KR20140045409A - 초기 류마티스성 관절염의 진단 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 류마티스성 관절염(RA) 환자의 생물학적 샘플에 존재하는 자가항체에 의해 특이적으로 인식되는 바이오마커에 관한 것이다. 본 발명은 RA의 진단, 특히 초기 RA의 진단을 위해 상기 바이오마커를 사용하는 방법 및 키트를 제공한다.

Description

초기 류마티스성 관절염의 진단 방법{METHOD FOR THE DIAGNOSIS OF EARLY RHEUMATOID ARTHRITIS}

관련 출원

본 출원은 2011년 5월 13일에 출원된 유럽특허출원 EP　11　305　584를 우선권으로 주장한다. 상기 유럽특허출원은 본원에 전체로서 참조로 삽입된다.

기술분야

본 발명은 류마티스성 관절염(RA)을 가진 환자의 생물학적 샘플에 존재하는 자가항체에 의해 특이적으로 인식되는 바이오마커에 관한 것이다. 본 발명은 RA의 진단, 특히 초기 RA의 진단을 위해 상기 바이오마커를 사용하는 방법 및 키트를 제공한다.

류마티스성 관절염은 전세계 인구의 약 1%가 앓고 있는 만성 자가면역 질환이다. 이 질환은 활막 관절의 내벽에서 염증 및 세포 증식을 특징으로 하며, 이는 결국 연골 및 골 파괴, 관절 기형 및 기동력의 손상을 유발할 수 있다. 류마티스성 관절염은 통상적으로 여러 관절들에서 동시에, 종종 대칭적인 방식으로, 문제를 발생시킨다. 초기 류마티스성 관절염은 처음에 더 작은 관절, 예컨대 손목, 손, 발목 및 발의 관절에 영향을 미치는 경향이 있다. 질환이 진행됨에 따라, 어깨, 팔꿈치, 무릎, 둔부, 턱 및 목의 관절들이 또한 연루될 수 있다. 관절 내 부위 또는 관절 주변 부위에만 영향을 미치는 다른 관절염 상태들과는 달리, 류마티스성 관절염은 피부, 혈관, 심장, 폐 및 근육을 포함하는 신체에 걸쳐 관절외 조직에서 염증을 야기할 수 있는 전신성 질환이다.

류마티스성 관절염은 통증, 기형, 삶의 질 하락 및 장애와 연관되며, 결과적으로 환자가 정상적이고 생산적인 삶을 살 수 있는 능력에 대해 영향을 미친다. 최근의 연구에 따르면, 상기 질환이 개시되고 5년 후에 류마티스성 관절염 환자의 약 1/3이 더 이상 작업을 할 수 없었으며, 10년 내에 환자의 절반이 실질적인 기능 장애를 가졌다고 보고되었다(A. Young et al., Rheumatology, 2007, 46: 350-357). 결과적으로, 류마티스성 관절염은 사회적으로 중요한 경제적 부담을 부과한다. 또한, 상당한 데이터들은 류마티스성 관절염이 기대수명의 저하와 연관된다는 점을 시사한다.

비록 류마티스성 관절염이 널리 연구되어왔을지라도, 상기 질환의 병인론 및 발병론은 불완전하게 이해된 상태로 남아있다. 류마티스성 관절염의 위험을 증가시킬 수 있는 요인들에는 다음이 포함된다: 개인의 성별(여성은 남성보다 3배 내지 4배 더 류마티스성 관절염을 진행시키는 것으로 여겨짐); 연령(류마티스성 관절염은 어린이, 십대, 60세 이상의 노인에게서도 발생할 수 있지만, 40세 내지 60세 사이에서 더 흔하게 발생함); 유전(류마티스성 관절염은 주요 조직적합성 복합체(MHC) 항원 HLA-DR4, 보다 구체적으로 DRB1*0401 및 DRB1*0404와 강하게 연관되는 것으로 발견되었음); 및 흡연(류마티스성 관절염은 비흡연자보다 흡연자에게서 약 4배 더 흔하게 발생함).

현재, 류마티스성 관절염에 대해 믿을 수 있는 치료법이 없다. 치료는 본질적으로 통증을 완화시키는 것, 염증을 감소시키는 것, 및 관절 손상과 골 파괴를 중단하거나 둔화시키는 것에 관한 것이다. 류마티스성 관절염 환자가 질환-조절 항류마티스성 약물(DMARD)로 초기에 처치될 때 더 나은 결과를 가져오므로, 현재 치료적 접근법은 기능의 더 우수한 보존, 더 적은 작업 장애 및 더 낮은 조기 사망 위험의 상태에서 상기 약물을 초기에 처방하는 것이다. 류마티스성 관절염의 병리생리학의 이해에 있어서 최근의 진전에 의해, 생물학적반응조절물질(biological response modifier)이라고 불리우는 새로운 DMARD가 개발되었다. 생물학적 DMARD는 류마티스성 관절염과 연관되는 비정상적 면역 작용에 관여하는 특정 주요 세포 또는 분자, 예컨대 종양괴사인자-알파(TNF-α), 인터루킨-1(IL-1), T-세포 및 B-세포의 작용을 표적으로 하고 차단시키는 것으로 설계된다. 전통적인 DMARD와 비교할 때, 상기 생물학적 제제는 훨씬 더 빠른 작용 개시점을 가지며, 관절 손상의 효과적인 장기간 방지와 함께 더 우수한 임상적 응답을 제공할 수 있다(J.K.D. de Vries-Bouwstra et al., Rheum. Dis. Clin. North Am., 2005, 31: 745-762).

비가역적인 관절 파괴는 류마티스성 관절염의 초기 단계에서 개입함으로써 방지될 수 있기 때문에, 류마티스성 관절염의 초기 진단은 중요하다. 그러나, 류마티스성 관절염의 명확한 진단은 어려울 수 있다. 류마티스성 관절염을 진단하기 위해 수행될 수 있는 면역학적 시험에는 특히 류마티스 인자(RF) 및 항-시클릭 시트룰린화 펩티드(항-CCP: anti-cyclic citrullinated peptide) 항체의 수준 측정이 포함된다. RF에 대한 혈청학적 시험은 중간정도의 민감성 및 특이성, 및 다른 만성 염증 및 감염성 질환의 높은 양성률에 의해 복잡해진다(T. Dorner et al., Curr. Opin. Rheumatol, 2004, 16: 246-253). 항-CCP 항체 시험은 높은 특이성, 질환 진행의 초기 양성, 및 중증 질환 및 비가역적 손상을 가질 것 같은 환자를 식별하는 능력과 함께, 류마티스성 관절염의 진단에 특히 유용하다. 그러나, 항-CCP 항체 시험에서 음성 결과는 류마티스성 관절염을 제외하지 않는다.

따라서, 류마티스성 관절염의 새로운 생물학적 마커에 대한 필요성이 존재한다. 특히, 류마티스성 관절염의 초기 단계를 신뢰성있게 진단하고 모니터링할 수 있으며, 통증, 관절 파괴 및 장기간 장애를 잠재적으로 예방하는 초기 개입을 가능하게 하는, 바이오마커가 매우 요구된다.

본 발명의 요약

본 발명자들은 류마티스성 관절염(RA)의 초기 단계와 연관되는 신규한 자가항체를 발견하였으며, 상기 자가항체의 검출에 사용될 수 있는 9개의 바이오마커를 동정하였다. 상기 바이오마커들 중 4개에 대해, 본 발명자들은 RA 환자의 혈청에 의해 특이적으로 인식되는 에피토프를 또한 동정하였다.

따라서, 일측면에서, 본 발명은 대상체의 류마티스성 관절염의 시험관내 진단 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상체에서 획득한 생물학적 샘플에서 WIBG-단백질, TPM2-단백질, C17orf85-단백질, TCP10L-단백질, ZNF706-단백질, MGC17403-단백질, CCDC72-단백질, ELOF1-단백질 및 GABARAPL2-단백질로 이루어진 단백질 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질 바이오마커를 인식하는 하나 이상의 자가항체를 검출하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 상기 방법은 상기 단백질들의 단편에 의해 수행될 수 있다.

바람직한 구현예에서, 복수개의 단백질 바이오마커(즉, 4개 또는 4개보다 많은 단백질 바이오마커)가 진단 방법에 사용된다. 즉, 본 발명의 방법은 다음과 같은 단계를 포함할 수 있다: 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 9개의 바이오마커와 생물학적 샘플에 존재하는 자가항체 사이에 바이오마커-항체 복합체가 형성될 수 있는 시간 및 조건 하에서, 생물학적 샘플을 복수개의 바이오마커와 접촉시키는 단계; 및 상기 형성된 임의의 바이오마커-항체 복합체를 검출하는 단계.

특정 구현예에서, 상기 진단 방법은 WIBG-단백질, TPM2-단백질, C17orf85-단백질, TCP10L-단백질, ZNF706-단백질, MGC17403-단백질, CCDC72-단백질, ELOF1-단백질 및 GABARAPL2-단백질을 포함하는 9개의 다른 바이오마커, 이들의 유사체 및 단편을 사용하여 수행된다.

또다른 특정 구현예에서, 상기 진단 방법은 4개의 바이오마커, 즉 WIBG-단백질, TPM2-단백질, ZNF706-단백질 및 GABARAPL2-단백질을 사용하여 수행된다.

특정 구현예에서, WIBG-단백질은 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나 또는 이러한 서열로 구성된 아미노산 서열을 갖는 펩티드이다.

특정 구현예에서, TPM2-단백질은 서열번호 14 및 서열번호 15로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나 또는 이러한 서열로 구성된 아미노산 서열을 갖는 펩티드이다.

특정 구현예에서, ZNF706-단백질은 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18을 포함하거나 또는 이러한 서열번호로 구성된 아미노산 서열을 갖는 펩티드이다.

특정 구현예에서, GABARAPL2-단백질은 서열번호 19 및 서열번호 20을 포함하거나 또는 이러한 서열번호로 구성된 아미노산 서열을 갖는 펩티드이다.

특정 구현예에서, 상기 시험되는 대상체는 CCP-음성(negative)이거나, 또는 상기 시험되는 생물학적 샘플은 CCP-음성 대상체에서 수득된 것이다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 초기 단계의 RA 환자를 검출하기 위해 수행된다.

본 발명에서 제공되는 진단 방법에서, 단백질 바이오마커와 생물학적 샘플내 존재하는 자가항체 사이에 형성되는 임의의 바이오마커-항체 복합체를 검출하는 단계는 임의의 적절한 방법에 의해 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 검출은 면역검정법(immunoassay)에 의해 수행된다.

특정 구현예에서, 상기 진단 방법에서 사용되는 단백질 바이오마커 또는 바이오마커들은 고형 담체 또는 지지체에 고정된다.

통상적으로, 상기 진단 방법은 대상체에서 획득한 생물학적 샘플에서 C-반응성 단백질, 혈청 아밀로이드 A, 인터루킨 6, S100 단백질, 오스테오폰틴, 류마티스 인자, 매트릭스 메탈로프로테아제 1, 매트릭스 메탈로프로테아제 3, 히알루론산, sCD14, 혈관형성 마커, 및 골, 연골 및 활막 대사 산물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 마커의 농도를 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

또다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 RA의 시험관내 진단을 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 본 발명의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 9개 바이오마커, 및 상기 단백질 바이오마커와 시험대상인 생물학적 샘플에 존재하는 자가항체 사이에 형성된 바이오마커-항체 복합체를 검출하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 상기 키트에서, 하나 이상의 단백질 바이오마커는 고형 담체 또는 지지체에 고정될 수 있거나, 또는 선택적으로 고형 담체 또는 지지체에 단백질 바이오마커를 고정시키는데 사용될 수 있는 시약이 키트에 포함될 수 있다. 상기 키트는 본 발명에 따른 진단 방법을 실시하기 위한 지시문을 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 키트는 WIBG, TPM2, C17orf85, TCP10L, ZNF706, MGC17403, CCDC72, ELOF1 및 GABARAPL2-단백질을 포함하는 9개 이상의 바이오마커, 또는 이의 단편을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 키트는 4개의 바이오마커, 즉 WIBG-단백질, TPM2-단백질, ZNF706-단백질 및 GABARAPL2-단백질을 포함한다.

바람직한 특정 구현예에서, 상기 키트는 RA-특이적 자가항체의 존재를 검출하기 위한 하나 이상의 부가적 RA 바이오마커, 예컨대 PAD4-펩티드, BRAF-펩티드 및 칼파스타틴-펩티드(본원에 참조로 삽입되는 WO2010115745 참고)를 추가로 포함한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 대상체의 RA 진단용 어레이(array)를 제공한다. 본 발명에 따른 어레이는 그 표면에 부착된 본 발명의 하나 이상의 단백질 바이오마커를 포함한다. 특히, 본 발명은 CCP-음성 대상체의 RA 진단용 어레이를 제공하며, 상기 어레이는 그 표면에 부착된, 본원에 기재된 WIBG, TPM2, C17orf85, TCP10L, ZNF706, MGC17403, CCDC72, ELOF1 및 GABARAPL2 단백질을 포함하는 9개 이상의 단백질 바이오마커를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 어레이는 그 표면에 부착된 4개의 바이오마커, 즉 WIBG-단백질, TPM2-단백질, ZNF706-단백질 및 GABARAPL2-단백질을 포함한다.

특정 구현예에서, 본 발명의 어레이는 그 표면에 부착된, RA-특이적 자가항체, 예컨대 항핵 항체 및 항-CCP 항체의 존재를 검출하기 위한 하나 이상의 부가적 RA 바이오마커를 추가로 포함한다.

바람직한 구현예에서, 상기 어레이는 그 표면에 부착된, RA-특이적 자가항체의 존재를 검출하기 위한 하나 이상의 부가적 RA 바이오마커, 예컨대 PAD4-펩티드, BRAF-펩티드 및 칼파스타틴-펩티드(본원에 참조로 삽입되는 WO2010115745 참고)를 추가로 포함한다.

본 발명의 여러 목적들, 이점들 및 특징들은 하기의 바람직한 구현예들의 상세한 설명을 참조한 당업계의 통상의 기술자에게 명백해질 것이다.

정의

본 명세서에서 하기에서 정의되는 여러 용어들이 사용된다.

"대상체(subject)"는 RA를 앓을 수 있는 인간 또는 다른 포유류(예컨대,　영장류, 개, 고양이, 염소, 말, 돼지, 마우스, 래트, 토끼 등)를 나타낸다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 대상체는 인간이다. 이러한 구현예에서, 대상체는 종종 "개체(individual)"로 언급된다. "개체"는 특정 연령을 지칭하는 것이 아니므로, 어린이, 십대 및 성인을 포괄한다.

"RA를 갖는 것으로 의심되는 대상체"는 RA를 보여주는 하나 이상의 증상(예컨대, 관절의 통증, 경직 또는 종창)을 나타내는 대상체, 또는 (예컨대, 신체 검사 동안) RA에 대해 스크리닝되는 대상체를 나타낸다. 선택적으로 또는 부가적으로, RA를 갖는 것으로 의심되는 대상체는 하나 이상의 위험 인자(예컨대, 연령, 성별, 가족력, 흡연 등)를 가질 수 있다. 상기 용어에는, RA에 대해 처음 진단을 받은 대상체 뿐만 아니라 RA에 대해 시험받은적 없는 대상체도 포함된다.

본원에서 "생물학적 샘플"은 가장 넓은 의미로 사용된다. 생물학적 샘플은 일반적으로 대상체로부터 획득된다. 샘플은 본 발명의 바이오마커가 검정될 수 있는 임의의 생물학적 조직 또는 유체일 수 있다. 샘플은 종종 "임상 샘플", 즉 환자로부터 유래된 샘플일 것이다. 이러한 샘플에는 세포를 함유할 수도 있고 함유하지 않을 수도 있는 체액, 예컨대 혈액(예컨대, 전혈, 혈청 또는 혈장), 활액, 타액, 조직 또는 미세바늘 생검 샘플, 및 진단, 치료 및/또는 결과 이력이 알려져 있는 기록(archival) 샘플이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 생물학적 샘플에는 또한 조직학적 목적으로 채취된 동결 절편과 같은 조직 절편이 포함될 수 있다. "생물학적 샘플"에는 또한 생물학적 샘플의 가공에서 유래된 임의의 물질이 포함된다. 유래된 물질에는 샘플에서 단리된 세포(또는 이의 자손) 또는 샘플에서 추출된 단백질이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 생물학적 샘플의 가공은 여과, 증류, 추출, 농축, 간섭 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등에서 하나 이상을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 생물학적 샘플은 혈청학적 샘플이며, 이는 대상체에서 획득한 전혈, 혈청 또는 혈장이거나 또는 이들로부터 유래된 것이다.

"정상" 및 "건강"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이들 용어는 대상체가 어떠한 RA 증상도 나타내지 않고, RA가 진단되지 않거나 연골 또는 골 손상이 진단되지 않는 것을 의미한다. 바람직하게는, 정상 대상체는 RA에 대해 약물 치료를 받고 있지 않으며, 임의의 다른 질환(특히, 자가면역 염증성 질환)이 진단되지 않았다. 특정 구현예에서, 시험대상인 생물학적 샘플이 획득된 대상체와 비교하여, 정상 대상체는 비슷한 성별, 연령 및/또는 체중 지수를 가질 수 있다. 본원에서 "정상"이라는 용어는 또한 건강한 대상체에서 획득한 샘플을 정성적으로 나타내기 위해 사용된다.

본 발명의 측면에서, 대상체를 특징화하기 위해 사용되는 "대조군(control)"은 건강한 대상체를 의미하거나 또는 RA가 아닌 다른 특이적 질환이 진단된 환자를 의미한다. "대조군 샘플"은 건강한 대상체로부터 획득한 샘플 또는 RA가 아닌 다른 질환이 진단된 환자로부터 획득한 샘플 하나 또는 그 이상을 의미한다.

"자가항체(autoantibody)"는 당업계에서 받아들여지는 의미를 가지며, 이는 대상체의 면역시스템에 의해 생성되고 대상체 자신의 단백질에 대항하는 항체를 나타낸다. 자가항체는 신체 자신의 세포, 조직, 및/또는 기관을 공격할 수 있으며, 염증 및 손상을 유발할 수 있다.

"자가항원(autoantigen)"은 자가면역반응에서와 같이 대상체의 체내에서 자가항체의 생성을 자극시키는 내인성 항원 또는 이의 활성 단편을 나타낸다. 상기 용어에는 또한 대상체에 존재하거나 또는 대상체에서 획득한 생물학적 샘플에 존재하는 자가항체와 항원-항체 복합체를 형성할 수 있는 임의의 물질이 포함된다.

"바이오마커" 및 "마커"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이들 용어는 생물학적 과정, 생물학적 사건 및/또는 병리학적 상태의 특징적인 지표가 되는 물질을 나타낸다. 본 발명의 측면에서, "RA의 바이오마커"에는 본원에서 제공되는 WIBG, TPM2, C17orf85, TCP10L, ZNF706, MGC17403, CCDC72, ELOF1 및 GABARAPL2 단백질이 포함되며, 이는 RA 환자의 생물학적 샘플(예컨대,　혈액 샘플)에 존재하는 항-WIBG 자가항체, 항-TPM2 자가항체, 항-C17orf85 자가항체, 항-TCP10L 자가항체, 항-ZNF706 자가항체, 항-MGC17403 자가항체, 항-CCDC72 자가항체, 항-ELOF1 자가항체 및 항-GABARAPL2 자가항체에 의해 특이적으로 인식된다. 바람직한 특정 구현예에서, 본 발명의 바이오마커는 20개 이하의 아미노산을 갖는 단백질 단편이다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명의 바이오마커는 5개 내지 20개의 아미노산(즉, 10개 또는 15개 아미노산)을 갖는 단백질 단편이다.

"RA의 지표"라는 용어가 과정 또는 사건에 대해 적용될 때, 이 용어는 RA로 진단되는 과정 또는 사건을 의미하며, 건강한 대상체 및/또는 RA가 아닌 다른 질환을 가진 대상체보다 RA를 앓는 대상체에서 유의적으로 더 빈번하게 발견되는 과정 또는 사건을 의미한다. "RA의 초기 단계"는 증상의 개시로부터 1년 후에 걸쳐 이어지는 질환의 단계를 나타낸다.

"단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 이는 중성(비하전) 형태이거나 염 형태인, 글리코실화, 측쇄 산화, 또는 인산화, 또는 시트룰린화에 의해 개질되거나 개질되지 않은, 다양한 길이의 아미노산 서열을 의미한다. 특정 구현예에서, 상기 아미노산 서열은 전장 천연 단백질이다. 또다른 구현예에서, 상기 아미노산 서열은 전장 단백질의 더 작은 단편이다. 또다른 구현예에서, 상기 아미노산 서열은 아미노산 측쇄에 부착된 부가적 치환체, 예컨대 글리코실 단위체, 지질, 또는 포스페이트와 같은 무기 이온에 의해 개질될 뿐만 아니라, 설프히드릴기의 산화와 같은 사슬의 화학적 변환과 관련되는 변형에 의해 개질된다. 따라서, "단백질"(또는 이의 동등한 용어들)은 단백질의 특이적 성질을 유의적으로 변화시키지 않는 개질이 이루어진 전장 천연 단백질 또는 이의 단편의 아미노산 서열을 포함하는 것으로 의도된다. 특히, "단백질"에는 단백질 이소폼, 즉 동일한 유전자에 의해 인코딩되지만 pI 또는 MW, 또는 pI 및 MW가 다른 변이체가 포함된다. 상기 이소폼은 (예컨대, 선택적 스플라이싱 또는 제한적 단백질분해의 결과로서) 아미노산 서열이 다를 수도 있고, 또다르게는 차등 번역후 변형(예컨대, 글리코실화, 아실화, 인산화)으로부터 발생할 수도 있다.

단백질 또는 폴리펩티드와 관련하여 본원에서 사용되는 "유사체"는, 상기 단백질 또는 폴리펩티드와 유사하거나 동일한 기능을 보유하지만, 반드시 상기 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열과 유사하거나 동일한 아미노산 서열 또는 상기 단백질 또는 폴리펩티드의 구조와 유사하거나 동일한 구조를 포함할 필요는 없는 펩티드를 나타낸다. 바람직하게는, 본 발명의 측면에서, 유사체는 상기 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열과 80% 이상 동일한, 더 바람직하게는 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 특정 구현예에서, 본 발명의 펩티드 바이오마커의 유사체는 펩티드 바이오마커의 아미노산 서열과 80% 이상 동일하거나 85% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는다.

"상동성"(또는 "상동")은 "동일성(identity)"과 동의어이며, 이는 2개의 폴리펩티드 분자 사이 또는 2개의 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 나타낸다. 2개의 비교되는 서열의 위치에 동일한 염기 또는 동일한 아미노산 잔기가 위치하고 있는 경우, 각각의 분자는 그 위치에서 상동성이다. 2개의 서열 사이의 상동 퍼센트는 2개의 서열에 의해 공유되는 매칭 또는 상동 위치의 개수를 비교되는 위치의 개수로 나누고 100을 곱하는 것에 해당한다. 일반적으로, 2개의 서열이 최대 상동을 나타내도록 배열될 때 비교가 이루어진다. 상동성 아미노산 서열은 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 공유한다. 유사한 잔기는 기준(reference) 서열에서 대응하는 아미노산 잔기에 대한 보존적 치환체이거나 또는 기준 서열에서 대응하는 아미노산 잔기의 허용가능한 점돌연변이이다. 기준 서열에서 잔기의 "보존적 치환체(conservative substitution)"는 대응하는 기준 잔기와 물리적 또는 기능적으로 유사한 치환체, 예컨대 유사한 크기, 형태, 정전하, 화학적 성질(공유결합 또는 수소결합을 형성하는 능력을 포함함) 등을 갖는 치환체이다. 특히 바람직한 보존적 치환체는 Dayhoff 등의 "허용가능한 점돌연변이(accepted point mutation)"에 대해 규정된 기준을 충족시키는 것이다("Atlas of Protein Sequence and Structure", 1978, Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington, DC, Suppl. 3, 22: 354-352).

"표지된", "검출가능 제제로 표지된" 및 "검출가능 모이어티(moiety)로 표지된"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이들 용어는 엔티티(entity)(예컨대,　WIBG-단백질, TPM2-단백질, C17orf85-단백질, TCP10L-단백질, ZNF706-단백질, MGC17403-단백질, CCDC72-단백질, ELOF1-단백질 또는 GABARAPL2-단백질)가, 예를 들어 다른 엔티티(예컨대, 항-WIBG 자가항체, TPM2 자가항체, C17orf85 자가항체, TCP10L 자가항체, ZNF706 자가항체, MGC17403 자가항체, CCDC72 자가항체, ELOF1 자가항체 및 GABARAPL2 자가항체)에 결합한 후에, 시각화될 수 있다는 것을 명시하기 위해 사용된다. 바람직하게는, 검출가능 제제 또는 모이어티는, 측정할 수 있는 신호를 발생시키고 그 신호의 세기가 결합된 엔티티의 양과 관련되는 것이 선택된다. 또한, 어레이-기초 방법에서, 검출가능 제제 또는 모이어티는 바람직하게는, 편재화된 신호를 발생시키고 이에 따라 어레이상의 각 지점으로부터의 신호에 대해 공간 분해능(spatial resolution)을 가능하게 하는 것이 선택된다. 단백질 및 폴리펩티드를 표지하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 표지된 폴리펩티드는 표지의 혼입에 의해 제조되거나 표지에 대한 컨쥬게이션에 의해 제조될 수 있으며, 이는 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단, 또는 임의의 다른 적절한 수단에 의해 직접적이거나 간접적으로 검출할 수 있다. 적합한 검출가능 제제에는 다양한 리간드, 방사성핵종, 형광염료, 화학발광제, 미세입자, 효소, 비색 표지, 자성 표지 및 합텐이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

"단백질 어레이(protein array)" 및 "단백질 칩(protein chip)"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이들 용어는 기질(substrate)상의 개별적인 지점에서 규칙적인 방식으로 다양한 단백질 또는 폴리펩티드가 고정되는 기질 표면을 의미한다. 단백질 어레이는, 단백질/단백질 상호작용(예컨대, 항원/항체 상호작용)을 식별하기 위해, 효소의 기질을 식별하기 위해, 또는 생물학적으로 활성인 소분자의 표적을 식별하기 위해 사용될 수 있다. "마이크로어레이"는 시각적 평가를 위한 현미경 검사를 필요로 하기 위해 소형화된 어레이를 특이적으로 나타낸다.

"CCP-음성(negative) 환자" 및 "CCP-음성 대상체"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이들 용어는 시트룰린화된 단백질에 대한 항체가 혈청에 함유되어 있지 않은(또는, 적어도 검출가능한 항체가 함유되어 있지 않은) 대상체를 나타낸다.

바람직한 특정 구현예들의 상세한 설명

전술한 바와 같이, 본 발명은 환자로부터 획득한 생물학적 샘플에서 RA-특이적 자가항체의 존재를 검출하는데 사용될 수 있는 바이오마커를 제공한다. 상기 바이오마커는 WIBG-단백질, TPM2-단백질, C17orf85-단백질, TCP10L-단백질, ZNF706-단백질, MGC17403-단백질, CCDC72-단백질, ELOF1-단백질 및 GABARAPL2-단백질로서, 이는 각각 그리고 특이적으로 RA 환자의 혈청에 존재하는 항-WIBG 자가항체, 항-TPM2 자가항체, 항-C17orf85 자가항체, 항-TCP10L 자가항체, 항-ZNF706 자가항체, 항-MGC17403 자가항체, 항-CCDC72 자가항체, 항-ELOF1 자가항체 및 항-GABARAPL2 자가항체와 반응한다.

본 발명의 진단 방법과 함께 사용될 수 있는 공지되어 있는 다른 바이오마커들은 PAD4-펩티드, BRAF-펩티드 및 칼파스타틴-펩티드이다(본원에 참조로 삽입되는 WO2010115745 참고)

또한, 본 발명은 RA의 진단에서 상기 바이오마커를 사용하는 방법을 제공한다.

I - 폴리펩티드/단백질 바이오마커

"WIBG-단백질"은 "within bgcn homolog (Drosophila)" 또는 "partner of Y14 and mago isoform 1"로 명명되고 본 실시예에서 P13으로 참조되는 단백질을 지칭한다. 상기 단백질의 서열은 NCBI 참조번호 NM_032345 또는 NP_115721로 찾을 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이 동정된 단백질 P13은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:

서열번호 1:

MEAAGSPAATETGKYIASTQRPDGTWRKQRRVKEGYVPQEEVPVYENKYVKFFKSKPELPPGLSPEATAPVTPSRPEGGEPGLSKTAKRNLKRKEKRRQQQEKGEAEALSRTLDKVSLEETAQLPSAPQGSRAAPTAASDQPDSAATTEKAKKIKNLKKKLRQVEELQQRIQAGEVSQPSKEQLEKLARRRALEEELEDLELGL

폭넓게 이해되도록, "WIBG"라는 용어는 단백질을 나타내고 또한 단백질의 유사체 및 단편을 나타낸다. "WIBG 단편"은 WIBG 단백질의 아미노산 서열 중 5개 이상의 아미노산 잔기(바람직하게는, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175 또는 200개 이상의 아미노산 잔기)의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 나타낸다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 WIBG 바이오마커의 단편은 펩티드 바이오마커의 아미노산 서열 중 5개 이상의 연속적인 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하며, 전(whole) 단백질이 아니다.

특정 구현예에서, WIBG 단편은 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13에서 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이러한 서열로 구성된 WIBG-단백질의 펩티드 단편이다.

"TPM2-단백질"은 "Tropomyosin 2 (Beta)"로 명명되고 본 실시예에서 P3으로 참조되는 단백질을 지칭한다. 상기 단백질의 서열은 NCBI 참조번호 NM_003289 또는 NP_003280으로 찾을 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이 동정된 단백질 P3은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:

서열번호 2:

MDAIKKKMQMLKLDKENAIDRAEQAEADKKQAEDRCKQLEEEQQALQKKLKGTEDEVEKYSESVKEAQEKLEQAEKKATDAEADVASLNRRIQLVEEELDRAQERLATALQKLEEAEKAADESERGMKVIENRAMKDEEKMELQEMQLKEAKHIAEDSDRKYEEVARKLVILEGELERSEERAEVAESKCGDLEEELKIVTNNLKSLEAQADKYSTKEDKYEEEIKLLEEKLKEAETRAEFAERSVAKLEKTIDDLEDEVYAQKMKYKAISEELDNALNDITSL

폭넓게 이해되도록, "TPM2"라는 용어는 단백질을 나타내고 또한 단백질의 유사체 및 단편을 나타낸다. "TPM2 단편"은 TPM2 단백질의 아미노산 서열 중 5개 이상의 아미노산 잔기(바람직하게는, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200 또는 250개 이상의 아미노산 잔기)의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 나타낸다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 TPM2 바이오마커의 단편은 펩티드 바이오마커의 아미노산 서열 중 5개 이상의 연속적인 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하며, 전 단백질이 아니다.

특정 구현예에서, TPM2 단편은 서열번호 14 및 서열번호 15에서 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이러한 서열로 구성된 TPM2-단백질의 펩티드 단편이다.

"C17orf85-단백질"은 "ELG PROTEIN isoform B" 또는 "chromosome 17 open reading frame 85"로 명명되고 본 실시예에서 P7로 참조되는 단백질을 지칭한다. 상기 단백질의 서열은 NCBI 참조번호 NM_018553 또는 NP_061023으로 찾을 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이 동정된 단백질 P7은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:

서열번호 3:

MKYGNPNYGGMKGILSNSWKRRYHSRRIQRDVIKKRALIGDDVGLTSYKHRHSGLVNVPEEPIEEEEEEEEEEEEEEEEDQDMDADDRVVVEYHEELPALKQPRERSASRRSSASSSDSDEMDYDLELKMISTPSPKKSMKMTMYADEVESQLKNIRNSMRADSVSSSNIKNRIGNKLPPEKFADVRHLLDEKRQHSRPRPPVSSTKSDIRQRLGKRPHSPEKAFSSNPVVRREPSSDVHSRLGVPRQDSKGLYADTREKKSGNLWTRLGSAPKTKEKNTKKVDHRAPGAEEDDSELQRAWGALIKEKEQSRQKKSRLDNLPSLQIEVSRESSSGSEAES

폭넓게 이해되도록, "C17orf85"라는 용어는 단백질을 나타내고 또한 단백질의 유사체 및 단편을 나타낸다. "C17orf85 단편"은 C17orf85 단백질의 아미노산 서열 중 5개 이상의 아미노산 잔기(바람직하게는, 약 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200 또는 250개 이상의 아미노산 잔기)의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 나타낸다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 C17orf85 바이오마커의 단편은 펩티드 바이오마커의 아미노산 서열 중 5개 이상의 연속적인 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하며, 전 단백질이 아니다.

"TCP10L-단백질"은 "T complex mouse like"로 명명되고 본 실시예에서 P9로 참조되는 단백질을 지칭한다. 상기 단백질의 서열은 NCBI 참조번호 NM_144659 또는 NP_653260으로 찾을 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이 동정된 단백질 P9는 하기의 아미노산 서열을 갖는다:

서열번호 4:

MLAGQLEARDPKEGTHPEDPCPGAGAVMEKTAVAAEVLTEDCNTGEMPPLQQQIIRLHQELGRQKSLWADVHGKLRSHIDALREQNMELREKLRALQLQRWKARKKSAASPHAGQESHTLALEPAFGKISPLSADEETIPKYAGHKNQSATLLGQRSSSNNSAPPKPMSLKIERISSWKTPPQENRDKNLSRRRQDRRATPTGRPTPCAERRGGV

폭넓게 이해되도록, "TCP10L"이라는 용어는 단백질을 나타내고 또한 단백질의 유사체 및 단편을 나타낸다. "TCP10L 단편"은 TCP10L 단백질의 아미노산 서열 중 5개 이상의 아미노산 잔기(바람직하게는, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175 또는 200개 이상의 아미노산 잔기)의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 나타낸다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 TCP10L 바이오마커의 단편은 펩티드 바이오마커의 아미노산 서열 중 5개 이상의 연속적인 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하며, 전 단백질이 아니다.

"ZNF706-단백질"은 "Zinc Finger Protein 706"으로 명명되고 본 실시예에서 P4로 참조되는 단백질을 지칭한다. 상기 단백질의 서열은 NCBI 참조번호 NM_016096 또는 NP_057180으로 찾을 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이 동정된 단백질 P4는 하기의 아미노산 서열을 갖는다:

서열번호 5:

MARGQQKIQSQQKNAKKQAGQKKKQGHDQKAAAKAALIYTCTVCRTQMPDPKTFKQHFESKHPKTPLPPELADVQA

폭넓게 이해되도록, "ZNF706"이라는 용어는 단백질을 나타내고 또한 단백질의 유사체 및 단편을 나타낸다. "ZNF706 단편"은 ZNF706 단백질의 아미노산 서열 중 5개 이상의 아미노산 잔기(바람직하게는, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60 또는 70개 이상의 아미노산 잔기)의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 나타낸다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 ZNF706 바이오마커의 단편은 펩티드 바이오마커의 아미노산 서열 중 5개 이상의 연속적인 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하며, 전 단백질이 아니다.

특정 구현예에서, ZNF706 단편은 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18에서 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이러한 서열로 구성된 ZNF706-단백질의 펩티드 단편이다.

"MGC17403-단백질"은 "hypothetical protein MGC17403" 또는 "Transcription elongation factor A (SII) N-terminal and central domain containing (TCEANC)"로 명명되고 본 실시예에서 P6으로 참조되는 단백질을 지칭한다. 상기 단백질의 서열은 NCBI 참조번호 NM_152634 또는 NP_689847로 찾을 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이 동정된 단백질 P6은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:

서열번호 6:

MSDKNQIAARASLIEQLMSKRNFEDLGNHLTELETIYVTKEHLQETDVVRAVYRVLKNCPSVALKKKAKCLLSKWKAVYKQTHSKARNSPKLFPVRGNKEENSGPSHDPSQNETLGICSSNSLSSQDVAKLSEMIVPENRAIQLKPKEEHFGDGDPESTGKRSSELLDPTTPMRTKCIELLYAALTSSSTDQPKADLWQNFAREIEEHVFTLYSKNIKKYKTCIRSKVANLKNPRNSHLQQNLLSGTTSPREFAEMTVMEMANKELKQLRASYTESCIQEHYLPQVIDGTQTNKIKCRRCEKYNCKVTVIDRGTLFLPSWVRNSNPDEQMMTYVICNECGEQWYHSKWVCW

폭넓게 이해되도록, "MGC17403"이라는 용어는 단백질을 나타내고 또한 단백질의 유사체 및 단편을 나타낸다. "MGC17403 단편"은 MGC17403 단백질의 아미노산 서열 중 5개 이상의 아미노산 잔기(바람직하게는, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175 또는 200개 이상의 아미노산 잔기)의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 나타낸다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 MGC17403 바이오마커의 단편은 펩티드 바이오마커의 아미노산 서열 중 5개 이상의 연속적인 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하며, 전 단백질이 아니다.

"CCDC72-단백질"은 "Coiled-Coil Domain Containing 72" 또는 "hypothetical protein HSPC016"으로 명명되고 본 실시예에서 P5로 참조되는 단백질을 지칭한다. 상기 단백질의 서열은 NCBI 참조번호 NM_015933 또는 NP_057017로 찾을 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이 동정된 단백질 P5는 하기의 아미노산 서열을 갖는다:

서열번호 7:

MSGREGGKKKPLKQPKKQAKEMDEEDKAFKQKQKEEQKKLEELKAKAAGKGPLATGGIKKSGKK

폭넓게 이해되도록, "CCDC72"라는 용어는 단백질을 나타내고 또한 단백질의 유사체 및 단편을 나타낸다. "CCDC72 단편"은 CCDC72 단백질의 아미노산 서열 중 5개 이상의 아미노산 잔기(바람직하게는, 약 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는 60개 이상의 아미노산 잔기)의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 나타낸다. 본 발명의 바람직한 특정 구현예에서, 본 발명의 CCDC72 바이오마커의 단편은 펩티드 바이오마커의 아미노산 서열 중 5개 이상의 연속적인 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하며, 전 단백질이 아니다.

"ELOF1-단백질"은 "Elongation Factor 1 Homolog (S. Cerevisiae)"로 명명되고 본 실시예에서 P10으로 참조되는 단백질을 지칭한다. 상기 단백질의 서열은 NCBI 참조번호 NM_032377 또는 NP_115753으로 찾을 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이 동정된 단백질 P10은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:

서열번호 8:

MGRRKSKRKPPPKKKMTGTLETQFTCPFCNHEKSCDVKMDRARNTGVISCTVCLEEFQTPITYLSEPVDVYSDWIDACEAANQ

폭넓게 이해되도록, "ELOF1"이라는 용어는 단백질을 나타내고 또한 단백질의 유사체 및 단편을 나타낸다. "ELOF1 단편"은 ELOF1 단백질의 아미노산 서열 중 5개 이상의 아미노산 잔기(바람직하게는, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는 60개 이상의 아미노산 잔기)의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 나타낸다. 본 발명의 바람직한 특정 구현예에서, 본 발명의 ELOF1 바이오마커의 단편은 펩티드 바이오마커의 아미노산 서열 중 5개 이상의 연속적인 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하며, 전 단백질이 아니다.

"GABARAPL2-단백질"은 "GABA(A) receptor-associated protein-like 2"로 명명되고 본 실시예에서 P23으로 참조되는 단백질을 지칭한다. 상기 단백질의 서열은 NCBI 참조번호 NM_007285.5 또는 NP_009216.1로 찾을 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이 동정된 단백질 P23은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:

서열번호 9:

MKWMFKEDHSLEHRCVESAKIRAKYPDRVPVIVEKVSGSQIVDIDKRKYLVPSDITVAQFMWIIRKRIQLPSEKAIFLFVDKTVPQSSLTMGQLYEKEKDEDGFLYVAYSGENTFGF

폭넓게 이해되도록, "GABARAPL2"라는 용어는 단백질을 나타내고 또한 단백질의 유사체 및 단편을 나타낸다. "GABARAPL2 단편"은 GABARAPL2 단백질의 아미노산 서열 중 5개 이상의 아미노산 잔기(바람직하게는, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 110개 이상의 아미노산 잔기)의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 나타낸다. 본 발명의 바람직한 특정 구현예에서, 본 발명의 GABARAPL2 바이오마커의 단편은 펩티드 바이오마커의 아미노산 서열 중 5개 이상의 연속적인 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하며, 전 단백질이 아니다.

특정 구현예에서, GABARAPL2 단편은 서열번호 19 및 서열번호 20에서 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이러한 서열로 구성된 GABARAPL2-단백질의 펩티드 단편이다.

펩티드 바이오마커의 제조

본 발명의 폴리펩티드/단백질 바이오마커는 재조합 방법을 비롯하여 임의의 적절한 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법들은 예를 들어 "The Proteins"(Vol. II, 3rd Ed., H. Neurath et al. (Eds.), 1976, Academic Press: New York, NY, pp. 105-237)에 개시되어 있으며, 이는 본 발명의 바이오마커를 합성하는데 사용될 수도 있다.

특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드/단백질 바이오마커는 고형 담체 또는 지지체(예컨대, 비드 또는 어레이)상에 고정되어 제공된다. 폴리펩티드 분자를 고형 표면상에 고정시키기 위한 방법들은 당업계에 알려져 있다. 폴리펩티드/단백질은 고형 담체 또는 지지체의 표면에 공유적으로 또는 수동적으로 결합됨으로써 고정될 수 있다. 적합한 담체 또는 지지체 물질의 예에는 아가로스, 셀룰로스, 니트로셀룰로스, 덱스트란, 세파덱스, 세파로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드, 폴리프로필렌, 여과지, 마그네타이트, 이온교환 수지, 유리, 폴리아민-메틸-비닐-에테르-말레산 코폴리머, 아미노산 코폴리머, 에틸렌-말레산 코폴리머, 나일론, 실크 등이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 고형 담체 또는 지지체의 표면상에 폴리펩티드/단백질 바이오마커의 고정화는 당업계에 잘 알려져 있는 방법들을 이용하여 가교결합, 공유결합 또는 물리적 흡착을 포함할 수 있다. 고형 담체 또는 지지체는 비드, 입자, 마이크로플레이트 웰, 어레이, 큐벳, 튜브, 막, 또는 본 발명에 따른 진단 방법을 수행하는데(예컨대, 면역검정법을 이용하는데) 적합한 임의의 다른 형태일 수 있다.

특히, 본 발명은 그 표면에 고정된 본 발명의 하나 이상의 펩티드 바이오마커를 포함하는 RA 진단용 어레이 또는 단백질 어레이를 제공한다. 바람직하게는, 상기 어레이는 본 발명의 폴리펩티드/단백질 바이오마커를 1개보다 많이 포함한다. 상기 어레이는 하나 이상의 부가적 RA 바이오마커를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 RA 바이오마커에는 항핵 항체 및/또는 CCP 항체의 존재를 검출할 수 있도록 하는 바이오마커가 포함된다.

또한, 본 발명은 RA 진단용 단백질 비드 서스펜션 어레이를 제공한다. 상기 비드 서스펜션 어레이는 하나 이상의 식별가능한 별개의 입자들 또는 비드들의 서스펜션을 포함하며, 여기서 각각의 비드는 크기, 색 또는 형광 시그니처와 관련되는 암호화 특징들을 가지며, 각각의 비드는 본 발명의 폴리펩티드/단백질 바이오마커로 코팅된다. 비드 서스펜션 어레이의 예에는 thexMAP® 비드 서스펜션 어레이(Luminex Corporation)가 포함된다.

II - 진단 방법

전술한 바와 같이, 본원에 개시된 바이오마커는 초기 단계의 RA 환자의 혈청에 의해 특이적으로 인식되며, 특정 구현예에서는 CCP-음성 RA 환자의 혈청에 의해 특이적으로 인식된다.

따라서, 본 발명은 대상체의 RA 진단 방법을 제공한다. 이러한 방법은 바이오마커-항체 복합체가 형성될 수 있는 시간 및 조건 하에서, 시험되는 대상체에서 획득한 생물학적 샘플을 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 9개의 바이오마커와 접촉시키는 단계; 및 상기 형성된 바이오마커-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함한다.

상기 바이오마커는 WIBG, TPM2, C17orf85, TCP10L, ZNF706, MGC17403, CCDC72, ELOF1 및 GABARAPL2로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

또한, 본 발명은 대상체의 RA 진단 방법을 제공한다. 이러한 방법은 바이오마커-항체 복합체가 형성될 수 있는 시간 및 조건 하에서, 시험되는 대상체에서 획득한 생물학적 샘플을 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 9개의 바이오마커와 접촉시키는 단계; 및 상기 형성된 임의의 바이오마커-항체를 검출하는 단계를 포함한다. 상기 바이오마커는 WIBG, TPM2, C17orf85, TCP10L, ZNF706, MGC17403, CCDC72, ELOF1 및 GABARAPL2로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

상기 방법에서, 바이오마커-항체 복합체의 검출은 대상체에서 초기 RA의 지표가 된다.

또다른 구현예에서, 3개보다 많은 바이오마커, 예를 들어 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 9개의 바이오마커가 조합되어 사용된다. 바람직한 구현예에서, 바이오마커들의 조합은 적어도 WIBG, TPM2, C17orf85, TCP10L을 포함한다.

바람직한 특정 구현예에서, 9개의 바이오마커, 즉 WIBG, TPM2, C17orf85, TCP10L, ZNF706, MGC17403, CCDC72, ELOF1 및 GABARAPL2가 사용된다.

또다른 바람직한 구현예에서, 4개의 바이오마커, 즉 WIBG, TPM2, ZNF706 및 GABARAPL2가 사용된다.

생물학적 샘플

본 발명의 진단 방법은 하나 이상의 바이오마커가 검정될 수 있는 임의 유형의 생물학적 샘플에 대해 적용될 수 있다. 적합한 생물학적 샘플의 예에는 전혈, 혈청, 혈장, 타액 및 활액이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명을 실시할 때 사용되는 생물학적 샘플은 대상체로부터 수집된 신선한 샘플 또는 동결 샘플일 수 있으며, 진단, 치료 및/또는 결과 이력이 알려져 있는 기록 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플은 임의의 비침습적 수단에 의해 수집될 수 있으며, 예를 들어 대상체로부터 혈액을 뽑거나 미세바늘 흡인 또는 바늘 생검을 사용하여 수집될 수 있다. 특정 구현예에서, 생물학적 샘플은 혈청학적 샘플이고, 전혈, 혈청, 혈장으로 이루어진 군에서 선택된다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 샘플의 가공이 이루어지지 않거나 또는 샘플의 가공이 제한적으로 이루어진 생물학적 샘플 그 자체에 대해 수행된다.

그러나, 선택적으로, 본 발명의 방법은 생물학적 샘플로부터 제조된 단백질 추출물에 대해 수행될 수 있다. 이 경우, 단백질 추출물은 바람직하게는 전체 단백질 내용물을 함유한다. 단백질 추출 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, "Protein Methods", D.M. Bollag et al., 2nd Ed., 1996, Wiley-Liss; "Protein Purification Methods: A Practical Approach", E.L. Harris and S. Angal (Eds.), 1989; "Protein Purification Techniques: A Practical Approach", S. Roe, 2nd Ed., 2001, Oxford University Press; "Principles and Reactions of Protein Extraction, Purification, and Characterization", H. Ahmed, 2005, CRC Press: Boca Raton, FL 참고). 다양한 키트들이 체액 및 조직으로부터 단백질을 추출하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 키트는 예를 들어 BioRad Laboratories(Hercules, CA), BD Biosciences Clontech(Mountain View, CA), Chemicon International, Inc.(Temecula, CA), Calbiochem(San Diego, CA), Pierce Biotechnology(Rockford, IL) 및 Invitrogen Corp.(Carlsbad, CA)에서 시판된다. 제안되는 프로토콜이 상세하게 기재되어 있는 사용자 가이드는 상기 모든 키트들에 포함되는 것이 일반적이다. 민감성, 가공 시간 및 비용은 키트마다 다를 수 있다. 당업계의 통상의 기술자라면 특정 상황에 대해 가장 적합한 키트(들)를 용이하게 선택할 수 있다.

바이오마커-항체 복합체의 검출

본 발명의 진단 방법은 시험대상인 생물학적 샘플에 존재하는 자가항체와 단백질 바이오마커 사이에 형성되는 바이오마커-항원 복합체의 검출을 포함한다. 본 발명을 실시함에 있어서, 상기 복합체의 검출은 임의의 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다(예를 들어, E. Harlow and A. Lane, "Antibodies: A Laboratories Manual", 1988, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY 참고).

예를 들어, 바이오마커-항체 복합체의 검출은 면역검정을 이용하여 수행될 수 있다. 광범위한 면역검정 기법들이 이용가능하며, 여기에는 방사성 면역검정, 효소 면역검정(EIA), 효소-결합 면역흡착검정(ELISA) 및 면역형광 면역침강이 포함된다. 면역검정은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검정을 수행하기 위한 방법들 뿐만 아니라 실제 적용들과 절차들이 텍스트북에 요약되어 있다. 상기 텍스트북의 예에는 [P. Tijssen, In: Practice and theory of enzyme immunoassays, eds. R.H. Burdon and v. P.H. Knippenberg, Elsevier, Amsterdam (1990), pp. 221-278] 및 면역학적 검출 방법들을 다루고 있는 다양한 볼륨의 [Methods in Enzymology, Eds. S.P. Colowick et al., Academic Press], 특히 볼륨 70, 73, 74, 84, 92 및 121이 포함된다. 면역검정은 경쟁적일 수도 있고 비경쟁적일 수도 있다.

예를 들어, 샌드위치 검정 기법의 다수의 변형된 임의 형태들이 면역검정을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 요약하면, 전형적인 샌드위치 검정을 예를 들어 본 발명에 따른 항-WIBG 자가항체의 검출에 적용함에 있어서, 표지되지 않은 WIBG-단백질/폴리펩티드 바이오마커가 (전술한 바와 같은) 고형 표면상에 고정되고, 시험대상인 생물학적 샘플이 상기 결합된 바이오마커와 바이오마커-항체 복합체를 형성할 수 있는 시간 및 조건 하에서 접촉하게 된다. 인큐베이션 이후에, 검출가능 모이어티에 의해 표지되고 시험대상인 종의 항체를 특이적으로 인식하는 항체(예컨대, 인간 대상체에 대해 항-인간 IgG)가 첨가되고, 임의의 바이오마커-결합된 자가항체와 상기 표지된 항체 사이에 삼원(ternary) 복합체를 형성할 수 있는 조건 하에서 배양된다. 결합되지 않은 임의의 물질은 세척되고, 샘플내 임의의 항-WIBG 자가항체의 존재는 검출가능 모이어티에 의해 직접적 또는 간접적으로 발생하는 신호의 관찰/검출에 의해 측정된다. 이러한 검정법에 대한 변형에는, 생물학적 샘플 및 표지된 항체가 고정된 WIBG-단백질/폴리펩티드 바이오마커에 동시에 첨가되는 검정법이 포함된다.

제2항체(즉, 전술한 바와 같이 샌드위치 검정에서 첨가되는 항체)는 임의의 검출가능 모이어티에 의해, 즉 화학성질에 따라 삼원 복합체를 검출할 수 있고 결과적으로 바이오마커-항체 복합체를 검출할 수 있는 분석적으로 식별가능한 신호를 제공하는 임의의 엔티티에 의해, 표지될 수 있다.

검출은 정성적이거나 정량적일 수 있다. 항체와 같은 생물학적 분자를 표지하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, "Affinity Techniques. Enzyme Purification: Part B", Methods in Enzymol., 1974, Vol. 34, W.B. Jakoby and M. Wilneck (Eds.), Academic Press: New York, NY; 및 M. Wilchek and E.A. Bayer, Anal. Biochem., 1988, 171: 1-32 참고).

면역검정법에서 가장 흔하게 사용되는 검출가능 모이어티는 효소 및 형광단(fluorophore)이다. 효소 면역검정(EIA 또는 ELISA)의 경우, 호스라디쉬 페록시다아제, 글루코스 옥시다아제, 베타-갈락토시다아제, 알칼린 포스파타아제 등과 같은 효소가 일반적으로 글루타르알데히드 또는 과요오드산염에 의해 제2항체에 컨쥬게이션된다. 특이적 효소와 함께 사용되는 기질은, 상응하는 효소의 가수분해에 따라 검출가능한 색변화의 발생을 위해 선택되는 것이 일반적이다. 면역형광의 경우, 제2항체는 결합 능력을 변경시키지 않고 형광 모이어티에 화학적으로 커플링된다. 형광 표지된 항체를 바이오마커-항체 복합체에 결합시키고, 결합되지 않은 임의의 물질을 제거한 후에, 형광 모이어티에 의해 발생한 형광 신호가 검출되고, 선택적으로 정량화된다. 선택적으로, 제2항체는 방사성동위원소, 화학발광 모이어티 또는 생물발광 모이어티에 의해 표지될 수 있다.

RA 진단

본 발명의 방법에서, 바이오마커-항체 복합체의 검출은 시험대상인 생물학적 샘플에서 WIBG 자가항체, TPM2 자가항체, C17orf85 자가항체, TCP10L 자가항체, ZNF706 자가항체, MGC17403 자가항체, CCDC72 자가항체, ELOF1 자가항체 및 GABARAPL2 자가항체의 지표가 되며, 이에 따라 생물학적 샘플이 획득된 대상체에서 RA의 지표가 된다. 따라서, 본 발명의 방법은 환자에게서 RA를 진단하기 위해 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 방법은 RA를 갖는 것으로 의심되는 대상체를 시험하기 위해 사용될 수 있다.

단지 본 발명에 따라 제공되는 방법에 의해 얻은 결과만에 기초하여 RA의 진단이 수행될 수 있다는 것을 당업계의 통상의 기술자라면 이해할 것이다. 선택적으로, 의사는 RA를 진단하는 기존의 방법들에서 이용되는 다른 임상적 또는 병리학적 파라미터들을 고려할 수도 있다. 따라서, 본 발명의 방법을 이용하여 얻은 결과는 RA를 진단하기 위해 수행되는 다른 시험들, 검정법들 또는 절차들에서 얻은 결과들과 비교되거나 및/또는 조합될 수 있다. 상기 비교 및/또는 조합은 더 정교한 진단을 제공하도록 도울 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 RA 진단 방법은 ARA 기준(즉, [D. Aletaha1 et al., Arthritis Rheum., 9 September 2010, Vol 62: 2569-2581: Table 3 참고]에 개시되어 있는 "2010 American College of Rheumatology/European League against Rheumatism classification criteria of RA")과 조합되어 사용될 수 있다.

선택적으로 또는 부가적으로, 본 발명의 RA 진단 방법에서 얻은 결과는 다른 RA 바이오마커를 이용하는 하나 이상의 검정법의 결과와 조합되어 사용될 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, RA의 진단은 본 발명에 따른 방법의 결과 및 다른 RA 바이오마커를 사용하는 하나 이상의 부가적 검정법의 결과에 기초할 수 있다. 예를 들어, RA 바이오마커의 패널은 예컨대 칩 또는 비드-기초 어레이 기법을 이용하여 개별적으로 또는 동시에 시험될 수 있다.

적합한 RA 바이오마커의 예에는 CCP, C-반응성 단백질, 혈청 아밀로이드 A, 인터루킨 6(IL6), S100 단백질, 오스테오폰틴, 류마티스 인자, 매트릭스 메탈로프로테아제 1(MMP-1), 매트릭스 메탈로프로테아제 3(MMP-3), 히알루론산, sCD14, 혈관형성 마커(예컨대, 혈관내피성장인자 또는 VEGF), 및 골, 연골 또는 활막 대사 산물(예컨대, 피리디놀린 또는 이의 글리코실화 형태; 데옥시-피리디놀린; 가교결합된 텔로펩티드; 콜라겐 네오에피토프; CS846; 연골 올리고머 매트릭스 단백질; 연골 중간층 단백질; 마트릴린, 콘드로모듈린, 오스테오칼신 등)이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 CCP-음성 환자에게서 RA의 진단을 위해 사용된다. 실제로, 본 발명의 실시예 섹션에 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 9개의 단백질 바이오마커(WIBG-단백질, TPM2-단백질, C17orf85-단백질, TCP10L-단백질, ZNF706-단백질, MGC17403-단백질, CCDC72-단백질, ELOF1-단백질 및 GABARAPL2-단백질) 중 하나 이상을 사용하는 본 발명의 방법에 의해 CCP-음성 대상체의 60% 이상에서 RA가 진단되었음을 보여주었다(항 CCP 음성 RA 환자들의 3/5가 하나 이상의 동정된 단백질에 대해 양성이었음).

III - 키트

또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 진단 방법을 수행하는데 유용한 물질을 포함하는 키트를 제공한다. 본원에서 제공되는 진단 과정들은 진단 연구소, 실험 연구소 또는 의사에 의해 수행될 수 있다. 본 발명은 이와 같이 다양한 세팅에 사용될 수 있는 키트를 제공한다.

생물학적 샘플에서 WIBG 자가항체, TPM2 자가항체, C17orf85 자가항체, TCP10L 자가항체, ZNF706 자가항체, MGC17403 자가항체, CCDC72 자가항체, ELOF1 자가항체 및 GABARAPL2 자가항체 또는 이들의 임의의 조합을 검출하기 위한 물질 및 시약, 및/또는 본 발명에 따른 대상체에서 RA, 특히 초기 RA를 진단하기 위한 물질 및 시약이 키트 내에 함께 어셈블리될 수 있다. 본 발명의 각각의 키트는 본 발명에 따른 하나 이상의 단백질/폴리펩티드 바이오마커를, 바람직하게는 생물학적 샘플에서 자가항체를 검출하는데 적합한 양으로, 포함한다.

따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 키트는 WIBG, TPM2, C17orf85, TCP10L, ZNF706, MGC17403, CCDC72, ELOF1 및 GABARAPL2로 이루어진 군에서 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 9개의 바이오마커를 포함한다.

또다른 구현예에서, 본 발명의 키트는 WIBG, TPM2, C17orf85, TCP10L, ZNF706, MGC17403, CCDC72, ELOF1 및 GABARAPL2로 이루어진 군에서 선택되는 4개 이상의 바이오마커, 예컨대 5개, 7개, 8개 또는 9개 바이오마커를 포함한다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 키트는 적어도 WIBG, TPM2, C17orf85, TCP10L을 포함한다.

또다른 바람직한 구현예에서, 상기 키트는 적어도 9개의 바이오마커, 즉 WIBG, TPM2, C17orf85, TCP10L, ZNF706, MGC17403, CCDC72, ELOF1 및 GABARAPL2를 포함한다.

또다른 바람직한 구현예에서, 상기 키트는 4개의 바이오마커, 즉 WIBG, TPM2, ZNF706 및 GABARAPL2를 포함한다.

키트에 포함되는 펩티드 바이오마커(들)는 기질 표면(예컨대, 비드, 어레이 등)상에 고정될 수도 있고 고정되지 않을 수도 있다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명의 키트는 본원에서 제공되는 것과 같은 RA 진단용 어레이를 포함한다. 선택적으로, 기질 표면이 펩티드 바이오마커를 고정시키기 위해 본 발명의 키트에 포함될 수 있다.

또한, 일반적으로 본 발명의 키트는 생물학적 샘플에 존재하는 자가항체와 키트에 포함된 펩티드 바이오마커 사이에 형성된 바이오마커-항체 복합체를 검출하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 이러한 시약은 예를 들어 전술한 바와 같이 시험대상인 종의 항체를 특이적으로 인식하는 표지된 항체(예컨대, 인간 대상체에 대해 항-인간 IgG)일 수 있다.

과정에 의존하여, 키트는 추출 완충제 및/또는 시약, 차단 완충제 및/또는 시약, 면역검출 완충제 및/또는 시약, 표지 완충제 및/또는 시약, 및 검출 수단 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 과정의 다양한 단계들을 실시하기 위한 상기 완충제 및 시약을 사용하는 프로토콜이 키트에 포함될 수 있다.

본 발명의 키트에 포함되는 다양한 시약들은 고체(예컨대, 동결건조) 또는 액체 형태로 공급될 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 각각의 개별적인 완충제 및/또는 시약에 대해 다른 용기(예컨대, 바이알, 앰플, 시험튜브, 플라스크 또는 병)를 포함할 수 있다. 일반적으로, 각 성분은 각각의 용기에 분취될 때 또는 농축된 형태로 제공될 때 적합할 것이다. 본 발명의 방법의 특정 단계들을 실시하는데 적합한 다른 용기들이 또한 제공될 수 있다. 키트의 개별 용기들은 바람직하게는 상업적 판매를 위해 단단히 밀봉된 상태로 유지된다.

특정 구현예에서, 키트는 본 발명의 방법에 따른 대상체에서 RA, 특히 초기 RA를 진단하는데 키트의 성분들을 사용하기 위한 지시문(instruction)을 포함한다. 본 발명의 방법에 따른 키트를 사용하기 위한 지시문에는, 대상체에서 획득한 생물학적 샘플을 처리하거나 및/또는 시험을 수행하기 위한 지시문, 및/또는 결과를 해석하기 위한 지시문이 포함될 수 있다. 또한, 키트는 의약 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 처방된 형태의 고지문을 포함할 수 있다.

본 발명은 하기의 실시예에서 추가로 설명될 것이다. 다만, 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 방식으로 해석되어서는 안 된다.

하기의 실시예들은 본 발명을 구성하고 실시하는 바람직한 예의 일부를 기재한 것이다. 그러나, 실시예들은 예시적인 목적으로만 제공된 것이고 본 발명의 범위를 한정하려는 의도가 아니라는 점이 이해되어야 한다. 또한, 실시예의 기재가 과거형으로 나타내지 않는다면, 본 명세서의 나머지 부분처럼 이는 실험이 실제로 수행되었다거나 데이터가 실제로 획득되었다는 것을 나타내기 위한 것이 아니다.

실시예 1: 초기 RA의 지표인 9개의 자가항원의 동정

도입부

RA에서 새로운 자가항체들을 동정하기 위하여, 본 발명자들은 질병 기간이 1년 이하인 20명의 RA 환자, 질병 기간이 5년 이상인 19명의 RA 환자, 및 23명의 대조군으로부터 혈청을 선택하고, 8000개의 인간 단백질 어레이들을 스크리닝하였다. 질병 기간이 1년 이하인 RA 환자와 연관되는 24개의 "새로운 자가항원"이 동정되었다. 단백질 어레이 검출의 유효성을 확인하기 위해, 본 발명자들은 ELISA 검정법에서 동일한 단백질을 사용하였다. 초기 RA 환자와 연관되는 24개의 단백질 중에서, 본 발명자들은 초기 RA 환자에게서 자가항체에 의해 우선적으로 인식된 9개의 단백질을 입증하였다. 실제로, 이러한 단백질들은 질병 기간이 1년 이하인 RA 환자의 21% 내지 47%와 대조군의 5% 이하에 의해 인식되었다.

환자 및 방법

단백질 어레이를 위한 RA 환자의 혈청. 본 발명자들은 마르세유에 위치한 La Conception 병원에서 류마티스 병동에 있는 39명의 RA 환자들을 연구하였다. 20명의 RA 환자는 질병 기간이 1년 이하였으며, 19명의 RA 환자는 질병 기간이 5년 이상이었다. 모든 RA 환자들은 [American College of Rheumatology 1987] 수정된 기준을 충족시켰다. 본 연구를 위해 윤리 승인이 얻어졌다(DC2008-327). 모든 참가자들은 고지에 입각한 동의를 하였다.

단백질 어레이를 위한 대조군의 혈청. 대조군은 마르세유에 위치한 La Conception 병원에서 류마티스 병동에 있는 7명의 척추관절증(AS) 환자 및 2명의 전신성 홍반성 루프스(SLE) 환자, 국가적 코호트(파리의 Cochin, Saint Antoine, Saint Louis 병원들, 릴의 Claude Huriez 병원, 및 마르세유의 La Conception 병원)의 4명의 전신성 경화증(SSc) 환자로 구성되었다. 10명의 건강한 대조군은 연구소 직원 자원자들 중에서 모집되었으며, 자원자의 골수가 사용되었다. 모든 참가자들은 고지에 입각한 동의를 하였다.

인간 단백질 어레이. 본 발명자들은 Invitrogen사의 "ProtoArray"를 사용하였다. 상기 인간 단백질 마이크로어레이는 8268개의 인간 단백질들을 함유하고 있다. 2%는 프로테아제 또는 펩티다아제이고, 2%는 분비 단백질이고, 3%는 전사인자이고, 3%는 세포 사멸에 관여하는 것이고, 11%는 신호 전달에 관여하는 것이고, 13%는 세포 통신에 관여하는 것이고, 5%는 단백질 키나아제이고, 13%는 핵 단백질이고, 17%는 막 단백질이고, 31%는 대사에 관여하는 것이다(Protein Content list 4.0에서 얻은 데이터).

모든 단백질들은 GST 융합 단백질로서 발현되었으며, 천연 조건하에서 정제되었으며, 니트로셀룰로스-코팅된 유리 슬라이드상에 2번 스폿팅되었다. 인간 단백질 수집은 human Ultimate ORF Clone Collection으로부터 유래되었다(http://orf.invitrogen.com에서 얻은 데이터). 각각의 클론은 GenBank에서 서열-체크되었다. 인간 단백질 수집을 생성하기 위해 사용된 모든 클론들은 Gateway® 벡터 내에 클로닝된 인간 ORF를 함유하였다. 관심대상인 단백질은 바큘로바이러스 발현 시스템을 이용하여 N-말단 GST-융합 단백질로서 발현되었다. 각각의 클론이 예상되는 분자량의 단백질을 발현한다는 것을 웨스턴 블롯팅에 의해 입증한 후에, 단백질들은 발현되고, 정제되고, 니트로셀룰로스-코팅된 유리 슬라이드상에 스폿팅되었다.

단백질 어레이에 대한 혈청 프로파일링 검정. 슬라이드는 1% BSA/PBST에 의해 차단(block)되었다. 혈청 샘플이 어레이에 첨가되었다. 세척한 후에, Alexa Fluor® 647 염료에 컨쥬게이션된 항-인간 IgG가 첨가되었다. 어레이는 세척되고 건조되었다(Partnership, Evry, FRANCE).

데이터 획득/분석. 어레이는 GenePix® 4000B Fluorescent Scanner에 의해 스캐닝되었다. 데이터는 GenePix® Pro 소프트웨어에 의해 획득되었으며, ProtoArray™ Prospector 2.0을 이용하여 처리되었다.

데이터 분석. 동정된 자가항원들의 질을 평가하기 위해, Z-Score, CIP 값(Chebyshev's Inequality Precision 값) 및 CV(2회 스폿팅 사이의 변동계수)를 포함한 값들의 패널이 각각의 단백질 어레이에 대해 산출되었다. Z-Score는 특정 스폿에 대한 신호 값 - 어레이상의 모든 인간 단백질들의 평균 신호 값 / 어레이상의 모든 인간 단백질들의 신호 값의 표준편차이다. CIP 값은 모든 음성 대조군 스폿에 대해 상대적으로 특정 스폿에 대한 신호 세기를 평가하고, 관찰된 신호가 음성 대조군 분포에서 발생할 수 있는 확률을 산출한다. CIP 값이 더 낮을수록, 신호가 임의 사건(random event)에 기인한 것이 아니라는 확률이 더 높다. CV는 복제본(duplicates) 사이의 유사도를 평가한다. CV가 더 낮을수록, 복제본 사이의 유사도는 더 높다. Z-Score > 3.0, CIP 값 < 0.05 및 CV < 0.5는 양성 스폿을 규정한다.

ELISA를 위한 RA 환자 및 대조군. RA 환자들은 프랑스의 마르세유에 위치한 La Conception 병원의 류마티스 병동과 프랑스의 브장송에 위치한 Jean Minjoz 병원의 류마티스 병동에서 선택되었다. 이들 환자는 RA에 대한 [1987 American College of Rheumatology] 수정된 기준을 충족시켰다. 초기 RA의 90%는 항 CCP 양성이었다. 척추관절증(AS) 및 건선 관절염(PsA) 환자들은 프랑스의 마르세유에 위치한 La Conception 병원의 류마티스 병동에서 선택되었다. 연구소 직원과 마르세유의 Blood Transfusion Center 직원 중 자원자들이 정상 대조군으로 제공되었다. 본 연구를 위해 윤리 승인이 얻어졌다(DC2008-327). 모든 참가자들은 고지에 입각한 동의를 하였다.

ELISA에 의한 자가항체의 검출. pH 7.4, 인산완충식염수(PBS)에서 희석된 각각의 정제된 단백질에 의해 플레이트가 밤새 코팅되었다. 플레이트는 5% 유(milk) 함유 PBS에 의해 차단되었다. PBS 중 1:100으로 희석된 혈청은 3시간 동안 인큐베이션되었다. 0.1% Tween 20으로 세척한 후에, 페록시다아제 컨쥬게이션된 항 인간 IgG(Sigma, 프랑스)가 첨가되었다. 광밀도는 405nm에서 판독되었다. 백그라운드 OD는 단백질 없이 웰에 각 혈청을 첨가함으로써 획득되었다. 양성 혈청은 백그라운드 OD의 2배 이상인 OD 값에 의해 규정되었다.

통계학적 분석. p-값은 Chi squareTest를 이용하여 계산되었다.

결과

초기 RA 환자와 연관되는 자가항체 패턴. 질병 기간이 1년 이하인 RA 환자의 20개 혈청이 선택되었으며, 단백질 어레이상에서 이들의 반응성 패턴이 비교되었다. 질병 기간이 5년 이상인 RA 환자의 19개 혈청과 대조 그룹의 23개 혈청은 이미 스크리닝되었다(Auger et al., Annals of Rheumatic Diseases, 2009, 68:591-594). 대조 그룹은 7명의 척추관절증(AS) 환자, 2명의 루프스(SLE) 환자, 4명의 전신성 경화증(SSc) 환자 및 10명의 건강한 대조군으로 구성되었다. 각각의 단백질에 결합된 자가항체의 존재는 항 인간 IgG 항체에 의해 검출되었다.

질병 기간이 5년 이상인 RA 환자와 대조군 각각에 의해 인식되는 단백질의 수는 매우 비슷하였다. 평균적으로, RA 혈청은 101개의 단백질을 결합하고, AS 혈청은 112개의 단백질을 결합하고, SLE 혈청은 91개의 단백질을 결합하고, SSc 혈청은 103개의 단백질을 결합하고, 건강한 대조군 혈청은 89개의 단백질을 결합하였다.

반면, 질병 기간이 1년 이하인 RA 혈청은 58개의 단백질을 결합하였다. 이들 단백질들 중에서, 초기 RA와 연관되는 24개의 단백질(P1 내지 P24)이 동정되었다. 이들 단백질들은 질병 기간이 1년 이하인 RA 환자의 30% 내지 60%에 의해 인식되었으며, 대조군의 10% 이하에 의해 인식되었다(표 1). 오직 P2, P4, P9, P10, P13, P15, P20만 질병 기간이 5년 이상인 RA 환자에 의해 또한 인식되었다.

초기 RA와 연관되는 특이적 자가항체의 동정. 단백질 어레이 검출의 유효성을 확인하기 위하여, 동일한 24개의 단백질들이 ELISA 검정법에서 사용되었다. 질병 기간이 1년 이하인 RA 환자 47명, 질병 기간이 5년 이상인 RA 환자 25명, AS 환자 66명, PsA 환자 21명 및 건강한 대조군 38명의 혈청들이 시험되었다.

P11, P16, P12, P1, P15, P8, P22, P24, P14, P18, P2, P21, P20, P17 및 P19가 초기 RA에 대해 덜 특이적이었으며, 대조군의 5% 내지 15%가 이들 단백질들에 대해 양성이었다.

표 1: 단백질 어레이 분석

본 발명자들은 P13, P3, P7, P9, P4, P6, P5, P10 및 P23이 초기 RA에 대해 더 특이적이었음을 확인하였다. 이들 단백질들은 질병 기간이 1년 이하인 RA 환자의 21 내지 47%에 의해 인식되었으며, 대조군의 5% 이하에 의해 인식되었다(표 2).

표 2: 자가항원의 확인

흥미롭게도, P13에 대해 자가항체는 초기 RA에서 매우 특이적이었다. 실제로, RA 환자의 47%의 혈청이 P13을 인식한 반면, AS 환자의 0%(p<10^-7), PsA 환자의 0%(p=0.0001) 및 건강한 개체의 0%(p<10^-5)가 P13을 인식하였다.

초기 RA 환자의 70%는 하나 이상의 단백질에 대해 혈청반응 양성이었다(표 3). 마지막으로, 항 CCP 음성 RA 환자의 3/5이 하나 이상의 동정된 단백질에 대해 양성이었다(표 3). 이들 자가항체는 RA 진단에 대해 잠재적인 부가가치를 가졌다.

결론

본 연구에서, 본 발명자들은 초기 RA와 연관되는 9개의 새로운 자가항체의 동정을 개시한다. 이들 자가항체의 민감성은 21% 내지 47%였으며, 특이성은 95% 내지 100%였다. 이들 단백질들은 RA 환자의 초기 진단을 가능하게 한다.

표 3: 초기 RA와 연관되는 자가항체 패턴

실시예 2: 초기 RA의 지표인 4개의 자가항원의 동정

환자 및 방법

실시예 1 참고.

단백질 어레이에 대한 혈청 프로파일링 검정. 단백질 어레이는 Partnerchip(Evry, 프랑스)에서 처리되었다. 요약하면, 슬라이드는 1% BSA(소 혈청 알부민) 함유 인산완충식염수(PBS)에 의해 차단(block)되었다. PBS 중 1:500으로 희석된 혈청 샘플이 어레이에 첨가되었다. 세척한 후에, Alexa Fluor® 647 염료에 컨쥬게이션된 항-인간 IgG가 첨가되었다. 어레이는 GenePix® 4000B Fluorescent Scanner에 의해 스캐닝되었다. 데이터는 GenePix® Pro 소프트웨어에 의해 획득되었으며, ProtoArray™ Prospector 2.0(Invitrogen, Carlsbad, California, USA)을 이용하여 처리되었다.

결과

RA 환자 및 대조군과 연관되는 자가항체 패턴. 본 발명자들은 질병 기간이 1년 이하인 RA 환자의 20개 혈청을 선택하였으며, 질병 기간이 5년 이상인 RA 환자의 19개 혈청 및 대조군의 23개 혈청과 단백질 어레이상에서 이들의 반응성 패턴을 비교하였다. 대조 그룹에는, 7명의 척추관절증(AS) 환자, 2명의 루프스(SLE) 환자, 4명의 전신성 경화증(SSc) 환자 및 10명의 건강한 대상체가 포함되었다. 자가항체는 항 인간 IgG 항체에 의해 검출되었다.

평균적으로, 질병 기간이 5년 이상인 RA 환자의 혈청은 101개의 단백질을 결합하는 것으로 확인되었다. AS 혈청은 112개의 단백질을 결합하고, SLE 혈청은 91개의 단백질을 결합하고, SSc 혈청은 103개의 단백질을 결합하고, 건강한 대조군 혈청은 89개의 단백질을 결합하였다.

질병 기간이 1년 이하인 RA 환자의 혈청은 평균적으로 58개의 단백질을 결합하였다. 이들 단백질들 중에서, 본 발명자들은 질병 기간이 1년 이하인 RA 환자의 30% 내지 60%에 의해 인식되고 대조군의 10% 이하에 의해 인식된 25개의 단백질(P1 내지 P25)을 동정하였다(표 4). 이들 단백질들은 질병 기간이 5년 이상인 RA 환자의 0 내지 37%에 의해 인식되었다.

표 4: 단백질 어레이 분석

RA 환자에 대해 특이적인 자가항체. 단백질 어레이 검출의 유효성을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 면역흡착제로서 정제된 단백질을 이용한 ELISA 검정법을 진행하였다. 본 발명자들은 질병 기간이 1년 이하인 RA 환자 68명, 질병 기간이 5년 이상인 RA 환자 40명, AS 환자 76명, PsA 환자 27명 및 건강한 대상체 38명의 혈청들을 시험하였다.

초기 RA에서 자가항체에 의해 표적화된 18개의 단백질은 대조군의 5% 이상에서 자가항체에 의해 또한 인식되었다. 이들 단백질들은 FGF12, DCX, SYT1, IGBP1, TCP10L, EIF1AX, C7orf50, C17orf85, TSLP, SCYL1, YY1, TPM4, FKBP3, SPANXN3, CCDC97, PAD4, LMNA 및 ANP32E이다.

7개의 단백질은 초기 RA 환자의 18% 이상에 의해 인식되었으며, 대조군의 5% 이하에 의해 인식되었다. 이들 단백질들은 WIBG, TPM2, ELOF1, CCDC72, MGC17403, ZNF706 및 GABARAPL2이다.

초기 RA 환자와 연관되는 특이적 자가항체. WIBG, TPM2, ZNF706 및 GABARAPL2는 초기 RA 환자에서 혈청에 의해 거의 유일하게 인식되었다(표 5). 실제로, 이들 단백질들은 초기 RA 환자의 18% 내지 41%를 식별하였으며, 질병 기간이 5년 이상인 RA 환자 또는 대조군의 5% 이하를 식별하였다. 흥미롭게도, WIBG에 대해 자가항체는 초기 RA에서 매우 특이적이었다. 실제로, RA 환자의 41%의 혈청이 WIBG를 인식한 반면, 질병 기간이 5년 이상인 RA 환자의 5%(p=0.00005), AS 환자의 0%(p<10^-7), PsA 환자의 0%(p=0.0001) 및 건강한 개체의 0%(p<10^-5)가 WIBG를 인식하였다.

초기 RA 자가항원의 확인

	양성 혈청의 퍼센트
	RA < 1년 (68)	RA > 5년 (40)	AS (76)	PSA (27)	건강한 대상체 (38)	p
WIBG	41%	5%	0%	0%	0%	p<10-7
TPM2	32%	2.5%	5%	0%	0%	p<10-7
ZNF706	25%	5%	1.3%	0%	3%	p<10-7
GABARAPL2	18%	0%	1.3%	4%	3%	p<10-4

p 값: 초기 RA vs 대조 그룹(AS, PsA 및 건강한 대상체)

더욱이, 초기 RA 환자 68명 중 40명(60%)은 상기 4개의 단백질 중 하나 이상을 인식하였다(표 6).

표 6: ELISA에 의한 WIBG, TPM2, ZNF706 및 GABARAPL2에 대한 초기 RA 환자의 자가항체의 결합. 어두운 박스는 양성 결합을 나타낸다.

논의

RA의 발달을 야기하는 초기 면역학적 사건에 대한 통찰을 얻고 초기 RA에 대한 진단 툴을 개발하기 위하여, 본 발명자들은 초기 RA(1년 이하) 환자, 질병 기간이 5년 이상인 RA 환자, 강직성 척추염 환자, 루프스 환자 및 건강한 대상체의 혈청에 의해 8000개 단백질 어레이를 스크리닝하였다.

초기 RA의 특이적 혈청학적 마커일 수 있는 25개의 단백질들이 선택되었으며, 그 이유는 초기 RA 환자의 30% 내지 60%를 식별하고 대조군의 10% 이하를 식별하였기 때문이다. 이들 단백질들 중에서, 오직 1개, 즉 PAD4(아르기닌을 시트룰린으로 전환시키는 효소)가 RA 자가항체에 대한 표적인 것으로 이미 알려져 있었으며, 이는 질병 기간이 5년 이상인 RA 환자의 10% 이상에 의해 인식된다.

단백질 어레이 검출의 유효성을 확인하기 위해, ELISA 검정법에서 동일한 단백질을 사용하여 환자와 대조군의 혈청들을 더 스크리닝하였다. 초기 RA의 특이적 마커를 동정하기 위해, 대조 그룹의 5% 이상에 의해 인식된 단백질들 전부와 질병 기간이 5년 이상인 RA 환자에 의해 인식된 단백질들 전부는 제외되었다. 질병 기간이 1년 이하인 RA 환자와 연관되는 4개의 새로운 자가항체 패밀리들이 동정되었다. 이들 자가항체는 WIBG, TPM2, ZNF706 및 GABARAPL2를 인식한다. 이들 자가항체는 RA 환자의 18% 내지 41%에 의해 인식되었으며, 대조군의 5% 이하에 의해 인식되었다.

WIBG, TPM2, ZNF706 및 GABARAPL2에 대한 자가항체는 초기 RA와 강하게 연관되었다. 실제로, GABARAPL2에 대한 자가항체는 초기 RA 환자에게서 발견되었지만, 질병 기간이 5년 이상인 RA 환자에게서는 발견되지 않았다. WIBG, TPM2 및 ZNF706에 대한 자가항체들은 질병 기간이 5년 이상인 RA 환자에게서도 발견되었지만, 그 빈도는 더 낮다. RA 환자에 양성인 항체의 퍼센트는 질병 기간에 따라 감소되었다. 실제로, WIBG는 질병 기간이 1년 이하인 RA 환자의 41%, 질병 기간이 1년 내지 5년인 RA 환자의 12%, 질병 기간이 5년 이상인 RA 환자의 오직 5%에 의해 인식되었다(데이터는 나타내지 않음).

자가항체 감소는 치료와 연관될 수 있다. 여러 연구들에 따르면, RA 연관 자가항체의 수준은 유효한 질병-변경 치료의 처치에 따라 감소한다는 점이 보고되었다. 이는 항-핵 자가항체(ANA)의 경우이다. ANA는 RA 환자의 20-30%에서 양성이다. 그러나, 질환이 개시되고 처음 몇 개월 이후에, ANA 시험은 음성으로 전환될 수 있으며, 질환이 진행됨에 따라 음성으로 남아있을 수 있다(Goldbach-Mansky et al., Arthritis Res., 2000, 3: 236-243). 이는 또한 항-Sa 및 류마티스 인자에 대해서도 마찬가지이다. 치료된 최근-발병 다발성 관절염에서, 항 CCP 출현율은 안정적이거나 약간 증가하는 반면, 항-Sa 및 류마티스 인자 항체는 30개월째에 종종 사라진다(Guzian et al., Arthritis Care Res., 2010, 62: 1624-1632).

질환이 발병하고 1년 후에, RA 환자의 97%는 유효한 질병-변경 치료를 갖는다. 이는 질병 기간이 5년 이상인 RA 환자에게서 자가항체 감소를 설명할 수 있다.

WIBG는 EJC(exon junction complex)의 분해에 관여하는 리보좀-연관 단백질이다. mRNA 스플라이싱 동안 결집된 EJC는 세포질 내로 핵 수출(nuclear export)하는 동안 mRNA를 이동시키며, 번역 동안 제거된다(Gehring et al., Cell, 2009, 137: 536-548). WIBG는 mRNA의 번역을 증대시킨다(Diem et al., Nat. Struct. Mol. Biol., 2007, 14: 1173-1179). WIBG는 또한 "샤페론"으로서 작용하여 바이러스 유전자의 번역을 증대시키는 것으로 알려졌다(Boyne et al., EMBO J., 2010, 29: 1851-1864).

WIBG(within BGCN homolog, Drosophila)는 초기 RA에 대한 높은 민감성(sensitivity) 및 특이성(specificity)에 기인하여 흥미로운 진단을 나타낼 수 있다. 실제로, 항 WIBG 자가항체는 초기 RA 환자의 41% 및 질병 기간이 5년 이상인 RA 환자의 5%에서 검출된 반면, 어떠한 대조군에서도 존재하지 않았다. 항 WIBG 항체는 항 CCP 양성 초기 RA 환자 58명 중 26명(45%)에서 검출되었으며, 항 CCP 음성 초기 RA 환자 10명 중 3명(30%)에서 검출되었다(표 6). 이와 함께, 상기 결과들은 WIBG가 초기 RA 환자를 진단하는데 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.

TPM2(tropomyosin 2)는 근수축에 관여하는 액틴 필라멘트 결합 단백질 패밀리의 구성원이다(Lin et al., Adv. Exp. Med. Biol., 2008, 644: 201-222).

ZNF706(zinc finger protein 706)은 C2H2-유형 징크-핑거 단백질 패밀리에 속한다. 징크 핑거 단백질은 특이성이 DNA-결합 도메인에 의존하는 DNA-결합 단백질이다(Luchi et al., Cell. Mol. Life Sci., 2001, 58: 625-635; Laity et al., Curr. Opin. Struct. Biol., 2001, 11: 39-46).

GABARAPL2(GABA(A) receptor associated protein like 2)는 자가포식작용(autophagy)에 관여하며, 이 과정에 의해 단백질 및 세포소기관이 자가포식소포에 격리되고 분해를 위해 리소좀으로 전달된다(Diem et al., Nat. Stuct. Mol. Biol., 2007, 14: 1173-1179).

따라서, WIBG, TPM2, ZNF706 및 GABARAPL2에 대한 자가항체들은 RA 질환의 초기 단계에서 RA를 진단하는데 사용될 수 있다.

실시예 3: 초기 RA의 지표인 4개의 자가항원의 에피토프 맵핑

환자 및 방법

실시예 2에서 나타낸 바와 같이, 초기 RA 환자의 혈청에 의해 거의 유일하게 인식된 4개의 자가항원(WIBG, TPM2, ZNF706 및 GABARAPL2)이 동정되었다. 상기 단백질들에 대해 B 세포 에피토프를 맵핑하기 위하여, 각각의 단백질을 포함하는 중첩 펩티드들은 ELISA 검정법에 의해 RA 혈청에서 그들의 반응성이 분석되었다.

펩티드 스크리닝을 위한 RA 환자의 혈청. 질병 기간이 1년 이하인 RA 환자들이 연구되었다. 모든 RA 환자들은 [American College of Rheumatology 1987] 수정된 기준을 충족시킨다. 본 연구를 위해 윤리 승인이 얻어졌다(DC2008-327). 모든 참가자들은 고지에 입각한 동의를 하였다.

펩티드 스크리닝을 위한 대조군의 혈청. 대조군은 척추관절증(AS) 환자, 건선 관절염(PsA) 환자, 또는 전신성 홍반성 루프스(SLE) 환자였다. 건강한 대조군은 연구소 직원 자원자들 중에서 모집되었으며, 자원자의 골수가 사용되었다. 모든 참가자들은 고지에 입각한 동의를 하였다(DC2008-327).

합성 펩티드. 각각의 바이오마커에 대해 7개 아미노산들이 중첩되는 15-mer 펩티드가 고체상 시스템(Eurogentec, 프랑스)을 이용하여 합성되었다.

ELISA에 의한 자가항체의 검출. pH 7.4, 인산완충식염수(PBS)에서 희석된 10　μg/웰의 펩티드에 의해 플레이트가 밤새 코팅되었다. 플레이트는 5% 유(milk) 함유 PBS에 의해 차단(block)되었다. PBS 중 1:100으로 희석된 혈청은 2시간 동안 인큐베이션되었다. 0.1% Tween 20으로 세척한 후에, 페록시다아제 컨쥬게이션된 항 인간 IgG(Sigma, 프랑스)가 첨가되었다. 광밀도는 405nm에서 판독되었다. 백그라운드 OD는 펩티드 없이 웰에 각 혈청을 첨가함으로써 획득되었다. 양성 혈청은 백그라운드 OD의 2배 이상인 OD 값에 의해 규정되었다.

통계학적 분석. p-값은 Chi square Test를 이용하여 계산되었다.

결과

WIBG의 에피토프. RA 환자의 혈청에 의해 인식되는 것으로 확인된 WIBG-단백질의 영역은 다음과 같았다:

서열번호 10: MEAAGSPAATETGKY

서열번호 11: AATETGKYIASTQRP

서열번호 12: IASTQRPDGTWRKQR

서열번호 13: KKKLRQVEELQQRIQ

TPM2의 에피토프. RA 환자의 혈청에 의해 인식되는 것으로 확인된 TPM2-단백질의 영역은 다음과 같았다:

서열번호 14: QKMKYKAISEELDNA

서열번호 15: ISEELDNALNDITSL

ZNF706의 에피토프. RA 환자의 혈청에 의해 인식되는 것으로 확인된 ZNF706-단백질의 영역은 다음과 같았다:

서열번호 16: MARGQQKIQSQQKNA

서열번호 17: IQSQQKNAKKQAGQK

서열번호 18: KKQAGQKKKQGHDQK

GABARAPL2의 에피토프. RA 환자의 혈청에 의해 인식되는 것으로 확인된 GABARAPL2-단백질의 영역은 다음과 같았다:

서열번호 19: MKWMFKEDHSLEHRC

서열번호 20: GFLYVAYSGENTFGF.

SEQUENCE LISTING <110> INSERM (Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale) UNIVERSITE D'AIX-MARSEILLE <120> Method for the diagnosis of early rheumatoid arthritis <130> IP20132337FR <150> EP 11 305 584.2 <151> 2011-05-13 <160> 20 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 204 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Glu Ala Ala Gly Ser Pro Ala Ala Thr Glu Thr Gly Lys Tyr Ile 1 5 10 15 Ala Ser Thr Gln Arg Pro Asp Gly Thr Trp Arg Lys Gln Arg Arg Val 20 25 30 Lys Glu Gly Tyr Val Pro Gln Glu Glu Val Pro Val Tyr Glu Asn Lys 35 40 45 Tyr Val Lys Phe Phe Lys Ser Lys Pro Glu Leu Pro Pro Gly Leu Ser 50 55 60 Pro Glu Ala Thr Ala Pro Val Thr Pro Ser Arg Pro Glu Gly Gly Glu 65 70 75 80 Pro Gly Leu Ser Lys Thr Ala Lys Arg Asn Leu Lys Arg Lys Glu Lys 85 90 95 Arg Arg Gln Gln Gln Glu Lys Gly Glu Ala Glu Ala Leu Ser Arg Thr 100 105 110 Leu Asp Lys Val Ser Leu Glu Glu Thr Ala Gln Leu Pro Ser Ala Pro 115 120 125 Gln Gly Ser Arg Ala Ala Pro Thr Ala Ala Ser Asp Gln Pro Asp Ser 130 135 140 Ala Ala Thr Thr Glu Lys Ala Lys Lys Ile Lys Asn Leu Lys Lys Lys 145 150 155 160 Leu Arg Gln Val Glu Glu Leu Gln Gln Arg Ile Gln Ala Gly Glu Val 165 170 175 Ser Gln Pro Ser Lys Glu Gln Leu Glu Lys Leu Ala Arg Arg Arg Ala 180 185 190 Leu Glu Glu Glu Leu Glu Asp Leu Glu Leu Gly Leu 195 200 <210> 2 <211> 284 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Asp Ala Ile Lys Lys Lys Met Gln Met Leu Lys Leu Asp Lys Glu 1 5 10 15 Asn Ala Ile Asp Arg Ala Glu Gln Ala Glu Ala Asp Lys Lys Gln Ala 20 25 30 Glu Asp Arg Cys Lys Gln Leu Glu Glu Glu Gln Gln Ala Leu Gln Lys 35 40 45 Lys Leu Lys Gly Thr Glu Asp Glu Val Glu Lys Tyr Ser Glu Ser Val 50 55 60 Lys Glu Ala Gln Glu Lys Leu Glu Gln Ala Glu Lys Lys Ala Thr Asp 65 70 75 80 Ala Glu Ala Asp Val Ala Ser Leu Asn Arg Arg Ile Gln Leu Val Glu 85 90 95 Glu Glu Leu Asp Arg Ala Gln Glu Arg Leu Ala Thr Ala Leu Gln Lys 100 105 110 Leu Glu Glu Ala Glu Lys Ala Ala Asp Glu Ser Glu Arg Gly Met Lys 115 120 125 Val Ile Glu Asn Arg Ala Met Lys Asp Glu Glu Lys Met Glu Leu Gln 130 135 140 Glu Met Gln Leu Lys Glu Ala Lys His Ile Ala Glu Asp Ser Asp Arg 145 150 155 160 Lys Tyr Glu Glu Val Ala Arg Lys Leu Val Ile Leu Glu Gly Glu Leu 165 170 175 Glu Arg Ser Glu Glu Arg Ala Glu Val Ala Glu Ser Lys Cys Gly Asp 180 185 190 Leu Glu Glu Glu Leu Lys Ile Val Thr Asn Asn Leu Lys Ser Leu Glu 195 200 205 Ala Gln Ala Asp Lys Tyr Ser Thr Lys Glu Asp Lys Tyr Glu Glu Glu 210 215 220 Ile Lys Leu Leu Glu Glu Lys Leu Lys Glu Ala Glu Thr Arg Ala Glu 225 230 235 240 Phe Ala Glu Arg Ser Val Ala Lys Leu Glu Lys Thr Ile Asp Asp Leu 245 250 255 Glu Asp Glu Val Tyr Ala Gln Lys Met Lys Tyr Lys Ala Ile Ser Glu 260 265 270 Glu Leu Asp Asn Ala Leu Asn Asp Ile Thr Ser Leu 275 280 <210> 3 <211> 340 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Lys Tyr Gly Asn Pro Asn Tyr Gly Gly Met Lys Gly Ile Leu Ser 1 5 10 15 Asn Ser Trp Lys Arg Arg Tyr His Ser Arg Arg Ile Gln Arg Asp Val 20 25 30 Ile Lys Lys Arg Ala Leu Ile Gly Asp Asp Val Gly Leu Thr Ser Tyr 35 40 45 Lys His Arg His Ser Gly Leu Val Asn Val Pro Glu Glu Pro Ile Glu 50 55 60 Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp 65 70 75 80 Gln Asp Met Asp Ala Asp Asp Arg Val Val Val Glu Tyr His Glu Glu 85 90 95 Leu Pro Ala Leu Lys Gln Pro Arg Glu Arg Ser Ala Ser Arg Arg Ser 100 105 110 Ser Ala Ser Ser Ser Asp Ser Asp Glu Met Asp Tyr Asp Leu Glu Leu 115 120 125 Lys Met Ile Ser Thr Pro Ser Pro Lys Lys Ser Met Lys Met Thr Met 130 135 140 Tyr Ala Asp Glu Val Glu Ser Gln Leu Lys Asn Ile Arg Asn Ser Met 145 150 155 160 Arg Ala Asp Ser Val Ser Ser Ser Asn Ile Lys Asn Arg Ile Gly Asn 165 170 175 Lys Leu Pro Pro Glu Lys Phe Ala Asp Val Arg His Leu Leu Asp Glu 180 185 190 Lys Arg Gln His Ser Arg Pro Arg Pro Pro Val Ser Ser Thr Lys Ser 195 200 205 Asp Ile Arg Gln Arg Leu Gly Lys Arg Pro His Ser Pro Glu Lys Ala 210 215 220 Phe Ser Ser Asn Pro Val Val Arg Arg Glu Pro Ser Ser Asp Val His 225 230 235 240 Ser Arg Leu Gly Val Pro Arg Gln Asp Ser Lys Gly Leu Tyr Ala Asp 245 250 255 Thr Arg Glu Lys Lys Ser Gly Asn Leu Trp Thr Arg Leu Gly Ser Ala 260 265 270 Pro Lys Thr Lys Glu Lys Asn Thr Lys Lys Val Asp His Arg Ala Pro 275 280 285 Gly Ala Glu Glu Asp Asp Ser Glu Leu Gln Arg Ala Trp Gly Ala Leu 290 295 300 Ile Lys Glu Lys Glu Gln Ser Arg Gln Lys Lys Ser Arg Leu Asp Asn 305 310 315 320 Leu Pro Ser Leu Gln Ile Glu Val Ser Arg Glu Ser Ser Ser Gly Ser 325 330 335 Glu Ala Glu Ser 340 <210> 4 <211> 215 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Leu Ala Gly Gln Leu Glu Ala Arg Asp Pro Lys Glu Gly Thr His 1 5 10 15 Pro Glu Asp Pro Cys Pro Gly Ala Gly Ala Val Met Glu Lys Thr Ala 20 25 30 Val Ala Ala Glu Val Leu Thr Glu Asp Cys Asn Thr Gly Glu Met Pro 35 40 45 Pro Leu Gln Gln Gln Ile Ile Arg Leu His Gln Glu Leu Gly Arg Gln 50 55 60 Lys Ser Leu Trp Ala Asp Val His Gly Lys Leu Arg Ser His Ile Asp 65 70 75 80 Ala Leu Arg Glu Gln Asn Met Glu Leu Arg Glu Lys Leu Arg Ala Leu 85 90 95 Gln Leu Gln Arg Trp Lys Ala Arg Lys Lys Ser Ala Ala Ser Pro His 100 105 110 Ala Gly Gln Glu Ser His Thr Leu Ala Leu Glu Pro Ala Phe Gly Lys 115 120 125 Ile Ser Pro Leu Ser Ala Asp Glu Glu Thr Ile Pro Lys Tyr Ala Gly 130 135 140 His Lys Asn Gln Ser Ala Thr Leu Leu Gly Gln Arg Ser Ser Ser Asn 145 150 155 160 Asn Ser Ala Pro Pro Lys Pro Met Ser Leu Lys Ile Glu Arg Ile Ser 165 170 175 Ser Trp Lys Thr Pro Pro Gln Glu Asn Arg Asp Lys Asn Leu Ser Arg 180 185 190 Arg Arg Gln Asp Arg Arg Ala Thr Pro Thr Gly Arg Pro Thr Pro Cys 195 200 205 Ala Glu Arg Arg Gly Gly Val 210 215 <210> 5 <211> 76 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Ala Arg Gly Gln Gln Lys Ile Gln Ser Gln Gln Lys Asn Ala Lys 1 5 10 15 Lys Gln Ala Gly Gln Lys Lys Lys Gln Gly His Asp Gln Lys Ala Ala 20 25 30 Ala Lys Ala Ala Leu Ile Tyr Thr Cys Thr Val Cys Arg Thr Gln Met 35 40 45 Pro Asp Pro Lys Thr Phe Lys Gln His Phe Glu Ser Lys His Pro Lys 50 55 60 Thr Pro Leu Pro Pro Glu Leu Ala Asp Val Gln Ala 65 70 75 <210> 6 <211> 351 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ser Asp Lys Asn Gln Ile Ala Ala Arg Ala Ser Leu Ile Glu Gln 1 5 10 15 Leu Met Ser Lys Arg Asn Phe Glu Asp Leu Gly Asn His Leu Thr Glu 20 25 30 Leu Glu Thr Ile Tyr Val Thr Lys Glu His Leu Gln Glu Thr Asp Val 35 40 45 Val Arg Ala Val Tyr Arg Val Leu Lys Asn Cys Pro Ser Val Ala Leu 50 55 60 Lys Lys Lys Ala Lys Cys Leu Leu Ser Lys Trp Lys Ala Val Tyr Lys 65 70 75 80 Gln Thr His Ser Lys Ala Arg Asn Ser Pro Lys Leu Phe Pro Val Arg 85 90 95 Gly Asn Lys Glu Glu Asn Ser Gly Pro Ser His Asp Pro Ser Gln Asn 100 105 110 Glu Thr Leu Gly Ile Cys Ser Ser Asn Ser Leu Ser Ser Gln Asp Val 115 120 125 Ala Lys Leu Ser Glu Met Ile Val Pro Glu Asn Arg Ala Ile Gln Leu 130 135 140 Lys Pro Lys Glu Glu His Phe Gly Asp Gly Asp Pro Glu Ser Thr Gly 145 150 155 160 Lys Arg Ser Ser Glu Leu Leu Asp Pro Thr Thr Pro Met Arg Thr Lys 165 170 175 Cys Ile Glu Leu Leu Tyr Ala Ala Leu Thr Ser Ser Ser Thr Asp Gln 180 185 190 Pro Lys Ala Asp Leu Trp Gln Asn Phe Ala Arg Glu Ile Glu Glu His 195 200 205 Val Phe Thr Leu Tyr Ser Lys Asn Ile Lys Lys Tyr Lys Thr Cys Ile 210 215 220 Arg Ser Lys Val Ala Asn Leu Lys Asn Pro Arg Asn Ser His Leu Gln 225 230 235 240 Gln Asn Leu Leu Ser Gly Thr Thr Ser Pro Arg Glu Phe Ala Glu Met 245 250 255 Thr Val Met Glu Met Ala Asn Lys Glu Leu Lys Gln Leu Arg Ala Ser 260 265 270 Tyr Thr Glu Ser Cys Ile Gln Glu His Tyr Leu Pro Gln Val Ile Asp 275 280 285 Gly Thr Gln Thr Asn Lys Ile Lys Cys Arg Arg Cys Glu Lys Tyr Asn 290 295 300 Cys Lys Val Thr Val Ile Asp Arg Gly Thr Leu Phe Leu Pro Ser Trp 305 310 315 320 Val Arg Asn Ser Asn Pro Asp Glu Gln Met Met Thr Tyr Val Ile Cys 325 330 335 Asn Glu Cys Gly Glu Gln Trp Tyr His Ser Lys Trp Val Cys Trp 340 345 350 <210> 7 <211> 64 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Ser Gly Arg Glu Gly Gly Lys Lys Lys Pro Leu Lys Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Gln Ala Lys Glu Met Asp Glu Glu Asp Lys Ala Phe Lys Gln Lys 20 25 30 Gln Lys Glu Glu Gln Lys Lys Leu Glu Glu Leu Lys Ala Lys Ala Ala 35 40 45 Gly Lys Gly Pro Leu Ala Thr Gly Gly Ile Lys Lys Ser Gly Lys Lys 50 55 60 <210> 8 <211> 83 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Gly Arg Arg Lys Ser Lys Arg Lys Pro Pro Pro Lys Lys Lys Met 1 5 10 15 Thr Gly Thr Leu Glu Thr Gln Phe Thr Cys Pro Phe Cys Asn His Glu 20 25 30 Lys Ser Cys Asp Val Lys Met Asp Arg Ala Arg Asn Thr Gly Val Ile 35 40 45 Ser Cys Thr Val Cys Leu Glu Glu Phe Gln Thr Pro Ile Thr Tyr Leu 50 55 60 Ser Glu Pro Val Asp Val Tyr Ser Asp Trp Ile Asp Ala Cys Glu Ala 65 70 75 80 Ala Asn Gln <210> 9 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Lys Trp Met Phe Lys Glu Asp His Ser Leu Glu His Arg Cys Val 1 5 10 15 Glu Ser Ala Lys Ile Arg Ala Lys Tyr Pro Asp Arg Val Pro Val Ile 20 25 30 Val Glu Lys Val Ser Gly Ser Gln Ile Val Asp Ile Asp Lys Arg Lys 35 40 45 Tyr Leu Val Pro Ser Asp Ile Thr Val Ala Gln Phe Met Trp Ile Ile 50 55 60 Arg Lys Arg Ile Gln Leu Pro Ser Glu Lys Ala Ile Phe Leu Phe Val 65 70 75 80 Asp Lys Thr Val Pro Gln Ser Ser Leu Thr Met Gly Gln Leu Tyr Glu 85 90 95 Lys Glu Lys Asp Glu Asp Gly Phe Leu Tyr Val Ala Tyr Ser Gly Glu 100 105 110 Asn Thr Phe Gly Phe 115 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Glu Ala Ala Gly Ser Pro Ala Ala Thr Glu Thr Gly Lys Tyr 1 5 10 15 <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Ala Ala Thr Glu Thr Gly Lys Tyr Ile Ala Ser Thr Gln Arg Pro 1 5 10 15 <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ile Ala Ser Thr Gln Arg Pro Asp Gly Thr Trp Arg Lys Gln Arg 1 5 10 15 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Lys Lys Lys Leu Arg Gln Val Glu Glu Leu Gln Gln Arg Ile Gln 1 5 10 15 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Gln Lys Met Lys Tyr Lys Ala Ile Ser Glu Glu Leu Asp Asn Ala 1 5 10 15 <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Ile Ser Glu Glu Leu Asp Asn Ala Leu Asn Asp Ile Thr Ser Leu 1 5 10 15 <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met Ala Arg Gly Gln Gln Lys Ile Gln Ser Gln Gln Lys Asn Ala 1 5 10 15 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Ile Gln Ser Gln Gln Lys Asn Ala Lys Lys Gln Ala Gly Gln Lys 1 5 10 15 <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Lys Lys Gln Ala Gly Gln Lys Lys Lys Gln Gly His Asp Gln Lys 1 5 10 15 <210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Met Lys Trp Met Phe Lys Glu Asp His Ser Leu Glu His Arg Cys 1 5 10 15 <210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Gly Phe Leu Tyr Val Ala Tyr Ser Gly Glu Asn Thr Phe Gly Phe 1 5 10 15

Claims (17)

1. 하기 단계를 포함하는, 대상체의 류마티스성 관절염의 시험관내 진단 방법:
   대상체에서 획득한 생물학적 샘플에서 WIBG-단백질, TPM2-단백질, C17orf85-단백질, TCP10L-단백질, ZNF706-단백질, MGC17403-단백질, CCDC72-단백질, ELOF1-단백질 및 GABARAPL2-단백질로 이루어진 단백질 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 바이오마커를 인식하는 하나 이상의 자가항체를 검출하는 단계.
2. 제1항에 있어서,
   상기 방법은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
   대상체에서 획득한 생물학적 샘플을 WIBG, TPM2, C17orf85, TCP10L, ZNF706, MGC17403, CCDC72, ELOF1 및 GABARAPL2로 이루어진 군에서 선택된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 9개의 바이오마커와 접촉시키는 단계; 및
   바이오마커-항체 복합체의 형성을 검출하는 단계,
   여기서, 바이오마커-항체 복합체의 검출은 대상체의 류마티스성 관절염의 지표임.
3. 제2항에 있어서,
   상기 대상체에서 획득한 생물학적 샘플은 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 9개의 상기 바이오마커와 접촉되는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제3항에 있어서,
   상기 대상체에서 획득한 생물학적 샘플은 WIBG, TPM2, ZNF706 및 GABARAPL2의 4개의 바이오마커와 접촉되는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제3항에 있어서,
   상기 대상체에서 획득한 생물학적 샘플은 9개의 상기 바이오마커와 접촉되는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
   WIBG-단백질은, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나 또는 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 구성된, 아미노산 서열을 갖는 펩티드이고;
   TPM2-단백질은, 서열번호 14 및 서열번호 15로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나 또는 서열번호 14 및 서열번호 15로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 구성된, 아미노산 서열을 갖는 펩티드이고;
   ZNF706-단백질은, 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18을 포함하거나 또는 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18로 구성된, 아미노산 서열을 갖는 펩티드이고;
   GABARAPL2-단백질은, 서열번호 19 및 서열번호 20을 포함하거나 또는 서열번호 19 및 서열번호 20으로 구성된, 아미노산 서열을 갖는 펩티드인 것;을 특징으로 하는 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 대상체는 CCP-음성인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 방법은 초기 단계의 류마티스성 관절염을 진단하기 위한 것을 특징으로 하는 방법.
9. 하기를 포함하는, 대상체의 류마티스성 관절염의 시험관내 진단용 키트:
   WIBG, TPM2, C17orf85, TCP10L, ZNF706, MGC17403, CCDC72, ELOF1 및 GABARAPL2로 이루어진 군에서 선택된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 9개의 바이오마커; 및
   상기 바이오마커와 대상체에서 획득한 생물학적 샘플에 존재하는 자가항체 사이에 형성되는 바이오마커-항체 복합체를 검출하기 위한 하나 이상의 시약.
10. 제9항에 있어서,
    상기 키트는 9개의 상기 바이오마커를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
11. 제10항에 있어서,
    상기 키트는 WIBG, TPM2, ZNF706 및 GABARAPL2의 4개의 바이오마커를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    WIBG-단백질은, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나 또는 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 구성된, 아미노산 서열을 갖는 펩티드이고;
    TPM2-단백질은, 서열번호 14 및 서열번호 15로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나 또는 서열번호 14 및 서열번호 15로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 구성된, 아미노산 서열을 갖는 펩티드이고;
    ZNF706-단백질은, 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18을 포함하거나 또는 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18로 구성된, 아미노산 서열을 갖는 펩티드이고;
    GABARAPL2-단백질은, 서열번호 19 및 서열번호 20을 포함하거나 또는 서열번호 19 및 서열번호 20으로 구성된, 아미노산 서열을 갖는 펩티드인 것;을 특징으로 하는 키트.
13. 하기를 포함하는, 대상체의 류마티스성 관절염 진단용 어레이:
    표면에 부착된, WIBG, TPM2, C17orf85, TCP10L, ZNF706, MGC17403, CCDC72, ELOF1 및 GABARAPL2로 이루어진 군에서 선택된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 9개의 바이오마커.
14. 제13항에 있어서,
    상기 어레이는 표면에 부착된 9개의 상기 바이오마커를 포함하는 것을 특징으로 하는 어레이.
15. 제13항에 있어서,
    상기 어레이는 표면에 부착된 WIBG, TPM2, ZNF706 및 GABARAPL2의 4개의 바이오마커를 포함하는 것을 특징으로 하는 어레이.
16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    WIBG-단백질은, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나 또는 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 구성된, 아미노산 서열을 갖는 펩티드이고;
    TPM2-단백질은, 서열번호 14 및 서열번호 15로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나 또는 서열번호 14 및 서열번호 15로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 구성된, 아미노산 서열을 갖는 펩티드이고;
    ZNF706-단백질은, 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18을 포함하거나 또는 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18로 구성된, 아미노산 서열을 갖는 펩티드이고;
    GABARAPL2-단백질은, 서열번호 19 및 서열번호 20을 포함하거나 또는 서열번호 19 및 서열번호 20으로 구성된, 아미노산 서열을 갖는 펩티드인 것;을 특징으로 하는 어레이.
17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    표면에 부착된, 항핵 항체의 존재 및/또는 항-CCP 항체의 존재를 검출하기 위한 하나 이상의 부가적 바이오마커를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 어레이.