JP7235436B2 - 細胞の表面上にポリペプチドを発現させるための組成物および方法 - Google Patents
細胞の表面上にポリペプチドを発現させるための組成物および方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7235436B2 JP7235436B2 JP2017524052A JP2017524052A JP7235436B2 JP 7235436 B2 JP7235436 B2 JP 7235436B2 JP 2017524052 A JP2017524052 A JP 2017524052A JP 2017524052 A JP2017524052 A JP 2017524052A JP 7235436 B2 JP7235436 B2 JP 7235436B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polypeptide
- amino acid
- acid sequence
- cases
- poi
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70532—B7 molecules, e.g. CD80, CD86
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
- C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1037—Screening libraries presented on the surface of microorganisms, e.g. phage display, E. coli display
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/035—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal for targeting to the external surface of a cell, e.g. to the outer membrane of Gram negative bacteria, GPI- anchored eukaryote proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
- G01N2333/70521—CD28, CD152
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
- G01N2333/70532—B7 molecules, e.g. CD80, CD86
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/715—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
- G01N2333/7155—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
〈導入部〉
例えば、酵母菌は真核生物であるから、酵母菌を表面表示のために使用することは、効率的な折り畳みおよび活性のための翻訳後修飾を必要とする哺乳類のタンパク質(例えば抗体、レセプター、サイトカインなどのような細胞表面及び分泌されたタンパク質)を組み替えおよび修飾することに(例えば定向進化を介して)よく適している。
表面の表示の1つの例において、対象のタンパク質はAga2pタンパク質に融合され、明細書でAga2pタンパク質は接合中に細胞間接触を媒介するために、酵母菌によって自然に用いられる。
現在の表面表示法は、複数の遺伝子を発現させる必要があり、対象の表示タンパク質の立体の接近性に関して制限される。
対象のタンパク質のモノシストロニック発現および表面表示を可能にする組成物および方法の技術、例えば調節可能(adjustable)な(「調整可能(tunable)」)レベルの接近性を可能にする方法が必要とされている。
〈出版物〉
Boder, et al., Nat Biotechnol.
1997 Jun;15(6):553-7; U.S. patent application number: 20110076752
ある場合には、表面の接近可能な融合タンパク質が、核酸(例えば組み換えの発現ベクター)の一部としては真核細胞の中へ導入される。
表示部分(例えばシグナルポリペプチド、ストークポリペプチドおよび表面のアンカーポリペプチドがある部分)をコードするヌクレオチド配列を含んでいる核酸が提供される。
ある場合には、主題の核酸が、POIの挿入するための挿入部位を含んでいる。
ある場合には、主題の核酸が、POIをコードするヌクレオチド配列を含んでいる。
ある場合には、ストークポリペプチドが合成ストークポリペプチドである。また、様々な合成ストークポリペプチドの例は本明細書に示される。
ある場合には、表面のアンカーポリペプチドが糖鎖ホスファチジルイノシトール(GPI)アンカードメインである。
ある場合には、GPIアンカードメインが合成GPIアンカードメインである。
ある場合には、表面のアンカーポリペプチドが膜貫通ドメインである。
以下の方法が提供される:POIに結合する薬剤(例えば与えられたPOIに結合する薬剤のため試験化合物をスクリーニングする方法)を判定するための方法;
与えられた薬剤に結合するポリペプチド(例えば薬剤が、前もって定義した値以上の親和性と共に薬剤に結合するポリペプチドを判定するために、薬剤が特定の濃度で存在する場合、薬剤に結合するポリペプチド)の識別するための方法;
および変異体が由来したポリペプチドの親和性と異なる(例えば、より大きな)親和性と共に薬剤に結合する、変異性のポリペプチド生成する方法。
ある場合には、表面の接近可能な融合タンパク質が、核酸(例えば組み換えの発現ベクター)の一部として真核細胞の中へ導入される。
シグナルポリペプチド、ストークポリペプチドおよび表面のアンカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでいる核酸が提供される。
ある場合には、主題の核酸は含まれ、およびPOIの挿入用挿入部位である。
ある場合には、主題の核酸が、POIをコードするヌクレオチド配列を含んでいる。
ある場合には、ストークポリペプチドは合成ストークポリペプチドであり、及び様々な具体例合成物ストークポリペプチドの例は明細書に示される。
ある場合には、表面のアンカーポリペプチドは糖鎖ホスファチジルイノシトール(GPI)アンカードメインである。
ある場合には、GPIアンカードメインは合成アンカーGPIドメインである。
以下の方法が提供される:POIに結合する薬剤(例えば与えられたPOIに結合する薬剤のため試験化合物をスクリーニングする方法)を判定するための方法;
与えられた薬剤に結合するポリペプチド(例えば薬剤が、前もって定義した値以上の親和性と共に薬剤に結合するポリペプチドを判定するために、薬剤が特定の濃度で存在する場合、薬剤に結合するポリペプチド)の識別するための方法;
および変異体が由来したポリペプチドの親和性と異なる(例えば、より大きな)親和性と共に薬剤に結合する、変異性のポリペプチド生成する方法。
さらに、本明細書で使用される用語は特定の実施形態だけを記載することを対象としており、本発明の範囲が添付の請求項によってのみ制限されるため、限定的であることを意図していないことも理解される。
記載された範囲の任意の記載された値または介在する値と、その記載された範囲の任意の他の記載されたまたは介在する値との間のそれぞれのより小さな範囲は本発明内に包含される。
より小さな範囲の上下限は、範囲に独立して含まれることもあれば、排除されることもあり、その上下限の小さな範囲のいずれかあるいはその両方、あるいはいずれも含まれない場合、それぞれの範囲は、記載された範囲中の任意の具体的に除外された制限を受けて、本発明に包含される。
記載された範囲が上下限の1つまたは両方を含む場合、これらの含まれる上限または下限のいずれかまたは両方を除外する範囲も本発明に含まれる。
本明細書に記載される方法や材料と類似するまたは同等の任意の方法や材料を本発明の実施または試験の際に使用することができるが、可能性のあるおよび好ましい方法や材料が本明細書で記載されている。
本明細書で言及されるすべての出版物は、出版物の引用の際に関連付けられる方法および/または材料を開示および記載するために参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は矛盾がある程度まで、組み込まれた出版物の任意の開示に取って代わることが理解される。
任意の列挙された方法を、列挙された事象の順序で、または論理上可能な他の順序で実行することができる。
したがって、例えば、「細胞(a cell)」への言及はその複数の細胞を含み、「ペプチド(the peptide)」への言及は1つ以上のペプチドとその等価物、例えば、当業者に知られているポリペプチドなどへの言及を含んでいる。
本発明が先行発明によるこうした公開に先行するという資格がないという承認として解釈されるものは本明細書には何もない。
さらに、提供される公開日は、独立して確認される必要がありうるある実際の公開日とは異なり得る。
〈定義〉
明細書と請求項についての明瞭かつ一貫した理解とこうした用語に与えられる範囲を提供するために、以下の定義が与えられる。
用語は、1つ以上のアミノ酸残基が対応する自然発生のアミノ酸の人工的な化学薬品ミメティックであるアミノ酸ポリマーや、自然発生のアミノ酸ポリマーと自然発生でないアミノ酸ポリマーにも当てはまる。
自然発生のアミノ酸は、遺伝コードによってコード化されたものや後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、ガンマ-カルボキシグルタマート、O-ホスホセリンである。
アミノ酸類似体は、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびR基に結合する、自然発生のアミノ酸と同じ基本的な化学構造(すなわち、アルファ炭素)を有する化合物(例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチルメチオニンスルホニウム)を指す。
こうした類似体は、修飾されたR基(例えば、ノルロイシン)または修飾されたペプチド骨格を有するが、自然発生のアミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持する。
アミノ酸ミメティックとは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なるが自然発生のアミノ酸に似た方法で機能する構造を有する化学化合物を指す。
例えば、定義による合成ストークポリペプチドは非自然発生のアミノ酸配列を含み、定義による合成の表面のアンカーポリペプチドは非自然発生のアミノ酸配列を含み、および、定義による合成シグナルポリペプチドは非自然発生のアミノ酸配列を含む。
「抗体」(Abs)と「免疫グロブリン」(Igs)は同じ構造的な特性を有する糖タンパク質である。
抗体が特異性抗原に対する結合特異性を示す一方で、免疫グロブリンは抗体と抗原特異性を欠いた他の抗体様分子の両方を含んでいる。
後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系により低いレベルで、および骨髄腫により高いレベルで生成される。
軽鎖はそれぞれ1つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結されるが、ジスルフィド結合の数は様々な免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。
重鎖と軽鎖はそれぞれ規則的に距離をおいた鎖内ジスルフィド架橋も有する。
各重鎖は一方の端部に可変ドメイン(VH)とその後に多くの定常ドメインを有する。
各軽鎖は一方の端部に可変ドメイン(VL)を、もう一方の端部に定常ドメインを有し、
軽鎖の定常ドメインは重鎖の最初の定常ドメインと位置合わせされ、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと位置合わせされる。
特定のアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖の可変ドメイン間のインタフェースを形成すると考えられている(Clothia et al., J. Mol. Biol. 186:651 (1985); Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:4592 (1985))。
しかしながら、可変性は抗体の可変ドメイン全体に均一に分布していない。
軽鎖と重鎖の両方の可変ドメイン中の相補性決定領域(CDR)または超可変領域と呼ばれる3つのセグメントに集中している。
可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク(FR)と呼ばれる。
天然の重鎖と軽鎖の可変ドメインは各々、b-シート構造を接続する、場合によってはb-シート構造の一部を形成するループを形成する3つのCDRにより接続された、b-シート構造を主に採用している4つのFR領域を含む。
各鎖のCDRはFR領域によって極めて接近して一緒に保持され、他の鎖からのCDRとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)を参照)。
定常ドメインは抗体を抗原に結合することに直接関与しないが、抗体依存性の細胞毒性における抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。
ペプシン処理により、2つの抗原結合部位を有するとともに依然として抗原を架橋結合することができるF(ab‘)2フラグメントが生成される。
2つの鎖Fv種では、この領域は、緊密な非共有結合性会合中の1つの重鎖と1つの軽鎖の可変ドメインの二量体からなる。
単一の鎖のFv種(scFv)では、1つの重鎖と1つの軽鎖の可変ドメインは、軽鎖と重鎖が二本鎖Fv種におけるそれに類似した「二量体」構造で会合することができるように、柔軟なペプチドリンカーによって共有結合することが可能である。
それぞれの可変ドメインの3つのCDRがVH-VL二量体の表面上に抗原結合部位を定義するように相互作用するのはこの構造内である。
まとめると、6つのCDRが抗体に抗原結合特異性を与える。
しかしながら、全結合部位よりも親和性は低いが、1つの可変ドメインでも(または、抗原に特異的なわずか3つのCDRしか含まないFvの半分)、抗原を認識して結合する能力を有している。
scFvの調査については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照されたい。
Fab’フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの1つ以上のシステインを含む重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端に少数の残基を加えることでFabフラグメントとは異なる。
Fab’-SHは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するFab’に関する本明細書での命名である。
F(ab‘)2抗体フラグメントは、元来その間にヒンジ・システインを有する対のFab’フラグメントとして生成された。
抗体フラグメントの他の化学的結合も知られている。
抗体フラグメントの例としては、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、およびFvフラグメント;
二重特異性抗体;
任意の抗体フラグメント、それはポリペプチドである、一次構造を持っていること、連続的アミノ酸残基(本明細書で「一本鎖の抗体フラグメント」または「一本鎖・ポリペプチド」として引用される)の1つの中断されない配列からなる一次構造を有するポリペプチドの抗体フラグメントは、限定されないが(1)一本鎖Fv(scFv)分子、(2)1つの軽鎖可変ドメインのみを含む一本鎖ポリペプチド、あるいは関連する重鎖部分のない軽鎖可変ドメインの3つのCDRを含むそのフラグメント、(3)1つの重鎖可変領域のみを含んでいる一本鎖ポリペプチド、あるいは関連する軽鎖部分のない重鎖可変領域の3つのCDRを含むそのフラグメント、および、(4)ヒト以外の種からの単一のIgドメインまたは他の特異的な単一ドメイン結合モジュールを含むナノボディ;を含む
および、抗体フラグメントから形成された多特異性構造または多価構造が挙げられる。
1つ以上の重鎖を含む抗体フラグメントにおいて、重鎖は、完全な抗体の非Fc領域で発見されたどんな不変領域配列(例えばIgGアイソタイプ中のCH1)も含むことができ、および/または完全な抗体で発見されたどんなヒンジ領域配列も含むことができる、
および/またはヒンジ領域配列あるいは重鎖の不変領域配列に融合している、または位置しているロイシンジッパー配列を含むことができる。
エピトープ決定基は通常、アミノ酸または糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面のグループからなり、通常、比電荷特性と同様に特異的な3次元の構造的な特性を有している。
例えば、薬剤は「検出できるようにラベルが付けられる」ということができ、あるいは検出できるラベルを含むということができる。
ラベルはそれ自身検出できてもよい。(直接検出できるラベル)(例えば放射性同位元素ラベル、蛍光性の化学の付加物等のような蛍光性のラベル)、あるいは、ラベルは間接的に検出可能である、例えば、酵素のラベルの場合には、酵素が基質化合物または組成物の化学変換を触媒してもよく、そして反応生成物は検出可能である。
間接のラベルの1つの例はビオチンであり、ストレプトアビジンを用いることで検出することができる。
あらゆる好都合な直接か間接のラベルも明細書中に記載された組成物および方法において用いることができる
ポリペプチドをコードするDNA配列は、細胞あるいは無細胞の転写および翻訳システムに含まれている組み換えの転写のユニットから発現させることができる合成核酸を提供するためにcDNAフラグメント、あるいは一連の合成オリゴヌクレオチドから組み立てることができる。
関連する配列を含むゲノムDNAも、組み換えの遺伝子または転写のユニットの形成において用いることができる。
翻訳されていないDNAの配列はオープンリーディングフレームから5’あるいは3’に存在してもよい、そのような配列はコード領域の操作あるいは発現の妨げにならず、様々なメカニズムによって所望の生成物の生産を調整するために実際は作用しうる。
翻訳されないRNAをコードするDNA配列も、組み換えであるとみなしてもよい。
したがって、例えば用語「組み換え」核酸は、自然発生でないものを表す、例えば、人間の介入による配列の2つの他の方法で分離されたセグメントの人為的な組み合わせによって作られる。
この人為的な組み合わせは、化学合成方法によって、あるいは核酸の分離されたセグメントの人為的操作によって(例えば遺伝子工学手法によって)しばしば遂行される。
これはコドンを同じアミノ酸、保存的なアミノ酸あるいは非保存的なアミノ酸をコードするコドンに取り替えるために通常行われる。
あるいは、それは所望の機能の核酸セグメントをともに結合させ所望の機能の組み合わせを生じさせるために行なわれる。
この人為的な組み合わせは、化学合成方法によって、あるいは核酸の分離されたセグメントの人為的操作によって(例えば遺伝子工学手法によって)しばしば遂行される。
組み換えの核酸がポリペプチドをコードする場合、コードされたポリペプチドの配列は自然発生であってもよく(「野生型」)、あるいは自然発生の配列の変異体(例えば突然変異体)であってもよい。
「発現ベクター」は、発現カセット(例えば、発現カセットである挿入物を有する)があるベクターである。
「発現カセット」は、プロモーターに動作可能に連結されたDNA塩基配列(コードまたは非コード)を含んでいる。
「動作可能に連結された」は並列を表し、そのように記載された構成要素は、それらが意図された方法で機能することを可能にする関係性にある。例えば、プロモーターがヌクレオチド配列の転写(例えばヌクレオチド配列の発現)に影響する場合、プロモーターはヌクレオチド配列に動作可能に連結される。
したがって、用語「組み換えの発現ベクター」、あるいは「DNA構築物」は発現ベクターが組み換え型で(すなわち、自然に生じない配列を含んでいる)、挿入物がある発現ベクターを表すために交換可能に本明細書中に用いられる。
組み換えの発現ベクターは、挿入物を発現させるおよび/または増やす目的で、あるいは他の組み換えのヌクレオチド配列の構造のため通常生じさせられる。
〈組成物〉
開示は、表面の接近可能な融合タンパク質としては対象のタンパク質(POI)を発現させることにより、細胞の表面上で(すなわち表面表示)POIを発現させるための組成物および方法を提供する。
用語「表面の接近可能な融合タンパク質」はシグナルポリペプチド、対象のタンパク質(POI)、ストークポリペプチドおよび表面のアンカーポリペプチドがあるポリペプチドを述べるために本明細書に用いられる。
当該技術分野で知られているように、シグナル配列はそれらの長さ、およびそれらのアミノ酸組成の両方において、非常に可変的である。
しかしながら、シグナル配列は、およそ15―30のアミノ酸長である傾向があり、かつ通常5―10の疎水性アミノ酸のブロックを含む。
しかしながら、酵母菌接合因子アルファ(約70のアミノ酸)のようないくつかの小さな分泌タンパク質は、ER内腔の中への翻訳後輸送を示す。
異なるタンパク質からのシグナル配列は交換可能に機能することができる。
ある場合には、シグナル配列が、タンパク質のプロセッシング中に切断される。(例えば、成熟したタンパク質上でもはや存在しない)
そのため、ある場合には、主題のシグナルポリペプチドは、表面の接近可能な融合タンパク質の処理中に切断される。(例えば、細胞の表面上に示される、成熟したタンパク質上でもはや存在しない)
そのため、ある場合には、主題のシグナルポリペプチドは、表面の接近可能な融合タンパク質のプロセッシング中に切断されない。(すなわち、成熟タンパク質中に存在する)
主題のシグナルポリペプチドは十分に特徴づけられたシグナル配列であってもよく、あるいは分泌経路の任意のタンパク質に由来した任意のシグナルポリペプチドであってもよい。
ある場合には、主題のシグナルポリペプチドが合成のシグナルポリペプチドである、すなわち、配列は自然に存在するタンパク質において存在しない(関連して修飾される)。
いくつかの実施形態において、主題の表面に接近可能な融合タンパク質は、前翻訳のルート(前翻訳シグナルポリペプチドとして本明細書に言及された)経由でERに入るタンパク質からのシグナルポリペプチドを含む。(あるいはタンパク質に由来する)
例えば、当業者は、主題の組成物、キットおよび方法で使用されるシグナルポリペプチドを容易に特定することができるだろう。
対象の宿主細胞(例えば真核細胞、哺乳動物細胞、真菌細胞、酵母菌細胞等)において機能的なあらゆる好都合なシグナルポリペプチドも用いることができる。
シグナル配列の選択には、例えば、細胞(例えば酵母菌細胞)の表面で示されるタンパク質の所望のレベルを考慮することができる。
例えば、高レベル表示されたタンパク質が所望される場合、アルファ接合因子からのシグナル配列は有用であり得るが、ある場合には、より少ないタンパク質が細胞表面で望まれ、および、そのような場合、他のシグナルポリペプチドは用いることができる(例えばPho5p、Suc2p等からのシグナルペプチド)。
例えば、表面の接近可能な融合タンパク質が酵母菌細胞中で発現されるならば、シグナルポリペプチドは、酵母菌細胞以外の細胞型(例えば哺乳動物細胞、脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞など)からのものでありうるかまたは(例えば、由来することができる)表面の接近可能な融合タンパク質が発現させられる種とは異なる種の酵母菌細胞のものでありうる。
例えば、表面の接近可能な融合タンパク質が酵母菌細胞中で発現させられるならば、シグナルポリペプチドは、酵母菌タンパク質(例えばいくつかの場合同じ酵母の種から由来する)から得てもよい。
具体例のシグナルポリペプチドの例は限定されないが以下のものを含んでいるが、酵母菌タンパク質からのものを含む。(あるいはそれらに由来する):接合因子アルファ、Aga2p、Pho5pおよびSuc2p。
接合因子アルファからのシグナルポリペプチド:
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPANTTTEDETAQIPAEAVIDYSDLEGDFDAAALPLSNSTNNGLSSTNTTIASIAAKEEGVQLDKREA(配列番号: 11)
接合因子アルファからのシグナルポリペプチド(より短い):
MRFPSIFTAVLFAASSALAA(配列番号: 12)
Aga2pからのシグナルポリペプチド
MQLLRCFSIFSVIASVLAQ(配列番号: 13)
Pho5pからのシグナルポリペプチド
MFKSVVYSILAASLANAG(配列番号: 14)
Suc2pからのシグナルポリペプチド
MLLQAFLFLLAGFAAKISAS(配列番号: 15)
セクロピン-Aからのシグナルポリペプチド(Hyalophora cecropia(ヤママユガから)):
MNFSRIFFFVFACLTALAMVNA(配列番号: 16)
GenBank AIO03624.1からのシグナルポリペプチド
MRAFLALIFLTFVMNVESS(配列番号: 17)
当業者によって容易に理解されるようにその場合、表面の接近可能な融合タンパク質は、II型膜タンパク質に適切なシグナルポリペプチドを含むことができる。
ある場合には、POIが全タンパク質(例えば自然に存在するタンパク質全体、タンパク質全体の修飾されたもの等)である。
ある場合には、POIがタンパク質のフラグメントであり、任意の対象のフラグメントであってもよい。
例えば、タンパク質(例えばドメイン、細胞外のドメイン、タンパク結合ドメイン、酵素のドメイン、エピトープ、既知の機能のあるいは疑わしい機能を有さないタンパク質の一部など)の特定の一部の結合または機能を調査することを望むならば、対象の特定の一部はPOIと呼ぶことができる。
POIが由来するタンパク質は、任意のタンパク質(例えば抗体、リガンド、レセプター、膜タンパク質、分泌タンパク質、細胞内タンパク質、特定のオルガネラに局在するタンパク質、細胞質タンパク質、酵素など)であってもよい。
POIは自然に存在する配列あるいは非自然の存在する配列(例えば合成アミノ酸配列、天然に存在する配列が変異したかまたは修飾されたバージョン等))であってもよい。
ある場合には、2つ以上の異なるPOIの少なくとも2つが互いに似ている。
例えば、ある場合には、主題の方法は、特定の化合物へのより高いかより弱い親和性で結合する変異体を特定するために用いることができるスクリーニング法である。
したがって、(例えば、突然変異生成によって生成された)互いの変異体である複数のPOIを用いることができる。
ある場合には、2つ以上のPOIの少なくとも2つが、1から20のアミノ酸(例えば1から19のアミノ酸、1から18のアミノ酸、1から17のアミノ酸、1から16のアミノ酸、1から15のアミノ酸、1から14のアミノ酸、1から13のアミノ酸、1から12のアミノ酸、1から11のアミノ酸、1から10のアミノ酸、1から9のアミノ酸、1から8のアミノ酸、1から7のアミノ酸、1から6のアミノ酸、1から5のアミノ酸、1から4のアミノ酸、1から3のアミノ酸、1から2のアミノ酸あるいは1つのアミノ酸)だけアミノ酸配列で異なる。
ストークポリペプチドは、POIが表面からの影響を受けないように折り畳まれる(及び場合によっては機能する)ことを可能にしながらもPOIの細胞表面への結合を提供することが目的としている。
さらに、合成ストークポリペプチド(例えば場合によっては、合成GPIポリペプチドなどの合成表面アンカーポリペプチドに加えて)の使用は、不必要な再結合が酵母菌ゲノム内において合成ストーク(および/または合成の表面のアンカーポリペプチド)をコードする酵母菌ゲノム配列とヌクレオチド配列との間で生じないことを確実にすることができる。
いくつかの場合、ストークポリペプチドがアミノ酸配列の低い複雑性、全面的な酸性の特性、高親水性、定義された二次あるいは三次構造特徴の欠如、高密度のO-結合型糖鎖付加部位、及びストークポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が低い自己相似性を特徴とすることを考慮に入れている。
ある場合には、ストークポリペプチドが、真核細胞(例えば酵母菌細胞)中の発現で強くO糖鎖を形成されるアミノ酸配列を含む。
ある場合には、主題のストークポリペプチド(およびストークポリペプチドをコードするヌクレオチド配列)が、(例えば任意の組み合わせで)上記の機能(例えば任意の組み合わせの中の)のうちのいずれかあるいはすべてを考慮することができる(すなわち、含んでいる)。
いくつかの場合において、ストークポリペプチド(例えば、合成ストークポリペプチド)は、5アミノ酸の範囲にわたって2から5個のO-結合型糖鎖化部位(例えば、2から4,2から3,3から5,3から4,4から5,2,3,4または5つのOー結合糖鎖付加部位)を有する1以上の領域(例えば、2以上、3以上、4以上、5以上、6以上、または7以上の領域)を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合において、ストークポリペプチド(例えば、合成ストークポリペプチド)は、10アミノ酸の範囲にわたって2から5個のO-結合型糖鎖化部位(例えば、2から4,2から3,3から5,3から4,4から5,2,3,4または5つのOー結合糖鎖付加部位)を有する1以上の領域(例えば、2以上、3以上、4以上、5以上、6以上、または7以上の領域)を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合において、ストークポリペプチド(例えば、合成ストークポリペプチド)は、1以上の領域(例えば、2以上、3以上、4以上、5以上、6以上、または7以上)で20アミノ酸の範囲にわたって2から5個のO-結合型糖鎖付加部位(例えば、2から4,2から3,3から5,3から4,4から5,2,3,4または5つのOー結合糖鎖付加部位)を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合において、ストークポリペプチド(例えば、合成ストークポリペプチド)は、50アミノ酸の範囲にわたって2から5個のO-結合型糖鎖化部位(例えば、2から4,2から3,3から5,3から4,4から5,2,3,4または5つのOー結合糖鎖付加部位)を有する1以上の領域(例えば、2以上、3以上、4以上、5以上、6以上、または7以上の領域)を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合において、ストークポリペプチド(例えば、合成ストークポリペプチド)は、100アミノ酸の範囲にわたって2から5個のO-結合型糖鎖付加部位(例えば、2から4,2から3,3から5,3から4,4から5,2,3,4または5つのOー結合糖鎖付加部位)を有する1以上の領域(例えば、2以上、3以上、4以上、5以上、6以上、または7以上の領域)を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合において、ストークポリペプチド(例えば、合成ストークポリペプチド)は、200アミノ酸の範囲にわたって2から5個のO-結合型糖鎖化部位(例えば、2から4,2から3,3から5,3から4,4から5,2,3,4または5つのOー結合糖鎖付加部位)を有する1以上の領域(例えば、2以上、3以上、4以上、5以上、6以上、または7以上の領域)を有するアミノ酸配列を含む。
ある場合には、ストークポリペプチド(例えば合成ストークポリペプチド)が、1から10のO-結合型糖鎖付加部位(例えば、1から9、1から8、1から7、2から10、2から9、2から8あるいは2から7のO-結合型糖鎖付加部位)があるアミノ酸配列を含む。
ある場合には、ストークポリペプチド(例えば合成ストークポリペプチド)が、40のアミノ酸につき1つ以上のO-結合型糖鎖付加部位(例えば1.2以上、1.4以上、1.6以上、1.8以上、2以上、2.2以上、2.4以上、2.6以上、2.8以上あるいは3以上のO-結合型糖鎖付加部位)を有しているアミノ酸配列を含む。
ある場合には、ストークポリペプチド(例えば合成ストークポリペプチド)が、50のアミノ酸につき1つ以上のO-結合型糖鎖付加部位(例えば1.2以上、1.4以上、1.6以上、1.8以上、2以上、2.2以上、2.4以上、2.6以上、2.8以上あるいは3以上のO-結合型糖鎖付加部位)を有しているアミノ酸配列を含む。
ある場合には、ストークポリペプチド(例えば合成ストークポリペプチド)が、100のアミノ酸につき0.5以上のO-結合型糖鎖付加部位(例えば0.6以上、0.7以上、0.8以上、0.9以上、1以上、1.1以上、1.2以上、1.3以上、1.5以上あるいは2以上のO-結合型糖鎖付加部位)を有しているアミノ酸配列を含む。
ある場合には、ストークポリペプチド(例えば合成ストークポリペプチド)が、100のアミノ酸につき1以上のO-結合型糖鎖付加部位(例えば1.2以上、1.4以上、1.6以上、1.7以上、1.8以上、2以上、2.2以上、2.4以上、2.6以上、2.8以上あるいは3以上のO-結合型糖鎖付加部位)を有しているアミノ酸配列を含む。
ある場合には、ストークポリペプチド(例えば合成ストークポリペプチド)が、200のアミノ酸につき0.5以上のO-結合型糖鎖付加部位(例えば0.6以上、0.7以上、0.8以上、0.9以上、1以上、1.1以上、1.2以上、1.3以上、1.5以上あるいは2以上のO-結合型糖鎖付加部位)を有しているアミノ酸配列を含む。
ある場合には、ストークポリペプチド(例えば合成ストークポリペプチド)が、200のアミノ酸につき1以上のO-結合型糖鎖付加部位(例えば1.2以上、1.4以上、1.6以上、1.7以上、1.8以上、2以上、2.2以上、2.4以上、2.6以上、2.8以上あるいは3以上のO-結合型糖鎖付加部位)を有しているアミノ酸配列を含む。
例えば、ある場合には、ストークポリペプチドは、10から2000のアミノ酸(例えば20から2000のアミノ酸、50から2000のアミノ酸、20から1500のアミノ酸、50から1500のアミノ酸、20から1000のアミノ酸、50から1000のアミノ酸、20から800のアミノ酸、50から800のアミノ酸、100から2000のアミノ酸、100から1500のアミノ酸、100から1000のアミノ酸、100から800のアミノ酸、10から100のアミノ酸、20から100のアミノ酸、40から100のアミノ酸、101から200のアミノ酸、201から300のアミノ酸、301から400のアミノ酸、401から500のアミノ酸、501から600のアミノ酸、601から700のアミノ酸、701から800のアミノ酸、801から900のアミノ酸、901から1000のアミノ酸、1001から1500のアミノ酸、または1501から2000のアミノ酸)までの範囲の長さを有しているポリペプチド配列を含む。
ある場合には、ストークポリペプチドが、10以上のアミノ酸(例えば20以上、30以上、40以上、50以上、60以上、70以上、80以上、90以上、100以上、125以上、150以上、200以上、250以上、300以上、350以上、400以上、450以上あるいは500以上のアミノ酸)の長さを有しているポリペプチド配列を含む。
例えば、もしストークポリペプチドが短い場合には(例えば100以下のアミノ酸)、より大きな薬剤は立体阻害により表面の接近可能な融合蛋白質のPOIに接近できないかもしれない。
したがって、ストークポリペプチドの長さは所望の薬剤と一致するように「調整する」ことができる。
例えば、与えられたPOIに対して結合のために化合物ライブラリーをスクリーニングするか、特定の分子量(閾値分子量)以下の化合物に興味を持っているだけの場合、特定の長さのストークポリペプチドはその閾値分子量を超えた化合物に対する立体阻害を提供するために選ぶことができる。
言いかえれば、与えられたPOIに対する立体の接近性は適切な長さのストークポリペプチドの選択により所望の分子量分画に「調整する」ことができる。
ストークポリペプチドの長さが長いと、立体阻害がより小さく、および高い接近性が高くなる(すなわち、ストークポリペプチドの長さが増えると、表面の接近できる融合蛋白質のPOIに対して結合するために用いることができる薬剤のサイズも増える。)実例に関して、下記の実施例を参照する。
S19(19のアミノ酸)(配列番号: 31)
GGGGSGGGGSGSTGGGGGS
S41(41のアミノ酸)(配列番号: 32)
QTSSPSREASVSTSSTSSSASQSSDPTTTSSSTVSTPATGA
S232(232のアミノ酸)(配列番号: 33)
QTSSPSTEASVSTSSTSSSASQSSDPTTTSSSSSSSSPSSQSEEISSSPTVSTTPSTSSSSSSMTSTTTTKSISTSTTSSAPVTDVTVSSSPSKSTSTSTSTETSKTPTSMTEYTSSTSIISTPVSHSQTGLSASSSSSSTTSGSSSTKSESSTTSGSSQSVESTSSHATVLANSAEMVTTSSSSSSTSEMSLTSTATSVPVSSSSSTTYSTSASTQAVTTTSSSTVSTTSS
S465(465のアミノ酸)(SEQ ID NO:34)
QTSSPSTEASVSTSSTSSSASQSSDPTTTSSSSSSSSPSSQSEEISSSPTVSTTPSTSSSSSSMTSTTTTKSISTSTTSSAPVTDVTVSSSPSKSTSTSTSTETSKTPTSMTEYTSSTSIISTPVSHSQTGLSASSSSSSTTSGSSSTKSESSTTSGSSQSVESTSSHATVLANSAEMVTTSSSSSSTSEMSLTSTATSVPVSSSSSTTYSTSASTQAVTTTSSSTVSTTSSSTTLTSAFTHSSTTSSDQPPSDTTSPSTTHEPHVTTQTSSETSSSKSSSTSSSSTSQTSESATPSDSVSPGSSTSTSSSSTSTSTSISSGETTTSSSSSSATTTSNSATLSVSTTQTSIEASSSTTSTSSSTITTSSSSAHISSKSQSSITYPSSSTSSSTSSSISSESESFESTSAEDAPSTAPSSSVSSKSSTSTTSSTSTSSSTPSPSPSSVSSSSTSSLTTSAVSTPAT
S649(649のアミノ酸)(配列番号: 35)
QTSSPSTEASVSTSSTSSSASQSSDPTTTSSSSSSSSPSSQSEEISSSPTVSTTPSTSSSSSSMTSTTTTKSISTSTTSSAPVTDVTVSSSPSKSTSTSTSTETSKTPTSMTEYTSSTSIISTPVSHSQTGLSASSSSSSTTSGSSSTKSESSTTSGSSQSVESTSSHATVLANSAEMVTTSSSSSSTSEMSLTSTATSVPVSSSSSTTYSTSASTQAVTTTSSSTVSTTSSSTTLTSAFTHSSTTSSDQPPSDTTSPSTTHEPHVTTQTSSETSSSKSSSTSSSSTSQTSESATPSDSVSPGSSTSTSSSSTSTSTSISSGETTTSSSSSSATTTSNSATLSVSTTQTSIEASSSTTSTSSSTITTSSSSAHISSKSQSSITYPSSSTSSSTSSSISSESESFESTSAEDAPSTAPSSSVSSKSSTSTTSSTSTSSSTPSPSPSSVSSSSTSSLTTSAVSTPATSHSQSTVVTTTTITTSTGPVMSTTTAYSSSSTSSSESSEVQSVMSSTPSSTSTTTSSESTSSSSTASTSPSTSQTFETSPTIGGVPSTTSFVSTPTTKLSHTTSTMTAQSDSKSTHSSSTSTEDKSSTASAVDESTTTSTSTESTTSVTSGTSHSAKESSSNSKVYSSQTAHSSISVASSPSTK
いくつかの場合に、対象の合成ストークポリペプチドは、配列番号32―35のいずれかに記載のアミノ酸配列と60%以上のアミノ酸配列同一性(70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、98%以上、99%以上、99.5%以上、99.8%以上、99.9%以上あるいは100%のアミノ酸配列同一性)を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合に、対象の合成ストークポリペプチドは、配列番号33―35のいずれかに記載のアミノ酸配列と60%以上のアミノ酸配列同一性(70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、98%以上、99%以上、99.5%以上、99.8%以上、99.9%以上あるいは100%のアミノ酸配列同一性)を有するアミノ酸配列を含む。
ある場合には、表面のアンカーポリペプチドが糖鎖ホスファチジルイノシトール(GPI)アンカードメインである(あるいは由来する)。
酵素、コート蛋白、表面抗原および接着分子を含む広範囲の細胞表面タンパク質は、GPIアンカーによって原形質膜に付けられている。(Burikofer et al. 2002 FASEB J 15:545).
GPIは翻訳後に付加された脂質アンカーである;
したがって、異なる膜貫通ドメインを有し、特定の細胞質の伸長につながる従来のポリペプチドアンカーとは異なりGPIアンカーは、連結されたタンパク質にかかわらず膜に結合する共通の脂質構造を使用する。(Englund et al., Annul Rev. Biochem. 62:121 (1993)).
GPIアンカーはGPIアンカードメインがあるタンパク質に付加される場合、GPIアンカードメインの全てあるいは一部はタンパク質から切断され、あるいはGPIアンカーはタンパク質に対して付加される。
GPIアンカードメインは、親水性のスペーサー領域によってGPI結合部位(オメガサイト)から分離された疎水性領域を含んでいる。
GPIアンカードメインは、多くのタンパク質のために同定された。(例えば、Cares et al., Science 243:1196 (1989)を参照)
GPIアンカーシグナルは、他のタンパク質のC末端の上にうまく組み替えられた。また、これらのGPIアンカータンパク質は細胞表面上でコーティングされ、機能的である。(Anderson et al., P.N.A.S. 93:5894 (1996); Brunschwig et al., J. Immunother. 22:390 (1999))
これら全体は、引用によって本明細書によって組込まれる。
主題方法、および組成物のために有益なGPIの表面のアンカーポリペプチドの例(例えばS.cerevisiaeタンパク質で発見されたGPI配列)は以下のものを含むが、これに限定されない:
IQQNFTSTSLMISTYEGKASIFFSAELGSIIFLLLSYLLF(配列番号: 51)
EKSTNSSSSATSKNAGAAMDMGFFSAGVGAAIAGAAAMLL(配列番号: 52)
SLLKSAASATSSSQSSSKSKGAAGIIEIPLIFRALAELYNLVL(配列番号: 53)
SSGASSSSSKSSKGNAAIMAPIGQTTPLVGLLTAIIMSIM(配列番号: 54)
AQANVSASASSSSSSSKKSKGAAPELVPATSFMGVVAAVGVALL(配列番号: 55)
GPGEKARKNNAAPGPSNFNSIKLFGVTAGSAAVAGALLLL(配列番号: 56)
SSTGMLSPTSSSSTRKENGGHNLNPPFFARFITAIFHHI(配列番号: 57)
SSFSSSGGSSESTTKKQNAGYKYRSSFSFSLLSFISYFLL(配列番号: 58)
YKSTVNGKVASVMSNSTNGATAGTHIAYGAGAFAVGALLL(配列番号: 59)
SGNLTTSTASATSTSSKRNVGDHIVPSLPLTLISLLFAFI(配列番号: 60)
GKNGAKSQGSSKKMENSAPKNIFIDAFKMSVYAVFTVLFSIIF(配列番号: 61)
TGSSSASSSSKSKGVGNIVNVSFSQSGYLALFAGLISALL(配列番号: 62)
ASGSSTHKKNAGNALVNYSNLNTNTFIGVLSVISAVFGLI(配列番号: 63)
EDADEDKDDLKRKHRNSASISGPLLPLGLCLLFFTFSLFF(配列番号: 64)
GPI表面アンカーポリペプチドが由来するタンパク質には、以下のものを含むがこれに限定されない:接合型タンパク質凝集素a-1(Aga1)、flocculinタンパク質(例えばFlo1)、Sed1、Cwp1、Cwp2、Tip1、Tir1/Srp1、CCW14、CIS3、CWP1、PIR1およびPIR3.
ある場合には、主題の表面アンカーポリペプチドが、配列番号:51-64のうちのいずれかにおいて示されたアミノ酸配列と60%以上のアミノ酸配列同一性(60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、92%以上、95%以上あるいは100%のアミノ酸配列同一性)を有しているアミノ配列を含む。
ある場合には、主題表面アンカーポリペプチドが、配列番号:51において示されたアミノ酸配列と60%以上のアミノ酸配列同一性(60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、92%以上、95%以上あるいは100%のアミノ酸配列同一性)を有しているアミノ配列を含む。
異種の表面のアンカーポリペプチド(例えばいくつかの場合に合成ストークポリペプチドに加えて)の使用は不必要な再結合が酵母ゲノム内において、異種の表面のアンカーポリペプチド(および/または合成ストークポリペプチド)をコードする酵母菌ゲノム配列とヌクレオチド配列との間に生じる可能性を減少させることができる。
合成の表面のアンカーポリペプチド(例えば合成GPIアンカードメイン)(いくつかの場合に合成ストークポリペプチドに加えて)の使用は不必要な再結合が酵母ゲノム内において、合成の表面のアンカーポリペプチド(および/または合成ストークポリペプチド)をコードする酵母菌ゲノム配列とヌクレオチド配列との間に生じる可能性を減少させることができる。
QIQSSMVEISTYAGSANSVNAGAGAGALFLLLSLAII(配列番号: 71)。
いくつかの場合に、主題の合成表面アンカーポリペプチドは配列番号71で示されたアミノ酸配列と60%以上のアミノ酸配列同一性(60%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、92%以上、95%以上あるいは100%のアミノ酸配列同一性)を有しているアミノ配列を含む。
いくつかの場合に、主題合成表面アンカーポリペプチドは配列番号71で示されたアミノ酸配列を含む。
そのため、GPIアンカードメインは、シグナルポリペプチドおよびストークポリペプチドの両方のC末端に位置することができる。
そのような場合、POIは、ストークポリペプチドのN末端およびシグナルポリペプチドのC末端(例えば、シグナルポリペプチドとストークポリペプチドとの間)に位置するだろう。
したがっていくつかの場合(例えば表面の接近可能な融合タンパク質が表面のアンカーポリペプチドとしてGPIアンカードメインを含む場合)に、表面の接近可能な融合タンパク質の構成要素は、N末端からC末端まで、シグナルポリペプチド、POI、ストークポリペプチド(例えば合成ストークポリペプチド)、および表面のアンカーポリペプチド(例えばGPIアンカードメイン)を含んでいる。
したがって、ある場合には、表示部分(下記に説明されるように)および/または表面の接近可能な融合タンパク質は、表面のアンカーポリペプチドとしてはGPIアンカードメインを含んでいる。
ある場合には、より詳細に下記に説明されるように、表面の接近可能な融合タンパク質はさらに1つ以上のタグを含んでいてもよい。
そのため、TMドメインは、シグナルポリペプチドおよびストークポリペプチドの両方のC末端に位置づけられる。
そのような場合、POIは、ストークポリペプチドのN-末端及びシグナルポリペプチドのC-末端(例えばシグナルポリペプチドおよびストークポリペプチドの間)に位置するだろう。
言いかえれば、そのような場合、TMドメインは表面の接近可能な融合タンパク質のC末端の近くに位置し、および、POIおよびストークポリペプチドは両方ともTMドメインのN末端に位置するだろう。
したがって、ある場合であって(例えば表面の接近可能な融合タンパク質がI型膜タンパク質であり、表面のアンカーポリペプチドとしてTMドメインを含んでいる場合)、表面の接近可能な融合タンパク質の構成要素は、N末端からC末端まで、シグナルポリペプチド、POI、ストークポリペプチド(例えば合成ストークポリペプチド)および表面のアンカーポリペプチド(例えばTMドメイン、I型TMドメイン)を含んでいる。
したがって、ある場合には、表示部分(下記に説明されるように)および/または表面の接近可能な融合タンパク質は、表面のアンカーポリペプチドとしてI型TMドメインを含んでいる。
ある場合には、より詳細に下記に説明されるように、表面の接近可能な融合タンパク質はさらに1つ以上のタグを含んでいてもよい。
そのため、TMドメインは、シグナルポリペプチドC末端およびストークポリペプチドのN末端に位置することができる。
そのような場合、POIはストークポリペプチドのC末端に位置するだろう。
言いかえれば、そのような場合、TMドメインは表面の接近可能な融合タンパク質のN末端の近くに位置し、及びストークポリペプチドおよびPOIは両方ともTMドメインのC末端に位置するだろう。
したがって、ある場合(例えば表面の接近可能な融合タンパク質がII型膜タンパク質であって、表面のアンカーポリペプチドとしてTMドメインを含んでいる場合)には、表面の接近可能な融合タンパク質の構成要素は、N末端からC末端まで、シグナルポリペプチド、表面のアンカーポリペプチド(例えば TMドメイン、II型TMドメイン)、ストークポリペプチド(例えば合成ストークポリペプチド)およびPOIを含んでいる。
したがって、ある場合には、表示部分(下記に説明されるように)および/または表面の接近可能な融合タンパク質は、表面のアンカーポリペプチドとしてはII型TMドメインを含んでいる。
ある場合には、より詳細に下記に説明されるように、表面の接近可能な融合タンパク質はさらに1つ以上のタグを含んでいてもよい。
本明細書に使用される用語「タグ」は、(直接および/または間接的に)検知できる、及び追跡および/または精製の容易さを提供するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
適切なタグの例は当業者に対して知られるだろう。また、どんな好適なタグも用いることができる。
適切なタグの例は、直接検知できるタグ(例えば蛍光性のポリペプチド(例えば緑色蛍光タンパク質、YFP、RFP、CFP、mCherry、tdTomatoなど)(GFP));およびアフィニティータグ。(例えばヒスチジン・タグ(例えば6XHisタグ);赤血球凝集素(HA)タグ;FLAGタグ;Mycタグ;など)を含んでいるがこれに限定しない
ある場合には、表面の接近可能な融合タンパク質が1つを超えるタグを含んでいる。
したがって、ある場合には、主題の表面に接近可能な融合タンパク質は1つ以上のタグ(2以上、3以上、4以上のタグ、または1、2、3あるいは4つのタグ、)を含んでいる。
タグは、表面の接近可能な融合タンパク質内のいかなる場所にも位置することができる。
例えば、タグは以下に位置することができる:
(i)シグナルポリペプチドのC末端及びPOIのN末端;
および/または(ii)POIのC末端および合成ストークポリペプチドのN末端。
表面の接近可能な融合タンパク質に1つを超えるタグがある場合に、タグは、POI(例えば、1つ以上のタグは、シグナルポリペプチドのC末端およびPOIのN末端に位置する、および、1つ以上のタグは、POIのC末端および合成ストークポリペプチドのN末端に位置する。)のどちらの端にも置くことができる。
ある場合には、タグが連続して(すなわちならんで)位置する。
主題の表面に接近可能な融合タンパク質の様々な構成要素(例えばシグナルポリペプチド、POI、タグ、ストークポリペプチド、表面のアンカーポリペプチド)は、(介在するアミノ酸なしで)直接つぎつぎに連結され、あるいは、リンカーアミノ酸(例えば任意の数のリンカーアミノ酸)によって分離することができる。
例えば、ある場合には、主題の表面に接近可能な融合タンパク質の2つの与えられた構成要素を分離するアミノ酸はない。
ある場合には、主題の表面に接近可能な融合タンパク質の2つの与えられた構成要素を分離する1つ以上のアミノ酸(例えば2以上、3以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、10以上、15以上、20以上、25以上、30以上あるいは40以上のアミノ酸)がある。
ある場合には、20以下のアミノ酸(例えば15以下、10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下あるいは2以下のアミノ酸)がある、主題の表面に接近可能な融合タンパク質の2つの与えられた構成要素を分離している。
ある場合には、主題の表面に接近可能な融合タンパク質が、シグナルポリペプチド、POI、ストークポリペプチド、表面のアンカーポリペプチドおよび1つ以上のタグから成る。
ある場合には、主題の表面に接近可能な融合タンパク質が、シグナルポリペプチド、POI、ストークポリペプチドおよび表面のアンカーポリペプチドから本質的になる。
ある場合には、主題の表面に接近可能な融合タンパク質が、シグナルポリペプチド、POI、ストークポリペプチド、表面のアンカーポリペプチドおよび1つ以上のタグから本質的に成る。
2つの実例で、CV1は表示されるべきPOIである。
それは高親和性を有するCD47に結合するのは前に述べられた改変タンパク質である。
以下の2つの実例において、CV1は、649アミノ酸ストークおよび2つの異なるGPIアンカーのうちの1つにつながれた、表面に接近可能な融合タンパク質として酵母菌細胞上に表示される:
シグナル配列:
接合因子アルファリーダー(アミノ酸1-87)(配列番号: 11)対象のタンパク質:
CV1(アミノ酸90-208)(配列番号: 7)HAエピトープタグ(アミノ酸211-219)(配列番号: 8)ストーク:
649のアミノ酸ストーク(アミノ酸220-868)(配列番号: 35)
表面のアンカー:
ハイブリッドGPIアンカードメイン(アミノ酸871-907)(配列番号: 71)MRFPSIFTAVLFAASSALAAPANTTTEDETAQIPAEAVIDYSDLEGDFDAAALPLSNSTNNGLSSTNTTIASIAAKEEGVQLDKREASAEEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSGSYPYDVPDYAQTSSPSTEASVSTSSTSSSASQSSDPTTTSSSSSSSSPSSQSEEISSSPTVSTTPSTSSSSSSMTSTTTTKSISTSTTSSAPVTDVTVSSSPSKSTSTSTSTETSKTPTSMTEYTSSTSIISTPVSHSQTGLSASSSSSSTTSGSSSTKSESSTTSGSSQSVESTSSHATVLANSAEMVTTSSSSSSTSEMSLTSTATSVPVSSSSSTTYSTSASTQAVTTTSSSTVSTTSSSTTLTSAFTHSSTTSSDQPPSDTTSPSTTHEPHVTTQTSSETSSSKSSSTSSSSTSQTSESATPSDSVSPGSSTSTSSSSTSTSTSISSGETTTSSSSSSATTTSNSATLSVSTTQTSIEASSSTTSTSSSTITTSSSSAHISSKSQSSITYPSSSTSSSTSSSISSESESFESTSAEDAPSTAPSSSVSSKSSTSTTSSTSTSSSTPSPSPSSVSSSSTSSLTTSAVSTPATSHSQSTVVTTTTITTSTGPVMSTTTAYSSSSTSSSESSEVQSVMSSTPSSTSTTTSSESTSSSSTASTSPSTSQTFETSPTIGGVPSTTSFVSTPTTKLSHTTSTMTAQSDSKSTHSSSTSTEDKSSTASAVDESTTTSTSTESTTSVTSGTSHSAKESSSNSKVYSSQTAHSSISVASSPSTKGAQIQSSMVEISTYAGSANSVNAGAGAGALFLLLSLAII(配列番号: 9)
シグナル配列:
接合因子アルファリーダー(アミノ酸1-87)(配列番号: 11)対象のタンパク質:
CV1(アミノ酸90-208)(配列番号: 7)HAエピトープタグ(アミノ酸211-219)(配列番号: 8)ストーク:
649のアミノ酸ストーク(アミノ酸220-868)(配列番号: 35)
表面のアンカー:Agg1p GPIアンカードメイン:(アミノ酸871-910)(配列番号: 51)MRFPSIFTAVLFAASSALAAPANTTTEDETAQIPAEAVIDYSDLEGDFDAAALPLSNSTNNGLSSTNTTIASIAAKEEGVQLDKREASAEEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSGSYPYDVPDYAQTSSPSTEASVSTSSTSSSASQSSDPTTTSSSSSSSSPSSQSEEISSSPTVSTTPSTSSSSSSMTSTTTTKSISTSTTSSAPVTDVTVSSSPSKSTSTSTSTETSKTPTSMTEYTSSTSIISTPVSHSQTGLSASSSSSSTTSGSSSTKSESSTTSGSSQSVESTSSHATVLANSAEMVTTSSSSSSTSEMSLTSTATSVPVSSSSSTTYSTSASTQAVTTTSSSTVSTTSSSTTLTSAFTHSSTTSSDQPPSDTTSPSTTHEPHVTTQTSSETSSSKSSSTSSSSTSQTSESATPSDSVSPGSSTSTSSSSTSTSTSISSGETTTSSSSSSATTTSNSATLSVSTTQTSIEASSSTTSTSSSTITTSSSSAHISSKSQSSITYPSSSTSSSTSSSISSESESFESTSAEDAPSTAPSSSVSSKSSTSTTSSTSTSSSTPSPSPSSVSSSSTSSLTTSAVSTPATSHSQSTVVTTTTITTSTGPVMSTTTAYSSSSTSSSESSEVQSVMSSTPSSTSTTTSSESTSSSSTASTSPSTSQTFETSPTIGGVPSTTSFVSTPTTKLSHTTSTMTAQSDSKSTHSSSTSTEDKSSTASAVDESTTTSTSTESTTSVTSGTSHSAKESSSNSKVYSSQTAHSSISVASSPSTKGAIQQNFTSTSLMISTYEGKASIFFSAELGSIIFLLLSYLLF(配列番号: 10)
本開示の態様は、上述の表面の接近可能な融合タンパク質および/または核酸(例えば、表面の接近可能な融合タンパク質を発現するための核酸および/または表面の接近可能な融合タンパク質をコードする核酸)を含む細胞(すなわち、宿主細胞)を含む。用語「宿主細胞」は、主題の表面の接近可能な融合タンパク質が発現され表示されるべき細胞を指し;または、核酸が増殖されるべき細胞を指すように、本明細書で使用される。宿主細胞は、主題の表面の接近可能な融合タンパク質を、組み換え発現ベクター(例えば真核生物の宿主細胞)のような主題の核酸から発現させるために、および/または主題の組み換え発現ベクター(例えば真核生物の宿主細胞あるいは原核生物の宿主細胞)を増殖させるために使用され得る。
方法
いくつかの実施形態において、主題の方法は、真核細胞において目的のタンパク質(POI)を発現する(例えば、真核細胞の表面上にPOIを表示する)方法である。そのような方法は、POIを含む主題の表面の接近可能な融合タンパク質を細胞(例えば任意の所望の宿主細胞)に導入する工程を含む。例えば、そのような方法は、真核細胞(例えば、上述のように真菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞などのような宿主細胞)に、表面の接近可能な融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を導入する工程を含み得る。表面の接近可能な融合タンパク質は、シグナルポリペプチド、POI、ストークポリペプチドおよび表面のアンカーポリペプチド(及びある場合においてはタグ)を含む。POIを含む表面の接近可能な融合タンパク質は、:(i)直接タンパク質として(例えばある場合にはタンパク質導入ドメインを用いる);(ii)タンパク質をコードするRNAとして;(iii)タンパク質をコードするDNAとして;細胞へ導入され得る。ある場合(例えば表面の接近可能な融合タンパク質がDNAとして細胞へ導入される場合)には、表面の接近可能な融合タンパク質をコードするヌクレオチドは、細胞内で動作可能なプロモーターに動作可能に連結される。
いくつかの実施形態において、主題の方法は、POIへの薬剤の結合を測定する(例えばある場合において薬剤がPOIに結合できるかどうか判断する)方法である。POIへの薬剤の結合を測定する方法は、真核細胞(例えば目的の任意の真核生物の宿主細胞、例えば哺乳動物細胞、真菌細胞、酵母細胞など)の表面上にPOIを表示する工程を含み得る(例えば、前記「発現する方法」参照)。
いくつかの実施形態において、主題の方法は、POIに結合する薬剤(化合物)を同定する方法である。POIに結合する薬剤を同定する方法(例えば、POIに結合する薬剤のための試験化合物をスクリーニングする)は、真核細胞(例えば、目的の任意の真核生物の宿主細胞、例えば哺乳動物細胞、真菌細胞、酵母細胞など)の表面上にPOIを表示する工程、細胞を薬剤と接触させる工程、細胞に結合される薬剤の量を(定量的および/または定性的に)測定する工程を含む。
いくつかの実施形態において、主題の方法は、薬剤に結合するポリペプチド(例えば、薬剤が特定の濃度に存在する場合に、薬剤に結合するポリペプチド、例えば、前もって定義した値より上の親和性をもつ薬剤に結合するポリペプチドを同定すること)を同定する方法である。薬剤に結合するポリペプチドを同定する方法は、真核細胞(例えば、目的の任意の真核生物の宿主細胞、例えば哺乳動物細胞、真菌細胞、酵母細胞など)の表面にPOIを表示する工程を含む。そのような方法は、薬剤を同定する方法について上述されるものと同一であり得る、しかしこの場合、使用されるものに一定に保たれ得る(又は特定の濃度で使用される)が、薬剤は2個以上の細胞と接触するために使用される。2つ以上の細胞の少なくとも2つは、異なる表面の接近可能な融合タンパク質の形態で異なるPOIを発現(表示)する。各細胞(又は細胞の各集団)については、薬剤の結合は(定性的に又は定量的に)測定され得て、それによって所与の薬剤(又は所与の濃度の所与の薬剤)に2つ以上のPOIのどれが結合することができるかを判断できる。
(v)変異ポリペプチドを生成する方法
全方法で使用するためにキットも提供される。主題のキットは、上述の表面の接近可能な融合タンパク質および/または核酸のいずれかを含み得る。例えば、ある場合には、上述されるように、適切なキットは表面の接近可能な融合タンパク質を発現するための核酸(例えば、組み換え発現ベクター)、又は表面の接近可能な融合タンパク質をコードする核酸(例えば、組み換え発現ベクター)を含む。ある場合には、キットが2つ以上のDNA核酸(例えば、組み換え発現ベクター)を含む。
ある場合には、2つ以上のDNA核酸の少なくとも2つによってコードされた合成ストークポリペプチドは、異なる長さであり且つ、それぞれは20から100個のアミノ酸、40から100個のアミノ酸、101から200個のアミノ酸、201から300個のアミノ酸、301から400個のアミノ酸、401から500個のアミノ酸、501から600個のアミノ酸、601から700個のアミノ酸、701から800個のアミノ酸、801から900個のアミノ酸、901から1000個のアミノ酸、または1001から1500個のアミノ酸、の範囲の長さを有する。そのため、ある場合には、キットは複数のDNA核酸(例えば主題の表面の接近可能な融合タンパク質を発現するための)を含み得て、複数のDNA核酸によってコードされたストークポリペプチドは、長さの範囲に及ぶ。
本明細書に記述された組成物と方法は、限定されないが、化学物質とポリペプチドの発酵生産を含む様々な目的のために新しい真菌細胞(例えば新しい酵母菌株)を開発するために使用できる。さらに、本明細書に記述された組成物と方法は、酵母上の突然変異誘発タンパク質の発現又は、他のコンビナトリアルライブラリーを含む様々な調査目的に使用され得る。他の方法とは対照的に、本明細書に記述された組成物と方法は、モノシストロニックベクターを用いて、様々な酵母菌株および種での使用を可能にする。さらに本明細書に記載の組成物および方法は、(例えば、ストークポリペプチドの長さを変えることによって)目的のタンパク質に対する選択的な(「調整可能な」)接近可能性を許容し、これは基質または結合の相手の分子量を制限するように調節され得る。真核細胞(例えば、真菌細胞、酵母細胞など)の表面上のタンパク質の発現は、多種多様な目的で産業において使用される。本明細書に記述された組成物と方法は、合成ストークポリペプチドに融合した任意の所望のタンパク質(目的のタンパク質)の直接的且つ、単純な発現を許容する。モノシストロニックベクターを用いて、表面の接近可能な融合タンパク質の一部としてPOIを表示できるので、システムは様々な酵母菌株および種に容易に移植可能(portable)である。
以下の実施例は、本発明を実施および使用する方法の完全な開示および記載を当業者に提供するために提示されたものであり、発明者が本発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではなく、以下の実験が実行された唯一の実験であることを示すことを意図するものでもない。用いられる数(例えば量、温度など)に関して正確であるように努力を重ねてきたが、実験の誤差や偏差について説明が付くものもあるはずであろう。特段指示のない限り、部分は重量部分であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧またはほぼ大気圧下である。
図1A-1Cは、可変長GPIアンカー「ストークポリペプチド」を使用して接近可能性を「調整する」ことができるかどうかを判断するために行った実験を示す。これらの実験に用いられた酵母株は、BJ5465である。図1Aは、酵母細胞表面へのペプチド結合の1つの実施形態の概略図を示す:目的のタンパク質(POI)(ここでは、操作されたSIRPa変異体CV1)は、表面の接近可能な融合タンパク質として分泌され、融合タンパク質においてPOIは(i)シグナルポリペプチド(分泌経路にタンパク質を導くが、翻訳後プロセシングによってタンパク質から切断させられ得る)、(ii)ストークポリペプチド(長さが広範囲にわたり修飾され得る合成配列)、(iii)GPIアンカー(例えば合成GPIアンカー)、そして随意に(iv)エピトープタグ(示されているものはHAエピトープタグである)に融合される。
目的:高い親和性および特異性でT細胞で発現したPD-1に結合するPD-L1の突然変異体を同定し、それにより腫瘍細胞または腫瘍浸潤性免疫細胞の表面に発現したPD-L1との相互作用の競合阻害剤として作用することである。
目的:高い親和性および特異性の内因性IL-2に結合するサイトカインレセプターサブユニットIL2Rβの突然変異体を同定し、それによって内因性のIL-2レセプター複合体とIL-2の相互作用を不活性化するために拮抗的なシンク(sink)として作用することである。
目的:任意の既知の細胞表面、又は分泌されたタンパク質に対して高親和性、高特異性の治療用ヒトモノクローナル抗体を生成する目的のために酵母の表面上に、抗原結合のフラグメント(Fab)あるいは一本鎖可変フラグメント(scFv)のいずれかとしてヒト抗体結合ドメインを発現することである。
目的:任意の既知の細胞表面又は、分泌されたタンパク質に対して高親和性、高特異性の治療用ヒトモノクローナル抗体を生成する目的のために酵母の表面上に、限定されないが、フィブロネクチン、免疫グロブリン、ノッチン、DARPins、アンチカリンを含む代替スキャフォールドライブラリーを発現することである。
目的:目的のタンパク質への結合に基づいて新規の相互作用パートナーを同定するために、目的のタンパク質をパニング(panning)するために酵母の表面上に、例えば、腫瘍由来細胞株、又は正常細胞型から集められたcDNAによってコードされたタンパク質を発現することである。
Claims (20)
- DNA核酸であって、
前記DNA核酸は、
(i)シグナルポリペプチドをコードする第1のヌクレオチド配列、
(ii)合成ストークポリペプチドをコードする第2のヌクレオチド配列、および
(iii)グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカードメインをコードする第3のヌクレオチド配列を含み、
(i)(ii)および(iii)は、5’から3’の方向に互いに対して位置決めされ、
同じプロモータに動作可能に連結され、
プロモータは真核細胞において機能的であり、および、
合成ストークポリペプチドは配列番号32-35のいずれかで示されたアミノ酸配列と90%以上のアミノ酸配列同一性があるアミノ酸配列を含み、
GPIアンカードメインは配列番号51-64及び71のいずれかで示されたアミノ酸配列と90%以上のアミノ酸配列同一性があるアミノ酸配列を含み、および、
シグナルポリペプチドは配列番号11-17のいずれかで示されたアミノ酸配列と90%以上のアミノ酸配列同一性があるアミノ酸配列を含む、
ことを特徴とするDNA核酸。 - 対象のタンパク質(POI)をコードするヌクレオチド配列を挿入するための挿入部位を含み、前記挿入部位は(i)の3’および(ii)の5’に位置する請求項1に記載のDNA核酸。
- (iv)対象のタンパク質(POI)をコードする、第4のヌクレオチド配列を含み、前記第1から第4のヌクレオチド配列は、
(a)(i)、(iv)、(ii)、(iii)の順に5’から3’へ位置決めされ、
および
(b)それらが前記シグナルポリペプチド、前記POI、前記合成ストークポリペプチドおよび前記GPIアンカードメインを含む表面の接近可能な融合タンパク質をまとめてコードするように、互いに、インフレームである請求項1に記載のDNA核酸。 - 前記合成ストークポリペプチドは40以上のアミノ酸を含む請求項1乃至3のうちのいずれか1項に記載のDNA核酸。
- 前記合成ストークポリペプチドは、40乃至2000のアミノ酸を含む請求項1乃至4のうちのいずれか1項に記載のDNA核酸。
- 前記シグナルポリペプチドは酵母タンパク質からのシグナルポリペプチドである請求項1乃至5のうちのいずれか1項に記載のDNA核酸。
- 前記シグナルポリペプチドは小胞体(ER)への翻訳後輸送を示すタンパク質由来のものである請求項1乃至6のうちのいずれか1項に記載のDNA核酸。
- 前記DNA核酸は組み換えの発現ベクターである請求項1乃至7のうちのいずれか1項に記載のDNA核酸。
- 前記プロモータは真菌細胞において機能的である請求項1乃至8のうちのいずれか1項に記載のDNA核酸。
- 前記真菌細胞は酵母菌細胞である請求項9に記載のDNA核酸。
- 2つ以上のDNA核酸を含むキットであって、
DNA核酸はそれぞれ次のものを含み、
(i)シグナルポリペプチドをコードする第1のヌクレオチド配列、
(ii)合成ストークポリペプチドをコードする第2のヌクレオチド配列、および
(iii)グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカードメインをコードする第3のヌクレオチド配列、
各DNA核酸の(i)、(ii)、および(iii)は5’から3’の方向に互いに対して位置決めされ、同じプロモータに動作可能に連結され、
2つ以上の前記DNA核酸の少なくとも2つによってコードされた前記合成ストークポリペプチドは、異なる長さであり、および、
前記合成ストークポリペプチドは配列番号32-35のいずれかで示されたアミノ酸配列と90%以上のアミノ酸配列同一性があるアミノ酸配列を含み、
前記GPIアンカードメインは配列番号51-64及び71のいずれかで示されたアミノ酸配列と90%以上のアミノ酸配列同一性があるアミノ酸配列を含み、および、
前記シグナルポリペプチドは配列番号11-17のいずれかで示されたアミノ酸配列と90%以上のアミノ酸配列同一性があるアミノ酸配列を含む、
キット。 - 2つ以上の前記DNA核酸の少なくとも2つによってコードされた前記合成ストークポリペプチドは、40以上のアミノ酸の長さを有している請求項11に記載のキット。
- 酵母菌細胞の表面上に対象のタンパク質(POI)を表示する方法であって、
前記方法は、
表面に接近可能な融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を酵母菌細胞へ導入する工程を含み、
該表面の接近可能な融合タンパク質はシグナルポリペプチド、POI、合成ストークポリペプチドおよびグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカードメインを含み、
前記合成ストークポリペプチドは配列番号32-35のいずれかで示されたアミノ酸配列と90%以上のアミノ酸配列同一性があるアミノ酸配列を含み、
前記GPIアンカードメインは配列番号51-64及び71のいずれかで示されたアミノ酸配列と90%以上のアミノ酸配列同一性があるアミノ酸配列を含み、および、
前記シグナルポリペプチドは配列番号11-17のいずれかで示されたアミノ酸配列と90%以上のアミノ酸配列同一性があるアミノ酸配列を含む、
ことを特徴とする方法。 - 対象のタンパク質(POI)への薬剤の結合を測定する方法であって、
前記方法は、
請求項13に記載の方法によって酵母菌細胞の表面上にPOIを表示する工程、
前記酵母菌細胞を薬剤に接触させる工程、及び
細胞に結合した前記薬剤の量を測定する工程を含む方法。 - 前記薬剤は直接検知できるラベルを用いて標識付けされる請求項14に記載の方法。
- 前記測定する工程はフローサイトメトリーを含む請求項14あるいは請求項15に記載の方法。
- 前記方法は、
2つ以上の異なる対象のタンパク質(POI)を表示する工程であって、各POIは異なる細胞の表面上に表示される工程、
前記POIを表示する前記細胞を前記薬剤と接触させる工程、及び
前記細胞に結合した前記薬剤の量を測定する工程
を含む請求項14乃至16のうちのいずれか1項に記載の方法。 - 前記2つ以上の異なるPOIの少なくとも1つは、前記2つ以上の異なるPOIの他の少なくとも1つに対して1から20のアミノ酸突然変異を有する請求項17に記載の方法。
- 前記方法は、突然変異生成を含む方法を使用し、前記2つ以上の異なるPOIの少なくとも2つを生成させる工程を含む請求項17あるいは請求項18に記載の方法。
- 前記方法は、
前記酵母菌細胞と2つ以上の薬剤とを接触させる工程、および
前記細胞に結合した薬剤を特定する工程、
を含む請求項14乃至19のうちのいずれか1項に記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2021041635A JP2021101712A (ja) | 2014-11-10 | 2021-03-15 | 細胞の表面上にポリペプチドを発現させるための組成物および方法 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201462077756P | 2014-11-10 | 2014-11-10 | |
US62/077,756 | 2014-11-10 | ||
PCT/US2015/059787 WO2016077249A1 (en) | 2014-11-10 | 2015-11-09 | Compositions and methods for expressing polypeptides on the surface of cells |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2021041635A Division JP2021101712A (ja) | 2014-11-10 | 2021-03-15 | 細胞の表面上にポリペプチドを発現させるための組成物および方法 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2018500009A JP2018500009A (ja) | 2018-01-11 |
JP2018500009A5 JP2018500009A5 (ja) | 2018-12-20 |
JP7235436B2 true JP7235436B2 (ja) | 2023-03-08 |
Family
ID=55954905
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017524052A Active JP7235436B2 (ja) | 2014-11-10 | 2015-11-09 | 細胞の表面上にポリペプチドを発現させるための組成物および方法 |
JP2021041635A Pending JP2021101712A (ja) | 2014-11-10 | 2021-03-15 | 細胞の表面上にポリペプチドを発現させるための組成物および方法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2021041635A Pending JP2021101712A (ja) | 2014-11-10 | 2021-03-15 | 細胞の表面上にポリペプチドを発現させるための組成物および方法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10829771B2 (ja) |
EP (1) | EP3218477A4 (ja) |
JP (2) | JP7235436B2 (ja) |
CN (1) | CN107075507B (ja) |
WO (1) | WO2016077249A1 (ja) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110268108B (zh) * | 2016-12-12 | 2022-09-06 | 埃克切拉生物科学公司 | 用于使用微毛细管阵列进行筛选的方法和系统 |
US11668021B2 (en) | 2017-05-09 | 2023-06-06 | Yale University | Basehit, a high-throughput assay to identify proteins involved in host-microbe interaction |
CN112272703A (zh) * | 2017-10-31 | 2021-01-26 | Encodia有限公司 | 采用核酸编码和/或标签进行分析的试剂盒 |
CN108085332B (zh) * | 2017-12-27 | 2020-11-27 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种细胞表面展示有豆壳过氧化物酶的重组酵母菌及其构建方法与应用 |
AU2019345157A1 (en) * | 2018-09-20 | 2021-12-23 | Vir Biotechnology, Inc. | Engineered microorganisms and methods of making and using same |
CN110551644A (zh) * | 2019-07-19 | 2019-12-10 | 天津科技大学 | 通过调控细胞壁组成蛋白构建的低产高级醇酿酒酵母菌株 |
US20240050583A1 (en) | 2020-12-08 | 2024-02-15 | Harbour Biomed (Shanghai) Co., Ltd | Protein-drug conjugate and site-specific conjugating method |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003235579A (ja) | 2002-02-19 | 2003-08-26 | Bio Energy Kk | 凝集タンパク質Flo1を用いる細胞表層発現系の最適化 |
JP2010512160A (ja) | 2006-12-12 | 2010-04-22 | バイオレクシス ファーマシューティカル コーポレーション | トランスフェリン融合タンパク質ライブラリー |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ATE437889T1 (de) * | 2005-12-02 | 2009-08-15 | Apceth Gmbh & Co Kg | Chemokin-mucin fusionsproteine mit einer gpi- ankerdomäne und deren verwendung als tumor-immun- adjuvanzien oder in der geweberegeneration |
CA2677383A1 (en) * | 2007-02-09 | 2008-08-21 | Medimmune, Llc | Antibody library display by yeast cell plasma membrane |
WO2010065407A2 (en) * | 2008-12-01 | 2010-06-10 | University Of Maryland Biotechnology Institute | High affinity recombinant sea lamprey antibodies selected by a yeast surface display platform |
US8343752B2 (en) * | 2011-05-03 | 2013-01-01 | Verdezyne, Inc. | Biological methods for preparing adipic acid |
-
2015
- 2015-11-09 EP EP15859426.7A patent/EP3218477A4/en not_active Ceased
- 2015-11-09 JP JP2017524052A patent/JP7235436B2/ja active Active
- 2015-11-09 CN CN201580059777.8A patent/CN107075507B/zh active Active
- 2015-11-09 WO PCT/US2015/059787 patent/WO2016077249A1/en active Application Filing
- 2015-11-09 US US15/525,397 patent/US10829771B2/en active Active
-
2021
- 2021-03-15 JP JP2021041635A patent/JP2021101712A/ja active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003235579A (ja) | 2002-02-19 | 2003-08-26 | Bio Energy Kk | 凝集タンパク質Flo1を用いる細胞表層発現系の最適化 |
JP2010512160A (ja) | 2006-12-12 | 2010-04-22 | バイオレクシス ファーマシューティカル コーポレーション | トランスフェリン融合タンパク質ライブラリー |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20180037898A1 (en) | 2018-02-08 |
JP2018500009A (ja) | 2018-01-11 |
EP3218477A1 (en) | 2017-09-20 |
CN107075507B (zh) | 2021-08-24 |
CN107075507A (zh) | 2017-08-18 |
EP3218477A4 (en) | 2018-07-18 |
JP2021101712A (ja) | 2021-07-15 |
WO2016077249A1 (en) | 2016-05-19 |
US10829771B2 (en) | 2020-11-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7235436B2 (ja) | 細胞の表面上にポリペプチドを発現させるための組成物および方法 | |
ES2410579T5 (es) | Sistemas de despliegue de levaduras | |
US20240102202A1 (en) | Yeast display of proteins in the periplasmic space | |
US9512203B2 (en) | Single-domain antibodies that bind to HIV-1 Nef with high affinity | |
CN111801446A (zh) | 一种用于分离G蛋白偶联受体(GPCRs)的功能性抗体的酵母表型筛选方法 | |
JP2021514648A (ja) | 新規の標的抗原結合部分のための特異性アッセイ | |
US20200072820A1 (en) | Method of Selecting for Antibodies | |
JP2023139090A (ja) | ドレブリンに特異的に結合するペプチド、及びそのペプチドを用いたドレブリンの検出方法 | |
CN116355094B (zh) | 抗小鼠白介素12的单克隆抗体及制备方法 | |
US20220186209A1 (en) | Methods of antibody panning against target proteins | |
US20200157529A1 (en) | Methods and compositions for ligand directed antibody design | |
US20220154174A1 (en) | Method of Selecting for Antibodies | |
TWI698643B (zh) | 用於檢測米田堡血型抗原的抗體及其片段、試劑盒及方法 | |
CN113461822B (zh) | Scl-70抗体或其结合片段、其筛选方法及包含其的检测试剂盒 | |
CN112079928B (zh) | 一种抗pd-l1的单克隆抗体 | |
US20210047637A1 (en) | Affinity resins and sample preparation devices based on cartilaginous fish ignar derived binding domains | |
WO2023118670A1 (en) | Method for screening a signal peptide for efficient expression and secretion of a heterologous polypeptide in mammalian cells | |
WO2023104933A1 (en) | Camelid antibodies for use in therapy and diagnosis | |
CN118725099A (zh) | cTnI抗体及其用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170502 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20181107 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20181107 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20191028 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200124 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200309 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20200605 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200730 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20201118 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210315 |
|
C60 | Trial request (containing other claim documents, opposition documents) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60 Effective date: 20210315 |
|
C11 | Written invitation by the commissioner to file amendments |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C11 Effective date: 20210324 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20210427 |
|
C21 | Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C21 Effective date: 20210428 |
|
A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20210604 |
|
C211 | Notice of termination of reconsideration by examiners before appeal proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C211 Effective date: 20210609 |
|
C22 | Notice of designation (change) of administrative judge |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C22 Effective date: 20211122 |
|
RD13 | Notification of appointment of power of sub attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7433 Effective date: 20211201 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20211210 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20211210 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220128 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220113 |
|
C092 | Termination of reconsideration by examiners before appeal proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C092 Effective date: 20220202 |
|
C22 | Notice of designation (change) of administrative judge |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C22 Effective date: 20220408 |
|
C13 | Notice of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C13 Effective date: 20220607 |
|
RD14 | Notification of resignation of power of sub attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7434 Effective date: 20220630 |
|
C22 | Notice of designation (change) of administrative judge |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C22 Effective date: 20220803 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220906 |
|
C23 | Notice of termination of proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C23 Effective date: 20230105 |
|
C03 | Trial/appeal decision taken |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C03 Effective date: 20230130 |
|
C30A | Notification sent |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C3012 Effective date: 20230130 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230224 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7235436 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |