JPS59183693A - ＤＨＦＲタンパクをコ−ドするベクタ−を使用するヒトｔＰＡの産生 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は形質転換宿主細胞培養でのヒト組織プラスミノ
ーゲン活性化因子（ｔＰＡ）の産生【こ係る。より詳し
くは、本発明は、ジヒドロ葉酸還元酵素（Ｄ　ＨＦ　Ｒ
＞タンパクをコートしＣいる配列を前記の如き■１胞中
で光現さぜると共に　ｔＰＡを産生するベクター、細胞
及び方法に係る。

組換技術を使用するｔＰＡの産生け、米国特許出願第３
７４，８６０号（１９８２年５月５日出願）、第３９８
、００３号（１９８２年　７月１４日出願）及び第４８
３．０５２号（１９８３年４月　７日出願）に既に開示
され（いる。これらの特翻出１９ｉ１　Ｌｌ、欧州：ｅ
＋’　＋’ｉ′！出願公開第００９３６１９号に対応し
−Ｃおり、−この開示内容は上記引用により本明胛１古
中に包含されるものとづる。

これらの出願には、　ｔＰＡの一］−ド配列を含有Ｊる
プラスミドの構築についＣ記載されてＪ５す、又、この
ようにして産生された　ｔＰＡのン１５↑（１及び用途
についても記載されＣいる。

同様に、１９８３年１月１９０出願の米国狛ム′Ｆ出願
第４５９、１５２号及び第４５９．１５１舅（これらの
出願を引用して本明細出中に包含゛りるものど゛りる）
に記載されているように、Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒタンパク
をコードしているＤＮＡ配列が、所望の異（ｉＦ全クン
クをコードしている配列の適当な宿主細胞中へのトラン
スフェクションに対゛りるマーカーどして利用し得るこ
とも既に知見されている。又、１つｌ−Ｉ　Ｆ　Ｒ配列
（Ｊ所望タンパク産生の制御を７ｊ）能にりる第２配列
としても使用し得る。これらの出願（ま、野生型Ｄ　Ｈ
「Ｒ１及びメトトレキセート耐性、の突然変異Ｄ　Ｉ−
ＩＦＲの双方の前記の如き用途を開示している。

ポリペプチドを外来宿主中で産生ずる際にしばしば遭遇
する問題は、所望タンパク産生を調節又は通常は増進す
るある種のメカニズムを必要とすることである。本発明
の主′題となる　ｔＰＡの場合、外部制御パラメーター
例えばメトトレキセートによって影響を受けるＤＨＦＲ
含有第２］−ド配列を使用すると、メトトレキセート（
Ｍ　Ｔ　Ｘ　）　濃度を制御することによって発現を制
御覆ることか可能になる。

メトトレキセートは、これを摂取し得る細胞にとって通
常致命的な薬剤である。然しながら、ある種の細胞は制
御されたレベルのＭＴＸの存在下で生育し得る。メトト
レキセート耐性となるいくつかのメカニズムの１つは、
Ｄ　ＨＦ　Ｒコード配列をコードしている遺伝子の増幅
を刺激するようなメカニズムである（　Ｒｏｂｃ已１−
．３　ｃｌ）ｉｍｋ、ｅ　ｅｔ　ａｌ。

３ｃｉｅｎｃｅ、　　２０２：　１０！ｉ１　（１９７
８）　　：　Ｊ　、　　ｌ−。

Ｂ　１ｏｄｌｔ３ｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃａｌ’ｔ（ｆｌ
’　　ＩＩ　（：３．．３２　：　　１り３（１９７２
）　　　；　　Ｓ　　、　　「　、　　Ｃ１）ａｎ（＋
　　（！ｌ　　ａｔ、、Ｃｅ１ｌ、ユニ３９１　（１９
７６）参照）。

更に、ＤＨＦＲの遺伝子の増１！１ｉｉｉの結末、他の
タンパクをコードしている関連配列の増幅も生じ得る口
とが既に示されている。これ（よ関連クンバクが、［３
型肝炎表面抗原（Ｉｌ［３ｓ　Ａ！Ｊ）＜、ノ。

Ｃ旧゛ｉｓｔｍａｎ、　　ｅｔ　　ａｔ、、　　Ｐｒｏ
ｃ、Ｎ１１ｔ１．Δｃａｄ、Ｓｃｉ、。

胆：　１８１５　（１９ｇ２）参照）、１二、−皿旦ク
ンバクＸＧＰ　ＲＴ’　（Ｒｊ　１１００１　（１、Ｃ
Ｏ１’ｄ（ｉｌ）、　ａｔ　、Ｌｌ　ｌ　、　、　Ｊ　
、　Ｍ　ＯＩ　ｅ’Ｃ。

ａｌ）ｄ　Ａ、　１ｌｌ１１．Ｇ　ｅｎ、、ユニ’　　
１６５　（１！Ｊｉｉｌ）参照）、及びＩＤ１〜ＩＦＲ
／ＳＶ４０プラスミドの結合ぜに由来づる内因性配列（
Ｒ、Ｆ　、　Ｋ　ａｕｆｍａｎ　ｏｔ　ａｔ、、　Ｊ　
。

Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、、ユ５９　：　　６０１　（
１９８２）参照）で゛ある場合に起こるようである。

メトトレキセート耐性を付与する他のメカニズムは、Ｄ
ＨＦＲタンパクの結合親和力の低下を含むが、この場合
メトトレキセート感受性が低ドしくＷ、　Ｆ、　Ｆｌｉ
ｎｔｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｓｏｍａｔ、　Ｃｅ１ｌ
Ｇｅｎｅｔ、、　２：　　２４５（’１９７６）参照）
同時に増幅も起こるように思われる。

このように、野生型Ｄ　Ｉ−（、Ｆ　Ｒ１及び結合親和
力が低下し−ＣいるためＭＴＸ耐性となつ−ＣいるＤ十
［Ｒの双方のｊ真仏子は、Ｍ　Ｔ　Ｘの存在により増幅
されるように思われる。従って、原理的（こ本発明は、
ＤＨＦ’Ｒ配列増幅の関連タンパクコード配列に及ぼす
インパクトに関係し、これによりＭＴＸの存在下で又は
形質転換細胞を前取てＭ　１−　Ｘで処置することによ
って　ｔＰＡ配列の＠度発現レベルが可能となる制御メ
カニズムが得られる。

欧州特許出願公開第００９３６１９号に記載されている
とおり、ｔＰＡはヒトメラノーマ（黒色腫）細胞から回
収され１Ｆ：３る繊維素溶解物質であるく欧州特許出願
公開第００４１７６６弓も参照）。この物質の単離及び
特性（よＷ　ｅ！ｎ１ａｎ　（！Ｌ　ａｌ、　、　１Ｎ
１０　　ｌ−ａｌｌｃＯｔ。

ＩＩ　（８２５０）　：　１０１８　（１９８１）に記
載されＣいる。

ｔＰＡの楳ｔｕｆｆ素溶解能（，１，２種の市販クンバ
ク叩らス１〜レブトキナーゼどつ［１キノーゼと同様Ｃ
あり、これらの効能は、急性心血１゛２病、例えば心筋
梗塞、脳卒中、　ｔｉｌｌ、基稈ｍ１−２深部静脈血梓
１ｌｌｒ、末梢動脈閉塞症及びその他の静脈血栓ｈ１−
の治療どδれている。これらの疾病の基本的１ネ囚は、
明らかに凝・血塊にＪ、る血管の部分的又（ｊ仝体的閉
塞にある。

従って、例えばヘパリン又はり、ノリンを用いるＪ：う
な従来の凝固防ＩＶ棹法は、ｌｉ　Ｊ、；二面（金が更
に形成するのを防止でるたけて・あり既に形成された血
栓を溶解するわりで（まないの−（イ］効Ｃ′はない１
．これらの繊維素溶解剤即ちス１〜レブ１〜キナーゼ、
ウロキナーゼ及びプラスミノーゲン活性化因子は、仝て
同様に作用づる。これらは不活性前駆体プラスミノーゲ
ンを。プラスミンに変換し、このプラスミンが、前記の
如き血栓を構成する繊維素（フィブリン）を溶解し得る
。プラスミノーゲン活性化因子は［素に対する高い親和
力（アフィニディ）を有しており、そのため溶解したい
繊維素と結合しているプラスミノーゲンを優先的に活性
化覆る。

これに対して、ストレプトキナーゼとｒクロキナーゼは
優先的に活性化することがないので、生成する、プラス
ミンの多くは循環血液中で形成されて目標とする血栓に
到達する前に中和されてしまう。

更に、これらの化合物は繊維素に結合したプラスミンよ
りも循環するプラスミンを生成づ−るため、循環してい
る伯の血液凝固因子タンパク例えばフィブリノーゲン、
第Ｖ因子及び第■因子も活性化されたタンパクによって
作用を受り、その結果出血の可能性が生じる。又、スト
レプトキナーゼは強度に免疫原性である。

プラスミノーゲン訃性化因子は繊維素に既に結合しでい
るプラスミノ−Ｖンに対して特異的に作用するので、上
述したようイー１国り！ＩＩ　１ｆＩＢ回貸される。

本発明は、ＤＩ−Ｉ　Ｆ　Ｒタンパクの配列の増幅を効
率的に制御づることによって、絹模体培養に於（）る前
記の如き価値あるタンパクのＮｉ′牛を増大せしめ１１
つ１１１制御する方法に係る。

本発明は、−面に於い（、じ１〜組組織プラスミノーゲ
ン活性化壬子ｔ１〕へ）及びＩ）　ｌ−＋　［Ｒタンパ
クをコードしている配列を含有し且つこれら双方のタン
パクの発現にイ）効である７゛シスミドに係る。

他の面に於いＣ１本発明はこれらのベクターで形質転換
された細胞に係る。

更に別の面に於い−Ｃ１本発明は、し１つＡ配列と共に
コートランスフエフ１−されたＤ　Ｉ−（Ｆ　Ｒ、−＋
−ド配列の、環境−によって制御された応答を利用する
ｔＰＡ産生方法及びこのようにして産生される［ＰＡに
も係る。

−１ ヒト［組織プラスミノーゲン活性化因子Ｊ（ｔＰＡ）は
、欧州特許出願公開第００４４７６６号（この開示内容
を本明細書中に包含する）に記載の繊維素溶解タンパク
である。

ｒ　Ｄ　Ｈ，Ｆ　Ｒタンパク」とは、ジヒドロ葉酸還元
酵素（Ｄ　ＨＦ　Ｒ）に関連づる活性を右し行、従って
、ヒポキサンチン、グリシン及びチミジンを○まない培
地（−ＨＧＴ培地）に於いて生４７シ冑る■１胞にＪ：
って産生される必要があるタンパクを意味する。通常、
Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒタンパクを欠く細胞は該培地では増
殖できないが、Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒタンパクをイｊする
細胞は該培地で増殖できる。

ｒ’Ｍ　Ｔ　Ｘ感受性細胞」とは、Ｄ　ＨＦ　Ｒ１ｉｆ
ｔ害剤メトトレキセー）−（ＭＴＸ）を含む培地で増・
殖し得ない細胞を意味づ゛る。従っ（’　ｒ　Ｍ　’ｌ
’　Ｘ感受性細胞」とは、還伝的（ε変容されるか又は
他ツノ）法で・補足（きれない限り、周囲及び培地が細
胞のタイプに追した条件（゛あってＥ）　Ｎ　Ｍ　Ｔ’
　Ｘ　ｊｔｉ′：１．Ｘか０．２１Ｊ９１．’ｍ！！以
上になると増殖できない細胞をノど一味する。細菌の如
く成る種の細胞は、通′７：；はｉＶＩ’ｌＸに感受ｆ
１を承ケ筈のＤ　ＨＦ　Ｒを含んでいるにも拘らず、細
胞膜内部へＭ　Ｔ　Ｘを透過させないのｃ　Ｎｌｌ　’
Ｔ　Ｘ感、受性を示さない。一般に、Ｄ　Ｉ−１１−Ｒ
タンパクとしＣ野生型Ｄ　Ｉ−１）−Ｆ＜を含む■１胞
は、ｌｖｌ　ｌ’　Ｘを透過し得るが又は摂取し得る限
り、メト１〜レ−１−レートに感受性であろう。

［野生型Ｄ　ＨＦ　Ｆ＜　’Ｊとは、使用り−る特定生
物に通常見出されるにう、なジヒドロ、？−酸）Ｊｉ元
酵素を意味する。野生型Ｄ　ＨＦ　Ｒは通常１１）＼１
１目゛ｏｃ但濃度のメ１〜１へレキレ−１〜に感受１！
トである。

ｒ　Ｍ　Ｔ　Ｘ　ニ対ツール結合２Ｍ　−；：ｕ　カッ
低イＤ　ｌ−Ｉ　Ｆ　Ｒりンパク」なる用語は機能的な
定義である。これは、細胞内部で生成されれば０．２７
１１／ｄ以上のＭＴＸを含む培地でもＭＴＸ感受性細胞
を増殖せしめるＤＨＦＲタンパクを意味する。このよう
な機能的定義は、生物のｒＭＴＸに対する結合親和力の
低いＤ　ＨＦ　ｒ！タンパク」を産生する能力及び産生
されたタンパク自体に依存することは明らかである。

然しながら、本明細書中でこの用語を使用する場合には
、これら２種のメカニズム間のバランスは問題にならな
い。即ち本発明では、前記の如ぎＭＴＸレベルで生存す
る能力を付与することが・操（’１の目的であり、産生
したＤＨＦＲ固右の性質に加えて多量の発現が前記の如
ぎ能力を強化したか否かは重要でない。

「発現ベクター」とは、内包するＤＮＡ配列がこれを発
現させ得る別の配列に有効に（発現し得るように）結合
されている場合、該ＤＮＡ配列な発現さぜ１ｑるベクタ
ーを意味Ｊる０、これらの発現ベクターは、本明細、Ｎ
ｌ中必づ゛シｂｌｌ１１確に記述しなくても、宿主生体
中で、コービソームとして又は染色体ＤＮＡに組込まれ
た部分としζ複製可能でなければならない。複製能が欠
如覆るとベクターは有効に作用し得ない４．要づるに、
「発現ベクター」なる用語（ま機能的定義であり、内包
づる特定のＤＮ　Ａコードを発現さ′Ｉ！得る任意のＩ
）　Ｎ　Ａ配列も、その特定の配列について使用りるど
きにはこの用ｎＤに包含される。一般には、組換１）　
Ｎ　Ａ技術で使用される発現ベクターは、Ｌ、　＋、＋
：’　Ｌ／ば「シラスミド」の形態にある。この「プラ
スミド」どは、環状二重鎖ＤＮＡルーゾのｌｌＩｒ′称
−（・あり、ベクター形態のときには染色体に結合しく
ｉい３．）゛ンスミドの形態のベクターが最もよく使用
されるので、本明細火中では「プラスミドＪ及び「ベク
ター」なる用語を互換的に使用している。然しなから、
本発明は、勿論、同等の機能を果すことができ今後当業
界で公知となる別の形態の発現ベクターをも包含する。

「組換宿主細胞」とは、組換ＤＮＡ技術を用いて構築さ
れたベクターで形質転換された細胞を意味づる。本明細
用中に記載するように、この形質転換によって多量のｔ
ＰＡが産生され１！ノる。対照的に形質転換されていな
い宿主を用いると　Ｎ）Ａの産生量は）ｍかに少なく、
普通の場合には検出不能な量でさえある。

Ｂ、詳細な説明 ８．１宿主細胞及びベクター 水明ＮＩＪ　ｍ中に開示するベクター及び方法は、広範
囲に亘る原核生物及び真核生物の宿主細胞中での使用に
適している。

勿論一般には、本発明に有用なベクターを構築するため
のＤＮＡ配列のクローン化−には原核生物が好ましい。

例えば、Ｅ　−ｃｏｌｉ　　Ｋ　１２２９４株（Δ丁Ｃ
ＣＮ　０．３１４４Ｇ　＞が特に有用である１、使用可
能な別の微生物菌株どして、ｌ”　、　ｃｏｌｉ　、　
（３及びＦ。

竺比　Ｘ　１７７Ｇ　（Ａ　Ｔ　ＣＣＮ　ｏ、：Ｎ５３
７　）の如きり。

Ｃ０１（菌株がある。これらは勿論代表例であり限定的
なものて１まない。

原核二１］物は、又、発現のｌこめにし使用され得る。

前記の菌４ツ１、及びり、仙　〜・Ｖ３１１０　（Ｆ−
、λ−、プロト１〜　ＣＩ　　−）　、　　　Ａ　　１
−　　ＣＣＮ　　Ｏ’、２７３２！＋　　　）　　、　
　稈　区１　炙Ｈ列　λばＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔ
ｉｌ’ｉｓ、１ｌｊ２の賜内細ｉｌｌ　ｍｊｌ、例えば
Ｓ　ａｌｌｌｌｏｎｅｌ　Ｉａ　ｊｙｐ１１！ｍ１ｌｌ
’！１ｌｎｌ又はＳｃｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｅｎｓ
　、並ひに秒々のシー１−ドしナス種が使用され得る。

一般に（よ、宿」っ細胞と適合１（１の種から二４填１
されたレプリコン及び制御配列を○むプラスミドベクタ
ーが、宿主と共に使用公れる。、ベクターは、通常、複
製部位と、形質転換された細胞中で・の表現型選択を可
能にし得るマーカー配列とを担持している。例えば１．
Ｅ−１坦比は典型的には、し、坦紅種から誘導されるプ
ラスミドｐＢＲ３２２を用いて形質転換される（Ｂｏｌ
ｉｖａｒ、　ｅｔ　ａｌ、’、　Ｇｅｎｅ、　２：９５
　（１９７７）　）。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン及
びテトラサイクリン耐性の遺伝子を合んで＋３す、従っ
て形質転換された□細胞の簡単な同定手段となる。

１）ＢＲ３２２プラスミド又は他の微生物プラスミ１〜
は３、微生物が自身のタンパクを発現すべく使用し１Ｓ
るプロモーターを含有するか又は含有づへく変性されて
いなければならない。組換ＤＮＡの描榮に最もよく使用
されるプロモーターとしでは、β−ラクタマーゼ（ペニ
シリナーゼ）及びラフｌ−−スプロモーターシステム（
Ｃｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｎ　ａｔＬＩＩ’ｅ、２７５　：　　６１５　（１９７
８）　　：　　Ｉ　ｔａｋ旧’ａ　　ｅｔ　　ａｌ、。

５ｃｉｅｎｃｅ、　　　１９８：　　１（１５６（１９
７７）’　　：　　ＧＯｅｄｄｅｌ　　ｅｔａ＋、’、
ｉ”Ｊａｔｕｒｅ、　２８１：　　５４４（１９７９）
　）　、並びに１〜リブ］〜フアン（ｔｒｐ’）プロモ
ーターシスデム（Ｇｏｅｄｄｃｌ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｆｌｓ　　Ｒｅｓ、、　８：４０
５７　（１９８０）　；欧州特ｉｉＱ出願公開第（ｌ　
０３６７７６号明細害）がある。１１α記の１［］シー
り−が最もよく使用されるが、他の微住物ブ［−１ヒ一
ターｂ発見（きれｎつ利用されており、それ＋３のメク
レオーヂド配列に関づ−る詳細す既に公表され−Ｃいる
ため、当業者はこれらのプロモーターをシラスミ１〜ベ
クター（こ機能的に結合し１！する（　３１ｃｂｃｎｌ
ｉｓｔ　ｃｔ　ａｌ、。

Ｃｅｌ　１，２０　：　　２（ｉ９　（１９８０）　）
。

原核生物以外に、酸１ヌｊの如さ貴核微生物の使用−し
可能である。５ａｏ（ｉｌｌａｒｏｌｌＩｙｃ（！ｓ　
Ｃ（ｉｌ゛ＯＶ：Ｓ！ａ（！　’ｙ（は曹通のパン酵母
が最もＪ、く使用′、＼れる哀杉微生物であるが、多く
の他の菌株も使用され得る。

Ｓ　ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ＋ｌ　’Ｃ′の発現のた
めにＩＪ、例λぼプラスミドＹ　Ｒｐ７　（Ｓ　ｔｉｎ
ｃｈｃｏｎ＋ｂ　ｃｌ　ａｌ、、Ｎ　ａｌｕｒｃ。

２８２：　３９　（１９７９）　　；　　Ｋ　ｉｎｇｓ
ｍａｎ　　ａｔ　　ａｌ、、Ｇｅｎｃ、７：１４１　（
１９７９）　：　Ｔｓｃｈｅｍｐｃｒ　ｅｔ　ａｌ、、
Ｇｅｎｅ、１０：１５７　（，１９８０）　）が常用さ
れる。このプラスミドはｔｒＦ１１１伝子を既に含有し
ており、同遺伝子は、トリプトフアンの不在下での増１
ｊｔＩ能ノＪか欠如した酵母突然変異株し例えは、Ａ　
Ｔ　ＣＣＮ　ｏ、４４０７６又はＰ　Ｅ　Ｐ　４−１　
（Ｊ　ｏｎｅｓ、　ＧｅｎｅｔｉｃＳ、８５：　１２（
１９７７）　）　］の選択マーカーとなる。従って、酵
母宿主細胞ゲノムの特徴としての二１の損傷の存在は、
形質転換をトリブｊ〜ファンの不在下Ｃ゛の増殖によっ
て検出するため゛の効果的な環境を提供する。

酵母ベクター中の適当なプロモーター配列として、例え
ば、３−ボスホグリセレー１−キノー−Ｕ（Ｈｉｔｚｅ
ｍａｎ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ　、　Ｆ３　ｉｏｌ、ｃＩ
）ｃ＋ｎ、、　　２５５　：２０７３　（１９８０）　
）又は他の解糖系酵素（ＨＯ３Ｓ　ｅｔａ’１．、Ｊ　
、　Ａ　ｄｖ、　Ｅ　ｎｚｙｍｅ　Ｒｅｇ、、、ユニ　
１４９（１９６８）　：Ｈｏ１ｌａｎｄ　ｅｔ　ａｔ、
、Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、旦：　４９００（７９
７８））に対するプロモーターがある。後者の例に、エ
ノラーゼ、グリレルアルデ゛ヒ１こ−・３−ボスフコ−
１〜デヒド１−１クツ−しイ、ｌ＼１ソ１−ノー（２゜
ピルベートデカルポー１ニジラーゼ、ホスボフルク１〜
キヅーゼ、グルコース−【；−小スフｆ−トイソメラー
げ、　３−ホスｌＪ＼クリレレ−１・１１クーレ、ビル
ベー１〜キナ〜ゼ、　ｌ−リＡ−ス小スフーｃ−１−イ
ソメラーヒ、小スホグルコースイソメノーゼ及びグルコ
キナーゼかある。ｊ凶当な発現プラスミドを（７１′ｉ
築りるには、これらの遺伝ｆに伴う停止配列を、発現ベ
クター中で発現したい配り）１のに′未ＤりｉＡに結合
しＣ１ＩＩ　ＲＮ　Ａのポリアデニル化及びｌ；Ｌ市を
行イ【わける。増殖条ｆ＋によって転７：７　／Ｊ〜制
御されるという付加的利点を右ηる別のプロモーターと
しＣ（ユ“、アルコールデヒドロゲナーゼ２．イソヂ１
〜り［１ムＣ２酸性ボスファクーＵ、窒素代謝に関連づ
−る分解酵素、前記グリゼルアルデにドー　３−ホスフ
Ｔ　　　ニートデヒドロゲナーゼ並びにマルト−ス及び
カラクトースの資化に関係づる酵素＜　Ｈｏｆ　１ａｎ
ｄ、上掲）に対するプロモーター領域がある。酵Ｅ１適
合士（１のブ［Ｊモーター、複製のオリジン及び停止配
列を含むいかなるプラスミドベクターも適当に利用′Ｃ
−する。

本発明に於いＣは、多細胞生物から誘導されＩｃ細胞を
宿主として好ましく使用し得る。原則として、このＪ：
うな細胞はを４１Ｆ動物又は無育椎動物のいずれから１
胃でもよい。然しなから、育（１１動物細胞の方が右利
であり、近年では相織培首ての☆柑動物細胞の増殖がル
ーチンプロセスになっている（、、Ｔ　１ｓｓｕｅ　Ｃ
ｕｌｔｕｒｅ、　Ａ　ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐ　ｒｅｓｓ、
　Ｋｒｕｓｅａｎｄ　Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ、　　（１９
７３）　）　、前記の如き有用な宿主細胞のセルライン
の例として、Ｖ　Ｅ　ＲＯ及びＨｅ　ｌａ細胞株、チャ
イニーズハムスターの卵巣（Ｃ１（Ｏ）セルライン並ヒ
ニｗ　１３８．　ｓＨＫ、　ｃ○Ｓ−７及びＭＤＣＫセ
ルラインがある。前記の如応じて）複製のオリジン、発
現リベき遺伝子の前方に位置りるプロし一ター、ＩＴＮ
のリポソーム結合部位、ＲＮ△スゾライス部位、ポリｉ
）ンール化部位及び転写終了配列を必用’ｊ　’ｂのと
して含む。

水門■？Ｌ中には好ましい貝１ホ例を記載づるが本発明
はこれらの例示配列に両足されるねりではないことが埋
ｉ！Ｊ？されＪ、う。

吐乳動物細胞中Ｃ使用する場合、発現ヘクター（ご対づ
る制御機能は、シ（３上しは、ウィルスス１１物貿（こ
よつＣ与えられる１７例えば７１ｊ゛用のゾｆ」モータ
ー（、ｔ、ポリオーマウィルス、ノ／−７ノウイルス２
がら誘導され、更に多くの場合リールウｒルス４０（３
１ｍ１ａｎ　Ｖ　ｉ＋゛ｕｓ　４０，３　■４０＞がら
誘合される１゜ＳＶ４０ウィルスの初期（ｅａｒｌｙ）
ブ［１モーター及び後期（１ａｌ（りプロモーターか９
．１に有用である。

これは、いずれもＳＶ４０ウィルスの複製のオリジンを
併せて含む断片どして、ウィルスから容易に得られるか
らである（　Ｆ　１ｅｒｓ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｎａｔ
ｕｒｅ。

ニア３　：　　１１３　（１９７８）参照。この文献の
内容は本明細書中に包含されるものとする）。断片がウ
ィルスの複製のオリジン中に位置するＢ、ｏ１１部位に
向ってｌ−１ｉｎｄｌ１１部位から伸びる約２５０　ｂ
ｐの配列を含む限り、ＳＶ４０断片の長ざの長短は問わ
ない。更に、所望の遺伝子配列が通常伴っているブ１」
モーター又は制御配列の使用も可能であり、このＪ、う
な配列の使用が好ましい場合もしばしば見られる。

但し、前記の如き制御配列は宿主■１胞系と適合しな（
プればならない。

複製のオリジンは、ＳＶ４０又は他のつ、（ルスく例え
ばポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、Ｂｌ”Ｖ等）起源から
誘導され得る外来性オーリジンを３むようにベクターを
＃４築しで得てもよく、又は宿主細胞染色体？！２製メ
カニズムによって得てもよい。ベクターが宿主ａ胞染色
体に」込ま松る揚台は、後右が良い場合もしばしばある
、。

８．２セルラインの選（ノー オ（発明のベクターによっ（１〜ノンスノ」クションを
行なう好ましい宿主細胞をｊ！択りる際に（、ｉ、、使
用覆るＤ　ＨＦ　Ｒタンパクの夕１′ゾに１ノ、・）で
１白十をｊ匹択覆るのが適当である。野ｌＪ、　＋３“
！　ｌ）　ｌ−Ｉ　Ｆ　Ｒタンパクの場合に（Ｊ、Ｄ　
Ｎ　Ｆ　Ｒが欠如した宿Ｅｌ細胞を）欽択し、こＩ’ｌ
ｌごより、Ｄ　Ｈ［−Ｒ−１−１〜配列を、ヒボニ１リ
ンデン、クリシン及びブミシンを含Ｊ：ない選択＋８地
でのトランスフエクシ」ンの成功を示すマーカーどして
使用覆るのが好ま［）い。この場合の適当な宿主細胞と
しＣ（Ｊｌ、ｌ）　１１１−Ｒ活１勺が欠如したチ（・
イニース゛ハムスター卵栄（Ｃ１］○）レルラインがあ
る。該セルライン（Ｊｌ、Ｌｌｒｌａｕｂ及びＣ１ｆａ
Ｓｌｎ、Ｐｒ０Ｃ，ＮａＬｌ、ＡＣａ（！、ＳＣ！、　
　　（ＬＪＳ　　△　）　。

７７　：　４２１６　（，１９８０）に記載の方法′で
調製され増殖さゼたものである。該文献を引用して本明
細７１中に包含する。

他方、ＭＴＸに対する結合親和力の低いＤＨＦＲタンパ
クを制御配列として使用する場合には、Ｄ　）−Ｉ　Ｆ
　Ｒが欠如した細胞を使用する必要がない。

突然変異ＤＨＦＲはメ１〜トレキセートに耐性であるか
ら、宿主細胞自体がメ１〜トレキレート感受性であれば
、ＭＴＸ含有培地を選択の手段として（す２用し得る。

Ｍ　Ｔ　Ｘを取込み得る多くの真核／ＰＩ胞はメトｉ〜
レキセーｌ−感受性であると考えられる。このような有
用なレルラインの一例として、ＣＨ０株、ＣＨ○−ＫＩ
　ＡＴＣＣＮｏ、ＣＣＬ６１がある。

後述の実施例では、宿主細胞としてのＣＨＯ細胞の使用
及びプロモーターとしてのＳＶ４０の複製のオリジンを
含む発現ベクターについて記載する。

然しながら、真核生物宿主細胞の培養物中で所望のタン
パク配列を発現する発現ベクターを構築するだめに類似
の技１（ｊを使用ザることは当業界で一１分に公知の事
実である。

Ｂ、３ＰＪＬＩＬＬ 堅固な細胞壁降壁を１、Ｊたイエ゛い細胞を宿主細胞と
して使用すると８は、１〜ランスノｊ−クシ」ンは、Ｇ
　ｒａｉｌａｎｌ及びＶ　１ｌｌｌ　ｄｏｒ　　「１１
．　Ｖ　：　ｌ”０１０１ｙ、玖：　５４６（１９７８
）に記載のリン酸カルシウ１１沈設法−（行なわれる。

然しながら、１つＮＡの細胞内導入のためには、核注入
又はプロトプラストＬ（１（台の如き他の方法も使用し
寄る。

原核ｍｌ胞又は堅固な■１胞壁Ｕが鱈・を自刃る＃ｌ［
ｌ胞を使用するとき、好ましいトランスフエクシＦ１ン
の方法は、Ｆ　、　Ｎ　、　Ｃｏｌ＋ｅｎ　ａｔ　ａｌ
、Ｊ）ｒｏｃ、Ｎ　ａｔｌ。

Ａ　ｃａｄ、３　ｃｉ、　　（Ｕ　ＳＡ＞　、　６９　
：　２１１０　（１９７２）に記載の塩化カルシウムを
用いたカルシウム処理である。

所望の」−ド配列及び制御配列を有する適当なベクター
の構築には、標準的な結合方法を使用する。単離された
プラスミド又はＤＮＡ断片を開裂し、末端処理し、所望
形態で再結合し−Ｃ所要プラスミドを形成づ”る。

開裂を行なうためには、適当な緩衝液中で１種（又は複
数種）の制限酵素で処理する。一般には、約１埒のプラ
スミド又はＤＮＡ断片に対し約１ユニツトの酵素を含む
緩衝溶液約２０鱈を使用する（特定の制限酵素に対する
適正な緩衝液及び塁質量はメーカーによって処方されて
いる）。インキュベーション時間は３７℃で約１時間で
ある。インキュベーション後、フェノール及びクロ［１
ホルム抽出でタンパクを除去し、エタノール沈澱にＪ、
り水性画分から核酸を回収する。

平滑末端が必要な場合、生成物を１０ユニツ１〜のポリ
メラーゼエ（Ｋ　ｌｅｎｏｗ　）により１５℃テ１５分
間処理し、フェノール−クロロホルム抽出し、エタノー
ル沈’ＩＩＩす◇。

開裂した断片のサイズに」、イ）分離は、［）。

Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ、　ａｌ’、、ＮｌＩＣ１ｅＩＣ
Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、、　８：４０５７　（１９８０
）に記載された６％ポリアクリルアミドゲルを用いてｉ
″ｊなう１．この文献を引用して本明細書中に包含する
。

１７１合を行なうためには、正しり′！１３台づべく末
端を適当に処理したほぼ省七ル♀の所望成分を、０．５
μｓのＩ）　Ｎ　Ａに対し約１０１．１ニツＩ〜のＴ４
ＤＮＡリガーゼて処理する（開裂されたベクターを成分
として使用する場合、開裂されｌ、−ベクターの１ｔ］
結合を阻止するために細Ｇ＋：＋のアルカリ十１小スフ
フ７夕一りに」；る予（１７ｒｌ処理を行くＪ−うとよ
い）１゜結合混合物を用いてり、鵡ｌｉ　　Ｋ１２２９
４株、（ＡＴ　ＣＣＮ　ｏ、　３１４４６）を形質転換
し、アンピシリン耐性を利用して所望の形質転換株をｊ
バ択づる。

形質転換株からプラスミドを調製し、　Ｍｅｓｓｉｎｇ
ｅｔ　ａｔ、、　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　
Ｒｅｓ、、　　９：　　３０９（１９８１）に記載の方
法又はＭ　ａｘａｍ　ｅｔ　、ａｌ、、Ｍ　ｅｔｈ−ｏ
ｄｓ　Ｆ　　Ｅ　ｎＺｙｍＯｌＯｇｙ、６．５　：　　
４９９　（１９８０）に記載の方法によって制限解析し
及び／又は配列決定する。

ＤＩ−（ＦＲタンパクをコードしている配列の１１幅を
行なうには、Ｄ　Ｉ−（Ｆ　Ｒ活性の競合阻害剤である
メ１〜トレキセートを温度約２０〜５００，０００ｎＭ
で存在させて宿主細胞を増Ｗ１させる。右効淵庶範囲は
、勿論、Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒ遺伝子の性質、タンパク及
び宿主の特性に依存する。従って、−ｈ記の上限値及び
下限値は確定値Ｃはない。ＤＨＦＲを阻害し得る１ｍの
葉酸誘導体又は他の化合物を適正濃度で使用りることも
可能である。然しながらやはりＭＴＸが便利で入手し易
く有効である。

Ｂ、４結　果 本脣明方法によれば、抗原的に活性なｔＰＡタンパクを
、宿主細胞培養で１日に細胞当り　０．１ｐ（］より多
い絹で産生し得る。適当な増幅条件を使用りると、２０
１）ｇＪ：り多いら１を冑ることも１■能Ｃ゛ある。

６ 換言ツれは、　９Ｘ　１０　　Ｐ　ｌ０Ｕ（）ｌ’＋　
　ノニツｌＪ、り多いか、又は適当な増幅によ−）’Ｃ
’　ＩＩＩＸ　１０　　Ｐ　１（ＩＬＩ！ＪＩＴ二１−
’ットヨリ多イｔ　Ｐ　Ａ　＞１ｒｌｌ’ｌ　’ｉ　？
’（ａ・Ｊ　ル、ｊ、：うなｊ真イ云ｆ発現レベルが達
成される。

Ｃ１実施例 以下の実施例は本発明の代り例としく示されたしのであ
り限定的な性質を持１．：／、、い。以上に記載の実ｋ
　泗に於いては、各々の場合導入されるＤｌ−１１＝Ｉ
Ｒタンパクのコード配列の型に適したＣＨＯ，Ｉ＝ニル
ライン宿主細胞として使用した。然しなから、池の真核
細胞及び原核細胞し同（ｊ：　ｌご本発明方法に適して
いる。

Ｃ，Ｉ　　ＭＴＸに・づる−Ａ、　　の　いＤ　ＨＦ　
ＲＣ，１，Ａ、ベクターの構築 ヒト絹様プラスミノーゲン活性化因子＜　　ｔｐΔ）を
コードする配列を、係属中の米国特許出願（Ｇｅｎｃｎ
ｔｅｃｌ＋　　１）ｏｃｋｅｔ　Ｎｏ、１００／１４０
　、）明ａＳに記載のＭ　１−　Ｘに対づる結合親和力
の低い突然変異Ｄ　ＨＦ　Ｒ用の発現プラスミドに以下
の手順ぐ挿入する（第１図参照）。該特許出願を引用し
て本明細書中に包含する。

ｔＰＡをコードしているｃＤ　Ｎ　Ａプラスミドは、Ｑ
ｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、欧州時１［出願公開味００
９３６１９ｇに記載されている。ヒトメラノーマ細胞（
Ｂ　ｏｗｅｓ）（この細胞は、例えばＬ　ｅｕｖｅｎ　
Ｒｃｓｅａｒｃ’ｈ　ａｎｄＤ　ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
　ｖｚｂ、　Ｌ　ｅｕｖｅｎ、　Ｂｅｌｇｉｕｍ　（１
）　ｒ、Ｄ　。

Ｃｏ１１ｅｎ　）等から制限なく自由に入手可能である
。

Ｒ１ｊｋｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ、
、Ｃｈｅｍ、、旦：　７０３５（１９８１）参照）を、
炭酸水糸す１〜リウム（最終濃度０．１２％）　、　２
＋ｎＭのグルタミン及び１０％の熱失活牛胎児血清を補
充した　１００　ｍｌのＦ　ａｒｉａｓ　Ｍ　Ｌｎｉｍ
ａｌＬ：　５Ｓｅｎｔｌａｌ　　Ｍ　ｅｄｉａ　（米国
バージニア用マツクレーンのｌ’　ｌｏｗ　ｌ−ａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｃｓ　Ｊ、１．　’＄ｑ　）中（、」ンフ
ルエントな状態になるまで単層培差しＩこ。メラノーン
ＩＩＩ胞がヒＩ〜組織プラスミノーゲン活性化因子を有
効に産生したことを確認づべり、２４つ］ルマイクロタ
イター皿でヒ１〜メラノーマ細゛胞をコンフル土ン１〜
な状態になるまでＪ８δした。０．３３ｆ１Ｍのプロテ
アーゼインヒビター、アゾ１−Ｊブニンの存在下又は不
在下で、細胞をリン酸緩衝りづ１１１介塩水て゛１１良
洗浄し、血清及びメチオニンをａまイｆいＪ８地０＝３
７を添加した。７５μＣ１のＥ　３５　Ｓ）−メｆ−Ａ
二ンを添加し細胞を３７°Ｃで３１１．’１問か（Ｊて
標識した。

３時間で標識した後、培地を細胞から除去し、免疫沈降
のためにｆｉｌｌ織プラスミノーゲン活性化囚了特異的
１ｇＧ又は免疫前血消で処理した（　　Ｏｐｐｅｒｍａ
ｎｎ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｖ　　ｉｒｏｌｏｇｙ、　　
１０８　：　　４７　　（１９８１）参照）。免疫沈降
産物を１０％５ＤＳ−アクリルアミドゲル電気泳動にＪ
：って表示した（　Ｌ　ａｅｍｍｌｉ。

Ｎ　ａｊＵｒｅ、　２２７　：　　ｆ３８０　（１９７
０）　参照）。平板ゲルを固定し、乾燥し、Ｘ線螢光測
定した。

メラノーマ細胞培養物から得た全ＲＮＡを、Ｗａｒｄ　
ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ　、　Ｖ　１ｒｏ１．　９：　６１
　（１９７２）の方法を準用して抽出した。細胞を遠心
によりベレットにし、次に　１０ｍＭのＮａ　Ｃｆｌ、
　１０　ｍ　Ｍのトリス−ｔ」Ｃｆｌ（ｐｌ−１７，５
）及び１．５ｍＭ１の１ｖＨｃＲ，に再男戻　濁　さ　
せ　Ｉこ　。　　ＮＰ−４０（ＮＯＮ　ＩＤＥＴ　　　
　　Ｉン　−１１０゜米国メリーランド州ロックウィル
のＢ　ＲＬ（Ｂ　ｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　
ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）社製。

最終濃度１％）を添加して細胞を溶解し、遠心して核を
ペレット化した。全ＲＮＡを含む上清を多数回のフェノ
ール／クロロホルム抽出により更に精製した。水相を０
．２ＭのＮａＣρ溶液にし、次ＩＪ２倍容のエタノール
を添加して全ＲＮＡを沈澱させた。Ａリボ−ｄＴｔル［
」−スクＬ！マｉ〜グラフィーを用い、全１−＜Ｎ△調
製物から１］ｌ［マベ１△を）’ｆ’ｌ製しＦ　ＣＣｒ
ｅａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎ　ｕｃｌ、Ａ　Ｃ１１ＩＳ　
　國ｅｓ、、８２３３１（１９８０）参照）。凹型的す
収１１１どして（ま、１０りの培たメラノーマガｆｉｌ
胞から　５乃−７１０ｍｇの全１でＮＡ及び５０乃至２
００屑のポリ（Ａ）ゾンス＋ｎＲＮＡか１ξｌられた。

１ボ素−アカ１］−スゲ街電気泳動４用いてポリギ１ｎ
ＲＮへ（２００ｉ、）の分画を（’＋イ、−）た（　Ａ
　ｎｉｖ　ｅｌａｉ、、　　　Ｐ　　ｒ　ＯＣ，Ｎ　　
ａｔｌ、Ａ　　ｃａｄ、Ｓ　　ｃｉ、、　　（Ｌ〕　Ｓ
　Δ　）　　、　　６９：１、Ｈ１８（１９７２）参照
）。１．７５％の）ツカＩＪ−ス。

０．０２５Ｍのクエン酸す１〜リウム（１珪１３．８）
及び６Ｍの１ボ累から成る平板アカロースグルを用いた
。

電気泳動は２５ミリアンペア、４℃℃−７時間実施し、
次にゲルをカミソリの刃で分割した９、各スライスを７
０℃で融解し、フェノールで２回、り［１０小ルムで　
１回抽出した。次に両分をエタノール沈澱し、引続いて
イヌのスイ臓ミクロソームを補充したウサギ網状赤血球
ライゼーｌへ系（Ｂ　ｃｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ−ｓｅａｒ
ｃｌｌＬ　ａｂ、　）中ｉｎ　ＶｉｔｒＯで、以下の如
く翻訳してアッセイ・を実施した。２５ｍＭのｌ−Ｉ　
Ｅ　ｔ”　ＩＦ　Ｓ　。

４８．３　ｍＭの塩化カリウム、　　１０ｍＭのリン酸
りレアヂン、各５Ｏｎ＋Ｍの１９種のアミノＷ、　１．
１１１１ＭのＪＭ化マグネシウム、　１６．６　ｍＭの
ＥＤＴ△、　　０．１６ｍ’Ｍのジチオスレイ１〜−ル
、　８．３ｍＭのヘミン、　ＩＧ、６μＬ／誦のタレア
ヂンキナーゼ、　　０．３３　ｍ　Ｍの」ふ１化カルシ
ウム、　　０．６６ｍＭのＥＧＴ’Ａ（エチレングリコ
ール−ビス−（β−７ミノエチルエーデル）−Ｎ、Ｎ。

Ｎ、Ｎ−テトラ酢ＩＩ　＃ｆｌ　＠液）及び２３．３ｍ
Ｍ　ｆ７）　ＩＸｔｓ化ナトツナトリウム最終容量３０
ρの溶液中で２５μＣＩの［’Ｓ］Ｓノーオニン及び５
００ｎｇ（７）各１ｊ　／Ｌ／スライスＲＮＡを用いて
翻訳した。

３０℃で９０分間インキュベートｌノた１、リポソーム
（ｉ、ｊ　Ｉｏｂｃｌ　ＱＬ　ａｌ、、　Ｊ　、　Ｃｅ
ｌｌ　１３　ｉｏｌ、、　Ｃ７：８！＋２（１９７５）
参照）を除去１べくＩ［）［Δを用いて相ミクロソーム
からｉ周製しｌこイヌのスイＣ・１ルミク［Ｉ　Ｖ−１
Ｘ肱を、ヌクレアーＬ／（処１里しく　３　ｂｉｃｌｄ
ｓ　ａｔａ　ｌ’　、　、　Ｊ　、　Ｂ、　ｊ　Ｏｉ　
、ＣＩ’１ｅｌｌ’、　、２５３−　：３７ＪＪ　（１
９７＋１　）　参照）、最終濃度７Ａ２６０ユニツ１〜
／′Ｉ雇で９′１］訳混合物中にぐ在さじた。翻訳産物
又は免役沈降翻訳産物を、既に記伎の如＜　（１，、ａ
ｅｍｌｌｉｌ　ｌ、Ｎａｌ’ｕｒｃ、　Ｆ２７゜６８０
　（１９７０）参照）、ドデシル硫酸プ１−リウム中の
１０％ポリアクリルアミドタル ４？伍した。未染色の平板ゲルを固定し、乾燥して螢光
測定した（　Ｂ　ｏｎｎｅｒ　ｅｔ　ａｔ．、　「’　
ｕｒ．、Ｊ　。

Ｂ　ｉｏｃｈｅｎ＋，、４６　：　８３　（　１９７４
）　’５−照）、。

各ゲル画分から得られた翻訳産物をウリ］−の抗−ヒト
組織プラスミノーゲン活竹化因ｒ！ｌ？ｊ　ｂ”、ｅ的
ＩｇＧで免疫沈降させた。１個の主要’ｃＩ：免疫沈降
ボリペプチドバンドが、分子圏約６３，０００ダルトン
のＲＮＡ画分Ｎ００７及び８（２１乃至２４Ｓの移動麿
）の翻訳産物中に見られた。免疫沈降の際に免疫前Ｉｇ
Ｇを使用すると前記のバンドが見られなかった。このこ
とは、これらのポリペプチドが組織プラスミノ、−グン
活性化因子特異的であることを意味する。

５埒のゲル分画ｍＲＮＡ（ゲルスライス７のｍＲＮＡ）
を使用し、標準法（Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｎａｔｕｒｅ、　２８７：　４１１　（１９８０）　：
　Ｇｏｃｄｄｃｌ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｎａｔｕｒｅ、　２８１　：　　５４４　（１９７９）
　；　Ｗ　１ｃｋｅｎｓ　ｅｔ　ａｌ、。

、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃ１１ｃｍ、、　　２５３：２４８
３（１９７８）参照）で二重鎖ｃＤ　Ｎ　Ａを調製した
。ｃＤ　Ｎ　Ａを６％ポリアクリルアミドゲルでり°イ
ズ分画し、３５０　ｂｐより長いｃＤＮＡ　（１２５ｎ
ｇ）を電気溶出した。ターミナルデオキシヌクレオチジ
ルトランスフエラーゼを用いて３０ｎｇのｃＤ　Ｎ　Ａ
にデオキシ（Ｃ）残塁をつなぎ、同様にＬ壮■部位にデ
Ａ：）シ（Ｇ）残塁を結合したプラスミドｔｌＢ　ｌ’
＜　　３２２　（ＣＩ＋旧１ｇ員ａｌ、、ｌ’ｊａｊｌ
ｌｌ’ｅ、２７５：　　６１７（１９７８）　　参ｊｊ
７ｊ）　３００ｎｇとアニールした。アニールした混合
物を・次にＦ。

視肛　Ｋ１２２９４株（Ａ　１−　ＣＣへｊＯ，３１ｎ
１１６　）に形質転換して約４６００個の形質転換株を
百だ。

１掲の文１ｉＴｌ、（欧州特訂出べ′ｆｉ公聞第４１７
６６５−３）に記載の方法で精製ヒ１〜１．１織プラス
ミノーゲン活性化因子を得た。

合成プローｊの作製の最）０領域をｉ；ｌ（い出−りへ
く分子を以下の如く検査した。

タンパクをトリゾシン消化し易くり゛るために運］し及
びカルボキシメチル化した。組織−／うスミノーケン話
性化因子２ｍｇのリーンプルを先り０．０１％Ｔｗｅｅ
ｎ　８０に対して室温で゛１晩透析した。凍結乾燥した
タンパクを次に０．５６Ｍのトリス−ＨＣ１’１衝液（
１）Ｈ８，６）、８Ｍの尿素及び５ｍＭのＥ　Ｄ　ｌ−
Ａを含む液１２ｍに溶解した。０．１ｄのβ−メルカプ
１〜エタノールを添加してジスルフィド結合を還元した
。反応は窒素下４５℃Ｃ２時間行なった。

１．４Ｍのヨード酢酸のｌＮＮａ０ｌ−１溶液１　、０
　ｍＲを添加して還元ジスルフィドをアルキル化しカル
ボキシメチル化誘導体を得た。室温に２０分間放置後、
０．０１％Ｔｗｅｅｎ　８０に対して室温で１８時間透
析して反応を停止し、凍結乾燥した。

得られた凍結乾燥カルボキシメチル化タンパクを３　ｍ
ｅの０．１Ｍリン酸す１〜リウム緩衝８２　（ｌＮ−１
７，５）に再度溶解した。トリプシン（Ｔ　Ｐ　ＣＫ　
。

Ｌ−１−トシルアミド− ロメチルケトンで処理したトリプシン）を（　１：５０
の割合で）添加し、３７℃で消化した。３時間。

６峙間及び１２時間後にサンプル（　　０．１ｍ）を取
出した。１２峙間後に１〜リプシンを再度添加した。２
４７時間後にサンプルを凍結して反応を停止し、ＨＰＬ
Ｃに注入できるまで保存しｔｓ　、、ＳＤＳグルに」；
す１Ｊンプルの消化の程度を測定した１，３時間後のリ
ーンプルでがケかなバンドが見られる以外、全一Ｃのグ
ルに変化はなかー）た。このことは、２　４　１１；’
Ｉ間で完全な消化が行なわれ、人さいベア　ｆ−　にが
残存しないことを示す。

杓０’．！ｉ威のリンプルを２系列操ｆｌ型の高づ）解
能、＋’ｌｔｅｘ　　Ｃ−８　ウルｈラス−、７　Ｉ７
　（　　ｕｌｔｒ．ｌｓｌ＋ｈｅｒｅ）Ｓａｔカラムに
注入した。）７し１〜二１−リルの勾配を徐々に与えた
く　５分′ｃ　１乃至　５％，１００分’Ｃ゛５乃↑３
５％。３０分で３５乃至５０％）７，２系列１ノ・１′
１のうりの１系列の操作で溶出液を２つの波長（　　２
　１　０　ｎ　ｍ及び２８０ｎｍ　）−でモニターした
。２′〕の波■（での吸収比を用いて１−リブトファン
を含むペプチドを検出した。

最も多くのトリプトファンを含むと思われるペプチドビ
ーク、又は他の理由でｈ用とＪツえられたペプチドビー
クの配列決定を最初に行なった。これににり大部分のト
リプトファンの周辺の配列を決定し得た。約２５個の最
良と思われるペプチドピークの配列決定後、−列に並べ
た全部の配列データをプールし”Ｃ組織プラスミノーゲ
ン活性化因子の一次構造の予備モデルが１！７られた。

こ１のデータ及びモデルからいくつかの可能なプローブ
の位置を決定した。

５１１！Ｉ／ｍｌのテトラザイクリンを含むしＢを入れ
たマイクロタイタープレートの各ウェル【Ｊコロニーを
１個ずつ接科し、７％までＤＭ、ＳＯを添加して一２０
℃に保存した。コロニーライブラリーの２個のコピーを
ニトロセルロースフィルター−ヒて増殖さけ、各コロニ
ーから得たＤＮＡをＱｒｕｎｓｔｅｉｎ）−１００ｎｅ
ＳＳ法（Ｐ　ｒｏｃ、Ｎ　ａｔｌ、Ａｃａｄ、３　ｃｉ
、、Ｕ　Ｓ　Ａ　。

７２　：　３９６１　（１９７５）参照）でフィルター
に固定した。

３ＬＰ−標識−ＴＯ（Ａ）ＣＡ（Ａ）ＴＡ（０）Ｇ　　
　　　　　　　　Ｇ　　　　　　　　　　−ＴＴＣＣＣ
Ａプローゾを、前記の如（合成オリゴマーから調製した
（既知のアミノ酸配列、ニトリブトファン−グルタミン
＃２　　’ｆ　ａシン−システィン−アスパラキン酸（
＼へｔ４−ｙ−Ｃ−，１））を１−ドづ°る配列と相補
的な８種の１／１ヌクレΔチド１ホ）。

５０　ｍ　Ｍのリン醒ブートリウム（１１１１ｂ、８）
、　５ｘ３Ｓ　Ｃ（Ｂ　ｔｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎ　
ｕｃｌ、△ｃｉｄｓ　　Ｒｅｓ、、　３：２３０３　（
１９７６）参照）、１！ｉ０紹／　ｍｌのｋｆ４　’％
１波処理（ノケ稍子ＤＮＡ、：ｉｘデ゛ンハル１〜）台
゛ン１シ及び１０％ホルムｊ／ミド中、４’、６００個
の形貿転１グ！株を含むフィルターを室温で２ｆｔ′ｉ
間ブレハイノリクｒズし、次にｊ［１１じ；８．伎中で
５０ｘ　１０　　カラン１−／′分の標識プローブとハ
イブリダイズしたＶ室Ｍ＋Ｖ’Ｃ１晩インキユベートシ
、フィルターを６ＸＳＳＣ及び０，１％ＳＤＳ中至温で
３０分間３回洗浄し、２Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃで　１回洗浄し
、次にＤｕｐｏｎｔ　Ｌ　ｉｇｈｔｎｉｎＯｒつＩｕｓ
増感スクリーンでＫ　ｏｄａｋ　　Ｘ　Ｒ−５Ｘ線フィ
ルムに１６時間露光した。

ポジティブなハイブリダイゼーション反応を示す全ての
］ロニーからプラスミドＤＮＡを急速法（Ｂｉｒｎｂｏ
ｉｍ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　　Ｒａ
ｓ、、ユニ１５１３　（１９７９）参照）により単離し
た。次に、これらのクローンから得たＣＤ　Ｎ　Ａイン
サー１−の配列を、断片をＭ１３ベクターｍｐ７　　（
Ｍｅｓｓｉｎｇ　ａｔ　ａｔ、。

Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、、　９：　　３０９
（１９８１）　参照）中でサブクローン化した後、Ｍａ
ｘａｍ　　ＱｉｌｌｌＯｒｔ化学法により決定した。ク
ローン２５．［１０中のｃＤ　Ｎ　Ａインサートのアミ
ノ酸配列と、精製組織プラスミノーゲン活性化因子から
得られたペプチド配列（前記）との比較、及びＥ’、　
ｃｏｌｉ中で産生きれた発現産物から（詳細は後記〉、
このｃＤ　Ｎ　Ａインサー１〜が組織プラスミノーゲン
活性化因子をコードするＤＮＡであることが判明した。

クローン２５ＥＩＯは２３０，４　ｂｐの長さを有して
おり、その最良のＡ−ブンリーディングル−ムＩＪ　、
’＋　０８１１＾１のアミノ酸からなるタンパク（ＮＩ
Ｉ　Ｗ　５Ｇ、７．’＋ｌＧ　）をコードしており、７
４５　ｂｐの３′非翻訳領域を・含んＣいた。このｃＤ
ＮＡり［１−ンにはＮ−末仝Ｍ：を−」−１・づる配列
か欠如していた。

５０７１９　（７）　ｐ　ｉ’　Ａ　２！ｉ　Ｅ　１０
　（前記）　ヲＰ　Ｓｌ、　’ｌ　テ消化し、６％ポリ
アクリルアミドゲル 断ｊ４を単ば１【−、た。この断片的３１１！Ｊを電気
溶出でグルから単離し、３０Ｊ−ツ１〜のｌ）　ｄｅ　
ｌ’　＠−用いて３７°Ｃｃ’　１１１４間消化し、フ
ｌノールーク１」ＩＪホルムで抽出し、エタノール沈澱
させた。これに、」；す［’）ｄｅ■粘る末端が得られ
る。反応況含物ｉ；二ｊｉ　、−７ニツ１〜のＤ　Ｎ　
ＡポリメラーゼＴ　（　Ｋ　ｌｃｎｏ＋ｖ　ｊＤｉ　Ｊ
ｉ　）並ヒニ各０、１ｍＭのｄＡ．ｌ−　Ｐ　、　　ｄ
Ｃ　ｌ−　Ｐ　、　　ｄＧ　−１−　Ｐ及’ＱＦｄｌ−
ＴＰを添加し４℃ｌ−８ＵＪ間インニ１ｚベートしＣ、
前記のｌ）６ｅＩ粘看末端を伸ばして平滑末端とした。

フ］．ノールークロロボルム抽出後、ＤＮＡを１５ユニ
ットの１ＱａｒＩで２時間消化し、反応混合物を６％ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。約０．５雌の
所望の１２５　ｂｐ平平床末端ＩＱａｒ■断片を回収し
た。この断片は、成熟全長組織プラスミノーゲン活性化
因子タンパクの、アミノ酸のうちＮ　Ｏ，６９からＮ　
Ｏ，１１０までのアミノ酸をコードしている１゜１６４
５　ｂｐ　Ｎ　ａｒＩ　−Ｂ　０ＩＩＩ断片を単離づる
ために、３０埒の　ｐＰ　Ａ　２５Ｅ　１０を３０ユニ
ツトの±肛■及び３５ユニツ１−のＢｏｌＩＩにより３
７°Ｃで２時間消化し、反応混合物を６％ポリアクリル
アミドゲル電気泳動にかけた。約６Ｎの所望の１６４５
　ｂｐ　Ｎ　ａｒＩ−１３１１■断片を回収した。

プラスミドｐ△ＲＩ　ｅＸＳｒＣはプラスミドＩ）ＳＲ
Ｃｅｘ１６　（Ｍｃ　Ｑｒａｔｈ　ｅｔ　ａｔ、、Ｎａ
ｔｕ’ｒｅ、　２９５：　　４２３（１９８２）参照）
の誘導体であり、後者に於いては、ｔｒｐプロモーター
に近位でＳＲＣｍ伝子に遠位のＥＣｏＲＩ部位がＤＮＡ
ポリメラーゼエで修復することにより除去され゛（Ｊ３
す、ホスホ１〜リエスデル法で合成された自己相補的Ａ
リゴデＡ１−シヌクレＡチド　ＡＡＩ−ｒＡｒ（３△Ａ
Ｔ　−ｒ　Ｃ；△−「が庄■部位の直ぐ隣りの残存ｊ　
（Ｍ１１’＜　１部（、ｊ７に挿入されＣいる。２０１
ｊ９Ｉのｐ△Ｆ＜　ｉ　Ｓ　ＲＣをＬ剪１＜］ぐ完全に
消化し、フェノ−ルーフＬ１［］小ルム抽出し、−１タ
ノール沈澱した。次に、２５　ｍ　Ｍの１１ｔ　ｉｔＱ
す１−リウム（１１１４４，［ｉ）　、ＩＩＩＩＭのｚ
ｎｃρ２及び０．３ＭのＮａＣρの中て゛プラスミドを
１００ユニツ）−のヌクレアー　Ｌ２ｓｉで１６℃、３
０分間消化し、配Ｉｌｊ　Ａ丁Ｇをもつ平滑末端を形成
した。７Ｔノール−り口［１ボルム抽出及び１タノール
沈Ｂ後、Ｉ）　Ｎ　Ａを旦ａｍｌｌ　Ｉで消化し、６％
ポリアクリルアミ１〜グル電気泳動にかけ、大ぎい（４
，３００ｂｐ）ベクター断片を電気溶出で回収した。

０．２鱈のベクター、Ｏ，（１Ｇ埒の１２５１）ｐ平滑
末端−断片とを、１０ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼで
、室温で７時間を要して互いに結合して発現プラスミド
を構築し、Ｅ　、　ｃｏｌｉ　２９４株（ＡＴＣＣＮｏ
。

３１４４６　）をアンピシリン耐性に形質転換゛りへく
使用した。プラスミドＤＮＡを２６個のコロニーから調
製しＸｂａＩ及びｇｆ　ｃｏＲＩで消化した。そのうち
１２個のプラスミドが所望の４１５　ｂｐ　Ｘ　ｂａＩ
　−Ｅ　ｃ。

ＲＩ断片及び４７２　ｂｐ　Ｅ　ｃｏＲＩ−断片を含／
υでいた。ＤＮＡの配列解析により、これらのプラスミ
ドのいくつかが、出発点であるアミン９　Ｎ　Ｏ，６９
（セリン）に対しで正しく配置されたＡＴＧ聞始１トン
を有することが確認ざｔ′−た・層、れらのプラスミド
の１つ、ｐΔＲＩ　ＰＡｏを試験したところ、所望の組
織プラスミノーゲン活性化因子を産生じていた。

０．４Ｉｌ！ｇの合成オリゴヌクレオチド５’Ｔ１−Ｃ
−ｒＧＡＧＣＡＣＡＧＧＧＣＧ３’　（これは　ｔＰ　
Ａ　−ｍＲＮＡのヌクレオチド２５６〜２７１に相補的
である）を合成しくＣｒｅａ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｎｕｃ
ｌ（！ｉｃ　　△ｃｉ（ｌｓ　　Ｒｃ−ｓｅａｒｃｈ、
　　８　：　２３３１（１９８０）　参照）、これを・
ブライマーとして１史ｊ目し、ｉ’？：　ｔｓ’−ン六
に」、す、７゜：’、、ｕｓのゲル画分Ｎ　Ｏ，８のｍ
ＲＮ　Ａ　（前記）から、二手銀ｃｌ）ＮＡを調製、し
た。　ｃＤＮＡを　６％ボリン７クリルノノミ１〜ゲル
でクイズ分画した。３００１月）Ｊ、゛り人きいクイズ
画分（３６ｎｇ　）を電気溶出した・。クーミプルデＡ
−１−シシヂシル１〜ランスフＪラーゼを用い（５部ｇ
のＣＤＮＡにデオキシ（Ｃ）残基をつへ〜ざ゛、同様Ｍ
片廷■部イ◇にデオキシ（Ｇ）残ｊ１１を：）ないだ５
０ｎｇのプラスミド１）１３Ｒ３２２どアー、−ルした
。次にアニールした混合物をＦ　ｃｏｌｉ　　Ｋ　１２
２９４株に形７５中λ１堕し人：４約　１，５００１１
月の形質中ムｊ襲（・二１、が１！７られｌζ、。

ｃＤＮＡのブライミング反応が、り１−１−ン１１　Ｐ
　Ａ　２５　Ｅ　ｌｏ）Ｎ−末端から１３１１１１　ト
／’１−１’　７リダイスした合成断片を用い０行４Ｔ
われたので、（１６ヌクレオチド体配列を含む）この２
９　ｂｐ領領域は、ＣＤ　Ｎ　Ａクローンをスクリーニ
ングするだめの適当な制限断片は得られなかった。従っ
て、Ｎ−末端組織プラスミノーゲン活性化因子をコード
しＣいる配列を含みプライマーで伸延したｃＤＮΔクロ
ーンを同定するためには、ヒト組織プラスミノーゲン活
性化因子ゲノムのクローンを単離−りることが必要であ
った。

このプロレスの第１段階では、唯一の相同組織プラスミ
ノーゲン活性化因子の遺伝子がヒ１−ゲノムＤＮＡ中に
存在することを確認した。このためにサザンハイブリダ
イゼーションを実施した。この方法に於いては、５鱈の
高分子母ヒトリンパ球ＤＮＡを種々の制限エンドヌクレ
アーゼで完全に消化し、１，０％アカロースグル電気泳
動にか（ジ、ニトロセルロースフィルターにブロワ１〜
した。

ｃＤ　Ｎ　ＡクローンｐＰ　Ａ　２５Ｅ　１０のｃＤＮ
Ａインザ−ｉ−（２３２ｔ＋ｐ凪■−ｍ壮丁所〕″１）
の、ｌ末端が’−，Ｉ）−４票識ＤＮΔブ′［−Ｊ−ブ
４・調１袈し、１）１１記！１〜ロレルロースフイルタ
−どハイブリダイズした５、３５ｘ１０６力ウン１〜／
分のブ’ｌ１ｌ−ブをｊｌ　ＯＩ＋、“１間ハイゾリグ
イズし次に洗浄した（　Ｆ　ｒｉｔｓｃｈ　ｅｔ　ａｌ
、、Ｃｅ１ｆ。

胆、’　９５９　　（１９８０）参照）。２（小の１ン
ドメクレアーゼ消化バクーンか６１１１１−のハイブリ
ダイズＩ）　Ｎへ断片：工ｆＪｌｌＩ　（５，７１＜ｂ
ｐ）及び２Δ共Ｕ　（１１，２Ｋｂ（〕２が１ｑられた
。２種のハイブリダイズＤＮＡ断片が１凪Ｃ］Ｔ　（５
，１Ｋｌ）ｐ及び’１．３ＫＩｌｐ）で征（察ξれた。

両者を総合したデ〜りによれ（、ｆ、ヒ１−ゲノム中に
唯一の組織ｊ′プラスミノーゲン、Ｓ乳化因子が存在づ
ること、及び該遺伝子が少４１＜ども１個の介在配列を
有することが判明した。

組織プラスミノーゲン活性化因子３ｖｉ仏子を担うλノ
アージ組換休を同定するために、組織−ｆラス４．／−
ゲン活性化因子り［１−ンＩｌｌ’　Ａ　２！ｉＥ　１
０がら調製された放剣性プローブとのヌクレＡヂド相同
性を検出する方法を用いた。１０Ｑ万個の組換λファー
ジを１０，０００ｐｆｕ／　１５ｃｍプレートの密度で
ＤＰ５０３ｕｐ　　Ｆにプレートアウトし、Ｂ　ｅｎｔ
Ｏｎ及び（）ａｖｉｓの方法（３Ｃ！０ｎｃｅ、　　１
９６　：　　１８０　（１９７７）　ｇｊ照）により、
各プレート毎にニトロセルロースフィルターレプリカを
調製した。標準払を使用しプラスミド１）２５Ｅ１０の
５゛末端から３４　ｂｐに位置する２３２力ｐ　胆■−
風工断片を用いて、３２　ｐ−楕：識ＤＮＡプローブを
調製した。５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６，５）
、５Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ（Ｓ　ｏｕｔｈｅｒｎ。

Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　９８：　　５０３（１
９７５）参照）、０．０５ｍｇ／Ｉｎ！ｌの超音波処理
１ノケ精子ＤＮＡ、５×デンハルト溶液及び５０％ホル
ムアミド中で、各ニトロセルロースフィルターを４２℃
で２時間プレハイブリダイズし、次に、１０％デキスト
ラン硫酸ナトリウムを含む同じ溶液中で、５０ｘ　１０
力ウント／分の標識プローブとハイブリダイズした。４
２℃ｒ１晩イン４：ユベー１〜し、フィルターを０．２
Ｘ　３３　Ｃ及び０．１％ＳＤＳ中５０℃、３０分間で
４回洗浄し、２Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃで室温で１回洗ｉγ１し
、次（６冒つｌ叩０１１ｔＣＩ’Ｏ１］ａｘ増感スクリ
ーンＣＫｏｄａｋ　　Ｘ　Ｒ−！＋　　Ｘ　−ワｉ（フ
ィルムに　１晩露光した。仝部Ｃ１９個のり「」−ンが
プ［１−ブとハイゾリタイス’シ／、−、、Ｇ個の組換
体から既に２収されたん法Ｃツノ・−シｌ）　Ｎ　Ａを
調”、４　Ｌ、　１．：、、Ｉ　ｎコースクリー−−−
ンク用のＬ鷺ＪＩ　ｌ１７ｉ　）’：を調製り゛るｌ〔
めに、λりＬｌ−ンＣをｊか択した２３ＯＮのＤＮＡを
圧…■を用い４３７℃（：　１１１．’ｒ間消化し、１
．０％ｊ′万［Ｊ−スゲル゛市気泳動にか（づた。組織
ブラ“スミノーゲン活性化囚１′を−１−ドする配列を
含有−りることが既に判明しＩ、：　４．２Ｋ１１１１
の断片を゛心気溶出して１６製した。後述の如さ二１し
に−ハイゾリタイゼーションを行なうために、畳：［１
ｆ払を用いて３沖−標識プローブを調装した。

コロニーをプレートからニトロセルロースフィルターに
移して増殖させ、各コロニーから得たＤＮＡをＧ　ｒｕ
ｎｓｔｅｉｎ　−１−１ｏｇｎｅｓｓ法でフィルターに
固定した。単離した組織プラスミノーゲン活性化因子λ
ゲノムのクローンから４，２Ｋ　ｂｐＰ　ＶＬＩＩＩ断
ｊ′ｌをプライムする仔牛胸腺（Ｔ’ａｙｌｏｒ　ｃｌ
　ａｔ、、　Ｂ　ｉｏ−ｃｈｅｍ、　３１ｏｐｈｙ、Ａ
ｃｔａ、　４４２　：　３２４　　（１９７６）　ｑ−
Ｓ照）によって　Ｐ−標識プローブを製造した。１．’
５００個の形質転換株を含むフィルターを１１２ｘ　Ｈ
）　Ｃ１１ｌ１１３ユ の　Ｐ−ゲノムｐｖｕｌ断片とハイブリダイズした。

Ｆｌ゛１ｊｓｃｈ　ｅｔ　ａｌ、により記載された条件
を用いてハイブリダイゼーションを１６時間絹；続した
。フィルターをＪ：＜洗い、次にＤｕｐｏｎｔ　ｌ　ｉ
ｇｈｔｎｉｎｇ−ｐＨｌＳ増感スクリーンど共にＫｏｄ
ａｋ　　ＸＲ−５Ｘ−線フィルムに１６乃至４８詩問露
光した。１８個のコロニーが明らかにゲノムプローブと
ハイノリダイス′ｌノだ。プラスミドＤＮＡをこれらの
：ＪＤコロニー々から単離し、二１〜［］［？ル１］−
スフイルターに固定し、最初のブライミング反応に使用
じた９１Ｄ−標識合成ＡリゴヌクレＡヂド（１６スクレ
オヂド体）とハイノリダイスした。１８周の９１１−ン
のうちの　７他１が一１ニナーレＬ−Ｊ：　ツー’Ｃン
’ｔ’ｉ　ｅｌ化シｌ＝　１６　ヌ’）　ｌｙＡヂド１
本とバイブ゛リクィス゛しｌこｔ＋　　ＩＩ：　１．３
ベクター　−ｍｐ７　　（ｆＶｌｅｓｓ！ｎｊｌ　ｅｔ
　ａｌ、、ＮｕＣｌｅ：ＣＡｃ１ｄｓ　　Ｒｃｓ。

９　：　　３０９　（１’Ｊ８１）ネさ！！、４　）申
τの断ｊ′ｌのリゾク［１−ン（ヒ接に配列を解析りる
ど、１　（Ｐ　；Ｈ，−、のりＬｌ−ン（ｐＰ　Ａ　１
７）が組織プラスミノーゲン活性化因子の口几い５’Ｎ
−末端領域、ジグノルリーダー配列及び８４　ｂｐ　５
１非翻４訳領域を含むことが判明した。

２Ｔ４ノ’ｙＤ−＞　ｐＰ、Ａ２５［１０及びＤ　Ｐ　
Ａ　１７ｈ＋ら、全長１１織ブ）スミノーグン活性化囚
ｉ″−クローンの完全ヌクレヂ１ζ配列及び制限パター
ンを決定した。

オーバーラツプする　ＵＰＡ７；スミ１〜．　　ｐＰＡ
２５Ｅ１０．　　ρＰＡ１７’及びρ△Ｆぐ７Ｐ△°が
ら３Ｍ！の断片を以下の如く調製した。プラスミドＩＩ
ＰＡ１７を１旦■で消化し、Ｋ　１ｅｎｏ１￥ＤＮ△ポ
リメラーゼ■を用いて充填し、旦貝」で再度切断した。

その結果生成された５′末端ｔＰＡ配列を含む約２００
　ｂ、ｐの断片を甲阿１した。第２のｔＰＡ断片を得る
ために、ｐ△Ｒ１１〕Δ°をｐｓｔＩ及び］ａｒＩで消
化し、約３１０ｂｐの断片を単離した。第３の　［１つ
へ断片を得るために、ｐＰ　Ａ　２５Ｅ　１０を生ａｒ
■及び１吐■で消化し、約１６４５　ｂｐの断片を単離
した。ｉｌ）後の断片はｔＰＡをコードする領域の殆ん
どを含んでおり更にいくらかの３′非翻訳配列を含んで
いる。

ＨＢＶ表面抗原を発現するプラスミドｐＥ３４２（’　
ｐＨＢ　Ｓ　３４８−Ｅとも指称される）は、１−ｅｖ
ｌｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｔ、により１９８１年１２月　３
日付出願の米国特許出願第３２６，９８０ケ明細書に記
載されている。該出願を引用して本明細書中に包含する
（欧州特許出願公開第００７３６５６号）。要約すれば
、ザルウィルスＳＶ４０のオリジンを１１Ｕｌｌ　ｒす
るために、ＳＶ４０　　ＤＮＩ：土ユａ　ｍで消化して
］ンバーク−＜ＡＧＣ下ＧＡＡ下下Ｃ）をｉ洛加しＣ’
　、１−１　ｉ四ｄ　ＩＩ［末端をＥＣ０ＲＩ末端に変
換した。こ０月つＮＡを凪ＶＵ［で切断しＲ１リンカ−
を河＼加しｌ、二、、　ｉ　ＣＯＲ丁で消化＋’２．Ａ
リジンを占む３４Ｂ　ｂｐ口ｌｉ　Ｆｌをボリン／クリ
ルアミドグル電気泳動及び電気溶出Ｃ単離し、１）ＢＲ
３２２中でクローン化した。ｌ−ｌ　ＢＶ　（Ａ　ｎｉ
−ｍａ！　Ｖ　！ｒ（１３’　Ｑ　ｅｎｃｌ、ｉｃｓ、
　（Ｃ［１，！＋　）　ＡＣａ（Ｉ、　［−）ｒＯ３３
゜Ｎ　、　Ｙ　、　　（１９８０）　）の１笠ＲＩ及び
比旺■によるｉｉ’ｔ　化−（−得うした１９８６　ｂ
ｐ断ハ（これＣＡＬ　ｌ−ｌ　１．’＞　ｓへ〇を−Ｊ
−１・づる道伝了を含んでいる）を・、１−ｃｏＲＩ部
旬及び（３ａｍｌ−Ｉ　Ｉ部位でプラスタｌ”　ｐＭ　
ｌ（ｌ　　ｕｓｌｔｙ　　ａｔ　　ａｌ、、　Ｎ　ａｔ
ｕｒｅ、　　２９３：　　７９　（１９８１）　　）　
　Ｉこり［１−ン化して発現プラスタｉ”　ｐＨＤ　ｓ
　３．４８−１−を構築した（ｐＭＬは、音ナル細胞中
Ｃ゛のプラスミド複製を阻害−りる配列が除去された欠
失゛をイ」りる１）ＢＲ３２２の誘導体である）。得ら
れたプラスミド（ｐＲＩ−Ｂ（ＩＩ）を次ニＥｃｏＲＩ
ｒｉｉ＆線化し、ＳＶ４０のオリジン領域を示す３４８
ｂｐ断片をｐＲ＋−１旺のＥｃｏＲＩ部位に導入した。

オリジン断片はいずれの配向でも挿入され有る。この断
片は複製のオリジン以外に初期及び後期のＳＶ４０プロ
モーターをコードしているので、オリジンの配向次第で
どちらかのプロモーターが作用し該プロモーターの制御
下でｌ−Ｉ　Ｂ　Ｖ　’Ａ伝子が発現し得た（１’１ｌ
−ＩＢＳ　３４Ｂ−Ｅは初期プロモーターの制御下で発
現したＨＢｓを示す）。１）Ｅ３４２を修飾するために
、ｐＦ３４２をＥｃｏＲＩで部分消化し、Ｋ　ｌｅｎｏ
ｗ　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ■を用いて開裂部位を充填
し、プラスミドを再結合し、これにより、１）Ｅ３４２
中のＳ′Ｖ４０オリジンに先行するＥＣｏＲＩ部位を除
去する。

得られたプラスミド即ち　ｐＥ３４２ΔＲ１ｅＥＣＯＲ
１で消化し、Ｋ　ｌｅｎｏｗ　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ
■を用いて充填し、［３ａｍｌ−Ｉ　Ｉで再度切断りる
１、アクリルアミドゲル電気泳動後、約３！ｉ００１坤
ＲＪｉ片を電気溶出し、）］−ノール／り［］Ｌ１小ル
ム抽出し、前記の如くエタノール沈澱さＵる。

前記の如く調製された１３４２［３！１１１月）ベクタ
ー及び約２１６０　ｂｐの前記　ＩＰＡ断Ｊ″１を（票
Ｌ（１法にＪ：り亙いに結合した。ｔＰＡ／！：コート
づる３（ＩＦの断片を適正方向で含むプラスミドを単離
し、特性決定し、　ｐｌ−３４２ｔＰΔと命名した。ｔ
：のｆう゛スミドを３ａＣ［で消化し細菌性アルカリ１
１小スノシ・ターげ（Ｂ　ＲＬ社製）で処理した。Ｄ　
Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒ配列を（該配列の発現用制御配列ど」（
に）′ノえるために、ｐＥｔ−ＩＬＩＲのＳ　ａｃ　Ｉ
（ｉ高化によツー（約１７００　ｌａｐ　ｆ７）断片を
生成した（ｐＥｌ−ＩＦＲＩユ前記米国特許出願第４５
９．１５１号明細書に記載の突然変￥＜　ｌ）　ｌ（Ｆ
　Ｒを発現するプラスミドである）。

要約すると、ｐＥＨＥＲは以下の如くして調製した（欧
州特許出願公開第９３１３１９号参照）。

＋１３４２　ＥはＬｅｖｉｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、欧州
特許出願公開第００７３６５６号に記載されている。Ｄ
Ｉ−（ＢＶ−Ｔ＝ＩＡ及びｐｓＶＲは１−ｉｕ　ｅｔ　
ａｌ、、ＤＮＡ、　　１：　　２１３（１９８２）に記
載されている。１）ＦＲ４００は以下のようにして調製
される。

ＳＶ４０複製オリジンを含むＳ４０　ｂｌ）生国（ＩＩ
Ｔ−１−１ｉｎｄＩｌＩｉｌｌｉ片（Ｌ　ｉｕ　ｅｔ　
ａｌ、、Ｄ　ＮＡ、ユニ２１３（１９８２）参照）をプ
ラスミドｔ］Ｍ　Ｌ　（Ｍ　、　Ｉ−ｕｓｋｙａｎｄ　
　Ｍ、Ｂｏｔｃｈａｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２９３ゴ９　（
１９８１）　　参照）中にＥＣｏＲＩ部位とｌ−１ｉｎ
ｄＩ［１部位の間で結合した。プラスミドのＥＣｏＲＩ
部位及びＳＶ４０の月−１ｎｄ　ＩＩ部位を、）ｌｉｎ
ｃｌｌ［［消化前に４種のｄＮＴＰの存在下でＫ　ｌｅ
ｎｏｗ　［）　Ｎ　Ａポリメラーゼ■を添加して平滑末
端化した。得られたプラスミドｐＥＳＶを±則ｄ■とＢ
ａｍＨＩとで消化して２９００　ｂｐベクター断片を単
離した。この断片のＥＣｏＲＩ部位に、ポリリンカー（
多数の制限部位を含むＩ）　Ｎ　Ａ断片）を含４′ｉづ
るよう（こ改質され／、、：ＩＩ　Ｂ　Ｖ由来の２０２
５　ｂｐ比止ｄＩ［［−■〔■…ｉ片を結合した。この
８８　Ｖ断片は表面抗原遺伝子を含んで（Ｉ３す１１．
［掲のＬ　ｉｕ　ｅｔ　ａｌ、、Ｄ　ＩＮ△、　　１　
：２ｉ３　（１９１１２）に記載のクローン化）−Ｉ　
Ｂ　Ｖ　　ｌ）　ＮＡの旦胚−１’＜　、Ｔ−凪■丁消
化によって誘導される。、ゴー単鎖りン力−１つＮ　／
１゜断片＜　５’ｄＡＡＧＣ’ｌ−１−ＡＴＣＧ△１−
　Ｔ　ＣＴ　Ａ　ＧΔ７へＴＴＣ３’・・・・・・）を
１ｌｉｎｄＩＩＩとｊ」則１’＜　Ｔで消化し＋＋ＢＶ
断片に添加して、　Ｆ　ｃｏＲＩ　　江ＩＩ断片をｔ（
ｉ＋＋ｄ　Ｉ（ｌ　−８’９１　ＩＩ断ハに変換しＩＪ
ｏこの操作ｌよリンカ−，１−ＩＢＶ断トＩ及びベクタ
ーから成る３種の部分の同時結合とじでも行なわれ寄る
が、より便利であり実際に用いた〕）法Ｃは、先り１．
１　ｉ＋ｏｌ　ｍ−１’、：　ｃｏＲＩ　１，１　ンカ
ーをクローン化Ｈ１３Ｖ　　Ｄ　Ｎ　Ａに添加し次いで
このプラスミドを旦ｉｎｄ　ｉｌｌと１３ｑｌＩＩ　Ｃ
同時消化してｌ（＋ｎｄ　ＩＩＩ−Ｂ　（Ｉｔ　ｉｆ　
ｌＵ＋片を切り出した。得られたプラスミドｐｃＶＥｓ
Ｖ）−ＩＢＶは、ｐｓ　Ｒ３２２から誘導されたＩ）Ｍ
Ｌ由来の細菌性複製オリジン、同様にｐＭＬ由来のアン
ピシリン耐性マーカー、初期プロモーターが組み込まれ
トＩＢＶ断片の転写を指令づ゛るように配向されたＳＶ
４０断片、及びＨＢ’Ｖの表面抗原遺伝子を含有してい
る。このトＩＢＶ断片からも、哺乳動物細胞の■ｌ　ｌ
ｉ包質内で通常形成されるようなポリアデニル化１１１
ＲＮＡの生成用のポリアデニル化シグナルが得られる。

ＥＣＯＲ工消化、前記の如ぎＫ　ｌｅｎｏｗ　Ｑ　Ｎ△
ポリメラーゼによる末端充填及びＢａｍＨＩによる再切
断によって、ＨＢＳ　Ａ（ｌコード領域を除去する。

この領域内にＤ　ＨＦ　ＲをコードしでいるｃＤＮＡカ
ラのＦｎｕ４ＨＩ一旦ＣＩＩＩＩ断片を挿入する。野生
型ＤＨＦＲプラスミドｐＤ　ＨＦ　Ｒ−１１の１翌４Ｆ
ＩＩ−ＢａｌＩＩ断片を使用してｐＦＤｌｌを構築した
。

（ＮＵｎｂｅｒＯ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ、１９：
　　３５５（１９８０）参照）　、　’ｔ）Ｆ　Ｒ４０
０−１２カ６０）　ｌ１ｌｉｊ−４、ｕ／１−、　ｉ’
９ｉ　）’ＩＡ：用イテρＦＲ４００を４１４築した。

１）Ｆ　Ｒ４００，１２は、メ１−トレル−１へ耐ｆノ
Ｌ：　ｏ　ｌ−Ｉ　ＦＩＲをコードしているＤＮＡ配列
を含有りる組換１ホブラスミドて゛ある。この、、１．
２製のため＋ＪＩユ、突然変ｌ１ｌ１体３ｒ６Ｒ／１０
０細胞（Ｄ　、　Ａ　、　ｌ−１ａｔ＋ｃｒ　ａｎｃｌ
　　Ｒ。

１’　、　Ｓｃｌ＋ｉｍｋｅ、　Ｃｅｊｌ、２６：　　
３！ｉ５　（＋９８ｔ）　参照）からｍＲＮＡを単離し
、単離したｍＲＮＡがらＣＤＮ　Ａライブラリーを調製
し、ｃＤＮハをｐｓｉ’Ｊ開ン：！　ＦＩＢ　Ｒ３２２
中に結合し、Ｅ　、　ｃｏｌｉ　２９４株＜　Ａ　−１
−ＣＣ３１４４６）を形？イ転換し、形質転換体をネズ
ミりｔｉｔ”ＲｃＤＮＡ　　（、、）　、　ト１．　　
Ｎｕｎｂｏｒｇ　　ａｔ　　ａｌ、、１掲）からのＣＤ
ＮＡインザー１〜のＰｓｔＩ−８ｇｌｆｆ消化物でプロ
ーブし、正しい突然変’ｉ’＜　１’）　ｌ−Ｉ　Ｆ　
ＩＲをコードしている配列を有力るプラスミドを含有す
るコロニーを選択する。

この断片をＩ）Ｅ３４２−　ｔＰＡシラスミドに結合し
、ｐＥＴＰＡＥＲ４０ｏを作製した。該プラスミドはｐ
Ｅｌ−（ＥＲに類似しＩているが１−ＩＢＳＡ（＋をコ
ードする領域がｔＰＡからのｃＤＮＡ配列で置換されで
いる。

ｐＥ　Ｔ　Ｐ　Ｅ　Ｒの構築に使用した方法と同様の方
法で、野生型ＤＨＦＲをコードするＤＮＡ配列を含むプ
ラスミドｐＥ　Ｔ　Ｐ　Ｆ　Ｒを構築した。実施例Ｃ，
１，Ａに記載の如く構築するが、ＤＨＦＲタンパク遺伝
子配列の起源としてプラスミドｐＩＮＥＲの代わりに、
プラスミドｐＥ　３４２．１−Ｉ　Ｂ　Ｖ　、　Ｅ４０
０Ｄ２２を使用した。野生型ＤＩ−ＩＦＲど突然変り′
シ株Ｄ　ｌ−Ｉ　Ｆ　Ｒとの間の１個の塩基対の相違以
外はプラスミドｐＥ　３４２．　ｌ−Ｉ　Ｂ　Ｖ　、　
Ｅ　４００．　Ｄ　２２はＩ）　Ｅ　ｔ−ｌ　ｆＥＲと
同様である。これはＩＩＦＲ４００の代わりにｐＦＤｌ
ｌを、用いてｐＥＨＥＲと同様にイｊ４築し得る。

従って、得られるプラスミドｐＥＴＰＦＲは全ての点で
ｐＥ　Ｔ　Ｐ　Ｅ　Ｒと類似しているが、突然変異Ｄ　
Ｈ−二Ｒ＠’−１−ドづるＤ　Ｎ　Ａ配列の代わりに、
野生型ＤＨＦＲをコードするＤ　Ｎ　Ａ配列が含まれて
いる。

Ｃ，１，Ｂ　　　ＩＩＰＡ配列の発↓ｌｌ！及び増幅Ｇ
ｒａｈａｌｌｌ及σＶ　ａｒ１＋ｌｅｒ　、　Ｅ　ｂ　
、の／）？人（前記）（１１１ＥＴＰＡＥＲ４００（Ｉ
ＩＥＴＰＩ−二　Ｒ）　　をし１ｒｌａＵｌ）及Ｄ’　
Ｃ１１ａｓ　ｌ　１１から譲り受（Ｊた旧］ｆ　ｒ−（
ＣＩ−Ｉ　Ｏ−Ｄ　ＬＪＸ　　Ｂ１１）及びＤト（ＦＦ
で　Ｃ（−１０−に１　　（Ａ−１−ＣＣＣＣ１６１）
細胞の双方に１〜ランスフエクトした。グリシン、ヒボ
キサンヂン及Ｇ−１−ミシンを含まない培地で増殖して
、形質ＩＩ＋；、模されたｄ　ｌ＋　ｆ　ｒ’ｆｆ１ｌ
ｌｌ胞ヲ選択した。、１０００Ｍ以上のＭ　Ｔ　Ｘ　Ｉ
　Ｃ”増殖し−（形′〔１転摸されたＤ　ＨＦ　Ｒ”細
胞を選択した。適当な選択培地上に発生したコロニーを
、り［」−ン化リングで単離し同じ培地中で数世代まで
・増＋ｉ１′＋　Ｌ、た。

増幅のために、コロニーから細胞を分割して５ｘ　１ｏ
４，１０”、　２，５Ｘ　ｉｏ５．　ｓ×１０Ｅ及び１
０６ｎ＼４のＭ丁Ｘを含む培地に入れ、この操作を数回
繰返した。極めて低い細胞密度（１０′″−１ゲ細胞／
プレー１〜）で細胞を１０ｃｍの朋にグレートし、得ら
れたコロニーを通常のように単離した。

Ｃ，１，０アラレイ方法 トランスフェクトされ増幅されたコロニー中のｔＰＡの
発現は、欧州特許出願公開第００９３［１１９舅に記載
の方法で簡便に検定され得る。要約で−るど、定量的ア
ッセイのためには、検定すべき培地又は抽出物をプラス
ミノーゲンを含む溶液中に入れ、形成されたプラスミン
の量を、Ｓ　２２５１　（Ｋ　ａｂｉＱｒｏｕｐ　　Ｉ
ｎｃ、、Ｇｒｃｅｎｗｉｃｈ、　ＣＴ）のような色素源
基質の開裂をモニターすることにより測定する。

サンプルを（０，０１２ＭのＮａ’Ｃ１を含む０．０５
Ｍのトリス−Ｈｃｐ、　　ｐＨ７，ａ中の）　’０．７
ｍｇ／ｍのプラスミノーゲン０．１ｄと混合し、容■を
０．１５ｄに調整する。混合物を３７℃で１０分間イン
キュベートし、０，３５Ｉｎｆ！、の５２２５１．（上
記耘雨液中の１，０ｍＭ溶液）を添加し、３７℃で反応
を３０分間継続づる。酢酸（２５，ｄ、）を添加しＣ反
応を停止さヒる１、す′ンノルを遠心し４０５ｎｍでの
吸収を測定りる。標（（（ウロキナーゼ溶液との比較（
、二Ｊ、す（１も、１！１１７５が定・°βＣ゛さ′る
。

溶液にフィブリノ−クン（０，２ｍｇ）を添加し、これ
により全長組織ブシスミノークン話ｆｉ化囚ｊ１を検出
リベくアッゼイ′条件を変更した。ノイノリノーゲンは
観察される組織プラスミノーゲン活性化因子の活性を剌
）２賀し、従って活雇し／／＼ルを−（ｂやトＲさせる
。活性をＰｌｏｕｇｌ＋コニツト（記１′、？：した。

９０．０ＯＯＰ　ｌｏｕｇｌ＋　−１ニラｌ−は、￥ｉ
ｌｌ製絹織″ｌ″ｙスミノーグン話性化因子１ｍｇが示
づ活１〕１に等しい。

ＤＨ’ＦＲ及びｔＰＡ配列のＩ？ｉｌ　ｌｌ’、’ｌ増
幅は、増幅されたコロニーのコンノルエンドな単層から
下記の如＜　Ｄ　Ｎ　Ａを単離してアッヒイする。１５
０　ｍ　ｍプレー１〜のコンフルエン−な単層を５０雇
の無菌ＰＢＳで洗浄し、５ｍｆ！、の０．１％ＳＤＳ、
ｏ、４Ｍ　ｃａＣρユ及び０．　ＩＭのＥＤＴＡ　（ｐ
ｌ−１８＞を添加して溶解づる。５乃至１０分後、混合
物を取出し、フェノール抽出し、クロロホルム抽出し、
エタノール沈澱さセル。１０ｍＭトリス−１−（Ｃｆｌ
（吐８）及び１’　ｍ　ＭのＥＤＴＡ（、ＴＥ）からな
る液１７（１５０ｍｍプレー１−当り）（こＤＮＡを再
懸濁さけ、ｏ、ｉｍ’ｇ／ｄまでＲＮ　ａｓｅを添加し
、溶液を３７℃で３０分間インキュベートする。次にＳ
ＤＳを０．１％まで添加し、プロナーＬ（シグマ社製）
を０　、５　ＩＩ　ｇ　、ｚ　ｔｒｆｌまで添加する。

３７℃で　３乃至１６時間インキュベー１へした後、溶
液を再度フェノール抽出、ゲロ［１ホルム抽出し、通常
のようにエタノール沈澱させる。

ＤＮＡペレットを０．５ｄの水に再懸濁させ、標準仕様
により制限酵素で消化する。約５乃至１０ｐ！ｌの消化
ＤＮＡをアガロースゲル［１％のアガロースを含むトリ
ス−酢酸緩衝液（４０ｍＭｌ〜リス、１ｍＭのＬＤＴＡ
、酢酸で吐８，２に調腎）１の電気体１’ＪＪ　ｆこか
りる　（Ｃｒｏｕｓｅ　　ｅｔ　　ａｔ、、、）　、　
　ｉ３　　ｉｏｌ、ＣＭｎ１．。

−υ■−：　７８１ｉ７　（１９ｇ２）参照）。プロセ
フ１−ノールブルー染斜がゲルの長さ　２／３よで（多
行した後、ゲルを取−し臭化−１ヂジウムで染ＱＪる、
１紫外線で１）ＮＩＡを兇えるようにし、ケルを１−Ｉ
Ｃρ、＼１ン１０）１及びＮａＣρ−トリス゛Ｃ処理し
、リリ゛ン法（ＪＭｏｌ、　Ｂｉｏｌ、、　９８：　　
５０３（１９７５）　参照）ににすＤＮＡをゲルから二
１〜１」セル［ｊ−スフイルターに移行さＵる。次にフ
ィルターを、（前記の如く調製されハイブリタイスされ
た）　　ｐＥ：　ＨＥ　Ｒの１７００ｂｐ工刈■断片又
はｐＦ　１−　Ｐ　ＩＥ　Ｆでの約１９７０　ｈｐのＲ
Ｑ１７Ｉ断片から製造されたニックｆＩ！　、！Ｊ！ノ
１１−ブどハイブリタイズさける。

６．２　野生型ＤＩ−（ＦＲ全タンパク１吏１ド全−ｔ
ＰＡの産生 ｐｔＦ　Ｔ　Ｐ　Ｅ　Ｒの構築に使用した方法と同林の
方法で、野生型Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　ＲをコードづるＤＮ’
Ａ配列を含むプラスミドｐＥＴＰＦＲを構築した。実施
例Ｃｙ１．Ａに記載の如く構築するが、Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ
　Ｒタンパク遺伝子配列の起源者してプラスミド　ｐ　
［Ｅ　Ｈ［三Ｒの代わりに、係属中のＧ　ｅｎｅｎｔｅ
ｃｈ　、　［）　ｏｃｋｅｔＮ　ｏ、　１００／　９２
に゛記載のプラスミド　ｌ）Ｅ　３４２．　ＨＢ　Ｖ　
。

Ｅ４００Ｄ２２を使用した。野生型ＤＨＦＲと突然変異
株ＤＨＦＲとの間の１個の塩基対の相違以外はプラスミ
ドＩ）Ｅ　３４２．ＨＢ　Ｖ　、　Ｅ　４００．Ｄ　２
２はｐＥＨＥＲと同様である。従って、得られるプラス
ミドｐＥ　Ｔ　Ｐ　Ｆ　Ｒは全ての点でｐＥ　Ｔ　Ｐ　
Ｅ　Ｒと類似しているが、突然変周Ｄ　ＨＦ　Ｒをコー
ドするＤＮＡ配列の代わりに、野生型Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　
ＲをコードするＤＮＡ配列が含まれている。

ｃ、２．８　　　ｔｐＡ配列の発現 Ｇ　ｒａｈａｍ及びＶａｎｄｅｒ　　Ｅｂのリン酸カル
シウム沈澱法により　ｐＥＴＰＦＲを使用しく１つｔ−
Ｉ　ＦＲが欠如したＣ　Ｉ−１０細胞（１−１１″ｌ　
ａｕ　ｂ及ｏ；Ｃｈａｓｉｎ（前記）参照）をトランス
フ」り１・し、た。ｊ巽択用培地（−ＨＧ　Ｔ　）で発
生した２１個の−」［に−をアッセイするために、Ｇ　
ｒａｎｅｌｌ　ｉ−ｐ　叩ｃｒｎｏ、、ｃｔａｌ、、。

Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、ユ４８　：　　２２３　（
１９７８）に記載の如く、綜雑））；及びプラスミノー
ゲンを含む本人プレート中の線維先の間化によっ（測定
されるプラスミン形成を検出した１゜ 次にｃ、ｉ、ｃ、に記載の方法により、最もポジティブ
なり１ｌｌ−ンのうら４個の６１１胞当りのプラスミン
形成を定量的に検定した。。

前記の如き定ｒｉｉ的測定にＪ、す、４個の被検り１１
−ンが、ユトット／卵）胞／日で示１ノと、笠しいか又
は同等の培地内ｔＰＡ分泌を示づことが知見された。２
個のクローンからの接種物を−ＨＧ　Ｔ培地を含む別の
プレートに移してザブク１”ｊ−ンを調製した。得られ
たサブクローンのうちの２種、１８Ｂ及び１を使用して
更に解析を進めた。

Ｃ，２，’Ｃ増幅及びｔｌ）△産生レベル増幅を促進す
べく前記サブクローンを５０ＢＭのＭ　Ｔ　Ｘ中で　１
００ｍｍプレート当り２×１♂の細胞を含むようにプレ
ートした。生存した細胞を前記の如くアッセイすると、
全ての場合に、未増幅の組織プラスミノーゲン活性化因
子の活性の約１０イ８の活性が検出された。これらのク
ローンの２個をｊ巽択して１−１５及び１８３−９と命
名し更に研究を進めた。

サブクローン１−１５を更に増幅するために、５００ｒ
＋ＭのＭＴＸを含む１００ｍｍプレートに２×腎個の細
胞を接種した。このようにして増幅された細胞のアッセ
イによれば、ｔＰＡ産生笛は更に附加していたく約３倍
〉。Ｃ，１，Ｃの方法で定量的に検定すると、レベルは
７ｘ１０　　、ｖニット／細胞／口であった。次に、こ
れらの増幅細胞の一部分を１０．０００ｎＭのＭＴＸの
存在下に移しく維持した。

サブク［１−ン１−１５及び１８Ｂ−９を表１に示した
条イ！［ぐ約　１乃至２力月維持した１りにｉｌｒ　Ｉ
ケ検ｒｒ　Ｌ）だ。

ヱ斐−−−−二Ｌ セルライン　　　　　増　殖　条　件　　　　　　ｎｇ
ｔｉｐΔ７／細胞／Ｅ１１−１５．ｙ　　　　５００ｎ
Ｍ　ＭＴＸ　　　　　　　　　　　２８．５ｘｌＯ−”
１１−１５Ｆｐｏ５００ｎ　’ＭＴＸ　　　　　　　　
　　　２６．０Ｘ１０−３１−１５カ　　　　（・−Ｈ
ＧＴ培地、ＭＴＸなし）　　　　　　　　８，３ｘ１０
−３１〜１５動　　　　（−ＨＧ丁培地、ＭＴＸなし）
　　　　　　　１８．０Ｘ１０−３１−１！］、っ　　
１０μＭ　ＭＴＸ　　　　　　　　　　２９．３ｘ　１
０−’１１！ｉ＋２　１０μＭ〜ＩＴＸ　　　　　　　
　　　　４９，０Ｘ１０−’１８１３−９　　　　５０
ｎＭ　　Ｍ　１−Ｘ　　　　　　　　　　　　　１４．
３ｘ　１０−’１８Ｂ−９５０ｎＭ　　ＭＴＸ　　　　
　　　　　　　　　１４，４ｘｌＯ，−３１８８−９（
−ＨＧＴ培地、ＭＴＸなし）　　　　　　　１４，３Ｘ
１０−３１８Ｂ−９（−ＨＧＴ培地、ＭＴＸなし）　　
　　　　　ｉ４，４Ｘ　１０−３１　　　　　　（−Ｆ
ＩＧＴ培地、ＭＴＸなし＞　　　　　　　　１．０Ｘ１
０−３１　　　　　　　（−１−Ｉ　Ｇ　Ｔ培地、−Ｍ
ＴＸなし）　　　　　　　　０，７ｘｌＯ−３培地中の
ｔＰＡをＪス手の如くシシＡイムノアツレノーマ細胞か
ら誘導された：”Ｉｊｌ製−１−ｌ〜化１〜レー１す−
ｔＰ、Ａを、燐酸緩％■牛Ｊψ食傷水（ｌ１ｌ−１７，
３）、０、！ｉ％牛血清アルブミン、０．０１％１・１
１・（！Ｏ１ｌ　ｆｌＯ及び０．０２％ＮａＮ、３を含
む’６１　’ｔＥＪ　＜’１．中Ｃｊｍａ庶１２．５乃
至　４００ｎＱ、／ｕ認まで順次希釈し１Ｊｔｌ冶当４
Ｊ゛１イ、釈疫の被検定培地（ブンプルを放射活性標識
１〜レー４ブータンパクに添ｊ〕１１シた。ｉ　：　１
０，０００希釈のつｌノ１抗−１１〕Δ抗血清の１００
画分（１）　（ｊ在］−Ｃ抗１ｊ：！Ａ’　ｌ：Ｉｆｌ
　＋晶で１晩インキユベートした。、ｔノ、、１抗−ウ
リｔ”　Ｉ　ＯＧイノ＼ノビーズ（３ｉｏＲａｄ社製）
に室温で・２時間吸収させ−Ｃ抗体−抗原コンプレック
スを沈澱ａｌ！た。希生理ｍＪｕ水を添加してビーズを
洗汀！し、次に４°Ｃ１２０００Ｘ　ｇで１０分間遠心
した。、［清を捨（、沈澱物中の放射活性を七ニターし
た。参照標１１（どの比較によって濃度を決定した。

セルラインは以下の如くである。セルライン“’ｉ’Ｍ
よ、４個のオリジナルセラ１へから選択された未増幅り
［Ｊ−ンである。”１−１５カ　″は最初に５０ｎＭの
ＭＴＸ中で増幅されて１−１５を生【Ｃ１次に５００ｎ
ＭのＭ　−ｒ　Ｘに移されて、更に増幅されたセルライ
ン“　１″の増幅サブクローンである。

１−１５１．ユ　　は１０，０００ｎＭのＭ　−ｒ　Ｘ
の存在下で更に増幅された１　１５．）。０　のザブク
ローンである。セルライン１８３−９は４１固のオリジ
ナルクローンθ）１１固から選択され５０１）〜Ｉ　Ｏ
）　ＩＶＩ　Ｔ　Ｘで増幅されたりブクローンである。

全ての増幅細胞は、未増幅細胞が示したよりも増加した
　ｔＰＡ産生レベルを示す。未増幅培養物で″ｂＯ，５
Ｈ／細胞／日より高いｔＰＡ産牛但を示すが、増幅の結
果として５０ｐｏ／細胞／日に、近いレベルが得られる
。

【図面の簡単な説明】

図ωは、例示したＤ　Ｉ−１［＋’＜　、（突然変異１
ホ父は野生型）／ｌＰＡ］−トゾフスミドのｆｉ＋？　
？Ａを示り図である。 代理人介在士今　　村　　　元 第１頁の続き ｏＩｎｔ、　Ｃ１，３識別記号　　　庁内整理番号、ゲ
（Ｃ１２Ｐ　　　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１１００） ０発　明　者　クリスチャン・クリントン・サイモンゼ
ン アメリカ合衆国カリフォルニア ９５３１０サン・ジョゼ・パークヴ イユー・アヴエニュ１５０９ ０発　明　者　エリザベス・マクリオウド・イ工−ルヴ
アートン アメリカ合衆国カリフォルニア ９５１２９サン・ジ白ゼ・ダンロマ ス・ウェイ１６２４ 手Ｕ５ネ市正書（方式） １、事件の表示　　　昭和５９年特許願第７８９８号２
、発明の名称　　　Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒタンパクをコー
ドづるベクターを使用するヒトｔＰＡの産生 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 名　称　　　　ジエネンテック・インコーホレイデッド
４、代　理　人　　　東京都新宿区新宿１丁目１番１１
１号　山田ごル［第１図（ま」と補止づる。 （戯添１ｔｆ＝１図面を別組朱２；のｉｆｆ！り祉１１
りろ１゜に〕）出願人の代表名を記載した適１［／「願
出及び委任状については／ｉ（願）こ関づる昭ｆ＋Ｉ　
Ｊ　９　’：３月１３１−目」の・丁続袖ｊ「（！’ｊ
（自発）に′ｃＪ：ｈ’−出致しました。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ＜　１　）　　Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒタンパクをコードし
   ている第１ＤＮＡ配列及びヒ１〜　ｔ、ＰＡをコードし
   ている第２ＤＮＡ配列を含み、前記第１配列及び第２配
   列がその各々を発現せしめ得るＤＮＡ配列に有効に結合
   されている発現ベクター。 （２）　ヒ１〜　ｔＰＡをコードしているＤＮＡ配列及
   びＤＨＦＲタンパクをコードしているＤＮＡ配列を発現
   せしめ得るベクターであり、前記配列が前記ベクターの
   内部に配置されており、前記発現が前記ベクターによっ
   て形質転換された細胞内で行なわれることを特徴とする
   前記ベクター。 （３）　　Ｄ　ＨＦ　Ｒタンパクが野生型Ｄ　Ｉ」Ｆ　
   Ｒであることを特徴とする１Ｚ１訂品求の１山間第１項
   に記載のベクター。 （４）　　ＤＨＦＲ欠損細胞（イ」効で′あることを特
   徴とする特許請求の範囲第３項に記載のベクター。 （５）　　Ｄ　Ｉ−１ｔ−１でタンパクのベア１丁Ｘ（
   こ対りる辛！！ｉ　ｆ令親和ツノが低いことを精微どづ
   る’Ｉ−：ｆ　ｌｌ’ｌ’　＋ｊ’ｌ求の範囲第１１Ｑ
   に記載のベクター。 （６）　Ｍ丁Ｘ感受付にｉ１１胞（゛）ｊ効であること
   を特徴とする持Ｆｌ請求の範囲第５Ｊｆｉ、に記載のベ
   クター。 （７）　フ゛ラスミド１１　Ｆ−−１−Ｐ　ＩヨＲ又（
   ，１、ｐ　「ｉ−ｌ）トＲ。 （８）　内部に配直さＩｔ　７Ｃ１）ｌｉ　ｒ−ｌ’＜
   クンバクを−１−ドしでいるＤＮＡ配列及０’ｌＰ△を
   コードしＣいるＤＮＡ配列の発現に右りｊｈＶラスミド
   て循Ｅｌ細胞の１〜ランスフ■クシコンを、ｌｊない、
   前記発現に適した条訃下で該宿主細胞を］曽′９めさゼ
   、該細胞から　ｔＰＡを回収することからなる、宿主細
   胞でｔＰＡを製造する方法。 （９）　　Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒタンパクが野生型Ｄ　Ｉ
   −１Ｆ　Ｒであることを特徴とする特許請求の範囲第８
   項に記載の方法。 （１０）　　宿主細胞がＤ　）−Ｉ　Ｆ　Ｒ欠損細胞Ｃ
   ゛あることを特徴とする特許請求の範囲第９項に記載の
   方法。 （１１）　　ＤＨＦＲタンパクのＭＴＸに対づ嘗５結含
   親和力が低いことを特徴とする特許請求の範囲第８項に
   記載の方法。 （１２）　　宿主細胞がＭＴＸ感受性細胞であることを
   特徴とする特許請求の範囲第１１項に記載の方法。 （１３）プラスミドがｐＥ　Ｔ　Ｐ　Ｅ　Ｒ又はｐＥ　
   Ｔ　Ｐ　ＦＲであることを特徴とする特許請求の範ｒ＋
   −ｎ第８項に記載の方法。 （１４）　　特許請求の範囲第８項に記載の方法により
   産生されるヒト組織プラスミノーゲン活性化因子。 （１５）　　特許請求の範囲第’ｌ　ＪＱ　（ご記載の
   ベクターによつ−Ｃ形貿転換された細胞、。 （１６）　　特許３！’！求の範囲第７１ｉｉに記載の
   へフタ−に五っＣ形質転換された細胞。 （１７）　　特６′１請求の範囲；ｌ；ｊ　’ｌ　１１
   １に記載のベクターを宿主細胞に与え、石効憎幅Ｌ　Ｉ
   ＭのＭ　−１−Ｘ　’７）　（ｒ右手て該細胞を増殖さ
   せることからイする、？１１主細胞培たで　１ｐＡを二
   １−ドしくいるｌ）　Ｎ　Ａ配列を増幅づる方法。 （１８）　　特許請求のζトロ囲ｉ′３１項（Ｊ記載の
   ベクターを宿主細胞に与え、有効ｊ曽幅淵良のＭ　Ｔ　
   Ｘの存在下で該細胞を増夕め８μることからなる、（ｉ
   ’ｒ　Ｈト却１胞培養て　叫つＡの産生を贈入さぜる方
   法。 （１９）　　組換宿主■１胞により　１１１　１　？ｒ
   ｉｌｌ胞当り　０．１ｐｇより多そに産生されるヒト　
   １１〕／＼。 （２０）　　　ＩＩＥＩ　　１？ｌＩＩ胞当す２０ｐｇ
   Ｊ、’）　多ｉｆｌ　（：産生される特許請求の範囲第
   １９項に記載のｔＰＡ。 （２１）　　組換宿主細胞によって　１日　１細胞当り
   ９ｘ　１０’　ｐ　Ｉｏｕｇｈユニツ１へより多量に産
   生されるヒ１〜　ｔＰＡｏ （２２）　　　１臼　１細胞当り１８ｘ　１０　　Ｐ　
   ｌｏｕｇ１１］　ニラ１へより多量に産生される特許請
   求の範囲第２１項に記載のｔＰＡ。