pro Phe Gly 80 85 90 Gln Ser Gly Gln Lys Gln Ala Leu Asn Gly Gly Lys Lys Val Asn 95 100 105 Asn Ile Trp Gly Ala Val Leu Gln Glu Gln Asn Gln Asp Ala Val 110 115 120 Ala Thr Glu Leu Gly Ile Leu Gly Met Glu Gly Thr Ile Asp Arg 125 130 135 Ser Arg Gln Ser Glu Thr Tyr Asn Tyr Leu Leu Ala Lys Lys Leu 140 145 150 Ala Lys Lys Glu Ser Gln Glu Tyr Thr Lys Glu Leu Asp Lys Asp 155 160 165 Leu Asp Glu Tyr Met His Gly Asp Lys Lys Pro Gly Ser Lys Glu 170 175 180 Glu Glu Asn Gly Gln Gly His Leu Lys Arg Lys Arg Pro Val Arg 185 190 195 Asp Arg Leu Gly Asn Arg Val Glu Met Asn Tyr Lys Gly Arg Tyr 200 205 210 Asp Ile Thr Glu Glu Asp Ser Pro Glu Lys Val Ala Asp Glu Ile 215 220 225 Ala Phe Arg Leu Gln Glu Pro Lys Lys Asp Leu Ile Ala Arg Val 230 235 240 Val Thr Ile Leu Gly Asn Lys Lys Ala Ile Glu Leu Leu Met Glu 245 250 255 Thr Ala Glu Val Glu Gln Asn Gly Gly Leu Phe Ile Met Asn Gly 260 265 270 Ser Arg Arg Arg Thr Pro Gly Gly Val Phe Leu Asn Leu Leu Lys 275 280 285 Asn Thr Pro Ser Ile Ser Glu Glu Gln Ile Lys Asp Ile Phe Tyr 290 295 300 Ile Glu Asn Gln Lys Glu Tyr Glu Asn Lys Lys Ala Ala Arg Lys 305 310 315 Arg Arg Thr Gln Leu Leu Gly Lys Lys Met Lys Glu Ala Ile Lys 320 325 330 Ser Leu Asn Phe Gln Glu Asp Asp Asp Thr Ser Arg Glu Thr Phe 335 340 345 Ala Ser Asp Thr Asn Glu Ala Leu Ala Ser Leu Asp Glu Ala Gln 350 355 360 Glu Gly Pro Gly Glu Thr Lys Leu Asp Ala Glu Glu Ala Ile Glu 365 370 375 Val Asp His Pro Gln Asp Leu Asp Ile Phe 380 385

【００６２】 配列番号：３ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACCAAAGGGG GGGGGGAAGT TCTC 24

【００６３】 配列番号：４ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GCAGGAGGGG CGGGGGGAGT CGGA ２
４

【００６４】 配列番号：５ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ＣＴＣＧＴＧＧＧＧＧ ＧＧＣＧＧＧＡＡＧＧ ＧＡＣＴ
24

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は酵母ワン・ハイブリッド・スクリーニ
ング法によるＧＢＰ−１ｃＤＮＡのクローニングを示
す。

【図２】 ＧＢＰ−１の構造の特徴を示す。

【図３】 ＦＮプロモーター活性と細胞数および細胞増
殖との関係、並びにＦＮプロモーター活性に対するＳｐ
１およびＧＢＰ−１の作用を示す。

【図４】 ＦＮプロモーター活性に対するＧＢＰ−１の
作用をＧリッチ配列との関係で検討した結果を示す。

【図５】 Ｇ１期からＳ期へ進行中の３Ｙ１およびＹＧ
細胞におけるＧＢＰ−１量の変化を示す。

【図６】 アデノウイルスＥ１ＡによるＧＢＰ−１の誘
導を示す。

【図７】 ＦＮプロモーター中のＧリッチ配列とＧＢＰ
−１とのＤＮＡ−タンパク質複合体の形成を示す。

【図８】 ＦＮプロモーター中のＧリッチ配列を示す。

【図９】 種々の細胞におけるＧＢＰ−１のホモダイマ
ー化を示す。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１０年７月６日（１９９８．７．６）

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図５

【補正方法】変更

【補正内容】

【図５】

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図６

【補正方法】変更

【補正内容】

【図６】

【手続補正３】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図７

【補正方法】変更

【補正内容】

【図７】

【手続補正４】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図９

【補正方法】変更

【補正内容】

【図９】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA12 AA20 BA01 BA08 BA12 BA43 BA61 CA01 CA04 CA06 CA07 DA06 EA04 FA02 GA27 HA12 4B063 QQ08 QQ79 QR32 QR40 QR55 QS16 QX07 4B064 AG01 AG26 CA02 CA06 CA10 CC24 DA01 DA05 DA13 DA14 4B065 AA26X AA72X AA91Y AA95Y AB01 BA02 CA24 CA25 CA28 CA31 CA44 CA46 4H045 AA10 AA11 BA10 CA40 DA50 DA75 DA76 DA86 EA28 FA72 FA73 FA74

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１に記載の塩基配列ま
   たはその一部を有するＤＮＡであって、フィブロネクチ
   ン遺伝子の発現を抑制するタンパク質をコードするＤＮ
   Ａ。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のＤＮＡにハイブリダイ
   ズするＤＮＡであって、フィブロネクチン遺伝子の発現
   を抑制するタンパク質をコードするＤＮＡ。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号１に記載の塩基配列の
   うちの連続する１２以上の塩基配列、または、配列表の
   配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列のうち
   の連続する１２以上の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
   チド。
4. 【請求項４】 請求項１に記載のＤＮＡが導入された形
   質転換体により産生されるタンパク質であって、配列表
   の配列番号３から５に記載の塩基配列に結合し、かつフ
   ィブロネクチン遺伝子の発現を抑制することを特徴とす
   るタンパク質。
5. 【請求項５】 配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配
   列、または、該アミノ酸配列において１若しくは数個の
   アミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を
   有するタンパク質であって、配列表の配列番号３から５
   に記載の塩基配列に結合し、かつフィブロネクチン遺伝
   子の発現を抑制することを特徴とするタンパク質。
6. 【請求項６】 請求項４または５に記載のタンパク質を
   認識する抗体。