JP2018500009A5

JP2018500009A5 -

Info

Publication number: JP2018500009A5
Application number: JP2017524052A
Authority: JP
Filing date: 2015-11-09
Publication date: 2018-12-20
Anticipated expiration: 2035-11-09

Claims

細胞の表面上に対象のポリペプチドを発現させるためのＤＮＡ核酸であって：
ＤＮＡ核酸は、
（ｉ）シグナルポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列；
（ｉｉ）合成ストークポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列；および
（ｉｉｉ）表面のアンカーポリペプチドをコードする第３のヌクレオチド配列：を含み、
（ｉ）（ｉｉ）および（ｉｉｉ）は、５’から３’の方向に互いに対して位置決めされ、
同じプロモータに動作可能に連結され、
プロモータは真核細胞において機能的であることを特徴とするＤＮＡ核酸。
対象のタンパク質（ＰＯＩ）をコードするヌクレオチド配列を挿入するための挿入部位を含み、挿入部位は（ｉ）の３’および（ｉｉ）の５’に位置する請求項１記載のＤＮＡ核酸。
（ｉｖ）対象のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする、第４のヌクレオチド配列を含み、第１から第４のヌクレオチド配列は、：
（ａ）（ｉ）、（ｉｖ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）の順に５’から３’へ位置決めされ：
および
（ｂ）それらがシグナルポリペプチド、ＰＯＩ、ストークポリペプチドおよび表面のアンカーポリペプチドを含む表面の接近可能な融合タンパク質をまとめてコードするように、互いに、インフレームである請求項１記載のＤＮＡ核酸。
ストークポリペプチドは２０以上のアミノ酸の長さを有しているポリペプチド配列を含む請求項１乃至３のうちのいずれか１項に記載のＤＮＡ核酸。
ストークポリペプチドは、２０乃至２０００のアミノ酸の範囲の長さを有するポリペプチド配列を含む請求項１乃至４のうちのいずれか１項に記載のＤＮＡ核酸。
前記第２のヌクレオチド配列は低い自己相似性を特徴とし、コードされたストークポリペプチドは、アミノ酸配列の低い複雑性、全体的に酸性の性質、高親水性、二次または三次構造の機能の定義の欠如、及び高密度のＯ−結合型糖鎖付加部位を特徴とする請求項１〜５のうちのいずれか１項に記載のＤＮＡ核酸。
ストークポリペプチドは配列番号：３１−３５のいずれかで示されたアミノ酸配列と６０％以上のアミノ酸配列同一性があるアミノ酸配列を含む請求項１乃至６のうちのいずれか１項に記載のＤＮＡ核酸。
シグナルポリペプチドは酵母蛋白質からのシグナルポリペプチドである請求項１乃至７のうちのいずれか１項に記載のＤＮＡ核酸。
シグナルポリペプチドは小胞体（ＥＲ）への翻訳後輸送を示すタンパク質由来のものである請求項１乃至８のうちのいずれか１項に記載のＤＮＡ核酸。
シグナルポリペプチドは配列番号：１１−１７のいずれかで示されたアミノ酸配列と６０％以上のアミノ酸配列同一性があるアミノ酸配列を含む請求項１乃至９のうちのいずれか１項に記載のＤＮＡ核酸。
表面のアンカーポリペプチドはグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカードメインである請求項１乃至１０のうちのいずれか１項に記載のＤＮＡ核酸。
ＧＰＩアンカーポリペプチドは配列番号：５１−６４及び７１のいずれかで示されたアミノ酸配列と６０％以上のアミノ酸配列同一性があるアミノ酸配列を含む請求項１１に記載のＤＮＡ核酸。
表面のアンカーポリペプチドは合成ポリペプチド配列である請求項１乃至１２のうちのいずれか１項に記載のＤＮＡ核酸。
ＤＮＡ核酸は組み換えの発現ベクターである請求項１乃至１３のうちのいずれか１項に記載のＤＮＡ核酸。
前記プロモータは真菌細胞において機能的である請求項１乃至１４のうちのいずれか１項に記載のＤＮＡ核酸。
真菌細胞は酵母菌細胞である請求項１５に記載のＤＮＡ核酸。
２つ以上のＤＮＡ核酸を含むキットであって、
ＤＮＡ核酸はそれぞれ次のものを含み：
（ｉ）シグナルポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列；
（ｉｉ）合成ストークポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列；および
（ｉｉｉ）表面のアンカーポリペプチドをコードする第３のヌクレオチド配列；
各ＤＮＡ核酸の（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）は５’から３’の方向に互いに対して位置決めされ、同じプロモータに動作可能に連結され、；
２つ以上のＤＮＡ核酸の少なくとも２つによってコードされたストークポリペプチドは、異なる長さであるキット。
２つ以上のＤＮＡ核酸の少なくとも２つによってコードされた合成ストークポリペプチドは、２０から１００のアミノ酸、４０から１００のアミノ酸、
１０１から２００のアミノ酸、２０１から３００のアミノ酸、３０１から４００のアミノ酸、４０１から５００のアミノ酸、５０１から６００のアミノ酸、６０１から７００のアミノ酸、７０１から８００のアミノ酸、８０１から９００のアミノ酸、９０１から１０００のアミノ酸、あるいは１００１から１５００のアミノ酸の範囲の長さを有している請求項１７に記載のキット。
合成ＧＰＩアンカードメインを含む、タンパク質、またはタンパク質をコードする核酸であって、
ここで合成ＧＰＩアンカードメインは、配列番号５１−６４のいずれかで示されたアミノ酸配列と６０％以上または、８０％以上のアミノ酸配列同一性があるアミノ酸配列を含むタンパク質、またはタンパク質をコードする核酸。
合成ＧＰＩアンカードメインを含む、タンパク質、またはタンパク質をコードする核酸であって、
ここで合成ＧＰＩアンカードメインは、配列番号７１で示されたアミノ酸配列と６０％以上または、８０％以上のアミノ酸配列同一性があるアミノ酸配列を含むタンパク質、またはタンパク質をコードする核酸。
真核細胞の表面上に対象のタンパク質（ＰＯＩ）を表示する方法であって、
該方法は：
表面に接近可能な融合蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を真核細胞へ導入する工程を含み、
該表面の接近可能な融合蛋白質はシグナルのポリペプチド、ＰＯＩ、合成ストークポリペプチドおよび表面のアンカーポリペプチドを含むことを特徴とする方法。
真核細胞は真菌細胞である請求項２１に記載の方法。
真菌細胞は酵母菌細胞である請求項２２に記載の方法。
対象のタンパク質（ＰＯＩ）への薬剤の結合を測定する方法であって、
該方法は：
請求項２１乃至２３のうちのいずれか１項に記載の方法によって真核細胞の表面上にＰＯＩを表示する工程、
真核細胞を薬剤に接触させる工程、及び
細胞に結合した薬剤の量の測定する工程を含む方法。
薬剤は直接検知できるラベルを用いて標識付けされる請求項２４に記載の方法。
前記測定する工程はフローサイトメトリーを含む請求項２４あるいは請求項２５に記載の方法。
前記測定する工程は定性的であり、薬剤が細胞に結合しているかどうかを判定することを含む、請求項２４乃至２６のうちのいずれか１項に記載の方法。
前記方法は：
２以上の異なる対象のタンパク質（ＰＯＩ）を表示する工程であって、各ＰＯＩは異なる細胞の表面上に表示される工程、：
前記ＰＯＩを表示する細胞と薬剤と接触させる工程：及び
前記細胞に結合した薬剤の量を測定する工程：
を含む請求項２４乃至２７のうちのいずれか１項に記載の方法。
２つ以上の異なるＰＯＩの少なくとも２つは１から２０のアミノ酸だけアミノ酸配列が異なる請求項２８に記載の方法。
前記方法は、突然変異生成を含む方法を使用し、２つ以上の異なるＰＯＩの少なくとも２つを生成させる１工程を含む請求項２８あるいは請求項２９に記載の方法。
前記方法は：
真核細胞と２つ以上の薬剤とを接触させる工程；および
前記細胞に結合した薬剤を特定する工程；
を含む請求項２４乃至３０のうちのいずれか１項に記載の方法。