JP2001517435A

JP2001517435A - シグナル伝達タンパク質ｇｒｂ７ファミリーの潜在的エフェクター

Info

Publication number: JP2001517435A
Application number: JP2000512939A
Authority: JP
Inventors: ダリー，ロジャー，ジョン; サザーランド，ロバート，リンゼイ
Original assignee: ガーヴァンインスティテュートオブメディカルリサーチ
Priority date: 1997-09-23
Filing date: 1998-09-23
Publication date: 2001-10-09
Also published as: DE69826137D1; EP1017802A4; AUPO938897A0; US20020037582A1; WO1999015647A1; EP1017802B1; EP1017802A1; CA2303760A1

Abstract

(57)【要約】シグナル伝達タンパク質Grb7ファミリーのエフェクタータンパク質候補をコードする新規ポリヌクレオチドを開示する。ホモジナイズした組織サンプル等のサンプル中における上記タンパク質の検出によって、乳癌及び前立腺癌等のある種のヒトの癌の有用な腫瘍マーカー及び／または予後のインジケーターが提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】［発明の分野］本発明は、シグナル伝達タンパク質Grb7ファミリーに対するエフェクタータン
パク質候補をコードする新規なポリヌクレオチド分子に関する。組織サンプル中
における上記のコードされたタンパク質を検出することで、有用な腫瘍マーカー
及び／または予後のインジケーターが提供される。さらにGrb7ファミリーメンバ
ーと、このコードされたタンパク質との相互作用における拮抗作用に着目すれば
、異常な受容体型チロシンキナーゼ(RTK)によるシグナル伝達を表現しているようなヒト疾患(たとえば癌)に対する新規な治療法を提供することができる。

【０００２】［発明の背景］ RTKは、特定のホルモン又は成長因子の結合の形態の細胞外のシグナルを、特定のシグナル伝達、及び細胞内情報伝達のモードの活性化に変換することにより
、細胞の増殖、分化、致死、代謝などの制御において主たる役割を担っている(S
chlessinger及びUllrich, Neuron 9, 383-391, 1992)。RTKの活性化により、受容体の自己リン酸化と下流ターゲット分子のチロシン残基のリン酸化が引き起こ
される。このRTKシグナル伝達における受容体-基質、あるいは他のタンパク質- タンパク質相互作用で、かぎとなるエレメントがsrc相同(SH)2ドメインであるこ
とは、最近１０年間に明らかにされてきた。SH2ドメインは、チロシンリン酸化された短いペプチド配列に結合する、シグナル伝達分子にひろく見られる約１０
０個のアミノ酸からなる保存された構造である。この相互作用の特異性は、ター
ゲットペプチド中の、ホスホチロシン残基に隣接するアミノ酸、およびこれらの
部位と相互作用するSH2ドメイン内の残基の性質によってきまる(Pawson, Nature
373, 573-580, 1995)。

【０００３】 SH2ドメインを含むタンパク質は２つのクラスにわけられる。ひとつは触媒的機能を有するタンパク質(たとえば細胞質チロシンキナーゼc-srcやチロシンホス
ファターゼSH-PTP2)であり、もうひとつは完全に非触媒タンパク質ドメインから
なるタンパク質(Grb2など)で、アダプターサブクラスである。後者のクラスの機
能は解離した触媒サブユニットをチロシンリン酸化された受容体又はシグナル伝
達中間体に連結することであり、この相互作用には他の非触媒的タンパク質が関
与することもしばしばみられる。たとえば、SH3およびWW ドメイン(それぞれ、約50および40個のアミノ酸が保存された領域)は、プロリンに富むペプチドリガンドに結合し、プレクストリン（pleckstrin）相同ドメイン(約100個のアミノ酸
)は、特殊なリン脂質及びターゲットタンパク質と相互作用する（Pawson, 1995,
前出）。

【０００４】 Grb７ファミリーは、今のところ3種のメンバー、Grb7、10、及び14を含む、SH
2ドメインを有するアダプターファミリーに相当する(Margolisら, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 89,8894-8898 1992, Steinら, EMBO J. 13, 1331-1340, 1994,
Ooiら, Oncogene 10, 1621-1630, 1995, Dalyら, J. Biol. Chem. 271, 12502-1
2510 1996）。これらのタンパク質は、それぞれが、高度に保存されたプロリンに富むデカペプチドモチーフを含むN末端領域、PHドメインを含む中央領域、およびC末端SH2ドメインからなる共通な全体構造をもつ。約300個のアミノ酸からなる中央領域は、C. elegansのタンパク質で、胚における広範な神経のミグレー
ションに必要なmig10と明らかな相同性を示すが、その他ではGrb7ファミリーとm
ig10は構造的に異なる。またこれらは、SH2ドメインのRTKに対する選択性(Janes
ら, J. Biol. Chem. 272, 8490-8497, 1997)、および組織分布は共に異なってい
る。従ってこのファミリーは組織特異的な形式で、特定の受容体を下流に位置す
るエフェクターに結合するように進化してきたものである。おもしろいことに、
このファミリーをコードする遺伝子は、進化の途上で、ERBBファミリー遺伝子と
一緒に分離していると思われる。すなわちGRB7, 10, 及び14 はそれぞれERBB2 ,
ERBB1(上皮増殖因子受容体), 及びERBB4に連携している(Steinら, 1994 前出,
Ooiら, 1995 前出, Bakerら, Genomics 36, 218-220, 1996)。GRB7とERBB2の並置により、ヒト乳癌で一般に、ともに増幅されることがみられる。また両者の遺
伝子産物も機能的に連携しているため、未確認のerbB2シグナル伝達経路のアップレギュレーションが考えられる。さらに、GRB14もヒト乳癌で示差的に発現を示す(Dalyら, 1996 前出)。よってこれらふたつのタンパク質は、この疾患においてRTKシグナル伝達を調節している可能性がある。

【０００５】このファミリーに結合するタンパク質を同定し、従ってエフェクタータンパク
質の候補を同定するために、我々は、酵母のツーハイブリッドシステムと、Grb1
4「バイト」を用いて遺伝子のスクリーニングをおこなった。本明細書は、現在2
.2412と名づけ、相互作用する新規なタンパク質のクローニングと性状解析を記載する。

【０００６】［発明の開示］第１の態様として、本発明は、シグナル伝達タンパク質Grb7ファミリーに対す
るエフェクタータンパク質候補をコードする単離されたポリヌクレオチド分子を
提供する。このポリヌクレオチド分子は、配列番号１に示すヌクレオチド配列に
少なくとも75%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。好ましくは、ポリヌクレオチド分子は配列番号１に示す配列に少なくとも85％
、より好ましくは少なくとも95％の配列同一性有するヌクレオチド配列を含む。
最も好ましくは、そのポリヌクレオチド分子は、配列番号２に示すアミノ酸配列
に実質的に相当するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド
配列を含む。

【０００７】第１の態様の発明の好ましい実施形態において、ポリヌクレオチド分子は、配
列番号１に示す配列に実質的に相当するヌクレオチド配列を含む。ポリヌクレオチド分子は、例えばシグナル伝達タンパク質Grb7ファミリーに対
する内在的エフェクタータンパク質の活性を低下あるいは消失させることによっ
て表現型を変える遺伝子産物をコードする、優性のネガティブ変異体である可能
性がある。このポリヌクレオチド分子は、プラスミド又は発現ベクター（ウイルスベクタ
ーを含む）に組み込まれ、細菌、酵母、昆虫、及び哺乳動物等の適合する宿主細
胞に導入することができる。このような宿主細胞を使用して、このポリヌクレオ
チド分子でコードされるタンパクを発現させることができる。

【０００８】従って第２の態様として、本発明は、第１の態様のポリヌクレオチド分子で形
質転換させた宿主細胞を提供する。第３の態様として、本発明は、第２の態様の宿主細胞を、ポリヌクレオチド分
子の発現に適した条件下で培養し、場合によりタンパク質を回収することを含む
、タンパク質の製造方法を提供する。宿主細胞は哺乳動物か昆虫起源のものがのぞましい。細胞が哺乳動物起源の場
合は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞やヒト胎児腎(HEK)293細胞がのぞましい。昆虫起源の場合は、昆虫Sf9細胞がのぞましい。

【０００９】第４の態様として、本発明は、第１の態様のポリヌクレオチドによってコード
された精製タンパク質を提供する。この態様の好ましい実施形態において、精製タンパク質は、配列番号２に示す
配列に実質的に相当するアミノ酸配列を含む。第５の態様として、本発明は、配列番号２に示す配列に実質的に相当するアミ
ノ酸配列を含む融合タンパク質を提供する。第５の態様に従う融合タンパク質は、発現及びエフェクタータンパク質候補を
発現している宿主細胞の選択を促進するために、β-ガラクトシダーゼ等のタンパク質のN末端断片を含んでいても良く、または他の活性を付加する他の適当なタンパク質の機能的断片を含んでいても良い。

【００１０】第６の態様として、本発明は、第４の態様のタンパク質に特異的に結合する抗
体またはその断片を提供する。抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましいが、モノクローナルまたは
ポリクローナルのいずれでも良い。好適な抗体断片としてはFab, F(ab')₂、およ
びscFvが挙げられる。第７の態様として、本発明は、少なくとも１２ヌクレオチドのヌクレオチド配
列を含むオリゴヌクレオチドプローブを提供する。このプローブは高ストリンジ
ェンシー条件下で、第１の態様のポリヌクレオチド分子に選択的にハイブリダイ
ズするようなヌクレオチド配列を含んでいる（Sambrookら, Molecular Cloning:
a Laboratory Mannual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss）。この態様の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは標識さ
れる。この態様の更なる好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドプロー
ブは少なくとも１８ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。

【００１１】第８の態様として、本発明は、サンプル中におけるGrb７ファミリータンパク質に対するエフェクタータンパク質の存在を検出する方法を提供する。この方法
は第６の態様の抗体またはその断片とサンプルを反応させ、抗体又はその断片の
結合を検出することを含む。第８の態様の方法は当分野で周知のイムノアッセイ(たとえばELISA)を使用して実施することができる。サンプルとしては、例えば、組織生検から調製した細
胞溶解物またはホモジネートであっても良い。

【００１２】第９の態様として、本発明は、サンプル中におけるGrb7ファミリータンパク質
に対するエフェクタータンパク質をコードするmRNAの存在を検出する方法を提供
する。この方法はサンプルと第７の態様のオリゴヌクレオチドプローブを反応さ
せ、プローブの結合を検出することを含む。第９の態様の方法は、当分野で周知のノーザンブロットなどのハイブリダイゼ
ーションアッセイを用いて実施することができる。サンプルは組織生検から調製
した、ポリ(A)RNA調製品、またはホモジネートであっても良い。 Grb7ファミリータンパク質は、ある種のヒト癌(特に乳癌及び前立腺癌)で示差
的発現を示す。そのため、腫瘍の進行に関係すると考えられる。サンプル中のcD
NA 2.2412にコードされるタンパク質を検出することにより、有用な腫瘍マーカー、及び／または予後のインジケーターが提供されるだろう。さらに、Grb7ファ
ミリーメンバーと2.2412との相互作用について検討すれば、治療的介在の新規な
ターゲットを提供することができる。適当なアゴニストの検出方法、および検出されたアゴニストによる治療方法が
、本発明の一部を形成することについても理解されるべきである。

【００１３】本明細書で配列番号１に示すヌクレオチド配列に関連して用いた「実質的に相
当する」の語は、DNAコードの縮重のためにコードされるタンパク質に変化のないヌクレオチド配列のマイナーな変化を含むことを意図するものである。更にこ
の語は、特定の系における発現を増大させるために必要となり得る配列中の他の
マイナーな変化であるが、コードされたタンパク質の生物学的活性の低下は生じ
ない変化を包含することを意図するものである。本明細書で配列番号２に示すアミノ酸配列との関連で使った「実質的に相当す
る」の語は、タンパク質の生物学的活性を低下させないアミノ酸配列のマイナー
な変化を含むことを意図するものである。これらの変化は保存的アミノ酸置換を
包含しても良い。その置換を以下に挙げる。 G, A, V, I, L, M: D, E; N, Q: S, T; K, R, H; F, Y, W, H: 及びP, Nα アルカリアミノ酸明細書全体を通じて使われている「含む」、「含有する」、「含んでいる」と
いうことばは、記載した段階、成分若しくは性質、又は段階、成分若しくは性質
の群を、更なる段階、成分若しくは性質、又は段階、成分若しくは性質の群と共
に、またはそれなしに包含することを意味することを意図するものである。本発明は、以下に、添付の図面およびそれに続く非制限的実施例によりさらに
説明される。

【００１４】［実施例］2.2412のクローニング及び性状解析（実施例１）酵母のツーハイブリッドスクリーニング酵母のツーハイブリッドシステムは、タンパク質-タンパク質相互作用を利用して、遺伝子レポーターシステムを使用して後に検出され得る機能的な転写アク
チベーターを再構成する（Fields及びSternglanz. TIG. 10. 286-292, 1994）。
この技術は酵母S. cerevisiaeのGal4タンパク質の性質を利用するものである。G
al4 DNA結合ドメイン（DNA-BD）または活性化ドメイン（AD）は単独では転写を誘導することができない。しかしながら、それぞれDNA-BD-及びAD-融合物として
合成された2種のタンパク質間の相互作用によって、双方のGal4ドメインが近接し、選択培地上での増殖、及び生化学的アッセイでモニターできる2種のレポーター遺伝子（HIS3及びLacZ）の転写活性化が生じる。

【００１５】 Gal4 DNA-BD-Grb14融合物をコードするプラスミド構築物を以下のようにして作製した。全長GRB14 cDNAを含有するプラスミドGRB14/ｐRcCMV_F（Dalyら、1996
）をHindIIIで制限消化し、Klenow処理して平滑末端を作製し、次いでBclIで消化しておよそ1.1、4.2、及び1.7ｋｂの３つの断片を放出させる。1.7ｋｂの断片
を単離し、酵母発現ベクターpAS2.1（Clontech）のNdeI（Klenow処理したもの）
及びBamHI部位中にクローニングし、全長Grb14とGAL4 DNA-BDのインフレーム融合物を含有するGRB14/pAS2.1を作製した。この構築物を、トリプトファン要求性
（prototrophy）を選択する酵母のCG1945株中にエレクトロポレーションによって導入した（MATa、ura3-52、his3-200、ade2-101、lys2-801、trp1-901、leu2-
3、112、gal4-542、gal80-538、cyh^r2、LYS2::GAL1_UAS-GAL1_TATA-HIS3、URA3::G
AL4_17mers(x3)-CYC1_TATA -lacZ）。融合タンパク質の発現は、Flagエピトープ及びGal4 DNA-BDに対する抗体を用いたウエスタンブロット分析によって確かめた。次いでレシピエント株を中間対数期（mid-log phase）まで増殖させ、ベクターpACT2（Clontech）内のヒト肝cDNAライブラリーをLiAc法（Schiestl及びGie
tz, Curr. Genet. 16, 339-346, 1989）を用いて導入した。次いで、５ｍMの３ −アミノトリアゾールの存在下において、形質転換体をトリプトファン、ロイシ
ン及びヒスチジン要求性について選択した。

【００１６】１×１０⁶個のクローンのスクリーニングから、合成完全(SC)-leu-his-trp＋3
AT培地上でまず39個のコロニーを選択し、次いでこれらをβ-ガラクトシダーゼ活性について試験した。後者のアッセイにおいて12個のクローンが陽性を示し、
これらを10μg/mlのシクロヘキシミド（CHX）を含有するSC-leu培地上にまく（s
treaking out）ことによっておとりの（bait）プラスミドを除去するためにCHX 処理（curing）にかけた（pAS2-1はCHX感受性をCG1945細胞に復活させるCYH2遺伝子を含有する）。これによって、LacZ活性化のおとり依存性の確認、及び標準
的な方法による相互作用タンパク質をコードするpACT2プラスミドの単離が可能となった（Philippsenら, Methods in Enzymology 194, 170-177）。次に、相互
作用の特異性を確認するために、おとりのプラスミド（GRB14/pAS2-1）、または
関連性のないGal4 DNA-BD融合物をコードする構築物を含有するCG1945株中にこれらのpACT2プラスミドを導入する復帰形質転換（back transformation）を行っ
た。

【００１７】次にcDNA挿入物のDNA配列を、pACT2-特異的及び／またはクローン特異的プライマーを使用して、サイクルシーケンシング（f-molキット、Promega）により得
た。そのヌクレオチド配列に基づき、12個の相互作用クローンを６つの独立した
群に分類した（表１を参照すること）。

【００１８】

【表１】

【００１９】 HIS3及びLacZレポーター遺伝子双方の活性化を示す１２個のクローンを、これ
らのcDNA挿入物の配列解析によって6群に分けた。2種の方法を使用して行ったβ
-ガラクトシダーゼ活性アッセイの結果を示す。液体培養による方法（Galacto-L
ight. TROPIX）はより定量的である：結果は平均相対光単位（RLU）で示し、サンプル中のタンパク質含量で標準化している。また、コロニーリフトフィルター
アッセイ（Clontech）を用いたcDNAクローンの青／白スクリーニングも行った。
およそ２時間にわたる青色の発色強度を+/-（非常に弱い）から++++（強い）までで評価する。

【００２０】 6個のクローンは、カルシウム依存性リン脂質結合（CaLB）ドメイン、4個のWW
ドメイン及びE6-APカルボキシ末端に相同性を有するC末端領域を含有するマルチ
ドメインタンパク質であるNedd4（Kumarら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1
85, 1155-1161, 1992: Sudolら, J. Biol. Chem. 270, 14733-14741, 1995: Hui
bregtseら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 2563-2567, 1995）に相当する部分cDNAであった。後者はNedd4にE3ユビキチン-タンパク質リガーゼ活性を付与す
るものと思われる。単離されたpACT2クローンは、第一のWWドメインの最初の22 アミノ酸とCaLBドメインをコードしていた。

【００２１】２個のクローンは、EphファミリーのRTKであるHtk（Bennettら, J. Biol. Che
m. 269, 14211-14218, 1994）の細胞内領域及び細胞外ドメインの一部をコードしていた。HtkによるGrb14の補充は、２つの理由から興味深い。まず、Htk及びそのマウスの同属体であるmyk-1双方の発現プロファイルは、乳腺の発育及び腫瘍形成において潜在的な役割があることを示している（Andresら, Oncogene 9,
1461-1467, 1994: Berclazら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 226, 869-875
1996）。第二に、Ephファミリーのメンバーは細胞移動の調節に関与している可能性があり（Tessier-Lavigne, Cell 82, 345-348, 1995）、このことはGrb7ファミリーのC.elegansタンパク質mig10（Steinら, 1994, 前出）への相同性を考慮すると面白い。

【００２２】 2.2412と命名される1971ｂｐの新規cDNAも単離した。このクローンは、Gal4 D
NA-BDと共にインフレームで657アミノ酸のポリペプチドをコードしていた。この
cDNAは終止コドンを含んでおらず、下記のノーザン分析の結果と合わせると、不
完全であることが示された。従ってこのDNA断片をプローブとして使用して、ヒトの胎盤cDNAライブラリー（5' STRETCH PLUS. Clontech, λgt10中）をスクリーニングした。この結果、クローン８及びクローン１２と命名される２個のクロ
ーンを単離した。クローン８はおよそ２ｋｂであり、元の2.2412クローンと３’
末端において900ｂｐ重複していた。このクローンによって、2.2412タンパク質配列のカルボキシ末端が得られた（図１）。クローン１２はおよそ3.5ｋｂであり、現在のところ５’方向に更に692ｂｐの配列情報を提供している。これらの重複するクローンによって得られた2.2412のヌクレオチド及びタンパク質配列を
図１に示す。５’の開始コドンはまだ同定されていないため、コーディング配列
は今なお不完全なものと考えられる。

【００２３】（実施例２）2.2412の更なる性状解析 2.2412 cDNA配列を用いたデータベースサーチから、アンキリン（ankyrin）様
反復を含む多数のタンパク質と顕著な相同性を有することが明らかとなった。最
初はこれらの配列をある種の細胞周期調節タンパク質及びショウジョウバエタン
パク質のNotch（Breeden及びNasmyth, Nature 329, 651-654, 1987）の間の相同
領域として同定したが、その後タンパク質-タンパク質相互作用において機能すると考えられる広範囲にわたる他のタンパク質（Bork, Proteins 17, 363-374,
1993）の中に同定された。タンパク質配列のその後の解析から、18個の連続アン
キリン反復及び更なる反復エレメントが同定された（図１）。アンキリン反復領
域に続いて、セリン残基に富むおよそ40アミノ酸の伸長部（stretch）がある。残りのC末端領域は比較的高含量の荷電アミノ酸を有している。

【００２４】（実施例３）2.2412 mRNA発現のノーザン分析元の2.2412 cDNAをプローブとして用い、複数組織ノーザン（multiple tissue
northerns; Clontech）のノーザンブロット分析を実施した。その結果、腎臓の
例外を除き、調べた全ての組織において、およそ７ｋｂの単一のmRNA転写物を検
出した。発現は骨格筋及び胎盤で特に高かった。この転写物の大きさを2.2412ク
ローンの転写物と比較すると、後者がcDNAの一部のみを表していることが示され
る。

【００２５】（実施例４）2.2412遺伝子のゲノム上の局在元の2.2412 cDNAを正常中期（normal metaphases; Bakerら、1996、前出）に蛍光in situハイブリダイゼーションさせ、10q23.32のフラジャイルサイトFRA10
Aと照合して、該遺伝子を染色体10q23.2及び近位10q23.32間に位置づけた。興味
深いことに、乳癌、前立腺癌、腎臓癌、小細胞肺癌、子宮内膜癌腫、多形性膠芽
腫、黒色腫及び髄膜腫等の種々のヒト癌において染色体10番の10q22-25領域の欠
失が検出されており、この領域に1種以上の腫瘍抑制遺伝子座が存在することが示唆される（Liら, Science 275, 1943-1947, 1997; Steckら, Nature Genetics
15, 356-362, 1997, 及びその中の引用文献）。２つの腫瘍抑制遺伝子の候補が
この領域において同定されている（MMAC1/PTEN及びMXI1、Liら, 1997, 前出: St
eckら, 1997, 前出; Albarosaら, Hum. Genet. 95, 709-711, 1995）。

【００２６】（実施例５）2.2412及びGrb7ファミリーメンバー間の相互作用の解析元の2.2412 cDNAクローンの全長及びN末端及びC末端領域をコードするcDNA（それぞれ図１に示す配列のヌクレオチド694-2664、694-1614、及び1615-2664）をベクターpGEX4T2（Pharmacia）中にクローニングした。全長の構築物は、pACT
2クローンからNdeI断片としてサブクローニングして作製し、一方より短い構築物はPCR産物の直接クローニングによって合成した。グルタチオン-アガロースビ
ーズを用い、IPTG誘導細菌培養から対応するGST-融合タンパク質を精製した（Sm
ith及びJohnson, Gene 67, 31-40, 1988）。次いでこれらの固定した融合タンパ
ク質を、Flagエピトープタグ付きGrb14を発現している細胞（Dalyら, 1996, 前出）または高レベルのGrb7を発現しているヒト乳癌細胞（SK-BR-3: Steinら, 19
94）由来の溶解物と共に、先に記載されているように（Dalyら, 1996, 前出）培
養した。洗浄後、ウエスタンブロット分析によって結合タンパク質を検出した。
その結果、2.2412がin vitroでGrb14及びGrb7の双方に特異的に結合すること、及びN末端融合タンパク質はC末端由来のものよりもより強く結合することが示さ
れた。酵母のツーハイブリッドシステムにタンパク質-タンパク質相互作用を検出する別の方法を使用して得られたこれらのデータから、2.2412がGrb14と相互作用することが確認される。更に、2.2412はGrb7にも結合する。従って、2.2412
はGrbファミリーに対する一般的エフェクターであると考えられる。

【００２７】（実施例６）Grb14上の2.2412結合領域のマッピング 2.2412と相互作用するGrb14の領域を同定するために、適当なフランキングプライマーを用いて合成したPCR断片をベクターpAS2.1中にクローニングすることによって一連のGrb14欠失変異体を作製した。これらの断片は以下の領域にわたっている：N末端（「N」、アミノ酸1-110）、mig10相同部及び「PH及びSH2間」（BPS）ドメインを包含する中心領域（「C」、アミノ酸110-437）、及びN末端及
び中心領域（「N+C」、アミノ酸1-437）。これらのプラスミドで酵母Y190株をそ
れぞれ形質転換し（MATa、ura3-52、his3-200、ade2-101、lys2-801、trp1-901 、leu2-3、112、gal4Δ、gal80Δ、cyh^r2、LYS2::GAL1_UAS- HIS3_TATA-HIS3、URA
3::GAL1_UAS- GAL1_TATA -lacZ）、ほぼGal4 DNA-BD融合タンパク質のサイズの発現をウエスタンブロッティングによって確認した。得られた酵母の株をpACT-2
中の元の2.2412 cDNAクローンで形質転換した後、相互作用の強さを液体またはフィルターベースのβ-ガラクトシダーゼアッセイによって測定した。結果を図2
に示す。図２の結果は、Grb14のN末端領域が2.2412の結合に必要なだけでなく、
十分であることを示している。Grb7ファミリータンパク質のN末端領域はこの相互作用を仲介する可能性がある高度に保存されたプロリンに富むモチーフを含有
するため、このことは、2.2412がGrb7ファミリーの一般的エフェクターであると
いう仮説を支持する。

【００２８】特定の態様によって示された本発明に対し、広く記載した本発明の精神または
範囲から外れることなく数多くの変形及び／または変更をなし得ることは、当業
者には理解されるであろう。従って、本明細書の実施態様は、全ての点において
説明のためのものであり、限定的なものでないと考えられるべきである。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 2.2412のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列（一文字表記）を示す。数字は塩
基対における距離を示す。アンキリン型の反復配列に下線を引いてある。別の反
復配列はイタリックで示す。終止コドンはアスタリスクで表す。ツーハイブリッ
ドスクリーニングで単離された元のcDNAクローン2.2412は、この配列のヌクレオ
チド694-2664にわたる。

【図２】 Grb14上の2.2412結合領域のマップを示す。 A. 分析に用いた欠失構築物の構造。全長Grb14（FL）、N-末端（N）、中心領域（C）、及びN-末端＋中心領域（N+C）をコードするGal4 DNA-BD融合構築物をベクターpAS2.1中に作製した。 B. 上記プラスミドを酵母Y190株中にpACT-2中の元の2.2412 cDNAクローンと共に
形質導入した後のβ-ガラクトシダーゼ活性アッセイの結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｑ 1/68 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者サザーランド，ロバート，リンゼイオーストラリア国 2070ニューサウスウェールズ州，リンフィールド，ノースコートロード 20 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA12 BA80 CA04 DA02 DA05 DA12 GA14 GA19 HA12 4B063 QA01 QA18 QQ42 QQ53 QR55 QS34 4B064 AG01 CA06 CA19 CC24 DA05 4B065 AA80X AA80Y AB01 AC14 BA03 BA25 CA24 CA44 CA46 4H045 AA10 AA20 AA30 CA15 EA28 EA51 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】シグナル伝達タンパク質Grb7ファミリーに対するエフェクタ
ータンパク質候補をコードする単離されたポリヌクレオチド分子であって、配列
番号１に示される配列と少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配
列を含むことを特徴とする、上記ポリヌクレオチド分子。
【請求項２】配列番号１に示される配列と少なくとも８５％の配列同一性
を有するヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載のポリヌク
レオチド分子。
【請求項３】配列番号１に示される配列と少なくとも９５％の配列同一性
を有するヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載のポリヌク
レオチド分子。
【請求項４】配列番号１に示される配列に実質的に相当するヌクレオチド
配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項５】請求項１から４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド分
子で形質転換した宿主細胞。
【請求項６】哺乳動物、昆虫、酵母または細菌宿主細胞である、請求項５
に記載の宿主細胞。
【請求項７】請求項５または６に記載の宿主細胞を、ポリヌクレオチド分
子の発現に好適な条件下で培養し、場合によりタンパク質を回収することを含む
、タンパク質の製造方法。
【請求項８】請求項１から４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド分
子によってコードされる精製タンパク質。
【請求項９】配列番号２に示される配列に実質的に相当するアミノ酸配列
を含むことを特徴とする、請求項８に記載の精製タンパク質。
【請求項１０】配列番号２に示される配列に実質的に相当するアミノ酸配
列を含む融合タンパク質。
【請求項１１】請求項８または９に記載のタンパク質に特異的に結合する
抗体またはその断片。
【請求項１２】高ストリンジェンシー条件下で請求項１から４のいずれか
一項に記載のポリヌクレオチド分子に選択的にハイブリダイズするようなヌクレ
オチド配列を含む、少なくとも１２ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むオリ
ゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１３】少なくとも１８ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むこ
とを特徴とする、請求項１２に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１４】サンプルを請求項１１に記載の抗体またはその断片と反応
させることを含む、サンプル中におけるGrb7ファミリータンパク質に対するエフ
ェクタータンパク質の存在を検出する方法。
【請求項１５】サンプルを請求項１２または１３に記載のオリゴヌクレオ
チドプローブと反応させることを含む、サンプル中におけるGrb7ファミリータン
パク質に対するエフェクタータンパク質をコードするmRNAの存在を検出する方法
。