CN103275226B

CN103275226B - 特异性抗人上皮细胞粘附分子（EpCAM）的单克隆抗体的制备、鉴定及应用

Info

Publication number: CN103275226B
Application number: CN201310231680.3A
Authority: CN
Inventors: 魏海明; 郑小虎; 范晓蕾; 田志刚; 孙汭
Original assignee: University of Science and Technology of China USTC
Current assignee: Hefei Ruida Immune Drug Research Institute Co Ltd
Priority date: 2013-06-09
Filing date: 2013-06-09
Publication date: 2017-08-29
Anticipated expiration: 2033-06-09
Also published as: CN103275226A

Abstract

本发明涉及到两种抗人上皮细胞粘附分子(EpCAM)的单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性针对人上皮细胞粘附分子第24至265位的氨基酸序列，本发明还涉及生产这两种单克隆抗体的杂交瘤细胞株CCTCC NO：C201371和CCTCC NO：C201373，本发明还涉及单克隆抗体的制备方法及应用，本发明中EpCAM‑mAb‑AE4和EpCAM‑mAb‑AE7单克隆抗体可以用于流式和免疫荧光检测白血病患者外周血和肿瘤标本中EpCAM蛋白的表达，还可以介导ADCC体外杀伤肿瘤细胞和体内肿瘤的治疗。

Description

特异性抗人上皮细胞粘附分子（EpCAM）的单克隆抗体的制备、鉴定及应用

技术领域

本发明涉及到两株抗人EpCAM的单克隆抗体。具体地说，涉及到对EpCAM第24至265位氨基酸序列中的位点有特异性的单克隆抗体，本发明还涉及产生这两种单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以及所述单克隆抗体的制备方法和应用。

背景技术

循环肿瘤细胞的发现最早在1869年，被定义为起源于原位肿瘤病灶或肿瘤转移病灶，并能够在病人的外周血中循环而在正常人的外周血中极少存在的一类肿瘤细胞。肿瘤诱发的血管生成通常伴随着肿瘤的侵袭，其结果是增加原位肿瘤释放高侵袭性肿瘤细胞进入外周循环的可能性。而高侵袭能力的循环肿瘤细胞不仅可以在远端器官内建立新的肿瘤病灶，也能够以肿瘤自播的形式回到原位肿瘤所在的器官内建立新的肿瘤病灶。临床癌症患者死亡率高的一个重要因素就是转移后肿瘤细胞的存在，另外循环肿瘤细胞的存在也是肿瘤手术切除后复发的主要原因。目前可行的几种循环肿瘤细胞检测平台已经通过多项临床研究证实，对于循环肿瘤细胞的检测有助于对恶性肿瘤的诊断和预后评估以及对肿瘤复发和抗癌治疗效果的监测。

上皮细胞粘附分子(EpCAM：epithelial cell adhesion molecule)，又称：ESA；KSA；M4S1；MK-1；DIAR5；EGP-2；EGP40；KS1/4；MIC18；TROP1；EGP314；HNPCC8；TACSTD1等，表达于所有正常的上皮细胞，在肿瘤细胞和增殖活跃的细胞上则呈现不同程度的表达上升，是最早被鉴定出与肿瘤相关的抗原之一。研究表明EpCAM也在肿瘤干细胞表面表达，它是wnt通路的信号受体和激活蛋白，而wnt通路调节着癌基因(比如 c-myc)的表达。因此，EpCAM分子的表达从基础上关系到肿瘤的发生和发展。

由于EpCAM分子表达于多种肿瘤细胞的表面，将抗EpCAM的抗体用于循环肿瘤细胞的诊断和治疗会获得更广泛的应用。同时通过鉴定该抗体的功能，探讨以EpCAM分子作为靶标的生物治疗也具有重要的临床意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种对人上皮细胞粘附分子(EpCAM)分子有特异性的单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性针对人EpCAM第24至265位的氨基酸序列。

本发明的又一个目的是提供产生单克隆抗体的杂交瘤细胞株EpCAM-mAb-AE4和EpCAM-mAb-AE7。由这两株杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体在本文中分别简称为AE4单克隆抗体和AE7单克隆抗体。

本发明的又一个目的是提供本发明的单克隆抗体的制备方法。

本发明的又一个目的是提供AE4和AE7的单克隆抗体在流式细胞术检测白血病患者外周血内EpCAM表达实验中的应用。

本发明的又一个目的是提供AE4和AE7的单克隆抗体在细胞免疫荧光检测肿瘤细胞的EpCAM表达实验中的应用。

本发明的又一个目的是提供AE4和AE7的单克隆抗体在体外能够通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用杀伤肿瘤细胞并且能够抑制体内肿瘤的生长。

有益效果：本发明提供了两株抗人EpCAM的单克隆抗体、其制备方法、鉴定及应用，其特异性好，灵敏度高。能够应用于检测人外周血和肿瘤组织中EpCAM的表达，作为癌症转移诊断和预后评估指标之一。另外，本发明的单克隆抗体可以通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用杀伤肿瘤细胞以及抑制体内肿瘤的生长，因此，此发明对癌症的诊断及治疗具有重大的临床意义。

具体说来，本发明的一个方面涉及两种EpCAM特异性的单克隆抗体及其制备方法，这两种单克隆抗体在本发明中分别称为AE4和AE7，它们的类型分别为IgG_2b，κ和IgG_2a，κ，它们均针对EpCAM第24-265位氨基酸序列。

本发明的另外一个方面涉及稳定分泌EpCAM单克隆抗体的杂交瘤细胞株EpCAM-mAb-AE4和EpCAM-mAb-AE7。这两株杂交瘤细胞株已经于2013年5月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉，武汉大学，邮编：430072)，保藏编号分别为CCTCC NO：C201371和CCTCC NO：C201373。

本发明的另外一个方面涉及制备所述单克隆抗体的方法。制备方法包括重组蛋白EpCAM的表达与纯化，用纯化后蛋白免疫小鼠，取免疫后小鼠的脾细胞与骨髓瘤Sp2/0细胞融合，筛选出能够稳定分泌对重组EpCAM有反应性的单克隆抗体的杂交瘤细胞，从杂交瘤细胞培养上清中或者从小鼠腹水中获取单克隆抗体。

本发明的另一方面涉及AE4和AE7单克隆抗体在流式检测肿瘤细胞系和癌症患者血液标本中的EpCAM表达的应用。用本发明的AE4或AE7单克隆抗体通过流式技术检测肿瘤细胞系和癌症患者外周血中的EpCAM蛋白的表达，结果显示：AE4和AE7单克隆抗体能在流式水平用于检测肿瘤细胞和癌症患者外周血中的EpCAM表达。

本发明的另一方面涉及AE4和AE7单克隆抗体在免疫荧光检测肿瘤细胞及肿瘤组织内EpCAM表达中的应用。用本发明的AE4或AE7单克隆抗体通过免疫荧光实验鉴定肿瘤细胞系和肿瘤组织上EpCAM蛋白的表达，结果显示：AE4和AE7单克隆抗体能在免疫荧光水平用于检测肿瘤细胞系和肿瘤组织中的EpCAM表达。

本发明的另一方面涉及AE4和AE7单克隆抗体在体外通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用杀伤肿瘤细胞，将本发明的AE4或AE7单克隆抗体与小鼠脾细胞(或NK细胞)和⁵¹Cr标记的NCI-H292(或K562)细胞共孵育，通过检测上清中的⁵¹Cr的释放量计算杀伤效率，结果显示这两株抗体都具有抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用。

本发明的另一方面涉及AE4和AE7单克隆抗体能够体内抑制移植性肿瘤(移植性肿瘤：人肺癌细胞系NCI-H292细胞接种于裸鼠皮下)的生长，肿瘤大小测量结果显示：AE4和AE7单克隆抗体能够减缓肿瘤的生长。

可以使用本发明的AE4或AE7单克隆抗体检测或抑制的癌症选自白血病、肺癌等。

因此，本发明提供下列各项：

1.一种特异性抗人上皮细胞粘附分子(EpCAM)的单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性针对人上皮细胞粘附分子第24至265位的氨基酸序列。

2.根据第1项所述的单克隆抗体，其亚型为IgG_2a，κ或IgG_2b，κ。

3.分泌第1项所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏编号为CCTCC NO：C201371或CCTCC NO：C201373。

4.第1项所述的特异性抗人上皮细胞粘附分子的单克隆抗体在制备用于检测癌症的存在和/或转移的检测剂或试剂盒中的应用。

5.根据第4项所述的应用，其中通过第1项所述的单克隆抗体检测人外周血和肿瘤组织中上皮细胞粘附分子的表达来判断癌症的存在和/或转移。

6.根据第4项所述的应用，其中所述癌症选自白血病或肺癌。

7.第1项所述的特异性抗人上皮细胞粘附分子的单克隆抗体在制备用于抑制体内肿瘤生长和/或转移的药物中的应用。

8.根据第7项所述的应用，其中所述癌症选自白血病或肺癌。

9.一种用于检测癌症存在和/或转移的检测剂或试剂盒，所述检测剂或试剂盒包含有效量的第1项所述的特异性抗人上皮细胞粘附分子的单克隆抗体。

10.根据第9项所述的检测剂或试剂盒，其中所述癌症选自白血病或肺癌。

11.一种用于抑制肿瘤细胞增殖和/或抑制肿瘤生长和/或转移的药物，所述药物包含治疗有效量的第1项所述的特异性抗人上皮细胞粘附分子的单克隆抗体。

12.根据第11项所述的药物，其中所述癌症选自白血病或肺癌。

本发明中，术语“单克隆抗体的特异性”是指单克隆抗体识别抗原上的特定表位或者抗原决定簇并与之结合的性质。

术语“单克隆抗体的反应性”是指在合适的反应条件下，单克隆抗体与抗原结合的能力。

术语“细胞株”是指通过筛选或者有限稀释方法，从原代培养物或者细胞系获得的单细胞培养物。

根据本发明的公开，选择EpCAM蛋白的C端(第24个氨基酸-第265个氨基酸)，按照本文描述的方法制备有特异性的单克隆抗体对本领域的技术人员而言是显而易见的，应该视为包含在本发明的范围内。

附图说明

从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：

图1，原核重组表达载体pET22b(+)-EpCAM的构建流程图。

图2，EpCAM重组蛋白的表达、纯化和鉴定。A.重组蛋白诱导表达并以包涵体形式存在的鉴定结果；B.重组蛋白免疫印迹鉴定结果；C.蛋白纯化结果；D.纯化后EpCAM蛋白的质谱鉴定结果。

图3，单克隆抗体纯度鉴定结果。

图4，AE4和AE7单克隆抗体应用于流式检测。A.EpCAM抗体AE4和AE7流式检测肿瘤细胞表面EpCAM分子的表达结果；B.EpCAM抗体AE4和AE7流式检测白血病患者外周血内EpCAM分子的表达结果。

图5，AE4和AE7单克隆抗体应用于免疫荧光检测。A.EpCAM抗体AE4和AE7免疫荧光检测肿瘤细胞表面EpCAM分子的表达结果；B.EpCAM抗体AE4和AE7免疫荧光检测肺癌患者肿瘤内EpCAM分子的表达结果。

图6，AE4和AE7单克隆抗体应用于体外杀伤肿瘤细胞。A.EpCAM抗体AE4和AE7体外杀伤肺癌细胞NCI-H292细胞结果；B.EpCAM抗体AE4和AE7体外杀伤白血病细胞K562细胞结果。

图7，AE4和AE7单克隆抗体应用于抑制移植性皮下肿瘤(肺癌)的生长。

序列表说明

SEQ ID No.1人EpCAM的cDNA序列(NCBI Reference Sequence：NP_002345)

SEQ ID No.2人EpCAM的蛋白序列(UniProtKB/Swiss-Prot：P16422.2)

SEQ ID No.3原核重组表达的EpCAM氨基酸序列

具体实施方式

下面参照具体的实施例进一步描述本发明，有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。

实施例中的实验方法，如无特别说明，均采用本领域常规技术，实验试剂均为市售分析级产品。

实施例1：原核重组表达载体pET22b(+)-EpCAM的构建

通过RT-PCR技术从A549细胞(购自美国ATCC)中获取EpCAM胞外段cDNA(人EpCAM的cDNA序列见NCBI Reference Sequence：NP_002345，SEQ ID No.1，其胞外段cDNA序列是指SEQ ID No.1的第70-795位核苷酸序列)，并克隆到pMD18T载体(购自TAKARA公司)中构建pMD18T-EpCAM重组载体。设计上游引物5’-GGAATTCCATATGCAGGAAGAATGTGTCTGTGA-3’和下游引物5’-CCGCTCGAGTTTTAGACCCTGCATTGAG-3’。以pMD18T-EpCAM为目的片段来源，经过NdeI和XhoI酶切之后克隆到pET-22b(+)载体(购自Novagen公司)，转入DH5α菌(购自全式金公司)中，筛选阳性克隆进行DNA测序鉴定，测序结果表明重组表达载体pET22b(+)-EpCAM构建成功。原核重组表达载体pET22b-EpCAM的构建流程如图1所示。

实施例2：重组EpCAM蛋白的表达，复性，纯化及鉴定。

1，重组EpCAM蛋白的诱导表达

将pET22b(+)-EpCAM转入到大肠杆菌BL21感受态细胞(购自Novagen公司)中，挑选单克隆菌落接种于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB 培养基中，置于37℃摇床，200转/分钟培养至OD_600nm＝0.6-0.8时，加入1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，继续培养4小时诱导蛋白表达。4℃、6000g离心10分钟收菌，沉淀用裂菌缓冲液(50mM三羟甲基氨基甲烷、100mM氯化钠，pH8.5)洗涤之后，用高压破碎方法裂菌。裂菌后的混合体进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定，如图2A结果显示，和对照相比，IPTG诱导后菌裂解液在28kDa处有一条明显的条带。裂菌后的上清和沉淀分别进行SDS-PAGE鉴定，结果显示重组蛋白主要以包涵体形式存在，如图2A所示。

2，重组EpCAM蛋白的复性及纯化。

采用稀释复性的方法对重组EpCAM蛋白进行复性。具体方法：大量诱导BL21/pET22b(+)-EpCAM菌，通过高压破碎，4℃、6000g离心10分钟，弃上清，沉淀用包涵体洗涤缓冲液(50mM三羟甲基氨基甲烷、100mM氯化钠、2M尿素、1mM二硫苏糖醇，pH8.5)洗涤3次，每次4℃、6000g离心10分钟，弃上清。包涵体沉淀用包涵体裂解液(50mM三羟甲基氨基甲烷、100mM氯化钠、8M尿素、1mM二硫苏糖醇，pH8.5)溶解，室温搅拌1小时。4℃、12000g离心10分钟，取上清，以1∶500比例缓慢加入到复性缓冲液(50mM三羟甲基氨基甲烷、100mM氯化钠、0.5M L-精氨酸、3mM还原型谷胱甘肽、0.3mM氧化性谷胱甘肽，pH9.5)中，4℃静置24小时，复性蛋白用Millipore公司的LabScale TEF system(5kDa浓缩膜)进行浓缩，蛋白浓缩液在透析缓冲液(50mM三羟甲基氨基甲烷、100mM氯化钠，pH9.0)中透析过夜。浓缩后的复性蛋白用镍柱亲和层析纯化，不同浓度的咪唑洗脱目的蛋白，在100mM咪唑洗脱液(50mM三羟甲基氨基甲烷、100mM氯化钠、200mM咪唑，pH9.0)中得到纯度一般的重组EpCAM蛋白。进一步用分子筛层析(S-200)纯化，洗脱缓冲液(50mM三羟甲基氨基甲烷、100mM氯化钠，PH9.2)洗脱到90ml时，得到纯度较高复性效果较好的重组EpCAM蛋白洗脱液，将含有目的蛋白的洗脱液用Millipore浓缩管进行浓缩和Bio-Rad蛋白定量试剂盒进行定量，最后可以得到纯度大于90％、浓度为1mg/ml的EpCAM重组蛋白。由于EpCAM蛋白在表达和纯化过程中存在降解，所以其以两条带的形式存在，结果如图2B所示。

3，重组EpCAM蛋白的鉴定。

对上述纯化后的目的条带进行免疫印迹检测，即小鼠抗His-tag抗体(购自Abmart公司，货号M20001)1∶1000稀释作为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(购自Boster公司，货号BA1050)1∶5000稀释作为二抗，化学发光显色(购自Thermo scientific公司，货号34080)检测，在28kDa处有一条特异的条带，图2C显示，表明诱导表达的蛋白为重组EpCAM蛋白。

另外，将纯化后的EpCAM重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，并用考马斯亮蓝染色。将含有目的条带的胶进行质谱鉴定，结果显示，有多个不同的肽段和EpCAM序列相匹配，结果如图2D所示，红色划线部分为检测到的能够与原序列吻合的肽段，证明该重组蛋白即为重组EpCAM蛋白。

实施例3：抗人EpCAM单克隆抗体的制备

1.细胞融合前准备

(1)小鼠免疫及免疫后脾细胞的制备

抗原免疫小鼠的方法：纯化后终浓度为100μg/ml的EpCAM蛋白与等体积完全弗氏佐剂(CFA)混合，充分混匀形成油包水状，取8周龄的BALB/c雌鼠(购自中国科学院上海斯莱科实验动物中心，用于实验时体重约为28g)进行初次免疫，每只小鼠腹腔注射40-60μgEpCAM蛋白。以后间隔2周加强免疫一次，加强免疫使用的是相同剂量的EpCAM蛋白与等体积不完全弗氏佐剂混合。免疫5次后，ELISA检测小鼠血清效价不低于1∶10⁵时，小鼠腹腔注射40-60μg EpCAM蛋白，三天后取小鼠脾细胞。

脾细胞的制备方法：将上述免疫后小鼠眼眶采血后脱臼处死，无菌取脾脏，过200目细胞筛，收集脾细胞悬液，冰浴中自然放置10分钟后弃沉降物，4℃、750g离心10分钟，收集细胞，加入1ml红细胞裂解液(0.155M氯化铵，10mM碳酸氢钾，0.1mM乙二胺四乙酸二钠，pH7.4)作用5分钟，加入20ml不完全DMEM培养基(购自Thermo Scientific Hyclone公司)中止反应。4℃，750g离心10分钟，弃上清，细胞沉淀用20ml不完全DMEM培养基洗涤2次，每次4℃，750g离心10分钟。弃上清，细胞沉淀用不完全DMEM培养基重悬。

ELISA检测抗体效价的方法：用包被液(0.1M碳酸盐缓冲液，pH9.6)稀释纯化蛋白至10μg/ml，100μl每孔包被96孔ELISA板，4℃过夜，用PBST(0.05％吐温20-PBS，pH7.4)清洗3遍，1％BSA封闭，37℃孵育2小时。PBST清洗3遍，加入待测倍比稀释的小鼠血清(实验组)，设置6-7个梯度，未免疫小鼠的血清作阴性对照，每孔100μl，37℃孵育1小时。PBST清洗3遍，每孔加入100μl辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠抗体(1∶10000稀释，购自Boster公司)，37℃孵育1小时。PBST清洗3遍后加入TMB(购自eBioscience公司，货号00-4201-56)底物，100μl每孔，避光显色10-15分钟，加入终止液(1M盐酸)100μl每孔，终止后立即用酶标仪进行检测，读取波长450nm的吸光值(OD₄₅₀)及630nm的吸光值(OD₆₃₀)，计算ΔOD₄₅₀＝OD₄₅₀-OD₆₃₀。与PBS孔相比，实验组ΔOD₄₅₀与阴性对照组ΔOD₄₅₀的比值大于2.1为阳性。

(2)饲养细胞的制备

在细胞融合的前一天，制备小鼠腹腔巨噬细胞。将8周BALB/c小鼠脱臼处死，无菌操作下，剪开腹部，吸取5ml DMEM不完全培养基注入腹腔，反复冲洗腹腔，吸回冲洗液并用DMEM不完全培养基洗涤2次，每次4℃300g离心10分钟，收集细胞，用含10％小牛血清(购自上海依科赛生物制品有限公司)的DMEM完全培养基(即，用90％DMEM不完全培养基、10％小牛血清(购自上海依科赛生物制品有限公司)和1×青霉素-链霉素溶液(购自碧云天生物技术研究所)配成)重悬细胞，使浓度为2×10⁵/ml，加入96孔板中，每孔100ul，37℃5％CO₂条件下培养。

(3)骨髓瘤细胞SP2/0的培养

复苏骨髓瘤细胞SP2/0(购自美国ATCC，编号CRL-1581)，用8-氮鸟嘌呤筛选HGPRT缺陷株，细胞融合时细胞要处于对数生长期，融合前用不完全的DMEM培养基洗涤，每次4℃，300g离心10分钟，收集细胞并用不完全的DMEM培养基重悬。

2.细胞融合及杂交瘤细胞的制备

取制备好的脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0于离心管中，分别取10⁸和2.5×10⁷个细胞，用不完全的DMEM培养基洗涤一次。离心后弃上清，轻轻弹散细胞，加入0.7ml40℃的PEG(分子量1,000-6,000)溶液，PEG的终浓度为50％(W/V)，60秒之后开始加入40℃预热的不完全DMEM培养基(5分钟加完)，首先加1ml，1分钟后加4ml，二分钟后加入20ml。4℃，300g离心10分钟收集细胞，用2×HAT培养基轻轻悬起细胞，使浓度为2×10⁶个/ml。100ul每孔加到含饲养细胞的96孔板中，继续培养。每两天吸出上清100ul，加入等体积的HAT培养基(20％胎牛血清、10mM次黄嘌呤、40mM氨喋呤、1.6mM胸腺嘧啶的DMEM培养基)。一周后，用HT培养基(包含20％胎牛血清、10mM次黄嘌呤、1.6mM胸腺嘧啶的DMEM培养基)培养2-3周。当观察到杂交瘤细胞克隆长出时，用含10％小牛血清的DMEM培养基培养，并用ELISA法检测是否有抗体分泌。接着用有限稀释法筛选阳性克隆，多次筛选后获得杂交瘤细胞株。连续体外培养2个月以上或者冻存6个月之后，细胞株仍能稳定和大量分泌抗人EpCAM抗体，从而获取两株杂交瘤细胞株分别命名为EpCAM-mAb-AE4和EpCAM-mAb-AE7。这两株杂交瘤细胞株已经于2013年5月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉，武汉大学，邮编：430072)，保藏编号分别为CCTCC NO：C201371和CCTCC NO：C201373。

3.单克隆抗体的大量制备

单克隆抗体的大量制备一般有两种方法：方法一、增殖培养法，杂交瘤细胞体外低血清培养2-3天后大量收培养上清，上清中含有较高浓度的单克隆抗体。方法二、小鼠腹腔接种法，首先500μl无菌的液体石蜡通过腹腔免疫8-10周龄的BALB/C鼠，一周之后腹腔注射1×10⁶个杂交瘤细胞，7-10天左右收集腹水，高速离心收集上清。通过上述方法获得的抗体，用Protein A亲和层析方法纯化并进行SDS-PAGE鉴定抗体纯度，如图三所示。经过纯化的单克隆抗体纯度高于95％，抗体的重链约为45kDa，轻链约为25kDa。

实施例4：单克隆抗体Ig亚型鉴定

采用Sigma-Aldrich提供的小鼠单克隆类型鉴定快速检测试剂盒IsoQuick^TM Kitfor Mouse Monoclonal Isotyping ISOQ5中的亚型检测试纸进行测定。

单克隆抗体的亚型见表1。

表1.单克隆抗体的亚型鉴定

抗体名称	AE4	AE7
			亚类	IgG_2b，κ	IgG_2a，κ

实施例5：抗人EpCAM单克隆抗体的应用

1.应用于流式检测肿瘤细胞及癌症患者外周血

(1)AE4和AE7单克隆抗体流式检测肿瘤细胞表面EpCAM的表达

当NCI-H292细胞(或HuH7、HCT-116、K562、HL60、Raji细胞)(均购自美国ATCC)生长状态良好时，取5×10⁵个细胞于管中，共取三管：每管加入10ul小鼠血清，4℃封闭30分钟；第一管实验管加3ugFITC-AE7(或FITC-AE4)，第二管Isotype管加3ug FITC-IgG2a(或FITC-IgG2b)，第三管空白管加等体积的1×PBS，4℃条件下孵育30分钟。4℃，1250g离心5分钟，1×PBS洗涤3遍，流式细胞仪(BD FACSCalibur)检测的结果如图4A所示。可以看出多种肿瘤细胞和血液病细胞表面均表达EpCAM分子。

(2)AE4和AE7单克隆抗体流式检测白血病患者外周血中EpCAM的表达

取临床白血病患者的外周血，每管加100ul血，共取两管：每管加入10ul小鼠血清，4℃封闭30分钟；第一管实验管加3ug FITC-AE7(或FITC-AE4)，第二管Isotype管加3ugFITC-IgG2a(或FITC-IgG2b)，4℃条件下孵育30分钟。每管加3ml红细胞裂解液，常温裂解15分钟。350g离心5分钟，1×PBS洗涤3遍，流式细胞仪(BD FACS Calibur)检测的结果如图4B所示。可以看出白血病患者外周血内存在EpCAM抗原阳性的肿瘤细胞。

2.应用于免疫荧光检测肿瘤细胞及组织

(1)AE4和AE7单克隆抗体免疫荧光检测肿瘤细胞表面EpCAM的表达

当NCI-H292细胞(或HCT-116、K562细胞)生长状态良好时，用AE4和AE7单克隆抗体免疫荧光检测其表面EpCAM的表达。免疫荧光流程：用培养基调整细胞浓度为每毫升5×10⁵个细胞，涂于防脱载玻片上，置于37℃C，5％CO₂培养箱内2小时，使细胞充分贴壁；用甲醛和丙酮按1∶1混合的固定液固定10分钟，1×PBS洗涤3次；用1％BSA(购自Sigma公司)阻断30min，1×PBS洗涤3次；10ug/ml单克隆抗体AE4(或AE7)室温孵育1h，1×PBS洗涤3次；羊抗鼠IgG-Alexa Four546(购自Invitrogen公司，货号A-11030)1∶200稀释，室温孵育1小时，1×PBS洗涤3次，每次5分钟；DAP I(细胞核染色)(购自Invitrogen公司)按1∶10000稀释，室温孵育1分钟，1×PBS洗涤3次，每次5分钟；封片后，上激光共聚焦扫描成像仪ZEISS710观察结果并拍照。结果如图5A所示，结果表明抗体AE4和AE7能够用于免疫荧光检测细胞表面EpCAM的表达。

(2)AE4和AE7单克隆抗体免疫荧光检测肿瘤组织中EpCAM的表达

取肺癌患者肺部肿瘤标本制成冰冻切片，免疫荧光检测其EpCAM表达情况。冰冻切片流程：用恒冷箱切片机Leica CM1900切片，厚度为4μm，切片附着于75％乙醇浸泡过的干净的载玻片上；用甲醛和丙酮按1∶1混合的固定液固定切片10分钟；用1％BSA阻断30min，1×PBS洗涤3次；10ug/ml单克隆抗体AE4(或AE7)室温孵育1h，1×PBS洗涤3次；羊抗鼠IgG-Alexa Four546(购自Invitrogen公司，货号A-11030)1∶200稀释，室温孵育1小时，1×PBS洗涤3次，每次5分钟；DAP I(细胞核染色)(购自Invitrogen公司)按1∶10000稀释，室温孵育1分钟，1×PBS洗涤3次，每次5分钟；封片后，上激光共聚焦扫描成像仪ZEISS710观察结果并拍照。结果如图5B所示，结果表明肺癌病灶中细胞表面表达EpCAM分子，抗体AE4和AE7能够用于免疫荧光检测肿瘤组织中EpCAM的表达。

3.应用于体外杀伤肿瘤细胞

当NCI-H292(或K562)细胞生长状态良好时，通过⁵¹Cr同位素释放法检测AE4和AE7单克隆抗体的ADCC作用。⁵¹Cr同位素释放法流程：准备靶细胞，收集细胞并计数活细胞，每1×10⁶个细胞加入200微居的⁵¹Cr液，轻轻混匀，保持100μl体系，37℃，5％CO₂培养箱内温育1小时，用完全培养基将⁵¹Cr标记后的靶细胞洗3遍；准备效应细胞，8周龄Balb/c小鼠(购自中国科学院上海斯莱科实验动物中心，用于实验时体重为26g)腹腔注射Poly I：C(购自Sigma公司)刺激18小时后摘眼球放血取脾脏，研磨得细胞悬液，4℃，350g离心5分钟，每1×10⁸个细胞加入1ml红细胞裂解液，冰上裂解10分钟，加入20ml1×PBS终止裂解，4℃、350g离心5分钟，MACS buffer洗涤一遍，按照NK Cell Isolation Kit II mouse(购自MiltenyiBiotec)说明书分离NK细胞，计数活细胞，按适当效靶比调整细胞浓度；效应细胞杀伤靶细胞，于96孔圆底细胞培养板中每孔加入一定量的效应细胞，按设定的效靶比加入对应比例的靶细胞，本实施例中靶细胞为10⁴个，效靶比为50∶1，抗体浓度为300μg/ml，对照组加入IgG(购自Meridia公司)，实验组分别加入AE4和AE7，保持200μl反应体系，每组设平行孔3孔，并且设自然释放组(只加靶细胞，200μl体系)和最大释放组(靶细胞加100ul1％TritonX-100溶液(购自Sigma公司)，200μl体系)，37℃，5％CO₂培养箱内温育4小时；细胞活性检测，取出培养板，350g，5分钟离心，每孔取100μl上清注入放射免疫管中，利用γ计数器(中佳GC-911γ计数器)进行60秒的γ粒子通过量测试，测定每管cpm值；细胞毒活性计算，计算每组平均值，按下式计算细胞毒活性：

结果如图6所示，结果表明AE4和AE7单克隆抗体能够介导ADCC作用。

4.应用于体内抑制肿瘤的生长

体外扩增培养NCI-H292细胞，收集细胞并用不完全RPMI-1640培养基(购自ThermoScientific Hyclone公司)洗涤一次，250g，10分钟离心收集细胞，用不完全RPMI-1640培养基重悬，调整浓度为2×10⁷个/ml，接种200ul细胞于5周龄裸鼠(购自中国科学院上海斯莱科实验动物中心，用于实验时体重为20g)腋窝皮下，总共接种10只。10天后随机分为两组，实验组和IgG组，每组5只，实验组每三天通过尾静脉注射20mg/kg(每千克小鼠注射20毫克抗体)并测量皮下肿瘤的长边和短边，对照组每三天通过尾静脉注射等体积的IgG(购自Meridia公司)并测量皮下肿瘤的长边和短边，总共治疗了8次。按经验公式：肿瘤大小＝(长边×短边×短边)/2，计算出肿瘤大小，结果如图7，结果显示单克隆抗体能够抑制肿瘤的生长。

应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由权利要求书所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。

Claims

1.一种特异性抗人上皮细胞粘附分子的单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性针对人上皮细胞粘附分子第24至265位的氨基酸序列，所述抗体的亚型为IgG_2a，κ或IgG_2b，κ，由保藏编号为CCTCC NO：C201371或CCTCC NO：C201373的杂交瘤细胞株分泌。

2.分泌权利要求1所述的特异性抗人上皮细胞粘附分子的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏编号为CCTCC NO：C201371或CCTCC NO：C201373。

3.权利要求1所述的特异性抗人上皮细胞粘附分子的单克隆抗体在制备用于检测癌症的存在和/或转移的检测剂或试剂盒中的应用，其中所述癌症选自白血病或肺癌。

4.根据权利要求3所述的应用，其中通过权利要求1所述的单克隆抗体检测人外周血和肿瘤组织中上皮细胞粘附分子的表达来判断癌症的存在和/或转移。

5.权利要求1所述的由保藏编号为CCTCC NO：C201373的杂交瘤细胞株分泌的特异性抗人上皮细胞粘附分子的单克隆抗体在制备用于抑制体内肿瘤生长和/或转移的药物中的应用，其中所述肿瘤选自白血病或肺癌。

6.权利要求1所述的由保藏编号为CCTCC NO：C201371的杂交瘤细胞株分泌的特异性抗人上皮细胞粘附分子的单克隆抗体在制备用于抑制体内肿瘤生长和/或转移的药物中的应用，其中所述肿瘤为肺癌。

7.一种用于检测癌症存在和/或转移的检测剂或试剂盒，所述检测剂或试剂盒包含有效量的权利要求1所述的特异性抗人上皮细胞粘附分子的单克隆抗体，其中所述癌症选自白血病或肺癌。

8.一种用于抑制肿瘤细胞增殖和/或抑制肿瘤生长和/或转移的药物，所述药物包含治疗有效量的权利要求1所述的由保藏编号为CCTCC NO：C201373的杂交瘤细胞株分泌的特异性抗人上皮细胞粘附分子的单克隆抗体，其中所述肿瘤选自白血病或肺癌。

9.一种用于抑制肿瘤细胞增殖和/或抑制肿瘤生长和/或转移的药物，所述药物包含治疗有效量的权利要求1所述的由保藏编号为CCTCC NO：C201371的杂交瘤细胞株分泌的特异性抗人上皮细胞粘附分子的单克隆抗体，其中所述肿瘤为肺癌。