JPH02259566A - 間接凝集反応試験法及びそれに使用する検体希釈用液 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は間接凝集反応試験法及びそれに使用する検体希
釈用液に関する。さらに詳細には、ゼラチン粒子又は表
面にゼラチンをコートした粒子を用い、特定の検体希釈
用液を使用する間接凝集反応試験法及びそれに使用され
る検体希釈用液に関する。

［従来の技術及び発明が解決しようとする課題］従来、
臨床検査、医薬品製造等の分野において、抗原−抗体反
応を用いた間接凝集反応試験法により、血清、血液製剤
等の検体中に含まれる抗原や抗体を測定することが行わ
れている。間接凝集反応試験法は、希釈用液で適宜希釈
された検体に、抗原又は抗体を適当な大きさの粒子担体
に結合又は吸着させた感作担体を添加し、上記抗原又は
抗体にそれぞれ対応する抗体又は抗原が検体中に存在す
ると感作担体が凝集する反応を利用して、検体中の抗体
又は抗原を測定する方法であり、例えば、ＨＴＬＶ＝１
　（ヒトＴ細胞白血病ウィルス−１）関連抗原、ＨＢｓ
Ａｇ　（Ｂ型肝炎つィルス表面抗原’）　、ＨＩＶ　（
ヒト免疫不全ウィルス）関連抗原等を感作させた粒子担
体を用いることにより、それぞれに対応する抗体が測定
され、また逆に抗体を感作させた担体を用いることによ
り抗原が測定される。間接凝集反応試験法は、特殊の装
置を必要とせず、また操作が簡便であり、大量の検体を
迅速に処理することができるという利点を有するので広
く用いられている。

間接凝集反応に用いられる粒子担体としては、従来、動
物赤血球等の生物学的粒子担体やポリスチレンラテック
ス等の非生物学的粒子担体が用いられているが、動物赤
血球は血球表面に存在する固有の抗原が検体中の抗体と
交差反応し易く、非特異凝集を起す虞がある。また、ポ
リスチレンラテックスの場合には、かかる非特異凝集が
生ずる虞はないが、感作させる抗原又は抗体の担体表面
への結合力が弱く、保存性に欠けるという問題がある。

このような問題から、ゼラチン粒子又は表面にゼラチン
をコートした粒子が開発され、抗原活性が無く且つ感作
させる抗原又は抗体との結合性に優れ、任意の粒径のも
のが容易に作製できることから、間接凝集反応試験用の
粒子担体として汎用されている。

しかしながら、ゼラチン粒子又は表面にゼラチンをコー
トした粒子に抗原又は抗体を感作させた感作粒子を用い
て血清等の検体を測定した場合、低希釈倍数領域（１：
１〜１：１６倍希釈）において非特異凝集を起し易いと
いう問題がある。例えば、ＨＴＬＶ−１を感作させたゼ
ラチン粒子担体を用いたＡＴＬウィルス抗体の測定にお
いて、陽性と判定された者の約半数はＡＴＬウィルスの
非保有者であったこ己が報告されている。

本発明は上記の従来技術の欠点を解消するために創案さ
れたもので、発明者らが鋭意研究した結果、ゼラチン粒
子又は表面にゼラチンをコートした粒子を用いた間接凝
集反応における非特異凝集は、プラスミン阻害剤により
抑制できることを見出して完成したもので、非特異凝集
を抑制でき、測定精度を高めた間接凝集反応試験法及び
それに使用される検体希釈用液を提供することを目的と
する。

［課題を解決するための手段］ 上記の目的を達成するためになされた本発明の間接凝集
反応試験法は、ゼラチン粒子又は表面にゼラチンをコー
トした粒子（以下、これらを「Ｇ粒子担体」という）を
用いる間接凝集反応試験法において、検体の希釈用液と
してプラスミン阻害剤を含有する溶液を使用することを
特徴とするものであり、また本発明の検体希釈用液は上
記方法に使用されるプラスミン阻害剤を含有する希釈用
液である。

本発明の間接凝集反応試験法において使用されるＧ粒子
担体は、間接凝集反応試験法で従来から使用されている
Ｇ粒子担体が使用でき、ゼラチン粒子としては、例えば
、ゼラチンを溶媒中に微粒子状に分散させ、グルタルア
ルデヒド等の架橋剤により不溶化させたものが例示され
る（例えば、特開昭５８−１１３７５４号公報参照）。

また、表面にゼラチンをコートした粒子としては、ポリ
スチレンラテックス等の粒子表面にゼラチンをコーティ
ングしたものが例示される。

これらのＧ粒子担体は、通常、２〜１０μ程度の粒径の
ものが使用される。Ｇ粒子担体に、抗原又は抗体を感作
させる方法としては慣用の方法を用いることができ、例
えば、担体に物理吸着させる方法、タンニン酸、グルタ
ルアルデヒド、トリレンジイソシアネート等のカップリ
ング剤を用いる方法などが例示される。なお、Ｇ粒子担
体は、凝集反応の判定を容易にするため、必要に応じて
着色されていてもよい。

上記のＧ粒子担体を用いた間接凝集反応試薬キットとし
て、セロディア＠−ＡＴＬＡ、セロディア＠−ＨＢｓ、
セロディア■−ＨＩＶ等が市販されている。

本発明の試験法においては、検体はプラスミン阻害剤を
含有する希釈用液を用いて希釈され、本発明の検体希釈
用液はこれに用いられる希釈用液である。該希釈用液と
してはプラスミン阻害剤を含有する緩衝液が用いられ、
緩衝液としては凝集反応を阻害せず又非特異凝集を生じ
ないものであればいずれのものも使用することができ、
例えば、トリス緩衝液、リン酸塩緩衝液、ホウ酸塩−リ
ン酸塩緩衝液等が例示され、通常、ｐＨ６〜８、好まし
くはｐＨ６，５〜７．５程度のものが使用される。

プラスミン阻害剤としては、例えば、ε−アミノカプロ
ン酸、Ｌ−リジン、ｐ−アミノメチル安息香酸、４−ア
ミノメチルシクロヘキサンカルボン酸及びこれらの塩等
が挙げられ、特にε−アミノカプロン酸及びＬ−リジン
が好ましい。希釈用液中のプラスミン阻害剤濃度として
は０．５〜１０　（ｌｊ／Ｖ）％程度、好ましくは１〜
５　（Ｗ／Ｖ）　％程度、より好ましく２〜３　（Ｖ／
Ｖ）％程度とされ、０．５（Ｗ／Ｖ）％未満では効果が
少なく、また１　０　（Ｗ／Ｖ）％までの添加で十分に
効果を発揮するのでそれを越える添加は特に必要とされ
ない。

なお、上記の検体希釈用液には、必要に応じて、等張化
剤（例えば、塩化ナトリウム、グルコース等）、赤血球
安定化剤（例えば、羊、牛等の赤血球膜破砕液等）、非
特異凝集反応抑制剤（例えば、動物の正常血清等）及び
この分野で慣用の添加剤（例えば、アラビアゴム、アジ
化ナトリウム、ポリエチレングリコール、ポリビニルピ
ロリドン等）を適宜添加してもよく、これらの添加剤は
適宜量使用される。

本発明の試験法は、検体の希釈用液としてプラスミン阻
害剤を含有する希釈用液を使用する以外は従来からの間
接凝集反応を利用した試験法に準じて行なえばよい。そ
の−例を、例えば、抗原を感作させたＧ粒子担体（以下
、抗原感作粒子という）を用いて、検体中の対応抗体を
測定する場合をもって説明すると、マイクロプレートの
ウェルに検体を加え、プラスミン阻害剤を含有する検体
希釈用液で倍々希釈して希釈列を形成し、各ウェルに抗
原感作粒子を添加し緩く攪拌した後、１〜３時間程度静
置して該感作粒子の凝集を観察することにより行われる
。また半定量試験とする場合には、上記方法で凝集の生
じる最大希釈倍数を求め、一方、測定対象である抗体を
既知量含有する試料を陽性コントロールとして使用し、
上記と同様にして倍々希釈列を形成すると共に各ウェル
に抗原感作粒子を添加し、凝集を生じる最大布、釈倍数
を求め、両者の最大希釈倍数を対比することにより行な
うことができる。さらに、定量試験とする場合には、例
えば、生じた凝集塊以外の凝集しなかった抗原感作粒子
の数を光学的に計数する方法（粒子カウンティングイム
ノアッセイ法）、近赤外線（０，８〜２．４μｍ）を用
いて凝集塊の濁度を測定する方法（近赤外線比濁法）等
の方法を使用することにより行なうことができる。

なお、簡便法としては、検体を、プラスミン阻害剤を含
有する検体希釈用液で適宜希釈した後、スライドガラス
上で抗原感作粒子と混合し、約１〜３分後の凝集を観察
することによっても行なうことができる。

上記の例は、抗原感作粒子を用いて検体中の抗体を測定
するものであるが、逆に抗体で感作されたＧ粒子担体を
用いれば、同様な方法にて検体中の抗原を測定すること
ができる。

［発明・の効果］ 本発明によれば、間接凝集反応試験法の検体の希釈用液
として、プラスミン阻害剤を含有する希釈用液が使用さ
れているので、Ｇ粒子担体の非特異凝集を抑制すること
ができ、測定精度を高めることができるという効果を奏
し、間接凝集反応試験法の簡便性及び迅速性と相まって
、血清、血液製剤等の試験法として極めて有用である。

［実施例］ 以下、実験例及び実施例に基づいて本発明をより詳細に
説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない
。なお、特に明示のない限り、％は（Ｗ／Ｖ）％を示す
。

実験例１ 使用材料 （１）検体希釈用液： （ａ）リン酸二水素カリウム　　　　　　２．９１ｇ＋
ｂ＞リン酸水素二ナトリウム・１２水塩１９．２０ｇ（
Ｃ）塩化ナトリウム　　　　　　　　　４４８ｇ曲アジ
化ナトリウム　　　　　　　　　１６５ｇ（ｅ）アラビ
アゴム　　　　　　　　　　　２．５ｇ（ｆ］正常家兎
血清　　　　　　　　　　１０．０ｍｌ上記（ａｌ〜（
ｆｔを精製水にて全量１ｇとなるように調製した緩衝液
（ｐＨ７，２、以下緩衝液Ｉという）に、ε−アミノカ
プロン酸を２％となるように溶解した溶液（以下、２％
ＥＡＣＡ溶液という）及びＬ−リジンを２％となるよう
に溶解した溶液（以下、２％リジン溶液という）を検体
希釈用液として用いた。

（２）検体 （ａ）プラスミノーゲン検体： プラスミンを７（Ｖハ）％含有するように調製されたプ
ラスミノーゲンを、緩衝液ｌ及び上記（１）に記載の各
検体希釈用液で２５０　ＣＵ　／　ｍｌに希釈した溶液
を用いた。

（ｂ）血清検体； ヒト血清を、緩衝液Ｉ及び上記（１）に記載の各検体希
釈用液で２倍に希釈した溶液を用いた。

（３）　Ａ　Ｔ　Ｌウィルス感作粒子及び未感作粒子：
夫々ゼラチン粒子凝集反応試薬（富士レビオ■製、セロ
ディア＠−ＡＴＬＡ）及び同試薬に添付の未感作粒子を
用いた。

（４）陽性コントロール： ゼラチン粒子凝集反応試薬（富士レビオ■製、セロディ
ア■−ＡＴＬＡ）に添付の対照用陽性血清を用いた。

実験方法 マイクロプレート［横８ウエル（Ａ−Ｈ列）、縦１２ウ
エル（１〜１２番）］を用い、Ａ列の１〜３番のウェル
に、それぞれ２％ＥＡＣＡ溶液、２％リジン溶液及び緩
衝液Ｉで希釈したプラスミノーゲン検体５０μｇを加え
た。また、ウェル番号１〜３のＢ−Ｈのウェルには、検
体希釈用液として、それぞれに対応する２％ＥＡＣＡ溶
液（ウェル番号１）、２％リジン溶液（ウェル番号２）
及び緩衝液Ｉ　（ウェル番号３）を２５μｇ加えた。

常法に準じてオートダイリュター（２５μＩＩ）を使用
してＡ列からＨ列へと倍々希釈し希釈列を形成した。

一方、Ａ列の４〜６番のウェルに、それぞれ２％ＥＡＣ
Ａ溶液、２％リジン溶液及び緩衝液Ｉで希釈した血清検
体５０μｇを加えた。また、ウェル番号４〜６のＢ〜Ｈ
のウェルには、検体希釈用液として、それぞれに対応す
る２％ＥＡＣＡ溶液（ウェル番号４）、２％リジン溶液
（ウェル番号５）及び緩衝液Ｉ　（ウェル番号６）を２
５μｇ加えた。常法に準じてオートダイリュター（２５
μｆｊ＞を使用してＡ列からＨ列へと倍々希釈し希釈列
を形成した。

また、Ａ列の７〜９番のウェルには、それぞれ２％ＥＡ
ＣＡ溶液（ウェル番号７）、２％リジン溶液（ウェル番
号８）及び緩衝液Ｉ（ウェル番号９）を２５μｇ加えた
。

上記の各ウェルにＡＴＬウィルス未感作粒子を添加し、
軽く振盪した後、１時間静置して凝集の有無を観察した
。

さらに、Ａ列の１０〜１２番のウェルには、それぞれ、
２％ＥＡＣＡ溶液、２％リジン溶液及び緩衝液ｌで陽性
コントロールを所定濃度に溶解した溶液を５０μｇ加え
、ウェル番号１０〜１２のＢ〜Ｈのウェルには、それぞ
れに対応する２％ＥＡＣＡ溶液（ウェル番号１０）、２
％リジン溶液（ウェル番号１１）及び緩衝液Ｉ　（ウェ
ル番号１２）を２５μｇ加えた。常法に準じてオートダ
イリュター（２５μｇ）を使用してＡ列からＨ列へと倍
々希釈し希釈列を形成した。各ウェルにＡＴＬウィルス
感作粒子を添加し、軽く振盪した後、１時間静置して凝
集の有無を観察した。

その結果を第１表に示す。なお、同表中、−は非凝集、
士は凝集と非凝集の中間の状態、＋は凝集を示す。

（以下余白） 第１表に示されるように、緩衝液Ｉを用いて希釈したプ
ラスミノーゲン検体（ウェル番号３）及び血清検体（ウ
ェル番号６）においては、ＡＴＬウィルス未感作粒子に
対しても凝集を示し、非特異反応が生じた。これに対し
て、２％ＥＡＣＡ溶液及び２％リジン溶液を用いて希釈
したプラスミノーゲン検体（それぞれウェル番号１及び
２）及び血清検体（それぞれウェル番号４及び５）にお
いては凝集が観察されず、非特異凝集は生じないことが
明らかになった。なお、プラスミノーゲン及び血清を含
まないウェル（ウェル番号７〜９）においては未感作粒
子の非特異凝集は生じなかった。

また、陽性コントロールを２％ＥＡＣＡ溶液及び２％リ
ジン溶液を用いて希釈して形成された希釈列（それぞれ
ウェル番号１０及び１１）にＡＴＬウィルス感作粒子を
添加した系は、陽性コントロールを緩衝液Ｉで希釈した
系（ウェル番号１２）と同様な凝集挙動を示しており、
ＥＡＣＡ及びＬ−リジンが陽性コントロールの凝集挙動
に影響を及ぼさないことが明らかとなった。

実験例２ 検体希釈用液に使用する緩衝液を下記組成の緩衝液（以
下、緩衝液■という）とする以外は、実験例１と同様な
実験を行なった。その結果、実験例１と同様な結果が得
られ、緩衝液■を用いた２％ＥＡＣＡ溶液及び２％リジ
ン溶液では非特異凝集は観察されなかった。

緩衝液■組成 下記（ａｌ〜（ｅ）を精製水にて全量１ｇとなるように
調製した緩衝液。

（ａＪトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン１．２
ｇ 曲水溶性ゼラチン　　　　　　　　　５．（］　ｇ（Ｃ
）塩化ナトリウム　　　　　　　　　７．３ｇ曲塩化カ
リウム　　　　　　　　　　１．９ｇ（ｅ）アジ化ナト
リウム　　　　　　　　　１．０　。

実験例３ 検体希釈用液に使用する緩衝液を下記組成の緩衝液（以
下、緩衝液■という）とする以外は、実験例１と同様な
実験を行なった。その結果、実験例１と同様な結果が得
られ、緩衝液■を用いた２％ＥＡＣＡ溶液及び２％リジ
ン溶液では非特異凝集は観察されなかった。

緩衝液■組成 下記（ω〜（ｈ）を精製水にて全量１Ｍとなるように調
製した緩衝液。

（田四ホウ酸ナトリウム・１０水塩　　　８．Ｏｇ＋ｂ
＋リン酸二水素カリウム　　　　　　８．０ｇ（Ｃ）塩
化ナトリウム　　　　　　　　　２．０ｇ（小ポリエチ
レングリコール６０００　　１５．Ｏｇ＜ｅ）ポリビニ
ルピロリドン　　　　　　１５．Ｏｆ＜ｆ＞アジ化ナト
リウム　　　　　　　　１．５ｇ（９）正常家兎血清　
　　　　　　　　　ＬＯｍｌ市正常ニワトリ血清　　　
　　　　　４．０ｍｌ実施例 使用材料 （１）検体希釈用液、ＡＴＬウィルス感作粒子、ＡＴＬ
ウィルス未感作粒子及び陽性コントロール：これらは実
験例１と同じものを用いた。

■プラスミノーゲン検体： 医用プラスミノーゲンバルク製剤を検体希釈用液で希釈
して、プラスミノーゲン濃度２５０ＣＵ／　ｍｌに調製
した試料を用いた。

実験方法 マイクロプレート［横８ウエル（Ａ−Ｈ列）、縦９ウエ
ル（１〜９番）］を用い、Ａ列の１〜９番の各ウェルに
下記の試料５０μｇ加えた。

ウェル番号１：陽性コントロールを２％ＥＡＣＡ溶液で
所定濃度に溶解した試料液 ウェル番号２及び３：２％ＥＡＣＡで溶解したプラスミ
ノーゲン検体 ウェル番号４：陽性コントロールを２％リジン溶液で所
定濃度に溶解した試料液 ウェル番号５及び６：２％リジンで溶解したプラスミノ
ーゲン検体 ウェル番号７：陽性コントロールを緩衝液Ｉで所定濃度
に溶解した試料液 ウェル番号８及び９：緩衝液Ｉで溶解したプラスミノー
ゲン検体 また、各ウェル番号のＢ−Ｈ列のウェルには、それぞれ
に対応する希釈用液（即ち、２％ＥＡＣＡ溶液、２％リ
ジン溶液及び緩衝液Ｉ）を２５μｇ加えた。常法に準じ
てオートダイリュター（２５μｇ）を使用してＡ列から
Ｈ列へと倍々希釈し、希釈列を形成した。次いで、ウェ
ル番号１．２．４．５．７及び８のＡ−Ｈ列の各ウェル
にはＡＴＬ感作粒子、ウェル番号３．６及び９のＡ−Ｈ
列のウェルにはＡＴＬウィルス未感作粒子を添加し、軽
く振盪した後、１時間静置して凝集の有無を観察した。

その結果を第２表に示す。なお、第２表中、−は非凝集
、士は凝集と非凝集の中間の状態、＋は凝集を示す。

（以下余白） 第２表に示されるように、緩衝液Ｉを希釈用液として用
いた系（ウェル番号８及び９）においては非特異凝集が
生じ、この系ではＡＴＬウィルス抗体の測定は不可能で
あるが、検体希釈用液として２％ＥＡＣＡ溶液及び２％
リジン溶液を用いた系においては、陽性コントロール及
び陰性コントロール（未感作粒子）とも正常に機能して
おり、本試験に使用したプラスミノーゲンバルク製剤は
ＡＴＬウィルス抗体陰性であることが確認できた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ゼラチン粒子又は表面にゼラチンをコートした粒子
   を用いる間接凝集反応試験法において、検体の希釈用液
   としてプラスミン阻害剤を含有する溶液を使用すること
   を特徴とする間接凝集反応試験法。 ２、プラスミン阻害剤が、ε−アミノカプロン酸又はＬ
   −リジンである請求項１記載の間接凝集反応試験法。 ３、検体が、血清又は血液製剤である請求項１又は２記
   載の間接凝集反応試験法。 ４、測定対象が、血清中又は血液製剤中のＡＴＬ抗体で
   ある請求項３記載の間接凝集反応試験法。 ５、プラスミン阻害剤を含有する溶液からなることを特
   徴とするゼラチン粒子又は表面にゼラチンをコートした
   粒子を用いる間接凝集反応試験法用の検体希釈用液。