CN102192888B - 一种测定促甲状腺激素的长光程酶联免疫分析法和试剂盒 - Google Patents
一种测定促甲状腺激素的长光程酶联免疫分析法和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种测定促甲状腺激素的长光程酶联免疫分析法,还提供了该方法的试剂盒。测定步骤包括:免疫反应、分离、显色、测量和数据处理。采用长光程流动样品池和光纤光谱仪进行测量,通过增加测量光程、采用低本底底物液、以及各组分制备和方法学优化使检测灵敏度达到0.015mIU/L,和使用同样抗体的、优化的常规酶联免疫分析法比较,灵敏度提高了4倍。测定线性范围为0.05~20mIU/L。免疫反应在包被管中进行,反应模式为双抗体夹心一步法。试剂盒包括抗体包被管、系列校准品、酶标记物、浓缩洗涤液、低本底底物液、终止液及终产物稀释液。本方法灵敏度高,测定范围适当,可以满足临床检测的需要。同时试剂盒制造成本低,有利于普及应用。
Description
技术领域
本发明涉及体外免疫分析技术领域,尤其是涉及一种测定促甲状腺激素(ThyroidStimulating Hormone,TSH)的长光程酶联免疫分析法和试剂盒。
背景技术
TSH是垂体前叶分泌的、促进甲状腺生长和机能的碱性糖蛋白激素。含211个氨基酸。糖类约占整个分子的15%,整个分子由两条肽链-α链和β链组成,分子量为25000~28000D。TSH分子α亚基的氨基酸序列与其它的糖蛋白激素如促黄体素(LH)、促卵泡素(FSH)和人绒毛膜促性腺素(HCG)的α亚基基本相同。β亚基为TSH所特有的,决定TSH的特异性。血清中除有生物活性的整分子TSH外,还有无生物活性的α及β亚基。TSH全面促进甲状腺的机能,同时受下丘脑分泌的促甲状腺激素释放激素(TRH)的促进性影响,T3、T4反馈性的抑制性影响,它们相互作用,组成下丘脑-垂体-甲状腺轴,血清中TSH的准确测定,是判断甲状腺和下丘脑-垂体-甲状腺轴的功能是否正常的首选指标之一,我国食品药品监督局已批准多种TSH检测药盒或试剂盒用于临床诊断。
TSH检测的难度主要是临床诊断要求很高的灵敏度。人血清中TSH含量低,正常值约在0.4~4.0mIU/L(57~712ng/L)范围,甲亢患者一般低于正常范围,相当部分的患者TSH小于0.04mIU/L,毒性弥漫性甲状腺肿甚至小于0.01mIU/L。高灵敏的TSH检测方法能显著地扩大其在临床诊断中的作用(Carole A.S pencer,Michael Takeuchi,Margarita Kazarosyan Currentstatus and performance goals for serum thyrotropin(TSH)assays.Clinical chemistry 42:1(1996)140-145)。
临床诊断中检测TSH的方法主要是非竞争性的双位点夹心免疫分析法(IMA),此方法测量信号的大小与待检物含量呈正比关系。根据标记物的不同,可分为免疫放射分析、酶联免疫分析、时间分辨荧光免疫分析和全自动化学发光免疫分析等。目前全自动化学发光分析法被认为具有灵敏度优势(0.01~0.02mIU/L),成为市场中的主流,但其仪器和试剂价格昂贵。酶联免疫分析具有试剂盒制造技术较成熟、制造成本较低、无放射性污染等优点,但测量仪器酶标仪采用传统的分光光度法,测量灵敏度低,直接影响了TSH测定的灵敏度。
分光光度法测量吸光度遵从朗伯-比尔定律:A=εbc(A为吸光度,ε为摩尔消光系数,b为测量光程,c为检测物的浓度)。由上式可知,当检测物浓度一定时,吸光度与测量光程成正比,所以可以通过增大有效光程的途径提高测量灵敏度。近年出现了用石英材料制作的长光程流动样品池,长可达2米,被测液流过样品池,光信号通过光纤传导到光纤光谱仪测定。长光程技术应用于食品质量检测、化学浓度分析、水质检测等领域,灵敏度较常规方法提高了数十倍(马剑,张敏,袁东星.反液相流动注射-长光程多波长分光光度法测定饮水中超痕量亚硝酸盐.分析化学37:2(2009年)p313)。将长光程光纤光谱技术引入到酶联免疫分析中,作为测量信号的手段,能显著提高试剂盒的灵敏度。如采用1米的长光程样品池和吸收光程0.01米的微孔板相比,根据朗伯-比尔定律测量灵敏度将提高100倍以上。
长光程技术、酶联免疫分析技术相结合的测定TSH的长光程酶联免疫分析法和试剂盒,具有灵敏度高、测定范围适当、试剂盒制造成本低的优点。
发明内容
(一)要解决的技术问题
为了克服现有酶联免疫分析法灵敏度不足的缺点,本发明提供一种长光程光纤光谱酶联免疫分析法,基于此方法提供一种测定TSH的长光程光纤光谱酶联免疫分析法,并提供一种实施上述方法的TSH长光程光纤光谱酶联免疫分析试剂盒,用于满足检测人血清样品的要求。
(二)技术方案
本发明为一种长光程光纤光谱酶联免疫分析法,是将现有的酶联免疫分析测量信号的方法--分光光度法改变成采用长光程流动样品池和光纤光谱仪测量的方法。所述长光程流动样品池为熔石英管,长度不小于0.5米,通过SMA接头和传输光信号的光纤耦合;光纤光谱仪光源为氘-卤灯或氘-卤钨灯或卤钨灯,测量波长范围是400~900nm。测量时,将反应终产物稀释液注入长光程样品池,入射光也通过光纤传导同时打入样品池,经过样品吸收后,信号光再通过光纤传导给光纤光谱仪,测量吸收光谱和吸光度。本发明将长光程技术、光纤光谱技术和酶免疫分析技术相结合,建立长光程光纤光谱酶联免疫分析法,提高免疫分析的灵敏度。
本发明一种测定促甲状腺激素(TSH)的长光程酶联免疫分析法,采用长光程流动样品池(LPC)和光纤光谱仪测量酶联免疫分析反应终产物的吸光度,它包括以下步骤:
(1)样品和酶标记物及固相捕捉剂温育;
(2)固液相分离使酶标记物结合部分和游离部分分离;
(3)向酶标记物结合部分加入低本底底物液,发生酶催化显色反应;
(4)把反应终产物稀释,并注入长光程流动样品池,用光纤光谱仪测量吸光度;
(5)数据处理,根据测定的吸光度值检测待检物的浓度。
其中,上述的长光程流动样品池为熔石英管,长度不小于0.5米,通过SMA接头和传输光信号的光纤耦合,用来检测低浓度样品的含量。
其中,上述的光纤光谱仪的光源为氘-卤灯或氘-卤钨灯或卤钨灯,测量波长范围是400~900nm。
其中,上述的固相捕捉剂为固定在试管内壁上的抗体,试管为聚苯乙烯或聚丙烯管,管内底部为凸起的六角星形;抗体为下列之一:
(1)酶标记的是可与TSH的β亚基结合的单克隆抗体,固相捕捉剂是可与TSH整分子结合的单克隆抗体或多克隆抗体;或
(2)酶标记的是可与TSH整分子结合的单克隆抗体或多克隆抗体,固相捕捉剂是可与TSH的β亚基结合的单克隆抗体;
其中的TSH单克隆抗体是小鼠单克隆抗体,多克隆抗体是以人TSH免疫绵羊或兔得到的。
其中,上述的低本底底物液由含过氧化氢或过氧化脲的A液和含四甲基联苯胺、盐酸及甲醇的B液组成,其中过氧化氢或过氧化脲的浓度是0.015~0.12g/L,四甲基联苯胺的浓度是0.02~0.2g/L,盐酸浓度为0.1%,甲醇浓度为5%。
其中,上述的测量前反应终产物用0.05~1.0M的硫酸溶液稀释5-17倍。
其中,上述的样品是人血清、血浆或全血;酶标记物为辣根过氧化物酶与抗体的化学连接物;数据处理是根据450nm的吸光度值用标准曲线定量样品中TSH浓度。
本发明提供的测定促甲状腺激素的长光程光纤光谱酶联免疫分析试剂盒,它包括以下基本组分:
(1)抗体包被管;
(2)酶标记物;
(3)TSH系列标准品;
(4)浓缩洗涤液;
(5)低本底底物液;
(6)终止液;
(7)终产物稀释液。
其中,上述的抗体包被管为内壁上吸附有TSH抗体的聚苯乙烯或聚丙烯试管,管内底部为凸起的六角星形;抗体为下列之一:
(1)酶标记的是可与TSH的β亚基结合的单克隆抗体,包被抗体是可与TSH整分子结合的单克隆抗体或多克隆抗体;或
(2)酶标记的是可与TSH整分子结合的单克隆抗体或多克隆抗体,包被抗体是可与TSH的β亚基结合的单克隆抗体;
其中的TSH单克隆抗体是小鼠单克隆抗体,多克隆抗体是以人TSH免疫绵羊或兔得到的。
其中,上述的酶标记物为辣根过氧化物酶和TSH抗体的化学连接物。
其中,上述的低本底底物液由A、B液组成,A液由柠檬酸-磷酸盐缓冲液加过氧化氢或过氧化脲配制而成,过氧化物的浓度是0.015~0.12g/L;B液由柠檬酸-磷酸盐缓冲液加入四甲基联苯胺、盐酸及甲醇配制而成,其中四甲基联苯胺的浓度是0.02~0.2g/L,盐酸的浓度是0.1%,甲醇的浓度是5%。
其中,上述的终产物稀释液是0.05~1.0M的硫酸溶液。
本发明测定促甲状腺激素的长光程光纤光谱酶联免疫分析试剂盒的制备方法,包括下述步骤:
(1)包被管的制备
用0.01~0.05M pH 7.2~7.6的磷酸盐缓冲液稀释TSH抗体至0.2~1μg/mL,200~500μl每管加至底部六角星形聚苯乙烯管,4℃温育过夜,洗涤包被管,用含0.2%~1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液封闭,冻干机干燥,4℃贮存;
(2)TSH系列标准品的制备
采用含有0.1%~0.3%柳硫汞的小牛血清或含有1%~5%牛血清白蛋白的磷酸缓冲液将促甲状腺激素纯品配制成系列浓度,分装,-20℃贮存;
(3)酶标记物的制备
将辣根过氧化物酶的羟基用过碘酸钠氧化为醛基,在碱性条件下与促甲状腺激素抗体的氨基结合为酰胺化合物,透析后即得到酶标记物,等体积加入丙三醇,-20℃保存;
(4)浓缩洗涤液的制备
浓缩洗涤液由0.1~0.3M pH7.2~7.6的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液加入Tween20及稳定剂配制而成;
(5)低本底底物液的制备
低本底底物液由A、B液组成,A液由0.15M柠檬酸-磷酸盐缓冲液加入0.015~0.12g/L过氧化氢或过氧化脲配制而成;B液由0.15M柠檬酸-磷酸盐缓冲液加入0.02~0.2g/L四甲基联苯胺、盐酸及醇类配制而成;
(6)终止液的制备
终止液由800ml蒸馏水加入50~100ml 96~98%的浓硫酸配制而成;
(7)终产物稀释液的制备
终产物稀释液由750ml蒸馏水加入19~750ml 2M硫酸配制而成;
(8)将各组分组装成试剂盒。
本发明技术原理为:
根据朗伯-比尔定律:A=εbc(A为吸光度,ε为摩尔消光系数,b为测量光程,c为检测物的浓度),当检测物浓度一定时,吸光度与测量光程成正比。现有的酶联免疫分析采用的微孔板,最大吸收光程不足0.01米,改用长度0.5米以上的长光程流动样品池,测量光程增加了50倍以上,测量灵敏度将提高50倍以上。测量灵敏度提高将使免疫分析的灵敏度提高,特别是对于测量信号的大小与待检物含量呈正比关系的非竞争性免疫分析模式(IMA)。
本发明分析法包括以下步骤:
(1)样品和酶标记物及固相捕捉剂温育;
(2)固液相分离使酶标记物结合部分和游离部分分离;
(3)向酶标记物结合部分加入低本底底物液,发生酶催化显色反应;
(4)把反应终产物稀释,并注入长光程流动样品池,用光纤光谱仪测量吸光度;
(5)数据处理,根据测定的吸光度值检测待检物的浓度。
基于上述方法本发明提供一种测定促甲状腺激素(TSH)的长光程光纤光谱酶联免疫分析法。
采用长光程样品池提高灵敏度的同时也成倍数地放大了被测物的本底,为解决这一问题,本发明优选低本底底物液的组分、浓度配比和缓冲体系,获得了具有足够显色能力、吸收本底低、性能稳定的低本底底物液。
采用终产物稀释后测量,也可降低本底,虽然稀释使灵敏度有所损失,但稀释倍数远小于测量光程增加倍数,因而仍然能提高灵敏度。本发明采用终产物稀释5~17倍后测量。
本发明采用特制塑料试管制备抗体包被管,取代了酶免疫分析中常用的微孔板。特制的试管增大了比表面积,可增加包被抗体量,进而提高免疫分析性能。并且试管可容纳反应物多,当样品中TSH含量较高,吸光度超出仪器测量范围时,可将剩余的反应终产物稀释,再进行测量,可扩大TSH测定范围。
总之,将长光程技术、酶免疫分析技术和包被管技术相结合,建立测定促甲状腺激素(TSH)的长光程光纤光谱酶联免疫分析法,通过优选的低本底底物液、特制的包被管替代微孔板、测量前稀释以及分析条件的优化,最终使本发明较常规的酶免疫分析法灵敏度提高,且测定范围适当。
测定原理为:
TSH抗体吸附在塑料试管内壁上成为抗体包被管,辣根过氧化物酶连接TSH单克隆抗体成为酶标记物,待测样品和酶标记抗体同时加入抗体包被管中温育,管内壁上的抗体和TSH及酶标记抗体反应结合,在管内壁上生成抗体-TSH-酶标记抗体复合物,弃去管中溶液并洗涤,使酶标记物结合部分和游离部分分离,管内壁上结合的酶与TSH量呈正比关系。加入底物,酶催化底物显色,将终产物稀释后注入长光程样品池,入射光也通过光纤传导同时打入样品池,经过样品吸收后,信号光再通过光纤传导给光纤光谱仪,测量450nm吸光度值。吸光度值与TSH含量呈正比关系。采用系列浓度的标准品可以获得标准曲线,从曲线上查得待测物的TSH浓度。
测定包括以下步骤:
(1)将人血清样品或标准品和辣根过氧化物酶标记的TSH抗体加入TSH包被管中温育;
(2)洗涤抗体包被管;
(3)加入低本底底物液温育;
(4)加入终止液;
(5)稀释反应终产物;
(6)把反应终产物稀释液注入长光程流动样品池,用光纤光谱仪测量吸光度;
(7)数据处理;
优选地,其中TSH抗体包被管是识别TSH整分子的单克隆抗体或多克隆抗体包被在试管内壁上,辣根过氧化物酶标记的是识别TSHβ亚基的单克隆抗体;或者抗体包被管上是识别TSHβ亚基的单克隆抗体,辣根过氧化物酶标记的是识别TSH整分子的单克隆抗体或多克隆抗体。TSH单克隆抗体为鼠抗人TSH抗体,TSH多克隆抗体为以人源性TSH为免疫原对绵羊或兔进行免疫得到的。
其中试管为聚苯乙烯或聚丙烯材料,特制为管内底部为凸起的六角星形。
优选地,其中低本底底物液本底低,适合长光程流动样品池测定。低本底底物液由A、B液组成;A液过氧化氢或过氧化脲的浓度是0.015~0.12g/L;B液的四甲基联苯胺的浓度是0.02~0.2g/L、盐酸浓度为0.1%和甲醇浓度为5%。
优选地,其中终产物稀释液为0.05~1.0M的硫酸溶液。
其中所述长光程流动样品池为不小于0.5米的熔石英管,通过SMA接头和传输光信号的光纤耦合;光纤光谱仪测量波长范围是400~900nm,光源为氘-卤灯或氘-卤钨灯或卤钨灯;数据经过软件处理后直接在计算机上显示出450nm时的吸光度。
其中所述数据处理是用TSH浓度的对数值做横坐标,吸光度值的对数值为纵坐标,制作标准曲线,根据样品的吸光度值,从标准曲线上读出TSH含量。也可以用计算机专业软件完成数据处理。
为方便起见,可以以试剂盒的形式提供本发明的测定方法,此类试剂盒是一种包装组合物,其包括的基本组分有:
(1)抗体包被管;
(2)酶标记物;
(3)TSH系列标准品;
(4)浓缩洗涤液;
(5)低本底底物液;
(6)终止液;
(7)终产物稀释液。
其中所述抗体包被管是识别TSH整分子或β亚基的多克隆或单克隆抗体,包被在特制的六角星形的聚苯乙烯管内壁上,抗体包被浓度是0.2~2.0mg/L。
其中所述酶标记物采用的是识别TSH的β亚基或整分子的单克隆抗体或多克隆抗体,使用的酶是辣根过氧化物酶,标记方法是过碘酸钠法。
其中所述TSH系列标准品为小牛血清或含牛血清白蛋白缓冲液中加入TSH纯品及0.1%~0.3%的柳硫汞配而制成,浓度为0、0.05、0.3、4.0、10.0和20.0mIU/L。
其中所述浓缩洗涤液为含有0.3%~0.8%Tween20和0.1%~0.3%柳硫汞的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液。
其中所述低本底底物液由A、B液组成,A液由0.15M柠檬酸-磷酸盐缓冲液加入过氧化氢或过氧化脲配制而成,B液由0.15M柠檬酸-磷酸盐缓冲液加入四甲基联苯胺及稳定剂配制而成。A液的过氧化物的浓度是0.015~0.12g/L;B液的四甲基联苯胺浓度是0.02~0.2g/L、盐酸的浓度是0.1%、甲醇的浓度是5%。
其中所述终止液和终产物稀释液为硫酸溶液,浓度分别为1~2M和0.05~1.0M。
其中所述试剂盒的制备方法为:
(1)抗体包被管的制备
用0.01~0.05M,pH 7.2~7.6的磷酸盐缓冲液稀释TSH抗体至0.2~2mg/L,以200μL/管加入六角星形聚苯乙烯管中,4℃下过夜;弃去上清,用含1%~3%牛血清白蛋白的0.01~0.05M,pH 7.2~7.6的磷酸盐缓冲液37℃下封闭2小时,反应结束后弃去封闭液,冻干机干燥,4℃保存,以备使用;
(2)TSH系列标准品的制备
采用含有0.1%~0.3%的柳硫汞,经56℃下灭活0.5~2.0小时的小牛血清或含1%~5%牛血清白蛋白的磷酸缓冲液将TSH纯品配制成浓度为0~20mIU/L的一系列标准品,分装,4℃或-20℃保存,以备使用;
(3)酶标记物的制备
将辣根过氧化物酶的羟基用过碘酸钠氧化为醛基,在碱性条件下与TSH抗体的氨基结合为酰胺化合物,透析后即得到TSH酶标抗体酶标记物,在标记好的溶液中,等体积加入丙三醇,-20℃保存,以备使用;
(4)浓缩洗涤液的配制
0.1M~0.3M,pH7.2~7.6的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液加入0.3%~0.8%的Tween20和0.1%~0.3%柳硫汞的配制而成;
(5)低本底底物液的配制
低本底底物液由A液、B液组成,A液由0.15M柠檬酸-磷酸盐缓冲液加入0.015~0.12g/L的过氧化氢或过氧化脲配制而成;B液由0.15M柠檬酸-磷酸盐缓冲液加入0.02~0.2g/L四甲基联苯胺、0.1%的盐酸、5%甲醇配制而成,使用时体积比1∶1混合;
(6)终止液的配制
终止液由800ml蒸馏水加入50~100ml 96%~98%的浓硫酸配制而成;
(7)终产物稀释液的配制
终产物稀释液由750ml蒸馏水加入19~750ml 2M硫酸配制而成;
(8)将上述所制备的各组分组装成试剂盒。
(三)有益效果
本发明提供了一种测定促甲状腺激素(TSH)的长光程光纤光谱酶联免疫分析法,并提供配套试剂盒,其中测量采用长光程流动样品池、匹配光纤光谱仪进行,通过加大测量光程并配合与其相适应的低本底底物液、采用特制的包被管以及方法学优化,使TSH检测的灵敏度达到最小检测限0.015mIU/L,和使用同样抗体的、优化了的常规酶联免疫分析法比较灵敏度提高了4倍(参见下表1),TSH标准品的最低浓度为0.05mIU/L。
免疫反应在特制的抗体包被管中进行,包被管底部为凸起的六角星形,比表面积大,吸附抗体多,有利于免疫反应。同时反应体积灵活,配合适当的稀释步骤,使标准曲线线性范围达到0.05~20mIU/L。
本发明实现较高的分析灵敏度,较宽的标准曲线线性范围,使TSH检测性能有较大改善,明显优于常规的酶免疫分析,可以满足临床检测的需要。同时保持了低的制造成本,有利于普及应用。
表1本发明与部分现有TSH酶联免疫分析(ELISA)灵敏度比较*
数据来源 | 本发明 | a | b | c |
灵敏度mIU/L | 0.015 | 0.06 | 0.1 | 0.05 |
*其中表中a~c为:a和本发明使用同样抗体的ELISA(见下表表2);b美国临床化学杂志1985年31卷第7期第1131-1134页;c美国商品超敏酶联免疫分析试剂盒产品说明书。
附图说明
图1表示促甲状腺激素长光程酶联免疫分析的典型标准曲线。
图2表示促甲状腺激素长光程酶联免疫分析试剂盒37℃的稳定性。
图3表示促甲状腺激素长光程酶联免疫分析试剂盒与同类产品检测值对照。
具体实施方式
这里描述的一种测定促甲状腺激素的长光程酶联免疫分析法,它含有,光源采用氘-卤灯、氘-卤钨灯或卤钨灯光源,优选卤钨灯光源;样品池采用不小于0.5m的熔石英管流动样品池,优选1.0m的熔石英管流动样品池;检测工具采用光纤光谱仪,优选3648像素CCD,600线/mm VB光栅,可测光谱范围400-900nm,分辨率0.27nm,10微米狭缝SLIT-10,灵敏度增强透镜DCL-UV/VIS,消二级衍射效应镀膜OSC的光纤光谱仪,例如荷兰avantes的AvaSpec-3648-USB2光纤光谱仪。测定方法包括以下步骤:
(1)将样品、标准品和辣根过氧化物酶标记加入TSH抗体包被管中温育;
(2)洗涤抗体包被管;
(3)加入低本底底物液温育;
(4)加入终止液;
(5)稀释反应终产物;
(6)把反应终产物稀释液注入长光程流动样品池,用光纤光谱仪测量吸光度;
(7)数据处理;
这里所述的抗体包被管的固相可以是基本不溶于水且可用于免疫测定的任何惰性支持物或载体,包括常用的聚苯乙烯,聚丙烯,聚乙烯塑料珠,微孔板及试管,优选底部为凸起的六角星形聚苯乙烯试管,TSH抗体吸附在管内壁上;标准品采用小牛血清基质或牛血清白蛋白缓冲液基质,加入TSH纯品及稳定剂配制成的TSH系列校准品;辣根过氧化物酶标记物为辣根过氧化物酶与TSH抗体的连接物,标记方法采用过碘酸钠法;洗涤液由浓缩洗涤液按体积比10∶1稀释配制而成,浓缩洗涤液为0.3%~0.8%Tween20及0.1%~0.3%柳硫汞的0.1~0.3M,pH7.2~7.6的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液;低本底底物液由A、B液组成,0.15M柠檬酸-磷酸盐缓冲液加入过氧化氢或过氧化脲配成A液;0.15M柠檬酸-磷酸盐缓冲液加入四甲基联苯胺、盐酸及醇类配成B液;终止液是1~2M硫酸溶液;终产物稀释液为0.05~1.0M的硫酸溶液。
为方便起见,以试剂盒的形式提供本发明的测定方法,此类试剂盒是一个包装组合物,其包括的基本元素有:
(1)抗体包被管;
(2)酶标记物;
(3)TSH系列标准品;
(4)浓缩洗涤液;
(5)低本底底物液;
(6)终止液;
(7)终产物稀释液。
上述试剂盒的制备方法包括下述步骤:
(1)抗体包被管的制备
采用0.03M,pH 7.2的磷酸盐缓冲液稀释TSH抗体至0.6mg/L,取200μL加入到每支聚苯乙烯管中,4℃过夜;弃去反应液,每管加入含1%牛血清白蛋白的0.03M pH 7.2的磷酸盐缓冲液300ml,37℃封闭2小时,弃去封闭液,冷冻机干燥或室温晾干,4℃保存,以备使用;
(2)TSH系列标准品的配制
用含有0.2%柳硫汞,56℃灭活1.0小时的小牛血清将TSH纯品稀释成浓度为0、0.05、0.3、4.0、10、20mIU/L的系列标准品,每瓶1.0ml分装,-20℃保存,以备使用;
(3)酶标记物的制备
称取辣根过氧化物酶5mg溶于1ml的蒸溜水中,充分溶解;加入0.1mol/L的过碘酸钠水溶液1ml,混匀,4℃放置30min进行醛化;加入0.16mol/L的乙二醇水溶液1ml,4℃静置60min终止反应;加入3mg抗TSH抗体,混匀,移入透析袋内对0.05M,pH 9.6的碳酸缓冲液透析,4℃过夜;取出透析液,加入新鲜配制的硼氢化钠水溶液0.5ml(5g/L),4℃静置2h;加入等体积饱和硫酸铵,4℃静置2h,取出反应液3500r/min离心30min,弃去上清,沉淀物用3mL 0.05MpH7.4磷酸盐缓冲液溶解,并对0.05MpH7.4磷酸盐缓冲液透析过夜;取出透析液,加入体积相等的丙三醇,-20℃保存,以备使用;
将标记好的酶标记物按照1∶3000的比例加入到含有0.2%牛血清白蛋白和0.1%柳硫汞的0.05M,pH7.4磷酸盐缓冲液中,混合均匀,即得到酶标记物工作液;
(4)低本底底物液的配制
低本底底物液由A、B液组成,A液由0.15M柠檬酸-磷酸盐缓冲液加入0.045g/L过氧化脲配制而成;B液由0.15M柠檬酸-磷酸盐缓冲液加入0.075g/L四甲基联苯胺,0.1%的盐酸及5%甲醇配制而成;
将A、B液按体积比1∶1混合均匀,即为低本底底物液;
(5)浓缩洗涤液的制备
浓缩洗涤液由NaH2PO4·2H2O 2.1g、Na2HPO4·12H2O 25.6g、NaCl 85g、8ml Tween20、硫柳汞1.5g及蒸馏水1000ml配制而成;
(6)终止液的制备
800ml蒸馏水加入50ml 96%~98%的浓硫酸配制而成;
(7)终产物稀释液的制备
750ml蒸馏水加入40ml 2M硫酸配制而成。
上述试剂盒的使用方法,包括以下操作步骤:
(1)人血清样本采集
采用正确医用技术,收集空腹晨血样本,取血清进行分析(严重溶血或溶脂的样本不能用于测定)。血清样本在室温放置不可超过8小时,如果不在8小时内检测需将样本放置于2~8℃的冰箱保存;如需超过72小时以上的保存或运输,则应冻存于-20℃,避免反复冻融。使用前恢复到室温,轻轻摇匀。
(2)实验前准备
a)将试剂盒提供的浓缩洗涤液加入10倍蒸馏水稀释,以备使用;
b)将恒温箱温度调到37℃,待温度稳定后使用。
(3)免疫反应及数据处理
a)取出一定量的TSH抗体包被管,编号,每管加入125μl人血清样品、标准品和75μl酶标记物工作液,轻轻摇匀,37℃温育2h;
b)弃管中反应液,每管加入洗涤液300μl洗涤4次,在吸水纸上拍干。
c)每管加入低本底底物液200μl,充分混匀,室温避光显色20min;
d)每管加入终止液50μl,充分混匀,确保蓝色完全转变为黄色。
e)每管加入终产物稀释液3ml,充分混匀;
f)光纤光谱仪检测每管吸光度值;
g)采用双对数拟合方式,以标准品浓度值的对数值为X轴,以标准品吸光度值的对数值为Y轴,建立标准曲线。根据待测样品的吸光度值计算其相应的浓度值。
以下结合实施例进一步说明本发明。
实施例1
本发明提供的TSH长光程酶联免疫分析方法与常规TSH酶联免疫分析方法比较:采用与本发明相同的抗体建立常规TSH酶联免疫分析方法,经方法学优化,灵敏度为0.06mIU/L,线性范围为0.3~20mIU/L;本发明分析方法的灵敏度是0.015mIU/L,线性范围为0.05~20mIU/L;本发明分析方法灵敏度较常规酶联免疫分析方法提高了4倍,具有明显灵敏度,线性范围优势(见下表2)。表中线性范围指第一个浓度不为零标准点与最高浓度标准点之间的范围;信噪比指第一个浓度不为零标准点与零标准点的比值;R为标准曲线经双对数数据处理的线性相关系数。
表2本发明TSH分析方法与常规TSH酶免疫分析方法的比较
实施例2
按照本发明所述的TSH分析方法及操作步骤,采用0.5m熔石英管作为流动样品池,进行免疫分析实验,得到较好的标准曲线、灵敏度及信噪比(见表3)。
表30.5m熔石英管流动样品池的实验结果
实施例3
按照本发明所述的TSH分析方法及操作步骤,采用1.0m熔石英管作为流动样品池,进行免疫分析实验,得到比较理想的标准曲线、灵敏度及信噪比(见表4)。
表41.0m熔石英管流动样品池的实验结果
实施例4
按照本发明所述的TSH分析方法及操作步骤,采用1.0m熔石英管作为流动样品池,低本底底物A液H2O2浓度为0.06g/L,低本底底物B液TMB浓度为0.02~0.2g/L,进行免疫分析实验,得到比较理想的标准曲线及信噪比(见表5)。
表5 0.02~0.2g/L TMB浓度的实验结果
实施例5
按照本发明所述的TSH分析方法及操作步骤,采用1.0m熔石英管作为流动样品池,低本底底物B液TMB浓度为0.075g/L,低本底底物A液H2O2浓度为0.015~0.12g/L,进行免疫分析实验,得到比较理想的标准曲线及信噪比(见表6)
表6 0.015~0.12g/L H2O2浓度的实验结果
实施例6
按照本发明所述的TSH分析方法及操作步骤,采用1.0m熔石英管作为流动样品池,低本底底物A液H2O2浓度为0.045g/L,低本底底物B液TMB浓度为0.075g/L,终产物稀释液为0.05~1.0M硫酸溶液,进行免疫分析实验,得到比较理想的标准曲线、信噪比及终产物稳定时间(见表7)。
表7 0.05~1.0M硫酸稀释液的实验结果
实施例7
按照本发明所述的TSH分析方法及操作步骤,采用1.0m熔石英管作为流动样品池,低本底底物A液H2O2浓度为0.045g/L,低本底底物B液TMB浓度为0.075g/L,终产物稀释液为0.1M硫酸溶液,经条件优化实验后,进行免疫分析,得到标准曲线线性范围为0.05~20mIU/L,线性系数R2为0.9962,灵敏度为0.015mIU/L(如附图1所示)。
实施例8
按照本发明所述的TSH分析方法及操作步骤,采用1.0m熔石英管作为流动样品池,低本底底物A液H2O2浓度为0.045g/L,低本底底物B液TMB浓度为0.075g/L,终产物稀释液为0.1M硫酸溶液,经条件优化实验后,进行精密度实验,批内变异小于10%、批间变异小于15%(见表8)。
表8精密度实验结果
实施例9
按照本发明所述的TSH分析方法及操作步骤,采用1.0m熔石英管作为流动样品池,低本底底物A液H2O2浓度为0.045g/L,低本底底物B液TMB浓度为0.075g/L,终产物稀释液为0.1M硫酸溶液,经条件优化实验后,将已知浓度的TSH标准品分别加入到3份不同浓度人血清样品中,测定其TSH浓度,进行回收实验,回收率在92.4%~111.1%之间(见表9)。
表9回收实验结果
实施例10
按照本发明所述的TSH分析方法及操作步骤,采用1.0m熔石英管作为流动样品池,0.045g/L的低本底底物A液,0.075g/L的低本底底物B液,0.1M硫酸终产物稀释液,用零标准品对高浓度TSH类似物FSH、LH、HCG纯品进行系列稀释,并作为样品在本系统中测定,进行特异性实验,本发明与上述类似物无明显交叉反应(见表10)。
表10特异性实验结果
实施例11
按照本发明所述的TSH分析方法及操作步骤,采用1.0m熔石英管作为流动样品池,0.045g/L低本底底物A液,0.075g/L低本底底物B液,0.1M硫酸终产物稀释液,对于37℃于放置3、7、14天的整体试剂盒进行试剂盒稳定性实验,并与4℃放置试剂盒对照,考察其热稳定性能,整体试剂盒37℃于放置3、7、14天没有显著性下降(如附图2所示)。
实施例12
按照本发明所述的TSH分析方法及操作步骤,采用1.0m熔石英管作为流动样品池,0.045g/L低本底底物A液,0.075g/L低本底底物B液,0.1M硫酸终产物稀释液,用本试剂盒和药检局注册产品(TSH免放试剂盒)同时对40例临床血清样品进行测定,测定值的相关方程为:y=0.9446x+0.253;相关系数R2为0.9442(如附图3所示)。
尽管已经描述了本发明以及它们的具体实施方案,应当理解它并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种测定促甲状腺激素(TSH)的长光程酶联免疫分析法,其特征在于,采用长光程流动样品池(LPC)和光纤光谱仪测量酶联免疫分析反应终产物的吸光度,它包括以下步骤:
(1)样品和酶标记物及固相捕捉剂温育;
(2)固液相分离使酶标记物结合部分和游离部分分离;
(3)向酶标记物结合部分加入低本底底物液,发生酶催化显色反应;
(4)把反应终产物稀释,并注入长光程流动样品池,用光纤光谱仪测量吸光度;
(5)数据处理,根据测定的吸光度值检测待检物的浓度;
固相捕捉剂为固定在试管内壁上的抗体,试管为聚苯乙烯或聚丙烯管,管内底部为凸起的六角星形;抗体为下列之一:
(1)酶标记的是可与TSH的β亚基结合的单克隆抗体,固相捕捉剂是可与TSH整分子结合的单克隆抗体或多克隆抗体;或
(2)酶标记的是可与TSH整分子结合的单克隆抗体或多克隆抗体,固相捕捉剂是可与TSH的β亚基结合的单克隆抗体;
其中TSH单克隆抗体是小鼠单克隆抗体,多克隆抗体是以人TSH免疫绵羊或兔得到的;
低本底底物液由含过氧化氢或过氧化脲的A液和含四甲基联苯胺、盐酸及甲醇的B液组成,其中过氧化氢或过氧化脲的浓度是0.015~0.12g/L,四甲基联苯胺的浓度是0.02~0.2g/L,盐酸浓度为0.1%,甲醇浓度为5%。
2.根据权利要求1所述的免疫分析法,其特征在于,长光程流动样品池为熔石英管,长度不小于0.5米,通过SMA接头和传输光信号的光纤耦合,用来检测低浓度样品的含量。
3.根据权利要求1或2所述的免疫分析法,其特征在于,光纤光谱仪的光源为氘-卤灯或氘-卤钨灯或卤钨灯,测量波长范围是400~900nm。
4.根据权利要求3所述免疫分析法,其特征在于,测量前反应终产物用0.05~1.0M的硫酸溶液稀释5-17倍。
5.根据权利要求4所述免疫分析法,其特征在于,其中样品是人血清、血浆或全血;酶标记物为辣根过氧化物酶与抗体的化学连接物;数据处理是根据450nm的吸光度值用标准曲线定量样品中TSH浓度。
6.一种实施权利要求1~5所述免疫分析法之一的测定TSH的长光程光纤光谱酶联免疫分析试剂盒,其特征在于,它包括以下基本组分:
(1)抗体包被管;
(2)酶标记物;
(3)TSH系列标准品;
(4)浓缩洗涤液;
(5)低本底底物液;
(6)终止液;
(7)终产物稀释液;
抗体包被管为内壁上吸附有TSH抗体的聚苯乙烯或聚丙烯试管,管内底部为凸起的六角星形;抗体为下列之一:
(1)酶标记的是可与TSH的β亚基结合的单克隆抗体,包被抗体是可与TSH整分子结合的单克隆抗体或多克隆抗体;或
(2)酶标记的是可与TSH整分子结合的单克隆抗体或多克隆抗体,包被抗体是可与TSH的β亚基结合的单克隆抗体;
其中TSH单克隆抗体是小鼠单克隆抗体,多克隆抗体是以人TSH免疫绵羊或兔得到的;
低本底底物液由A、B液组成,A液由柠檬酸-磷酸盐缓冲液加过氧化氢或过氧化脲配制而成,过氧化物的浓度是0.015~0.12g/L;B液由柠檬酸-磷酸盐缓冲液加入四甲基联苯胺、盐酸及甲醇配制而成,其中四甲基联苯胺的浓度是0.02~0.2g/L,盐酸的浓度是0.1%,甲醇的浓度是5%。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,酶标记物为辣根过氧化物酶和TSH抗体的化学连接物。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,终产物稀释液是0.05~1.0M的硫酸溶液。
9.一种适用权利要求6~8之一所述试剂盒的制备方法,其特征在于,包括下述步骤:
(1)包被管的制备
用0.01~0.05M pH 7.2~7.6的磷酸盐缓冲液稀释TSH抗体至0.2~1μg/mL,200~500μl每管加至底部六角星形聚苯乙烯管,4℃温育过夜,洗涤包被管,用含0.2%~1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液封闭,冻干机干燥,4℃贮存;
(2)TSH系列标准品的制备
采用含有0.1%~0.3%柳硫汞的小牛血清或含有1%~5%牛血清白蛋白的磷酸缓冲液将促甲状腺激素纯品配制成系列浓度,分装,-20℃贮存;
(3)酶标记物的制备
将辣根过氧化物酶的羟基用过碘酸钠氧化为醛基,在碱性条件下与促甲状腺激素抗体的氨基结合为酰胺化合物,透析后即得到酶标记物,等体积加入丙三醇,-20℃保存;
(4)浓缩洗涤液的制备
浓缩洗涤液由0.1~0.3M pH7.2~7.6的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液加入Tween20及稳定剂配制而成;
(5)低本底底物液的制备
低本底底物液由A、B液组成,A液由0.15M柠檬酸-磷酸盐缓冲液加入0.015~0.12g/L过氧化氢或过氧化脲配制而成;B液由0.15M柠檬酸-磷酸盐缓冲液加入0.02~0.2g/L四甲基联苯胺、盐酸及醇类配制而成;
(6)终止液的制备
终止液由800ml蒸馏水加入50~100ml 96~98%的浓硫酸配制而成;
(7)终产物稀释液的制备
终产物稀释液由750ml蒸馏水加入19~750ml 2M硫酸配制而成;
(8)将各组分组装成试剂盒。
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