HU196842B - Process for producing hybrid dna and bonding composition comprising the same - Google Patents

Description

Az emlős immunrendszer egyedülálló képessége azon nagyszámú immunglobulinoknak nevezett protein bioszintézise, amelyek kiemelkedően magas speeifitásúak egy adott molekulaszerkezetre. Ezen proteineknek olyan a konformációjuk, hogy egy adott struktúrához specifikusan képesek komplementálódni, így nagy affinitású kötődés jön létre. Ily módon az emlős immunrendszer válaszolni képes idegen molekulák, különösen mikroorganizmusok felületi membránjain lévő proteinek, toxinok inváziójára, amikor a behatoló test detoxifikálódik vagy felbomlik anélkül, hogy a gazdaszervezetre hatással lenne.

A védekező rendszer elsődleges immunglobulinja a gamma-globulin (IgG). Ennek a 150 000 dalton molekulasúlyú glikoproteinnek négy lánca van,két úgynevezett nehéz lánc és két könnyű lánc. Mindegyik láncon találunk egy változó és egy állandó szakaszt. A változó szakaszoknak köszönhető az immunglobulin kötődő képessége, míg az állandó szakaszok több más, az antitest affinitással közvetlenül nem összefüggő funkcióval rendelkeznek.

Bizonyos helyzetekben előnyös lenne, ha rendelkeznénk az immunglobulinoknál kisebb, de az immunglobulinok specifitásával és affinitásával bíró kötő molekulákkal. A kisebb molekulák rövidebb ideig tartózkodnak az emlős szervezetben. Ezenkívül, amikor az immunglobulin egy másik molekulához már hozzákötődött, gyakran előnyös, ha az így keletkező termék kisméretű. Gazdaságosabb is, ha kisebb molekulák képesek ellátni a nagyméretűek funkcióját.

Bizonyos helyzetekben előnyös nagyszámú molekulát szorosan együtt tartani. Kisebb molekulákat használva nagyobb számú molekulát juttathatunk egy adott kis térbe. Ezenkívül, ha a fenti kötő molekulákat hibrid DNS technikával állíthatjuk elő, megvan a lehetőségünk arra, hogy a molekula kötő részét több más polipéptidhez kapcsoljuk, így előállíthatunk olyan kötő molekulát, amelyek egy adott polipeptid lánc egyik vagy másik végéhez kovalens kémiai kötéssel kapcsolódnak.

Amikor az immunglobulinokat in vivő diagnózishoz vagy terápiáson használjuk, immunogén lehet az allogén gazdaszervezet antiszéruma vagy egy monoklónozott antitest. Ha más molekulacsoportokat használunk az antitesthez, a képződő termék immunogénné válik és megindul a gazdaszervezet antitest képzése az immunglobulin állandó szakaszával vagy a molekula más részével szemben.

A fentiek alapján fontos lenne olyan módszerek kifejlesztése, amelyek révén lehetővé válna egy adott antigénnel vagy liganiddal szemben erősen specifikus kötő molekulákat tartalmazó homogén készítmények előállítása, amelyek azonban a teljes immunglobulinok hátrányaival nem rendelkeznek és bírnak a kis molekulasúlyú molekulák előnyeivel.

Az immunglobulinok nehéz és könnyű láncaival kapcsolatos problémákra vonatkozóan ajánljuk Sharon és Givol (Biochem., 15., 1591-1594, 1976) Rosenblatt és Hood (Genetic Engineering, 3, 157-188, 1981) munkáit. Az egér immunglobulinjának könnyű láncát baktérium kiónban Amster és munkatársai (Nucleic Acids Rés., 8, 2055-2065, 1980) állították elő. A leírás során megadott közleményekben módszereket és készítményeket írnak le.

A találmány tárgya eljárás új protein-komplexek előállítására. A találmány szerinti homogén készítményék tartalmazzák egy adott immunglobulin könnyű és nehéz láncainak változó szakaszait, ezek pedig külön-külön vagy együtt egy adott antigént előre meghatározott hapten szakaszon specifikusan kötő komplexet alkotnak. A találmány szerinti homogén készítmények két, egy adott immunglobulin változó szakaszának legalább egy részét meghatározó aminosav-szekvenciáját tartalmazó, de az állandó szakaszt gyakorlatilag nem tartalmazó polipeptid láncból álló specifikus kötő készítmények, ahol a nevezett imminglobulin egy adott, előre meghatározott liganddal szemben kötő aktivitással bír. A két polipeptid lánc az előre meghatározott ligandot erősen kötő komplex molekulává alakul.

A polipeptid láncokat genetikai-úton, génsebészettel készített mikroorganizmusok tenyésztésével állítjuk elő. Hibrid DNS technikát használva a cDNS-ről lehasítjuk a könnyű és nehéz lánc változó szakaszairól a felesleges nukleotidokat. A kapott kétszálú cDNS-t megfelelő kifejeződő vektor molekulába építjük be, majd transzkripcióra és transzlációra sejtbe juttatjuk. A kapott könnyű és nehéz láncok a változó szakasz legalábbis nagy részét meghatározzák és olyan komplex molekulává alakulnak, amely erős affinitással specifikusan kötődnek egy antigén vagy liganid hapten helyéhez. A kötődési konstans általában nagyobb, mint 10⁵ .gyakran nagyobb mint 10⁶ .előnyösen nagyobb, mint 10*.

A liganid kötésére a könnyű és nehéz láncok változó szakaszait tartalmazó polipeptid láncokat általában együtt használjuk. Esetenként azonban használhatunk egyetlen láncot is, ha ennek megfelelő kötő affinitása van a kérdéses liganiddal szemben.

A találmány szerinti készítményekben lévő két polipeptid lánc, egyenként vagy együttesen, egy adott immunglobulin kötőhelyével analóg receptor helyet alkot. A készítményt rFv jellel jelöljük, az egy láncot tartalmazót pedig LrFv-(könnyű lánc) vagy H-rFvnek (nehéz lánc). A két lánc is lehet, származhat a könnyű vagy nehéz lánc szekvenicájából. Az rFv polipeptid lánc általában 125-nél kevesebb aminosavat tartalmaz, előnyösen 95-nél; még előnyösebben 100nál többet. A Η-rFv lánc előnyösen 110 és 125 közötti számú, az L-rFv lánc pedig 95 és 115 közötti számú aminosavat tartalmaz.

Az adott idiotípustól függően a készítmény aminosav összetétele széles határok között változik. A 60—75 aminosav között általában két cisztein van, ezek diszulfid-kötést (cisztin) alkotnak. A két lánc általában az immunglobulinok könnyű és nehéz láncaiban található változó szakaszok idiotípusainak másolata, esetenként azonban elegendő, ha a könnyű vagy a nehéz lánc változó szakaszai kombinálódnak.

Gyakran előnyös, ha az rFv egyik vagy mindkét lánca például radioizotóppal, fluoreszkáló molekulával vagy toxinnal jelölt, vagy semleges, élettani szempontból elfogadható vivőanyagokhoz, például szintetikus szerves polimerhez, poliszacharidhoz, természetes proteinekhez vagy más, nem immunaktív anyaghoz van kötve.

Esetenként előnyös, ha a két protein lánc például a karboxil-terminális végén lévő ciszteinnel kovalensen kapcsolt. A láncokat általában úgy állítják elő, hogy az állandó szakaszok hiányoznak, a J szakasz részben vagy teljesen jelen lehet, vagy hiányozhat. A D szakasz a Η-rFv transzkripciós másolatában általában je-21 len van.

Az rFv-ben a teljes aminosav készlet relatíve kis százaléka változik idiotípustól függően. így viszonylag állandó vázzal bíró területek és változó, úgynevezett bipervariálódó szakaszok alakulnak ki.

Az rFv C-terminális szakaszában a szekveniák nagyobb mértékben variálódnak, mint az N-terminális végen, és így,, a jelen leírás értelmében tovább módosítható, amikor a természetben előforduló nehéz és könnyű láncoktól még inkább különböző változatok jöhetnek létre. A hipervariábilis szakasz aminosavai· nak megváltoztatására mutációt okozó szintetikus oligonukleotid építhető be.

Az rFv hibrid DNS technikával való előállítását először általánosságban, majd részletesen ismertetjük.

Jelentős kötő affinitással rendelkező homogén rFv előállítására az emlős immunrendszerből indulunk ki. Hibridoma vagy rna's monoklónozott antitestet termelő sejtből izoláljuk a mRNS-t (hírvivő RNS) és felhasználjuk az immunglobulin könnyű és/vagy nehéz láncainak szekvenciáját meghatározó cDNS előállítására. A jobbra és balra eső szekvenciák esetén a változó szakaszt meghatározó DNS valószínűleg vezető (leader) régiót tartalmazó első és befejező szakaszába legalább részben komplementer rövid DNS szekvenciákat (olignukleotidokat) építünk be a primer repair vagy in vitro mutagenezis biztosítására, amikor különleges szakaszok kieshetnek a DNS-ből és beépülhet a transzlációs kontroll jele. In vivő mutageneziskor olyan oligounkleotidot használunk, amely a cDNS egyik szálával heteroduplexet alkot, ha a DNS polimeráz I Klenow-fragmensével kezeljük. Primer reapir esetén hompduplexet kialakító oligonukleotidra van szükség, ilyen esetben is a fenti enzimet használjuk. A folyamatot kétszer végezzük el, egyszer a kódoló szállal, egyszer pedig a nem kódolóval, amikor olyan kétszálú cDNS-t kapunk, amely meghatározza a váltó zó szakaszt, és előre meghatározott helyen tartalmaz za a transzlációs szabályozó jeleket. Ezt a kétszálú cDNS-t megfelelő vektor molekulába, például plazmidba építjük be, amikor olyan hibrid vektor DNS-t kapunk, amely replikálódni képes és megfelelő szabályozó szakaszokat tartalmaz replikációra, szelekcióra és kifejeződésre.

A hibrid vektor DNS-t ezután megfelelő gazdasejtbe juttatjuk az rFv könnyű és nehéz polipeptid láncaiban lévő változó szakaszok kifejezésére, majd izoláljuk a polipeptideket. Az rFv könnyű és nehéz polipeptid láncainak változó szakaszait eztkövetően megfelelő reakcióelegyben összekapcsoljuk, amikor létrejön az rFv.

Mivel az idiótípusok változnak, a jelen szabadalmi leírásban megadott reakció lépések sorrendjének változtatásával lehetó'ségünk van a változó szakaszokat meghatározó kódoló-szekvenciák széles körű változtatására. Ugyancsak hasíthatjuk a kétszálú cDNS-t és a vektor DNS-t a használt szabályozó jelek, különösen a promoter optimalizálására. Megfelelően helyezhetjük el a riboszóma kötőhelyet és a változó szakaszt iniciálé kodont abból a célból, hogy optimalizáljuk a polipeptid változó szakaszát meghatározó DNS kifejeződését.

A változó szakaszt meghatározó szekvenciát tartalmazó hibrid vektorral megfelelő gazdasejtet transzformálunk, amikor az információ kifejeződik. A transzformánsokat a vektorban jelenlévő markerek segítségével szelektáljuk, majd klónozzuk és szaporítjuk. A transzformáncok által termelt polipeptidet a sejtek elkülönítésével és a felülúszó izolálásával kapjuk, az adott típusú poiipeptidek ugyanis oldatba szekretálódnak. Abban az esetben, ha a poiipeptidek nem kerülnek oldatba, a transzformáns sejteket izoláljuk, lizáljuk és elkülönítjük a polipeptidet. Ismert módszereket, például gélelektroforézist, frakcionált kicsapást, affinitás kromatográfiát, vagy nagynyomású folyadékkromatográfiát vagy hasonlókat használva növekvő mennyiségű, változó szakaszt hordozó polipeptideket tartalmazó frakciókhoz juthatunk. Az eredeti lizátumot vagy felülúszót, vagy az ebből nyert tömény frakciókat immunméréssel vizsgáljuk és megállapítjuk a változó szakaszt tartalmazó poiipeptidek jelenlétét.

A szekretált nehéz vagy könnyű láncot az alábbiak szerinti izoláljuk. Monoklónozott immunglobulinra poliklónozott antiszérumot állítunk elő olymódon, hogy megfelelő gerincest a teljes monoklónozott antitesttel immunizálunk, így olyan antiszérum jön létre, amely felismeri a nehéz, és könnyű láncok determinánsait. A teljes immunglobulint vagy csak a könnyű vagy nehéz láncot felismerő antitesteket az antiszérumban jelen lévő más antitestektől elkülöníthetjük és tisztíthatjuk. Olyan affinitív kromatográfiás oszlopot készítünk, amely megfelelő hordozóra kovalensen kötve tartalmazza a teljes immunglobulint vagy csak a nehéz vagy könnyű láncot, majd az oszlophoz kötjük és eluáljuk a teljes immunglobulinra, vagy a nehéz vagy a könnyű láncra antitestként viselkedő és az oszlophoz kötődő molekulákat. Az iszlopot denaturáljuk és a tisztított antitesteket eltávolítjuk, majd megfelelő hordozóra kötve kromatografáló oszlopot készítünk az rFv nehéz és könnyű kancáinak tisztítására.

Abban az esetben, ha a könnyű és nehéz láncok nem szekretálódnak, úgy járunk el, hogy a könnyű és nehéz láncok bioszintézisét meghatározó kétszálú cDNS-t tartalmazó transzformált mikroorganizmusokat folyékony halmazállapotú táptalajon tenyésztjük, tiszta lizátumot állítunk elő például a sejtek lizozimos kezelésével, roncsoljuk a sejtmembránt és az így kapott elegyet centrifugáljuk és összegyűjtjük a felülúszót. A lizátumot immunszorbeiós affinitás kromatográfiával (lásd fent) tisztítjuk, specifikus poliklónozott antiszérumot használva. Az oszlophoz kötődött változó szakaszokat tartalmazó proteint megfelelő denaturáló oldószerrel eluáljuk. A nehéz és könnyű láncot tartalmazó eluátumot összegyűjtjük és megfelelően kezelve renaturáljuk a fehérjéket, amikor sorrendben megkapjuk a Η-rFv és L-rFv terméket. Renaturáláshoz az eluátumot megfelelő vizes pufferral szemben dializáljuk. A keveréket ezután tovább tisztítjuk megfelelő ligand-affinitív oszlopon átvezetve, a kötődő molekulákat megfelelő denaturáló oldószerrel eluáljuk. A fentiek szerint eljárva renaturáljuk a változó régiókat, amikor olyan oldatot kapunk, amely tartalmazza a különböző célokra használható rFv termékeket.

A találmány szerinti eljárással olyan molekulákat állíthatunk elő, amelyek immunglobulinok nehéz és könnyű láncainak változó szakaszait tartalmazzák polipeptid duplexként és amelyek rendelkeznek az immunglobulinok specifitásával. Mivel a találmány szerinti rFv molekulák nem tartalmaznak állandó sza-31 kaszt, kevéssé immunogének és így előállíthatók a kezelendő szervezetre nézve xenogén forrásokból. Ezenkívül a találmány szerinti rFv molekulák nem heterogén, hanem homogén keverékben léteznek. (A különböző hosszúságú láncokat tartalmazó heterogén keverékeket más módszerekkel, például enzimes vagy savas hidrolízissel állítjuk elő.) A találmány szerinti homogén készítményeket homogenitásuk miatt egységesen módosíthatjuk és pontosan meghatározhatjuk terápiás mennyiségüket. A készítmény nem tartalmaz továbbá a teljes immunglobulinokból származó láncokat, amelyek tökéletlen emésztés esetén nem vesztik el immunogén részeiket vagy új immunogén helyek keletkezhetnek rajta. Végül a találmány szerinti eljárással a kívánt rFv-ből jó kitermeléssel és nagy tisztaságban állíthatunk elő nagyobb mennyiségű terméket.

A találmány szerinti eljárással továbbá olyan megfelelő transzformáló kifejeződő vektorokat és plazmidokat állíthatunk elő, amelyek hordozzák az adott rFv molekulákat meghatározó kétszálú DNS-szekvenciákat, előállíthatunk a kifejeződő DNS vektorokat tartalmazó transzformált gazdasejteket, például baktériumokat, mint például E. colit vagy élesztőket, a találmány szerinti eljárás során transzformált kifejeződő vektor DNS molekulákat állítunk elő és a transzformált sejtek tenyésztésével előállítjuk a megfelelő rFv molekulákat,

A találmány szerinti eljárással előállított transzformáló kifejeződő vektor vagy plezmid DNS molekulák olyan kétszálú DNS-szekvenciát tartalmaznak, amely meghatározza egy előre meghatározott ligandra specifikus immunglobulin könnyű vagy nehéz láncának változó szakaszát és nem tartalmaznak olyan-nukleotidokat, amelyek a fenti változó régión kívüleső aminosavakat kódolnak, a DNS-szekvencia hordozza továbbá az 5 -, illetve a 3’- végen az iniciációs, illetve a terminációs kodonokat.

A liganid lehet például enzim vagy egy felületi fehérje. A kétszálú DNS-szekvencia kódolhatja például a 95-125,előnyösen 95-115 aminosavból álló nehéz lánc változó szakaszát, elsősorban legalább a nehéz lánc D régióját.

A találmány tárgya eljárás előre meghatározott liganidra specifikus immunglobulin könnyű vagy nehéz láncának változó szakaszát meghatározó kétszálú DNS-szekvenciát tartalmazó transzformáló kifejeződő vektor vagy plazmid DNS előállítására, amely DNS nem tartalmazza a fenti változó szakaszon kívüleső aminosavakat kódoló nukleotjdokat, de hordozza a 3’- végén a terminációs és az 5 -végen az iniciációs kodonokat.

A fenti vektor vagy plazmid DNS molekulák előállítására a találmány értelmében úgy járunk el, hogy kétszálú, a könnyű vagy nehéz láncok legalább egyikét meghatározó cDNS-t állítunk elő a fenti láij cokat kódoló mRNS-ből, az adott változó szakaszon kívüleső nukleotld-szekvenciákat eltávolítjuk a kétszálú cDNS-ről és beépítjük az iniciációs, illetve a terminációs kodonokat a DNS-szakasz 5'-illetve 3-végeire, amikor olyan hasított cDNS-t kapunk, amely az adott változó régiót határozza meg, majd az adott, hasított kétszálú cDNS molekulát beépítjük egy kifejeződő vektor DNS-be, amikor az adott kétszálú cDNS kifejeződik.

Az iniciációs és terminációs kodonokat In vitro mutagenezissel építjük be. Adott esetben beiktathatunk egy további lépést is a fenti mutagenezis előtt, amelynek során a kétszálú cDNS legalább egy nukleotidját olyan kodonná változtatjuk, amely egy másik aminosav beépülését határozza meg.

A találmány értelmében részletesen úgy járunk el, hogy

a) egy immunoglobulin állandó és változó szakaszból álló, ahol a változó régió 95-125 aminosavból áll, könnyű vagy nehéz láncát meghatározó cDNS-t izoláljuk, a cDNS előállítására reverz transzkriptázzal kezeljük az mRNS-t, kétszálú cDNS előállítására DNS polímerázzal létrehozzuk az egyszáhí cDNS komplementer szálját, ahol a kétszálú cDNS kódoló szálja meghatározza az adott könnyű vagy nehéz láncot és ahol a kódoló szálak az adott immunglobulin vezető szekvenciáját a változó és állandó régiót meghatározó szekvenciát tartalmazzák 5 -3'-irányban, majd az előállított kétszálú cDNS-t kiónozzuk,

b) az adott klónozott kétszálú cDNS-ből kódoló és nem kódoló egyszálú cDNS szálat állítunk elő, és ezután a c., d., e., f. lépéseket decf vagy cedf sorrendben elvégezzük,

c) a nem kódoló szál vezető szakaszt és változó szakaszt meghatározó helyei kapcsolódásának pontján olyan oligonukleiotid prímért építünk be, amely az iniciációs hely létrehozásához alkalmas iniciációs kodont tartalmaz, amikor megkapjuk az első duplex molekulát, ezt a duplexet enzimesen kezeljük abból a célból, hogy az első oligonukleotid prímért 5 -3-irányban a nem kódoló, egyszálú cDNS szál mentén meghosszabbítsuk, majd ezután az oligonukleotid printerrel komplementer szállal ellenkező irányban leemésztjük a nem kódoló egyszálú cDNS szakaszt, amikor N-terminálissal meghatározott kétszálú cDNS( kapunk,

d) a változó és az állandó szakaszt meghatározó DNS-szekvenciák találkozási pontjába egy második olyan oligonukleotid prímért hibridizálunk, amely stop anti-kodont tartalmaz, amikor létrejön a második duplex molekula, ezt a duplexet enzimatikusan kezeljük a kódoló szálra komplementer 5-3-irányú második oligonukleotid primer meghosszabbítása és a másik irányban elhelyezkedő kódoló egyszálú cDNS-t leemésztve C-terminálisan végződő kétszálú cDNS-t hozunk létre,

e) az előállított C- vagy N-terminállsan meghatározott kétszálú cDNS-t klónozzuk, a kapott C- vagy Nterminálisan meghatározott cDNS-t kódoló és nem kódoló szálakra választjuk szét, végül a kódoló szálat használjuk, ha a d. lépés következik, de a nem kódolót, ha a c. lépést végezzük el, ezután, végül

f) a kapott N- és C-terniinálisan végződő cDNS-t klónozzuk, és a fenti, az adott kódoló szekveniát tartalmazó kétszálú cDNS-t a transzkripciós és transzlációs szabályozó jelekkel megfelelő összefüggésben beépítjük egy kifejeződő vektorba vagy plazmidba.

A találmány egy előnyös kivitelezési változata szerlnt úgy járunk el, hogy

A), előállítunk egy immunglobulin könnyű vagy nehéz láncát meghatározó kétszáló cDNS-t, ahol a szálak mindegyike egy állandó és egy változó szakaszból áll, és ahol a változó szakasz 95—125 amlnosavat tartalmaz, a cDNS előállítására az adott láncot meghatározó mRNS-t izoláljuk, majd reverz transzkriptázzal előállítjuk a megfelelő egyszálú cDNS-t, az adott egyszálú cDNS-re komplementer szálat szintetizálunk DNS-polímerázzal, amikor olyan kétszálú cDNS-t kapunk, amelynek kódoló szálja az adott könnyű vagy nehéz láncot határozza meg, és ahol a kódoló szál az adott immunglobulinra jellemző vezető szekvenciát, változó és konstans szakaszt meghatározó DNS-szekvenciákat tartalmaz 5’-3’-irányban, a kapott kétszálú cDNS-t klónozzuk,

B). az adott könnyű vagy nehéz lánc adott változó szakaszával szomszédos régiókat meghatározó DNS legalább egy részét eltávolítjuk úgy, hogy a klónozott kétszálú cDNS-t kódoló és nem kódoló szálakra választjuk, a nem kódoló szálhoz olyan oligonukleotid primer! bibridizálunk, amely a változó szakasz kifejeződését lehetővé tevő iniciációs helyet meghatározó inleiációs kodont tartalmaz, az oligonukleotid primer komplementer a vezető szakasz N-terminális végét meghatározó szekvenciával vagy részlegesen komplementer a vezető szakasz és a változó régió találkozási helyét meghatározó DNS-szekvenciával és egy nem komplementer iniciációs kodonnal rendelkezik az ' adott létrehozott első duplex molekulát enzimatikusan kezeljük a duplex 5 -3 -irányban való meghosszabbítására, amikor a nem kódoló egyszálú cDNS-t egészen az első oligonukleotid primerrel komplementer szekvenciáig, a miután N-terminálisan meghatározott kétszálú cDNS-t kapunk, az N-terminálisan meghatározott kétszálú cDNS-t klónozzuk, a kapott N-terminiálisan meghatározott kétszálú cDNS-t kódoló és nem kodoló szálakra választjuk szét, a kódoló szálhoz stop anti-kodont tartalmazó, de egyébként az adott változó szakasz és állandó szakasz határát meghatározó résszel komplementer szekvenciát tartalmazó második oligonukleotid printert hibridizálunk, amikor megkapjuk a második duplex molekulát, ahol a stop anti-kodon a változó szakasz végén helyezkedik el, ezután a kapott duplexet enzitnatikusan kezeljük a második oligonukleotid primer 5’-3 -irányban való meghosszabbítására a kódoló szálra komplementer módon, majd a második irányban, a második oligonukleotid primerre komplementer szekvenciáig leemésztjük a kódoló egyszálú cDNS-t, amiután olyan N- és C-terminálisan meghatározott kétszálú cDNS-t kapunk, amely egy adott immunglobulin könnyű vagy nehéz láncában lévő változó régiót határoz meg, az állandó szakasz kódja pedig hiányzik, az N- és C-terminálisan kialakított kétszálú cDNS-t klónozzuk, az N- és C-terminálisan meghatározott kétszálú cDNS-t beépítjük egy kifejeződő vektorba vagy plazmidba, a beépítés úgy történik, hogy a kódoló szekvencia megfelelő kapcsolatban legyen a transzkripciós és transzlációs szabályozó jelekkel.

Az első oligonukleotid primer homoduplex lehet az említett vezető szekvencia N-terminális nem kódoló szálára nézve, vagy hidridizálva lehet az említett vezető szekvencia és a változó szekvencia találkozási helyére abból a célból, hogy a változó szakaszt meghatározó DNS-szekvencia N-terminális részébe egy iniciációs kodont építsünk be. A cDNS láncra nézve legalább egy oligonukleotid primer csak részlegesen komplementer.

A találmány szerinti eljárásba egy további lépést is beiktathatunk a fenti beépítés előtt, nevezetesen az N- és C-terminálisan hasított készálú cDNS-be restrikciós linkereket (felismerőhelyek) építhetünk be, majd a linkereket enzimatikusan hasítva kohézív (ragadós) végeket hozunk létre. Mindegyik hibridizációs lépést követő klónozás után olyan klóitokat szelektálhatunk, amelyek rendelkeznek az említett első vagy második oligunkleotid-szekvenicával, majd izoláljuk a kétszálú cDNS-t tartalmazó DNS-t és újra klónozzuk.

A találmány szerinti eljárással olyan kétszálú cDNS-t hordozó transzformáló kifejeződő vektor vagy plazmid állítható elő, amelyben a cDNS-szekvencia egy protein vagy enzim csak egy adott polipeptid láncrészletét határozza meg, és amely DNS-szekvencia az 5’- illetve a 3’-végen iniciációs, illetve terminációs kodonnal rendelkezik.

Úgy járunk el, hogy az adott proteint vagy enzimet meghatározó mRNS-böl cl)NS-t állítunk elő, a kétszálú cDNS-ről az adott polipeptid láncon kívül eső nukleotid.szekvenciákat eltávolítjuk és az 5’illetve a 3 -végen iniciációs, illetve terminációs kodont építünk be, amikor olyan meghatározott, kétszálú cDNS-hez jutunk, amely az adott polipeptid lánc egy adott részét határozza meg, majd ezt követően az előállított hasított, kétszálú cDNS-t kifejezésre egy kifejeződő vektorba építjük be

A találmány szerinti eljárás és különösen az a-f. pontokban megadottak tetszés szerint adaptálhatók.

A találmány szerinti eljárás egy előnyös kivitelezési változata szerint előre meghatározott ligandra specifikus immunoglobulin könnyű vagy netiéz Ián cában található változó szakasz legalább egy részét adó aminosav-szekvenciát tartalmazó kötő polipeptidet állítunk elő, ahol az aminosav-szekvencia az analóg [ánc kötő spccifitásával rendelkezik.

IJgy járunk el, hogy az adott láncot meghatározó mRNS-bőI előállítunk legalább egy könnyű vagy nehéz láncot mégha tározó cDNS-t, a változó szakaszon kívüleső nukleotid-szekvenciá kát eltávolítjuk a kétszálú cDNS-ről, majd az 5 llletve a 3 -végeken iniciációs, illetve terminációs cDNS-t kapunk, amely az adott változó szakaszt meghatározza, az előállított, hasított, kétszálú cDNS-t kifejezésre egy kifejeződő vektorba építjük és gazdasejtet transzformálunk a meghatározott, kétszálú cDNS-t hordozó kifejeződő vektorral, a transzformált sejtet tenyésztjük, amikor az adott könnyű vegy nehéz lánc kötő polipeptidje kifejeződik, végül izoláljuk az adott kötő polipeptidet.

A találmány szerinti eljárás egy másik előnyös kivitelezési változata szerint előre meghatározott ligandra specifikus immunglobulin könnyű vagy nehéz láncában található változó szakasz legalább egy részét adó aminosav-szekvenciát tartalmazó kötő polipeptidet állítunk elő, ahol az aminosav-szekvencia az analóg lánc kötő specifitásával rendelkezik.

Úgy járunk el, hogy az adott immunglobulin könynyű vagy nehéz láncában lévő változó szakaszt meghatározó, de az adott változó szakaszon kívüleső aminosav-szekvenciát meghatározó nukleotidokat nem tartalmazó, az 5 - illetve 3-végeken iniciációs, illetve terminációs kodonnal ellátott kétszálú DNS-szekven-51 ciát hordozó, transzformáló kifejeződő vektorral vagy plazniiddal transzformált gazdasejtet tenyésztjük.

Λζ eláhbiakban részletesen ismertetjük az rFv előállítását hibrid DNS technikával.

1. A megfelelő DNS-szekvencia izolálása

A DNS előállítására a változó régiót meghatározó génekre van szükségünk. A változó régiók származhatnak az IgA-, IgD-, IgE- vagy az IgM-ből, általában az IgM és az IgG-ből. Ezt úgy akpjuk, hogy megfelelő gerinces állatot, átalában háziállatot, leggyakrabban egeret immunizálunk. Az immunizálást a szokásos módon, az immunogén egyszeri vagy ismételt injektá lásával végezzük, általában emlőssel, és általában két-három héten át. Az utolsó injekciót követő harmadik napon eltávolítjuk a lépet, sejtekre bontjuk és a sejteket hibridoma előállítására fuzionáljuk.

Az iinmunogénként egy adott antigént használunk, vagy ha hapten van jelen, úgy a hapten és az antigén antigenikus komplexét alkalmazzuk.

A hibridoma előállítására a iépsejteket fuzionáló szer, például polietilén-glikol 6000 (PEG6000) jelenlétében több ínter- vagy intra specifikus mieloma sejttel fuzionáljuk, előnyösen egérsejtekkel, például SP-2/0, NS-I stb. sejtekkel, majd HAT szelektív tápoldatban szuszpendáljuk. A túlélő sejteket Mikrotiter csövekben növesztjük és az adott lígandra nézve antitestként viselkedő termék termelését megállapítjuk.

Az antitestek meghatározása jól ismert módszerekkel történik, jelzett antigéneket vagy hapténeket használhatunk, a jelzettséget radioizotóppal, fluoreszcenciával, enzimekkel stb. érjük el. Használhatunk más módszereket is, például két antitestet felhasználó szendvics-módszert, ahol az egyik antitestet a hordozóhoz kötjük, és a másikat jelezzük. A Mikrotiter csöveken lévő pozitív sejteket hígítással vagy lágy agáron klónozzuk. Az így kapott sejtvonalakat szaporítjuk, a szaporítás megfelelő tápoldatban történik. A sejteket szükség esetén folyékony nitrogénben fagyasztva tároljuk.

Az adott monoklónozott antitestet termelő sejtvonal szelektálása után tenyésztjük a sejteket. A tenyésztést addig folytatjuk, míg 1 liter tenyészetben milliliterenként IxlO⁶ sejtet kapunk. A sejteket centrifugálással összegyűjtjük, majd lizáljuk.

Az adott DNS-szekvencia izolálására a változó szakaszt kifejező gént vagy a változó szakaszt kifejező mRNS-t keressük. A genomban lévő DNS vizsgálata során szembe kell nézni a nehézségekkel, hogy a változó szakaszt meghatározó szekvenciákat intronok választják szét. Izolálnunk kell a megfelelő exonokat tartalmazó DNS fragmens(eket), ki kell vágnunk az inti unokát és ezután össze kell kapcsolnunk az exonokat mégpedig megfelelő sorrendben és orientációban. Általában ezt nehéz kivitelezni, így az mRNS-t felhasználó módszert választjuk.

Ha az mRNS-t használjuk, a sejtek lizisét a ribo· nukleáz enzim gátlása közben végezzük. Az érett mRNS használatakor azonban szembe kell néznünk azzal, hogy nem teljes reverz transzkripció történhet, de ez minimalizálható. Első lépésként izoláljuk az mRNS-t. A poliadenilezett mRNS könnyel leválasztható a tötjbi RNS molekulától oIigo-(dT)-cellulóz oszlopont. így olyan mRNS keveréket kapunk, amely mentes más RNS molekulától. Az immunglobulin polipeptid nehéz és könnyű láncát meghatározó szekvenciákat használjuk, ezeket megfelelő forrásokból megkaphatjuk (lásd például Early és Hood, Genetic Engineering, Setlow és Hollandéra szerk., 3. kötet, Plenum Publishing Corp., New York, 1981,157-188. oldal).

A hibátlan immunglobulint leíró mRNS meghatározható in vitro transzlációval, nyúl retikulocita sejtmentes kivonatot használva (Pleham és Jackson, Eurp. J. Biochem., 77, 247-256, 1976). A kapott transzlációs termék izolálható az adott lánc egy vagy több szakaszára specifikus antitestekkel, például nyúl anti(egér IgC)-vel, ahol a láncok egér immunglobulinból származnak.

Az immuncsapadékot poliakril-amid gélelektroforézissel tovább analizálhatjuk, a komplexek jelenlétét antigén-antitest komplexekre érzékeny radioaktívan jelzett receptorokkal bizonyítjuk, például S. aureus A proteinnel, Rf-faktorral stb. Á hibátlan mRNS jelenlétét bizonyítjuk továbbá RNS hibridizációval (agaróz gélen való szétválasztással, az mRNS nitrocellulóz szűrőre viteléve, 80 °C hőmérsékleten forralva és radioaktív próbával vizsgálva).

A kívánt mRNS szekvenciákat tartalmazó nyers mRNS keveréket az alábbiak szerint kezeljük. Okayama és Berg módszerét (Mol.Cell. Bioi., 1982) használva növeljük annak valószínűségét, hogy teljes hosszúságú cDNS-t kapjunk. Eljárhatunk azonban Efstradiadis és Villa-Komaroff módszere (Genetic Engineering Pirciples and Methods, 1, Setlow és Hollaender szerk., New York, Plnum Press, 15-36. oldal, 1979) vagy Steinmezt és munkatársai szerint is (Cell, 24, 125-134, 1981.) A cDNS első szálát vírus reverz transzkríptázzal állítjuk elő oligo-(dT)-primer jelenlétében. A második szálat ezután reverz transzkriptázzal és a DNS polimeráz I Klenow-fragmensével vagy TH polimerázzal állítjuk elő. Ha szükséges, a kapott kétszálú cDNS-t egyszálú DNS-re specifikus nukleázzal, például SÍ nukleázzal kezeljük a kétszálú cDNS-en lévő egyszálú szakaszok eltávolítására, majd a kapott cDNS-t klónozzuk.

2. Az L-rFv-t és a H-rFv-t meghatározó gének előállítása és kifejeződő vektorba juttatása sokszorosításra

Az immunglobulin könnyű és nehéz láncainak előállítására a kétszálú cDNS-t sokszorosítás vagy kifejezés céljából több vektor molekulába beépíthetjük. A megfelelő restrikciós hellyel bíró vektor molekulát megfelelő restrikciós endonukleázzal kezeljük. Az mRNS reverz transzkripciójával kapott cDNS-t linkerek hozzákapcsolásával, terminális transzferázzal kezelve vagy komplementer vagy tompa végek előállításával módosíthatjuk. A vektor molekula a transzformánsok szelektálására egy, kettő vagy több markert tartalmazhat. Előnyös az a vektor, amely több marker közül egyen belül egyetlen restrikciós szakaszt tartalmaz, így a transzformánsok szelektálhatok az egyik marker kifejeződése és a másodikmarker kifejeződésének hiánya alapján. Markerként használhatunk biocid rezisztencia markert, auxotróf komplementációt, vírus immunitást vagy hasonlókat.

Az mRNS-ből előállított készálú cDNS-sel megfelelő gazdasejtet, általában baktériumot, például E. colit, B. subtilist, S. Cerevisiae-t stb. transzformálunk. A transzformációt ismert módszerekkel végezzük, a transzformánsokat agar lemezekre szélesztjük és a ér markereknek megfelelően szelektáljuk. A kapott telepeket restrikciós elektroforetikus képük, jelzett pró• bához való hibridizációval vagy más ismert módszerekkel vizsgáljuk (lásd például Hanahan és Meselson, Gcne, 10, 63-67, 1980). Az egyik módszer szerint előállítására szilárd halmazállapotú táptalajon növesztjük. A telepek sejtjeit nitrocellulóz replika szűrőre juttatjuk, majd tovább növesztjük az átvitt sejteket és lizisiikct követően szárítjuk és 80 °C hőmérsékleten kezeljük. A replika szűrőt megfelelő radioizotóppal jelzett próbákkal hibridizáljuk. A különböző emlős immunglobulinok állandó szakaszaiban jelen lévő determináns kötőhelyek próbái könnyen hozzáférhetők. A telepeket az adott immunglobulin természete vagy az adott immunglobulinban jelen lévő különböző determináns helyek alapján vizsgáljuk. A próbával hibridizálódó telepeket, azaz azokat, amelyek tartalmazzák a könnyű vagy nehéz láncot meghatározó DNS szakaszt, elkülönítjük és szelekciós körülmények között tenyésztjük. A szelekciós körülmények fenntartása érdekében kívánatos, hogy a használt vektor DNS biocid, előnyösen antibiotikum rezisztenciát határozzon meg. A tenyészetből megfelelő növesztést követően, előnyösen centrifugálással elkülönítjük a sejteket. Ezután ismert módszerekkel (például Gunsalus és munkatársai, J. Bact., 140, 106-1 33, 1979 módszerével) elkülöníthető a hibrid plazmid DNS.

Az elkülönített plazmid DNS-t restrikciós endonukleázos analízissel és DNS-szekvenálással analizáljuk. Az analízis adatai bizonyítják, hogy az izolált cDNS kiónok teljes mértékben kódolják a változó szakaszt és kedvező esetben az adott immunglobulin nehéz vagy könnyű láncának vezető szekvenciáját. A változó szakaszok, vezető és semleges szekvenicák restrikciós térképének ismeretében meghatározhatjuk azt a restrikciós helyet, ahonnal egy DNS szakaszt kihasíthatunk és módosíthatjuk abból célból, hogy vektor DNS-be építhessük és kifejezhessük az adott polipeptidet. Abban az esetben, ha a semleges régiók meg felelő pozíciójában nincs egyedülálló restrikciós hely úgy részleges emésztést végzünk és szelektáljuk azo kát a fragmenseket, amelyek tartalmazzák a változó régiót és előnyösen a teljes vezető szekvenciát is. Ha az 5 - és 3’-semlcges szakaszok túl hosszúak, Bal 31 részleges emésztéssel rövidíthetjük azokat.

A nehéz és könnyű lánc változó szakaszainak C-terminális részén lévő kódoló szál DNS-szekvenciájának ismeretében az alábbi eljárással stop kodon építhető be a C-terminális részbe. Az in vitro mutagenezíst úgy végezzük, ho£y a cDNS-t a megfelelő enzimekkel) hasítjuk, amiután a változó szakaszt meghatározó szegmensen kívül 5’-3’-semleges szekvenciákat tartalmazó molekulát kapunk. Ezt a szegmenst például gélelektroforézissel, sűrűségi gradiens centrifugálással stb. tisztítjuk. Izolálást követően szétválasztjuk a szegmens két szálát, ezt forralással végezzük. Az intakt cDNS plazmid klón felesleges szálát hasíthatjuk és emészthetjük.

Szintézissel előállítunk egy olyan egyszálú oligonukleotidot (DNS oligomert), amely legalább 12, általában 15 nukleotid bázist, de gyakran 50-nél, általában 30 nukleotidnál kevesebbet tartalmaz, mivel tú! hosszú oligomerre nincs szükségünk.

Ahol ezt a szintetikus DNS oligomert használjuk a heteroduplex előállítására a nem komplementer nuk leotldokat a hibridizált szállal komplementer legalább három, gyakrabban legalább hat nukleotiddal egészítjük ki. A heteroduplex DNS oligomer komplementer a vezető-szekvencia és a változó szakasz, vagy a változó szakasz és az állandó régió közötti szakaszokkal,

A DNS oligomer gyakorlatilag komplementer i változó szakaszt kódoló (sense) szekvenciával, de tartalmaz a változó szakasz C-terminális részén egy terminációs kodont. Azaz a DNS oligomer a kódoló szálra komplementer, kivéve tannál az aminosavnál, amely a változó szakasz ésa könnyű és nehéz láncok D-, J- vagy C-régiójának kapcsolódási helyén, különösen pedig a D- vagy J-szakaszon vagy a J-szakaszon belül, vagy a J- és C-szakasz kapcsolódási helyén helyezkedik el. Úgy tervezünk, hogy az előállított polipeptidben bizonyos variáció jön létre a változó szakasz hoszszában vagy olymódon, hogy a változó szakasz C-terminális részén lévő aminosavak közül nem tartalmazza mindegyiket.

Megfelelő szoros hibridizációs körülmények között a restrikciós fragmens denaturált száljajhoz fölös mennyiségű DNS oligomert kapcsolunk. így a DNS oligomer specifikus lieteroduplexct alkota kódoló szál komplementer szakaszával, ugyanakkor egy vagy több stop kodon is létrejön a megfelelő C-terminális aminosav kifejeződésének terminálisa céljából.

A megfelelő szoros hibridizációs reakciót megfelelő időn át végezzük, majd megfelelő mennyiségben adagoljuk a négy dezoxi-nukleotidot a DNS polimeráz I Klenow-fragmensével együtt. A primer enzimatikus meghosszabbításával szintetizáljuk a változó szakasz kódoló száljára komplementer és bármely 5 -irányban húzódó szekvenciát, amiután olyan szekvenciát kapunk, amely komplementer árra a szálra nézve, amelyhez a DNS-szekvenciát, amely a szintetikus olígonukleotidhoz hibridizált szakaszhoz képest 3 -irányban helyezkedik el, a DNS polimeráz -5 -exonukleáz aktivitását felhasználva emésztjük. Így olyan kétszálú cDNS-t kapunk, amely specifikusan határozza meg a változó szakaszt és ellenkező irányú a könynyű és nehéz láncok túlnyomó szakaszaihoz képest. A nehéz és könnyű láncok mindegyike olyan kodont tartalmaz, amely a kifejeződést V-, D- vagy J-régiók előre meghatározott kodonja mellett megállítja.

Az előállított heteroduplex, tompa végű, kétszálú cDNS fragmenseket ezután felhasználjuk annak az egyébként homoduplex kétszálú cDNS előállítására, amely a megfelelő helyeken stop kodonokat tartalmaz és meghatározza a könnyű és nehéz változó szakaszokat.

Előnyösen úgy járunk el, hogy, vagy a fentiek szerint módosítjuk a tompa végű fragmenseket, például a változó szakasz szekvenicájában hiányzó restrikciós helyeket meghatározó linkerekhez kötjük, vagy végénél meghosszabbítjuk, például poliG vagy poliC szekvenciát kapcsolunk hozzá, de felhasználhatjuk beépítésre közvetlenül is. A restrikciós helyet tartalmazó linkerhez kötött fragmens megfelelő komplementer végekkel rendelkező vektor DNS-hez köthető, majd ezután adott esetben a kötőhelyek resktrikciós endonukleázos hasításával onnan visszanyerhető. A linkereket a tompa végű fragmensekhez megfelelő ligázzal, például T4 ligázzal kötjük, a kapott ligáit fragmenst pedig kohézív végű rövidebb fragmens előállítására restrikciós enzimmel kezeljük, a rövid fragmens egy vektor komplementer végeihez köthető.

Az előállított vektor DNS alkalmas amplifikálásra és a változó szakaszt meghatározó kódoló szekvenciát tartalmazó szakaszt hordozó transzformánsok izolálására. A szokszorosításra számtalan, baktériumban létező vektor molekula áll rendelkezésünkre, például a pBR322, pSCIOl, pRK290, 2 μ plazmid stb. A kohézív végekkel rendelkező rövidebb fragmens vektorhoz kötése után olyan hibrid plazmidot kapunk, amely a DNS oligomer által kialakult heteroduplex-et kivéve, ahol a DNS-szekvenciák hibásak, komplementer DNS-szekvenciákat tartalmaz. A hibás szekvenciákat tartalmazó hibrid plazmid a gazdasejtben replikálódik, amikor két különböző plazmid molekula jön létre, az egyik az eredeti szekvenciájú, a másik pedig a szintetikus DNS oligomer jelenléte miatt tailored (hasított) vagy site mutated (helyileg mutált). A Iranszformáns telepeket külön-külön 2 ml térfogatú tenyészetekben növesztjük, a plazntid DNS-t ismert módszerekkel izoláljuk és felhasználjuk egy második t transzformációs ciklusban a hasított szekvenciát replikáid kiónok előállítására. A kiónokat szűrő folthibridizációval választjuk ki, vagy jelzett szintetikus DNS oligonukleotiddal (például szintetikus DNS oligomert használunk a változó szakasz szekvenicájának váltpztatására) vizsgáljuk, vagy más előnyös módszerrel. Így olyan plazmidokat kapunk, amelyek kétszálú cDNS-e megfelelő restrikciós helyeket tartalmaz és előre meghatározott helyen stop kondonnal rendelkeznek.

Meghatározott a kódoló szál 3 -terminális vége (a C-terminális aminosavat írja le), majd meghatározottá válik a kódoló szál 5 -szakasza (ez a polipeptid N-terminális részét határozza meg). A két vég módosításának sorrendjét kényelmi szempontok határozzák meg, módosítható a két vég egyszerre, ekkor a kódoló szál 5-végén primer repairt, a 3’-végen pedig helyi mutációt végzünk.

Attól függően, hogy az a gazdasejt, ahol a kifejezés megtörténik, milyen természetű, és attól függően, hogy a gazdasejt mechanizmusa eltávolítja-e a vezető szekvenciát, miután a polipeptid szekretálását elősegítő szekretáló szignálként felismert, különböző stratégiát alkalmazunk. Ha a gazdasejt nem képes a fentiekre, úgy a vezető szekvenciát meghatározó DNS sza kaszt el kell távolítanunk és létre kell hoznunk a változó szakaszt meghatározó kódoló szál 5’-végén egy start kodor.t. Azután a rövidített szekvenciát kifejeződő vektorba építhetjük, mégpedig úgy, hogy egy előre meghatározott promoter és riboszomális starthely szabályozása alá kerüljön.

A vezető szekvencia szekvenciájára vagy a változó szakasz N-terminális részét meghatározó szekvenciára alapozva különböző homo- vagy heteroduplex képző oligonukleotidokat állíthatunk elő.

Ha a vezető szekvencia megmarad, a kódoló szál 5-eltérő szekvenicájának eltávolítására primer repairt használunk. Ha az. N-terminális primer repair a C-terminális mutagenezissel együtt történik, az oligonukleotiddal duplex kódoló szálat DNS polimerázzal kezeljük és a kapott részlegesen kétszálú DNS-t 5 -3’-’ -egyszálú exonukleázzal kezeljük Az 5’-eltérő szakaszok eltávolítására, majd ligázzal kezelve hozzákötjük a replikálódó szálat az N-terminális oligonukleotidhoz.

Ha eltávolítjuk a vezető szekvenciát, in vitro mutagenezissel alakítjuk ki a változó szakaszt meghatározó DNS-szekvencia N-terminális részén az iniciációs kódont (ATG az N-formil-metionin esetén).

Az előnyös kétszálú cDNS izolálására in vitro mutagenezis végzésére többféle módon járhatunk el. Ha a kódoló szekvenciától távoleső restrikciós helyei léteznek, a plazmidot a megfelelő restrikciós endo* ukleázzal emésztjük, majd az, emésztést kétszálú DNS-t hasító exonukleázzal, például Bal31-el folytatjuk. A kapott kétszálú cDNS klónozható és a megfelelő szekvencia szelektálható és módosítható, ahogy azt a fentiekben megadtuk. Ha a kódoló szál 5 -végén lévő nenf kódoló szakasz túl hosszú, ez endonukleázzal emészthető, ha megfelelő restrikciós hely lélezik, de végezhető az emésztés exonukleázzal is, például Bal31-el.

A fenti, a 3 -terminális vég módosítására használt eljárást megismételve a változó szakaszokat meghatározó DNS szekvencia 5 -terminális vége hasítható, jelen esetben az oligonukteotid komplementer a nem kódoló (nonsense) szállal, és az 5 -végen (pirmer repair) vagy az oligonukleotidban (in vitro mutagenezis) iniciációs kodont tartalmaz. Közönséges körülmények között is az oligonukleotid homoduplexet primer répámhoz, a bteroduplexeket in vitro inutagenezisre használjuk. így olyan hasított készálú cDNS-t kapunk, amely az immunglobulinok könnyű és nehéz láncainak változó szakaszát meghatározó, alkalmasan elhelyezkedő start és stop kodonokat tartalmaz. A kapott tompa végű kétszálú cDNS módosítható, például úgy, hogy linkereket kötünk hozzá kifejezhető vektorba való beépítést megengedő komplementer végek előállítására. A beépítés úgy történik, hogy a vektor megfelelő orientációban tartalmazza a beépített szakaszt a kétszálú cDNS-hez kapcsolt vagy a vektorban jelenlévő szabályozó szignálhoz képest.

Az előállított kétszálú cDNS-t kifejező vektroba építjük. A korábbi vektorokkal ellentétben, mivei ezek csak a kétszálú cDNS replikációját tették lehetővé, a jelen kísérleti stádiumban használt molekulának tartalmaznia kell a transzkripciós és transzlációs szabályozójeleket.

A megfelelő promotert és más transzkripciós szabályozó szignál-szekvenciákat, például operátort, attenuatort, aktivátort, tartalmazó vektort választunk. A vektort legalább részben szekvenálnunk kell ahhoz, hogy legalább egy beépülési helyet meghatározhassunk, ahova a változó régiókat meghatározó cDNS-t a szabályozó jelek kontrollja alá építhetjük be.

A transzkripciós szabályozó jelek mellett léteznek, ahogy azt már közöltük, transzlációs szabályozó jelek is, elsősorban a riboszóma kötőhely (Shine-Dalgarne-szekvencia, S-D) és az iniciációs kodon (formil-met kodon). Az S-D szekvenciának és az iniciációs kodonnak megfelelően kell elhelyezkednie, általában 3—12 bázispár távolságban. Az S-D szekvencia a vektorba egy beépülési helyhez képest megfelelő pozícióban lehet, de hozzá is kapcsolható a változó szakaszt meghatározó kódoló szevenciához, például az S-D-szekvenciát biztosító oligonukleotid lizálásával és egy megfelelő restrikciós hely létrehozásával az S-D-szekvenciát követően. Az S-D-szekvencia in vitro mutagenezissel is kialakítható, ahogy azt az előzőekben már megadtuk, A kódoló szekvencia leolvasási fázisban kell hogy legyen az iniciációs kodonnal.

A választott stratégia attól függ, hogy a kódoló szekvencia és az ezen kívüleső régiók tartalmaznak-e vagy sem restrikciós helyeket. Függ attól, hogy milyen vektor áll rendelkezésünkre a kétszálú cDNS-szekvencia beépítésére és a polipeptid változó szaka-81 száriak kifejezésére, függ a felhasználható kifejeződő vektor hozzáférhetőségétől, a jó kitermelést biztosító, az információt kifejező gazdasejttől és függ, hogy rendelkezünk-e olyan gazdasejttel, amely képes felismerni például a szekretálást biztosító jeleket, hogy biztosítható legyen a vezető szekvencia lebasítása. Így minden helyzetben és minden egyes idiotípus esetén meg kell állapítanunk a változó és ezen túlmenő régiókat meghatározó DNS-szekvencia legalább egy részének restrikciós térképet.

Ha a vektor végei és a beépítendő szekvencia végei hasonlóak, meg kell vizsgálnunk, hogy az adott szekvencia jó, azaz nem rossz orientációban épült be. A beépítést követően kapott klónozott plaznn'dok térképezésével kiválaszthatjuk azt a plazmidot, amely a változó szakaszt meghatározó szekvenciát megfelelő orientációban tartalmazza.

A fenti stratégia több fontos előnnyel jár. A polipeptid láncokat azonos szckvenicákat és azonos lánchosszúságú szálakat tartalmazó homogén készítményként kapjuk. Az rFv-t alkotó polipeptidek cukormentesek és ezért, további homogenitásuk,miatt egységesen jelezhetők vagy módosíthatók. így a terméket egységes és reprodukálható tulajdonságú anyagként kapjuk meg. A termék emlősnek megbízhatóan adagolható és viszonylag enyhe melléktüneteket vált ki, amelyek heterogén termek adagolásakor jelentkezhetnek.

Az alábbiakban az eljárás az oltalmi kör korlátozása nélkül, példában szemléltetjük.

A példában jellemző ligandként a dinitro-fenilt adjuk meg. A találmány szerinti eljárást természetesen bármely ligandra felhasználhatjuk, bár a szóba jövő idiotípusok nagy száma miatt az eljárás bizonyos szakaszait egy adott restrikciós hely vagy más jellemzők miatt részben módosítanunk kell.

Példa

A dinitro-fenil (DNP) monoklónozott antitestjeinek előállítása

10,5 pH-jú vizes pufféiban 10 mM 2,4-dinitro-benzol-szulfonátot oldunk (lásd Eisen és munkatársai, J.A.C.S., 75,4583, 1953) és az oldathoz 0,01 mM hemocianint adunk, majd 20 órán át szobahőmérsékleten rázzuk az elegyet. Ezt követően 0,6 M nátrium-klorid oldattal szemben többször dializáljuk, az oldatot és a maradékot immunizálásra elkülönítjük.

100 pg így előállított DNP immunogént 0,1 ml komplett vagy inkotnplett Freund-adjuvánssal és 0,1 ml per dózis mennyiségű PEs-sel (polietilén-nátrium-szulfonát) keverjük. Hat BALB/c egeret injektálunk egy-egy dózissal, hetenkénti adagolással, az injekciókat intraperitoneálisan és szubkután adjuk a talpba és az inguinális területre. Az első injekciót komplett, a többi hármat inkomplett Freund-adjuvánssal adjuk. Az utolsó injekciót követő harmadik napon leöljük az egereket, izoláljuk a lépet és monoklónozott antitestek képzésére használjuk fel.

A fúziót úgy végezzük, hogy 3xl0⁷ Sp2/O-Agl4 mileloina sejtet (Shulman és munkatársai, Natúré, 276, 269-270, 1978) és 5x10⁷ lépsejtet egyesítünk és a sejt szuszpenziót 5 percen át 200 g-n centrifugáljuk, majd óvatosan 0,6 ml 50%-os polietilén-glikol 1500 oklatban (az. oldatot Dulbecco módosított Eagle-táptalajával készítjük, Elow) újra szuszpendáljuk. 1 perc múlva 20 ml, 37 C hőmérsékletű R táptalaj adunk (RPMI 1640 táptalaj, Gibco, amit 30 mM Hepes oldattal, Flow, egészítünk ki). Centrifugáljuk a sejteket és 20 ml R táptalajban szuszpendáljuk, amit előzőleg 10% borjú szérummal (Gibco) (RF táptalaj) egészítünk ki. 0,2 0,2 ml sejtszuszpenziót 0,8 ml RF táptalajt tartalmazó, 200 db csövecskébe mérünk. 100 db csövecske 2x10’ egér peritoneális sejtet is tartalmaz. 24 órán át inkubáljuk a sejteket, majd mindegyik csövecskébe 1 ml, HAT táptalajjal kiegészített RF táptalajt mérünk. Minden 2-3. napon I ml táptalajt friss RPGAT táptalajjal cserélünk ki. Két hét múlva a növekvő sejteket immunglobulin termelésre vizsgáljuk, a vizsgálatot ”S-2,4-dinitro-fenil-szulfonamíd-lizinnel végez.zük. A sepcifíkus aktivitást adó kiónokat lágyagaron klónozzuk anti-DNP előállítására.

Eljárhatunk Herzenberg és munkatársai módszere szerint is (J. Exp. Med., 151. 1071-1087, 1980). E szerint a DNP-szubs/.tituált marha szérum albumint RIA hígítóval (1% BSA, 0,005 M EDTA és 0,1% NaN₃ 7,6 plf-jú l’BS-ben) adagolunk a mikrolemez csövecskéibe, és 1 órán át inkubáljuk a lemezt, majd vizsgálandó és standard antiszérumot adunk a csövecskékhez, megfelelő hígítás után (20 μΙ/cső) és I órán át folytatjuk az inkubálást. Háromszor RIA hígítóval mossuk a lemezeket, majd ^{1 25}1-jelzett anti-egér immunglobulint adagolunk 2x10’ cpm/cső mennyiségben és I órán át inkubálunk. Ezután háromszor RIA hígítóval mossuk a lemezeket, szárítjuk és autoradiografiát végzünk.

Az antitestek detektálására mindkét fenti módszer jól ismert. Ezután klónozzuk a sejteket, vagy hígítást követően vagy' lágyagaron és a klónozott sejtvonalakat szaporítjuk és folyékony nitrogén alatt fagyaszlva tároljuk felhasználásig.

Egy liter tenyészetet készítünk egy pozitív klónozott sejt vonalból, a tenyészet milliliterenként lxlO⁶ sejtet tartalmaz. Centrifugálással összegyűjtjük a sejteket, majd 1 g-ot 16 ml guanidium-tiocianát törzsoldatban (4 M, 50 g guanidium-tiocianát, 0,5 g nátrium-N-lauril-szarkozinát, 2,5 ml 1M nátrium-citrát, pH 7,0, 0,7 ml 2-merkapto-etanol és 0,5 ntl 30%-os Antifoam A (Sigma) keverése után az oldatot 100 ml-re töltjük fel) szuszpendálunk, a szuszpenziót 55 ml-es Potter-Elvehjen homogenizátorba töltjük és 30 60 másodpercen át homogenizáljuk teljes fordulatszámon, 18 mm átmérőjű Tissumizer homogenizálóban (Tekmar-Industries). A kapott homogenizátumot 10 percen át percenkénti 8000-es fordulattal centrifugáljuk, 10 °C hőmérsékleten Sorval HB4 lengő rotorban. A felülúszót lombikba töltjük, 0,024 térfogat (a homogenizáló puffer eredeti térfogatára számítva) I M ecetsawal keverjük a 7-es pH 5-re csökkentésére, majd 0,75 térfogat vízmentes etanolt adagolunk. Lezárjuk a lombikot és erőteljesen rázzuk, majd egy éjszakán át -20 °C hőmérsékleten tároljuk. Ezután 10 percen át -10 °C hőmérsékleten 6000 fordulatszám/perccel centrifugáljuk HB4 rotorban a termék elkülönítésére.

A csapadékot elkülönítjük és erőteljes rázás közben 0,5 térfogat pufferolt guanidin-hidrogén-klorid törzsoldatban (⁷,5 M, semlegesített, majd 0,25 térfogat 1 M nátrium-citráttal pufferolt oldat, pH 7,0, 5 mM ditio-treitol) szuszpendáljuk. 68 °C hőmérsékletű vízfürdőben rövid időn át melegítjük a szusz.pcnziót, amikor diszperziót kapunk. 0,025 térfogat (gua-91 nidín-liidrogén-kloridra számítva), 0,5 térfogat etanolban oldott 1M ecetsav oldattal kicsapjuk a csapadékot. legalább három órán át -20 C hőmérsékleten tartjuk a szuszpenziót, majd centrifugáljuk. A csapadékot guanidin-hidrogén-kloridban szuszpendáljuk és fentieket megismételve újra kicsapjuk. Az ismételten kivált csapadékot percenként 6Ó00-szer forduló rotorban 5 percen át centrifugáljuk, majd ezután mindent steril körülmények között végzünk.

A végső csapadékot szobahőmérsékleten etanolban diszpergáljuk, a fölös guanidin-hidrogén-klorid eltávolítására extraháljuk, majd 5 percen át 6000 fordulattal centrifugáljuk. Az etanolt nitrogénáramban desztilláljuk és az RNS üledéket erőteljes rázás közben vízben oldjuk. 10 percen át 10 °C hőmérsékleten 13 000 percenkénti fordulatszám mellett centrifugálunk, az RNS-t tartalmazó felülúszót dekantáljuk. Az RNS-teljes extrakciójára kétszer 0,5 ml steril vízzel újra extraháljuk az oldhatatlan anyagot, az extraktumot 10 percen át 10 °C hőmérsékleten percenkénti 130 000 fordulatszámú rotorban centrifugáljuk és egyesítjük a vizes oldatokat. Ezt 0,1 térfogat pH5-ös, mólos kálium-acetát/ecetsav pufferral és 2 térfogat etanollal keverjük, és egy éjszakán át -20 °C hőmérsékleten állni hagyjuk.

Centrifugálással elkülönítjük az RNS-t az etanolos szuszpenzióból, a centrifugálást 20 000 fordulat/perc fordulatszámú rotorban végezzük 20 percen át -10 C hőmérsékleten, Corcx csövekben (HB4 rotor). A csapadékot 95%-os etanollal erőteljesen mossuk, nitrogénáraniban szárítjuk, és 1 ml/g sejt mennyiségű, 10 mM trisz-puffert, pH 7,5, IniM EDTA-t és 0,2% SDSt tartalmazó elegyben oldjuk. Az RNS oldódása után 1)9 térfogat 5 mólos nátrium-kloridot adagolunk és az oldatot oligo-(dT)-oszk)pra (0,5 g száraz súly,T3 grade, Collaborative Research) öntjük. Az oszlopot az alábbi összetételű eleggyel erőteljesen mossuk, 0,5 M nátrium-klorid, 10 mM trisz, ImM EDTA, pH 7,5, 0,2% SDS, majd a mosás után 10 mM trisz, ImM EDTA, pH 7,5 és 0,05% SDS eleggyel eluáljuk. Az eluációt λ 260-on hullámhosszon ellenőrizzük. Az UV-elnyelő frakciókat összegyűjtiük és ecetsav-nátrium-acetát, pH 5, puffer és 2,5 térfogat etanol adagolá sával kicsapjuk. A szárított üledéket 50μ1/1 térfogat 10 mM trisz, pH 7,5, I mM EDTA elegyben oldjuk és 9 térfogat dimetil-szulfoxidot adagolunk, majd közvetlenül ezután 1 térfogat pufferezett 1 mólos lítium-klorid oldatot (1 M lítium-klorid, 50 mM EDTA, 2,0% SDS, 10 mM trisz, pH 6,5). Az oldatot 5 percen át 55 C hőmérsékleten tartjuk, 100 térfogat kötő puffért adagolunk hozzá, majd oligo-dT-cellulóz oszlopra öntjük, amit kötő pufferral (0,5 M nátrium-klorid 10 mM trisz, 1 mM EDTA, 0,2% SDS) egyensúlyoztuk ki. Az eluálást az előzőkben megadottak szerint végezzük.

A monoklónozott immunglobulin polipeptídek könnyű és nehéz láncait meghatározó mRNS jelenlétét hibrid szelekcióval bizonyítjuk, a megfelelő nehéz és könnyű láncokat leíró gének (lásd Early és Hood, Genetic Engineering, 3. kötet, 1981, Setlow és llollander, Plenum Publishing Corp., 157-188. oldal) DNS kiónjait használva. A DNS próbákat a közölt aminosav- vagy DNS-szekvcnciák alapján szintézissel állítjuk elő, vagy más forrásból nyerjük (lásd Early és Hood, mint fent). A DNS próbákat denaturáljuk, semlegesítjük és nitrocellulóz szűrőpapírhoz kötjük.

(Schleicher és Schnell BA-85-R 597) a Southern féle módszert használva (J. Mól. Biok, 98, 503-517,1975). A kísérletet 10-szer tömény standard cítráttal végezzük (lásd még a 4 302 204 számú amerikai egyesült íllamokbeli leírást). A próbákat 30 pg mRNS-hez hibidizáljuk 100 μ\ végtérfogatú reakcióelegyben 50 °C hőmérsékleten, 2 órán át. A reakcióelegy összetétele; 65% forinamid/10 mM puffer, pH 6,4,0,4 M nátriumklorid. 10 másodpercig microfugában centrifugáljuk a reakcióelegyet, vortexeljük, ismét centrifugáljuk, majd gyengén vortexeljük a szűrőpapírok szuszpendáására. 1 órán át gyenge keverés közben 50 °C hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet. Ezután az oldatot eltávolítjuk, a szűrőket tíz.szer 1 ml alábbi összetételű eleggyel mossuk: 0,15 M nátrium-klorid, 0,15 in nátrium-citrát, 0,5% nátrium-dodexilszulfát. A mosópuffer hőmérsékletét 60 °C-on tartjuk. A mosófolyadékok adagolása közben több másodpercen át vortexeljük a csöveket. Ezután kétszer 10 tnM trisz, pH 7,8 és 2 mM EDTA elegyének 1 ml-vel mossuk a szűrőket, majd 5 percen át 60 °C hőmérsékleten inkubáljuk, és levegőztetéssel eltávolítjuk az oldatot.

Az RNS-DNS hibridről az RNS-t úgy eluáljuk, hogy a szűrőket 60 másodpercen át 300 pl kétszer desztillált, steril vízben forraljuk, majd metanol-száraz jég fürdőben gyorsan fagyasztjuk. Jégen felolvasztjuk az oldatot, az RNS-t tartalmazó vizet egy másik csőbe juttatjuk, 0,2 M végkoncentrációban nátrium-acetátot adagolunk és 20 pg borjú thymus tRNS-t adagolunk. 2,5 térfogat etanollal -20 °C hőmérsékleten kicsapjuk az RNS-t és közvetlenül transzláció előtt I 2 000 g-n 10 percig, 4 °C hőmérsékleten centrifugálva üllepítj ik. Az üledéket kétszer 70%-os etanollal mossuk, riajd csökkentett nyomáson szárítjuk.

Az eluált RNS-t in vitro transzlatáljuk nyúl retikulocita sejtmentes lizátumban, például a New England Nuclear transzlációs rendszert használva, ámultán a rendszerhez adott melléklet szerint detektáljuk a protein szintézist.

Monoklónozott antitestekkel alikvot mintákat inkubálunk, úgy, hogy az in vitro transzlációs lizátumban lévő kifejeződő termék feleslegben legyen jelen. Az antitest-antigén komplexet rögzített S. aureus-szal kicsapjuk és háromszor pH 8,3, 0,05 M triszt, 0,45 M nátrium-kloridot és 0,5% NP40-t tartalmazó eleggyel mossuk a csapadékot, 0,01 mólos nátrium-foszfát pufferben (pH 7,5) forraljuk, a pufferhez előzőleg 1% β merkapto-etanolt adunk. A mosás után 5-20%-os g adiens SDS-poliakril-amid gélen elektroforézist végzünk 125 V feszültségen, mindaddig, míg a brómfen )lkék jel eléri a gél végét és plusz 1 órát. Szárítjuk a gélt, fixáljuk és az immunoglobulin könnyű és nehéz láncait meghatározó mRNS kimutatására Kodak X-R filmet használva fotózzuk, Az így kapott mRNS keverékkel Okayaina és Berg mószerét (Molecular and Cellular Biology, 1982 február, 161-170. oldal) használva kétszálú cDNS sorozatot állítunk elő. Először megadjuk a vektor primer és az oligo-dG-t tartalmazó linker DNS előállításának módját.

400 pg pBR322-SV40 (térképegység 0,71-0,86) DNS-t az alábbi összetételű, 0,4 ml térfogatú reakcióelegyben, 37 °C hőmérsékleten 700 egység KpnI endonukleázzal kezelünk: 5 nrM trisz-hidrogén-klorid, pH 7,5, 6 mM magnézium-klorid, 6 mM nátrium-klorid, 6 mM 2-merkamo-etanol és 0,1 mg/ml marha szérum albumin (BSA). 5 órás kezelést követően 40 pl

-101

0,25 mólos EDTA (pH 8,0) és 20 μ) 10%-os SDS adagolásával leállítjuk a reakciót, A protein eltávolítására vízzel telített fenol és kloroform (1 :l) eleggyel extraháljuk az oldatot, majd etanollal kicsapjuk a DNS-t.

A KpnI endonukleázzal előállított végekhez 60, de nem több, mint 80 dT-csoportot kapcsolunk (végenként) borjú thymus terminális dezoxi-nukleotidil-transzferázzal. Ögy járunk el, hogy 0,2 ml reakcióelegy előállítására 140 mM nátrium-kakodilátot 30 mM trisz-hidrogén-kloridot (pH 6,8), 1 mM kalcium-klorídot, 0,1 nrM ditio-treitolt, 0,25 mM DTTP-t, KpnI endonukleázzal emésztett DNS-t és 400 egység terminális dezoxi-nukleotidil-transzferázt tartalmazó oldatot készítünk. 30 percen át 37 C hőmérsékleten végezzük a reakciót, majd 20 μΐ 0,25 inólos.EDTA (pH 8,0) és 10 μΐ 10%-os SDS adagolásával leállítjuk, a DNS-t pedig fenol és kloroform 1:1 arányú elegyéve] végzett extrakciókat követően etanollal kicsapjuk. 17 egység Hpal endonukleázzal emésztjük az izolált DNS-t, az emésztést 0,2 ml, 10 mM trisz-hidiogénkloridot (pH 7,4), 10 mM magnézium-kloridot, 20 mM kálium-kloridot, I mM ditio-treitolt és milliliterenként 0,1 mg BSA-t tartalmazó reakcióelegyben végezzük 5 órán át, 37 °C hőmérsékleten.

A pBR322 DNS replikációs origóját és az ampicillin rezisztenciát meghatározó gént tartalmazó nagy DN*^ fragmens 1% agarózt tartalmazó gélen elektroforézist végezve tisztítjuk, a gélről Vogeistein és Gillespie (PNAS USA, 76, 615-619, 1979) üvegporos módszerének módosított változatával izoláljuk a DNS-t.

A dT-végű DNS-t oligo-dA-cellulóz oszlopra adszorbeálva és eluálva az alábbiak szerint tovább tisztítjuk: a DNS-t 1 mM EDTA-t és 1 M nátrium-kloridot tartalmazó 10 mM-os trisz-hidrogén-klorid (pH 7,3) pufferben oldjuk, 0 C hőmérsékletre hú'tjük, és 0,6x2,5 cm méretű, 0 °C hőmérsékleten hasonló pufféira] kiegyensúlyozott oligo-dA-cellulóz oszlopra öntjük az oldatot. 0 °C-on hasonló pufferral mossuk az oszlopot és szobahőmérsékleten vízzel eluáljuk, A 14 μg-nyi eluált DNS-t etanollal kicsapjuk és 10 mM trisz-hidrogén-klorid (pH 7,3 és 1 mM EDTA elegyének 100 μΙ-ében oldjuk.

Az oligo-dG-végű linker DNS előállítására 100 Mg pBE322-SV40 (térképegység 0,19-0,32) DNS-t 120 egység PstI endonukleázzal emésztünk 0,2 ml alábbi Összetételű reakcióelegyben: 6 mM trisz-hidrogén-klorid (pH 7,4), 6 mM magnézium-klorid, 6 mM 2-merkapto-etanol, 50 mM nátrium-klorid és 0,1 mg/ml NSA. A reakciót 1,5 órán át 37 °C hőmérsékleten végezzük, majd a reakcióelegyet fenol és kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk és a DNS-t alkohollal kicsapjuk. Ezt követően a végekhez 10-15 dG-csoporiot kapcsolunk 50 μΐ az előzőekben megadott öszszetételű, de a dTTP helyett 0,1 mM dGTP-t tartalmazó reakcióelegyben 60 egység terminális dezoxi-nukleotidil-transzferázzal. A reakciót 20 percen át 37 °C hőmérsékleten végezzük, majd fenol és kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk az elegyet, a DNS-t etanollal kicsapjuk és 50 μΐ, alábbi összetételű reakcióelegyben 50 egység Hind III endonukleázzal hasítjuk 20 mM trisz-hidrogén-klorid (pH 7,4), 7 mM magnézium-kloríd, 60 mM nátrium-klorid és 0,1 mg/ml BSA. A kisméretű, oligo-dT-végű linker DNS-t 1,8% agarózt tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítjuk és az előzőekben megadottak szerint izoláljuk.

Előállítjuk az alábbi reakcióelegyet (térfogata μΐ 50 mM Trisz-hidrogén-klorid (pH 8,3), 8 mM magnézium-klorid, 30 mM kálium-klorid, 0,3 mM ditio-treitol, 2 mM DATP, dTTP, dGTTP és P³³-dCTP (850 beütés/perc/pmol), 0,2 Mg rnRNS (körülbelül 2-3 szoros feleslegben a primer végekhez, képest), 1,4 Mg vektor primer DNS (0,7 pmol primer vég) és 5 egység reverz transzkriptáz. (A poliA rnRNS mólaránya a vektor primer DNS-re számítva 1,5:1 és 3:1 közötti).

A cDNS szintézisét a reverz transzkriptáz adagolásával indítjuk meg és 37 °C-on 20 percen át folytatjuk. Ekkor a dCTP beépülés csökken és a primer több. mint 60%-a felhasználódott a cDNS szintéziséhez. 1 μΙ 0,25 M EDTA (pH 8,0) és 0,5 μ], 10%-os SDS adagolásával leállítjuk a reakciót, az elegyet fenol és kloroform 1 :l arányú elegyével vortexeljük, majd centrifugáljuk. A vizes fázishoz 10 μΐ 4 M ammónium-acetátot és 40 μΙ etanolt adunk, száraz jég között 15 percen át hűtjük, a hűtés közben kivált nem reagált dezoxi-nuklcozid-triofoszfátok oldására enyhén rázzuk, majd Eppcndorf mikrofugában 10 percen át centrifugáljuk. A csapadékot 10 mM trisz-hidrogén-kloridot (pH 7,3) és 1 mM EDTA-t tartalmazó elegy 10 μΙ-ében oldjuk, az oldathoz 10 μΐ 4 mólos ammónium-acetát oldatot keverünk és 40 μΐ etanollal újra kicsapjuk, majd etanollal mossuk a csapadékot.

Λ cDNS: mRNS plazmidot tartalmazó csapadékot 15 μΐ, 1 mM koball-kloridot, 0,1 mM ditio-treitolt, 0,2 Mg poli-A-t, 66 μΜ P^3í-dCTP-I (600 beütés/percpmól) és 18 egység terminális dezoxi-nukleotidil-t -transzferázt tartalmazó 6,8 pH-jú 140 mM nátrium-kakodiiát-30 mM trisz-hidrogén-klorid elegyben oldjuk. A reakciót 37 °C hőmérsékleten végezzük 5 perc át, amikor 10 15 dCMP kötődik a molekulák végéhez. A reakciót 1,5 μΙ 0,25 M EDTA (pH 8,0) és 0,75 μΙ 10%-os SDS adagolásával állítjuk le. 15 μΐ fenol-kloroform eleggyel (1:1) extraháljuk az elegyet, és 15 μΐ 4 M-os ammónium-acetáttal keverjük, majd 60 μΐ etanollal kicsapjuk, és ismételten kicsapjuk, és végül a csapadékot etanollal mossuk.

A csapadékot 20 mM trisz-hidrogén-kloridot (pH 7,4), 7 mM magnézium-kloridot, 60 mM nátrium-kloridot és 0,1 mg/ml BSA-t tartalmazó, 10 μΐ térfogatú pufferban oldjuk, majd 2,5 egység HindllI endonukleázzal emésztjük 37 °C hőmérsékleten, 1 órán át. 1 μΐ 0,25 M EDTA (pH 8,0) és 0,5 μΐ 10%-os SDS adagolásával leállítjuk a reakciót, majd fenol és kloroform-acetátot adagolunk és a DNS-t 40 μΐ etanollal kicsapjuk. A csapadékot etanollal mossuk és 10 mM trisz-hidrogén-kloridot (pH 7,3) és 1 mM EDTA-t tartalmazó elegy 10 μΙ-ében oldjuk, végül 3 μΙ etanolt adunk hozzá, hogy -20 “C hőmérsékleten tárolva ne fagyjon meg.

0,02 pmól (1 μΙ) HindllI endonuklezázzal emésztett oligo-dC-végű cDNS: mRNS plazmidot 10 μΐ, alábbi összetételű elegyben inkubálunk 2 percig, 65 °C-on: 10 mM trisz-hidrogén-klorid (pH 7,5), I mM EDTA, 0,1 M nátrium-klorid és 0,04 pmól oligo-dG-végű linker DNS (ez a mennyiség egyszeres moláris felesleget jelent a kétszálú cDNS. mRNS-re és a HindllI endonuklezázzal való fentiek szerinti emésztést követően kapott fragmensre számítva). Az ínkubálást 30 percen át 42 °C hőmérsékleten folytatjuk, majd 0 °C-ra hűtjük. 10 μΐ elegyhez annyi alábbi öszszetételű elegyet adunk, hogy térfogata 100 μΐ legyen: 20 mM trisz-hidrogén-klorid (pH 7,5), 4 mM magnéziumklorid, 10 mM ammónium-szulfát, 0,1 M kálium11

-111

196.842

-klorid, 50 Mg/ml BSA és 0,1 mM β-NAD. Az elegyhez 0,6 gg E. coli DNS-ligázt adunk és egy éjszakán át 12 °C hőmérsékleten inkubálunk.

A kétszálú cNDS; mRNS szálának kicserélésére a ligációs elegyhez 40 -40 μΜ-t adunk a négy dezoxi-nukleitid-trifoszfátból, továbbá 0,15 mM β-NAD-ot, 0,4 Mg további E.coli DNS-ligázt, 0,3 Mg E. coli DNS-polimeráz I-et és 1 egység E. coli RNáz H-t adagolunk. A 140 Ml térfogatú reakcióelegyet 12 °C-on, majd szobahőmérsékleten inkubáljuk 1-1 órán át, amikor létrejön a repair szintézis éa a Poli katalizált nick-transzláció. A reakciót 0,9 ml hideg, 10 mM-os trisz-hidrogén-klorid (pH 7,3) adagolásával leállítjuk és 0,1 ml alikvótokat tárolunk 0 C hőmérsékleten.

A transzformációt Cohen és munkatársai által leírt (PNAS USA, 69, 2110-2114, 1972) némileg módosított módszerét használva végezzük el. Az E. coli KI 2 HB101 törzset 37 °C hőmérsékleten növesztjük 20 ml standard L-táptalajban. A növesztést addig folytatjuk, míg λ 600 hullámhosszon az 0DÖ,5. Centrifugálással összegyűjtjük a sejteket, 10 ml, 50 mM kalcium-kloridot tartalmazó 10 mM-os trisz-hidrogén-kloridban (pH 7,3) szuszpendáljuk és 5 percen át 0 °C hőmérsékleten centrifugáljuk. A sejteket 2 ml fenti összetételű pufferban szuszpendáljuk és 5 percen át 0 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután 0,2 ml sejtszuszpenziót 0,1 ml DNS- oldattal keverünk, és 15 percen át 0 °C hőmérsékleten inkubálunk. 2 percig 37 °C, majd 10 percen át szobahőmérsékleten tartjuk a szuszpenziót, majd 0,5 ml standard L-táptalajt adagolunk hozzá, 30 percen át 37 °C-on inkubálunk és ezt követően 50 Mg/ml ampicillint tartalmazó agarlemezeken lévő nitrocellulóz szűrőkre szélesztjük. 1224 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubálunk, majd az E.coli transzformánsokat Grunstein és Hognessin situ telephibridizációs módszerével megvizsgáljuk, tartalmaznak-e könnyű és nehéz láncot meghatározó cDNS-t. A három replika nitrocellulóz szűrőkorongon többezer transzformáns nő, ezeket lúggal iizáljuk, és az előzőekben megadottak szerint próbákkal hibridizáljuk az immunglobulin láncok nehéz és könnyű szakaszainak konstans régióit keresve. Az immunglobulin könnyű és nehéz láncait meghatározó géneket tartalmazó kiónokat azonosítjuk. A pozitív hibridizációs jelet adó telepeket egy liter, 50 pg/ml amplicillint tartalmazó L-táptalajban tenyésztjük és a plazmid DNS-t ismert módon izoláljuk (Gunsalus és munkatársai, J. Bact., 140, 106-113, 1979).

Az előzőekben megadottak szerint eljárva lizáljuk 'θ a sejteket, a lizátumot centrifugáljuk és a tiszta oldatot azonos térfogatú vízzel hígítjuk. Milliliterenként 50 /rg RNáz A-t adagolunk, majd egy órán át 37 °C hőmérsékleten inkubálunk. Ezután 0,3 térfogat, TE-pufferral (10 mM trisz-hidrogén-klorid, pH 7,9 1 c mM EDTA) telített fenollal extraháljuk az oldatot, majd 4 °C hőmérsékleten 10 percen át 16 0000 g-n centrifugáljuk. A vizes fázist elkülönítjük, 1 M végkoncentrációra nátrium-kloriddal egészítjük ki és 2 térfogat etanollal kicsapjuk a DNS-t. Több órán át -20 't'-on tartjuk a szuszpenziót, majd 10 000 g-n,

4 °C hőmérsékleten 20 percen át centrifugálva elkülönítjük a kivált DNS-t.

A cDNS kiónokat restrikciós enzimekkel térképezzük, illetve szekvencia-analízist végzünk ismert módszerekkel. A kapott restrikciós térkép segítségével a változó szakaszokat meghatározó cDNS olymódon manipulálható, hogy az klónozható és kifejezhető lesz. A fentiekhez Maxam és Gilbert (Methods Enzymol., 65, 499-560, 1980), illetve Sanger ésmunkatársai, (J. Mól. Bioi., 143, 161-178, 1980) módszereit használjuk a könnyű és nehéz láncok teljes változó régióit és a vezető szekvenciákat meghatározó cDNS klónokat.

Izoláljuk, szekvenáljuk és manipuláljuk például a MOPC41 K-láncát (könnyű lánc) és a myeloma S107 nehéz láncát.

Az alábbiakban megadjuk a MOPC41-K-láncának 35 szekvenciáját, ahol a vezetőt, a változó régiót és konstans szakaszt pontokkal választottuk el. A konstans szakasznak csak az első tizenhat aminosavát jelöljük (Natúré, 280, 370-375, 1979, {Jeidman és munkatársai).

Met ASP Met Alá Pro Alá ATG GAC AGG GCT CCT GCA

TCA GGA CTC AGC

Gin	He	Phe	Gly	Phe
CAG ATT	TTT	GGC TTC
Thr	Arg	Cys		Asp
ACC	AGA TGT		GAC
Ser	Ser	Leu	Ser	Alá
TCC	TCC	TTA	TCT	GCC
Leu	Thr	Cys	Arg	Alá
CTC	ACT	TGT	CGG	CCA
Leu	Asn	Trp	Leu	Gin
TTA	AAC TGG CTT	CAG
Lys	Arg	Leu	Ile	Tyr
AAA CGC CTG	ATC	TAC

Gly Val Pro Lys Arg GGT GTC CCC AAA AGT

Leu	Leu	Leu	Leu	Phe	Gin	Gly
TTG	TTG	CTC	TTG	TTT	CAA GGT
Ile	Gin	Met	Thr	Gin	Ser	Pro
ATC	CAG	ATG	ACC	CAG	TCT	CCA
Ser	Leu	Gly	Glu	Arg	Val	Ser
TCT	CTG	GGA GAA AGA GTC	AGT
Ser	Gin	Asp	Ile	Gly	Ser	Ser
AGT	CAG	GAC	ATT	GGT AGT AGC
Gin	Glu	Pro	Asp	Gly	Thr	Ile
GAG GAA CCA	GAT GGA ACT	ATT
Alá	Thr	Ser	Ser	Leu	Asp	Ger
GCC	ACA TCC	AGT TTA GAT TCT

Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly TTC AGT GGC AGT AGG TCT GGG

-121

196.842

Ser	Asp	Tyr	Ser	Leu	Thr	Ile	Ser	Ser	Leu	Glu	Ser
TCA	GAT	TAT	TCT	CTC	ACC	ATC	AGC	AGC	CTT	GAG	TCT
Glu	ASp	Phe	Val	Asp	Tyr	Tyr	Cys	Leu	Gin	Tyr	Alá
GAA	GAT	TTT	GTA	GAC	TAT	TAC	TGT	CTA	CAA	TAT	GCT
Ser	Ser	Pro	Trp	The	Phe	Gly	Gly	Gly	Thr	Lys	Leu
AGT	TCT	CCG	TGG	AGG	TTC	GGT	GGA	GGC	ACC	AAG	CTG
Glu	Ile	Lys	Arg		Alá	Asp	Alá	Alá	Pro	Thr	Val
GAA	ATC	AAA	CGT		GCT	GAT	GCT	GCA	CCA	ACT	GTA
Ser	Ile	Phe	Pro	Pro	Ser	Ser	Glu	Gin
TCC	ATC	TTC	CCA	CCA	TCC	AGT	GAG	CAG

Az alábbiakban a myeloma S107 nehéz lánc változó régiójának nukleotid-szekvenciáját adjuk meg, ahol pontokkal választjuk el a vezető-szekvenciát, a változó és állandó régiót. A konstans szakasznak csak az első kilenc aminosavát adjuk meg (Early és munkatársai., Cell, 19, 981-992,1980).

Met ATG

Lys AAG

Leu TTG

tJg

Leu TTA

Asn AAC

Trp TGG

Val GTT

Phe TTT

Leu CTT

Leu TTA

Thr ACA

Leu CTT

Leu

His

Gly

Ile

Gin

Cys

Glu

Val

Lys

Leu

Val

Glu

TTA

CAT

GGT

ATC

CAG

TGT

GAG GTG

AAG CTG

GTG

GAA

Ser

Gly

Gly

Gly GÓC

Leu

Val

Gin

Pro

Glv

Gly

Ser

Leu

Arg

TCT

GGA GGA

TTG

GTA

CAG

CCT

GGG GGT TCT

CTG

AGA

Leu

Ser

Cys

Alá

Thr

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Asp

Phe

CTC

TCC

TGT GCA ACT

TCT

GGG TTC

ACC

TTC

AGT GAC

TTC

Tyr

Met

Glu

Trp

Val

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys

Arg

Leu

TAC

ATG GAG TGG

GTC

CGC

CAG

CCT

CCA

GGG AAG AGA CTG

Glu

Trp

Ile

Alá

Alá

Ser

Arg

Asn

Lys

Alá

Asn

Asp

Tyr

GAG TGG

ATT

GCT

GCA

AGT

AGA AAC

AAA GCT

AAT

GAT TAT ✓

Thr

Thr

Glu

Tyr

Ser

Alá

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Ile

ACA ACA GAG TAC

AGT GCA TCT

GTG

AAG GGT CGG

TTC

ATC

Val

Set

Arg

Asp

Thr

Ser

Gin

Ser

Ile

Leu

Tyr

Leu

Gin

GTC

TCC

AGA GAC ACT

TCC

CAA

AGC

ATC

CTC

TAC

CTT

CAG

Met

Asn

Alá

Leu

Arg

Alá

Glu

Asp

Thr

Alá

Ile

Tyr

Tyr

ATG

AAT GCC

CTG

AGA GCT

GAG

GAC ACT

GCC

ATT

TAT

TAC

Cys

Alá

Arg

Asp

Tyr

Tyr

Gly

Ser

Ser

Tyr

Trp

Tyr

Phe

TGT

GCA AGA GAT

TAC

TAC

GGT AGT

AGC TAC

TGG

TAC

TTC

Asp

Val

Trp

Gly

Alá

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

GAT GTC

TGG GGC GCA GGG ACC

ACG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

Alá

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Thr

Val

Tyr

GCC

AAA ACG ACA CCC

CCA

TCT

GTC

TAT

-131

196.842

A DNS-szekveneia és a restrikciós térkép alapján megállapítható, hogy PstI helyek találhatók a kódoló szál -110. bázispárja mellett és a könnyű láncot meghatározó cDNS terminációs helyétől lefelé haladva, ugyanakkor felhasználható HindlII restrikciós helyek helyezkednek el a nehéz láncot meghatározó szál vezető szekvenciájától felfelé és terminációs kodontól lefelé haladva. A könnyű és nehéz lánc változó régióit meghatározó kódoló szál és a vezető szekvenciák nem tartalmaznak a fenti endonukleázok által felismerhető helyet.

Az izolált plazmid dezoxi-ribonukleinsavakat a gyártó utasításai szerint a megfelelő restrikciós endonukleázokkal emésztjük és a kapott fragmenseket 2%-os agaróz gélen (Seakem, 15 cm x 15 cmx0,2 cm) 100 V feszültségkülönbséggel 2 órán át elektroforézissel tisztítjuk. Kontrollokat használva megállapítjuk az egyes csíkok molekulasúlyát és kivágjuk a gélből. A gélcsíkokat 1,5 ml-es Eppendorf-csövekbe helyezzük, gyorsan fagyasztjuk száraz jég-alkoholos fürdőben, majd kétszer felolvasztjuk. Ezután percenként 15000et forduló Eppendorf centrifugában centrifugáljuk és a felülúszót elkülönítjük. A DNS denaturálására 6xSSC-ben forraljuk a felülúszót, amikor egyszálú DNS-t kapunk. Ezt 0 °C-ra hűtjük.

A DNS-szekvencia alapján olyan DNS-oligomert készítünk, amely legalább részben komplementer a könnyű és nehéz lánc változó szakaszinak megfelelő nem kódoló (antisense) száljainak rövid szakaszaival. Az oligomer az 5’-végen iniciációs kodont tartalmaz (ATC, az N-formil-metioninhoz (f-met)) továbbá komplementer a primer repair vezető szekvenciáját . meghatározó N-terminális nukleotidjaivai, vagy olyan '^u végekkel rendelkezik, amelyek f-met kodont tartalmaznak és komplementer szekvenciákat a vezető szakasz kódoló szekvenciájának 3 -végére és a változó régiók kódoló szekvenciájának 5.’-végére in vitro mutagenezis végrehajtása céljából. Az oíigomert könnyen ic előállíthatjuk Itakura és munkatársai módszerével (j.

Bioi. Chem., 150,4592,1975).

Az alábbiakban ismertetjük a könnyű és nehéz láncokra alkalmazható primer repair szintézis szkémáját, ahol a vezető szekvenciát megtartjuk a, illetve b. és azt az in vitro mutagenezis módszert, amelynek során ^a vezető szekvenciát eltávolítjuk és a könnyű és nehéz lánc változó szakaszát leíró kódoló szekvencia N-terminális végébe f-met kodont építünk be (a, illetve d). A hosszú vonalak hosszú DNS láncokat, a rövid gondolatjelek a beépített végeket jelentik.

5’_- ATG GAC ATG AGG GCT- 3’

3’- TAC CTG TAC TCC GCA-5’

1) Denaturálás (a szálak elkülönítése) _v 2)5-ATG GAC ATG AGGGC-3' ATG GAC ATG AGG GC

3’-- TAC CTG TAC TCC GC-5’

Klenow-fragmens * dNTP-k (dATP, dCTP, dGTP és dTTP)

3’

b. 5’ 3’

ATG GAC ATG AGG GC

TAC GTC TAC TCC GCATG AAG TTG TGG — TAC TTC AAC ACC —

3’

5’

3’

5’

1) Denaturálás

2) 5’-ATC AAG ATG AAG TTG TGG

TAC TTC AAC ACC ____________5’___ '^^vKlenow fragmens * dNTP-k

ATG AAG TTCTTGG - 3’

TAC TTC AAC ACC

5’

TTG TGG

-14196.842

GGT ACC AGA TGT GAC ATC CAG- 3

CCA TGG TGT ACA CTG TAG GTC-5’

1) Denaturálás

2) 5’ - GGT ACC AGA TGG ACA TCC - 3’ GG TAC CAG ATG GAC ATC C

CC ATG GTC TAC CTG TAG G T

ÍJenow-fragmens + dNTP-k

GG TAC CAG ATG GAC ATC C CC ATG GTC TAC CTG TAG G \ /

T

5’

1) PstI linker + T4 polinukleotid ligáz

12) PstI

13) pBR322 Pst 1 emésztés/T4 polinukleotid ligáz

4) tisztítás klónozással GG TAC CAG ATG GAC ATC C CC ATG GTC TAC CTG TAG G GGT ATC CAG TGT GAG GTG - 3’

- 5’

- 3’ — CCA TAG GTC ACA CTC CAC - 5’

1) Denaturálás

2) 5 - GGT ATC CAG ATG GAG GTG

3’

GGT ATC CAC

CCA TAG GTC

ATG \

GAG GTG

CTC CAC /

3’ ' ACA

Klenow fragmens ♦ dNTP-k Ψ >ATG<

CGT ATC CAG ^X CAG CTG--CCA TAG GTC

CTC CAC

5’

ACA

5’ 3’ Kezelés c. szerint, 1—4. átlépés

GGT ATC CAG ATG GAG GTG- 3’

CCA TAG GTC TAC CTC CAC-5’

-151

0,5 pg egyszálú DNS-hez 15 pMól 5’-foszforilezetl, fentebb az a-nál és b-nél leírt oligonukleotidot adunk 38 pl 200 mM nátrium kloridot, 13 mM trisz-liidrogén-kloridot (pH 7,5) 9 mM magnézium-acetátot és 20 mM (3-merkapto-etanolt tartalmazó elegyben, majd 3 percen át forraljuk és azonnal lehűtjük. A reakcióelegyhez 1 pl, 4 4 mM koncentrációban a négy dezoxi-nukleotid-trifoszfátot, 0,1 pl, 100 mM adenozin-trifoszfátot és 1 pl (1 egység) DNS polimeráz I Klenow-fragmenst tartalmazó oldatot (Boehringer Mannheiin) adunk.

Jgy az 5-vezető szekvenciát meghatározó szálakat és a kódoló szekvenciát vagy éppen a változó régió kódoló szekvenciáját szintetizáljuk, és ugyanakkor a 3-5-exonukleáz aktivitással leemésztjük a templát nem kódoló szálának 3 -irányában az egyszálú DNS-szekvenciát. A szintézis eredményeképpen a vezető szekvenciát tartalmazó szálra olyan nomoduplexet kapunk, amely kódolja a vezető szekvenciát és a könnyű és nehéz láncok változó szakaszait. A termék tompa végű, továbbá a kódoló szál 5-végénél egy iniciációs kodont tartalmaz leolvasási fázisban a további DNS szekvenciával.

A láncok változó régióit és a vezető szekvenciát meghatározó tompa végű duplexhez megfelelő foszforilezett linkereket, például Pstl linkereket használva restrikciós linkereket ligálunk T4 polinukleotid 11gázt és a gyártó által javasolt reakciókörülményeket használva. A pBR322 vektort Pstl enzimmel hasítjuk, amikor kohézív végeket kapunk, ezekkel pedig a módosított cDNS-hez kapcsoljuk.

Mindegyik cDNS-t hozzákapcsoljuk a komplementer végekkel rendelkező lineáris pBR322-höz. A reakcióelegyként használt pufferban (Steinmetz és munkatársai, Cell, 24, 125-134, 1981) azonos moláris mennyiségű vektort és cDNS-t reagáltatunk és az őszszekapcsolt DNS-t közvetlenül használjuk fel transzformáláshoz.

Az E. coli HB101 (Boyer és Roulland-Dussiox, J. Mól. Bioi., 41,459-472,1969) törzset egy éjszakán át növesztjük L-táptalajban, míg a tenyészet milliliterenként 2x10* sejtet tartalmaz. A sejteket centrifugálással összegyűjtjük (Sorval SS34 rotor, 80 000 fordjperc, 4 °C, 5 perc) és 0,5 térfogat 10 mM-os hideg kalcium-kloriddal mossuk. Az üledéket 0,5 térfogat hideg, 30 mM-os kalcium-kloridban szuszpendáljuk. 20 percen át jégfürdőben tartjuk a sejteket, majd ismét centrifugáljuk és 0,1 térfogat 30 mM hideg kalcium-kloridban szuszpendáljuk. Ezután 0,20 ml szuszpenziót adunk 0,1 ml, az elkészített plazmidot tartalmazó 30 mM-os kalcium-klorid oldathoz és 16 percen át jégfürdőben inkubálunk. Ezután mindegyik transzformációs elegyet 75 másodpercen át 42 °C hőmérsékleten tartjuk, majd 5 ml L-táptalajt adagolunk.

A transzformált tenyészeteket 2 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután M-9 szilárd halmazállapotú minimál táptalajon 10 pg/ml tetraciklin jelenlétében növesztjük a transzformánsokat. Az agaron növekvő telepeket 40 pg/ml ampicillint tartalmazó agaros minimál táptalara replikázzuk. Az ampicillinre érzékeny és a tetraciklinre rezisztens sejteket a megfelelő cDNS-t tartalmazó plazmid jelenlétére vizsgáljuk.

A kiválasztott kiónokat 18 órán át 2 ml megfelelő táptalajon növesztjük. 0,5 pl alikvót mintát 1,5 ml-es Eppendorf csőbe juttatunk a plazmid extrahálására. A kísérleteket szobahőmérsékleten végezzük, kivéve, ha másként nem adjuk meg. A centrifugacsöveket 15 percen át centrifugáljuk, a felülúszót finoman elkülönítjük és a sejteket 100 pl, 2 mg/ml lizozimot, 50 mM glükózt, 10 mM EDTA-t és 25 mM trisz-hidrogén-kloridot (pH 8,0) tartalmazó lizozim oldatban erőteljesen szuszpendáljuk.

percen átO °C hőmérsékleten inkubálunk, majd 200 pl alkalikus SDS oldatot (0,2 N nátrium-hidroxid és 1% nátrium-dodecil-szulfát) adagolunk, és ezután enyhén vortexeljük a szuszpenzíót. 5 percen át 0 °C hőmérsékleten tartjuk a csöveket, majd 150 pl 3 M-os nátrium-acetát oldatot (pH 4,8) adagolunk. Néhány másodpercen át a csövek forgatásával enyhén keverjük az oldatot, majd 16 percen át 0 °C hőmérsékleten tartjuk. 5 percen át centrifugáljuk az elegyet, majd 0,4 ml felülúszót elkülönítünk, egy másik centrifugacsőbe juttatjuk, 1 ml hideg etanolt adunk hozza és 30 percen át -20 °C hőmérsékleten tartjuk. A csapadékot centrifugálással összegyűjtjük (2 percnyi centrifugálás) és a felüúszót leszívjuk. Az üledéket 100 pl 0,1 M nátrium-acetátban szuszpendáljuk, 200 pl etanolt adagolunk és 10 percen át -20 °C hőmérsékleten tartjuk. Ezután centrifugálással ismét összegyűjtjük a csapadékot és 50 pl vízben oldjuk.

Az in vitro mutagenezishez lényegében a fenti eljárást használjuk. A primer repair szintézissel csak egy homoduplexet készítünk, az in vitro mutageneziskor eredetileg egy heteroduplexet alakítunk ki, ami transzformációt és klónozást követően két heteroduplexet alakít ki: az eredeti génszekvenciát és a módosított vagy hasított génszekvenciát. Az utóbbiban a változás az oligomerben meghatározott szekvenciában is bekövetkezik.

Ahogy azt a c. és d. rekcíóvázlat során megadtuk, olyan oligomert állítunk elő, amely a változó régiókat meghatározó kódoló szekvencia N-terminális végén f-metiont meghatározó ATG iniciációs kodont tartalmaz.

A kapott plazmid DNS-t a fentiek szerint eljárva izoláljuk és ismét transzformációt végzünk. A transzformánsokat 2 ml tenyészetben növesztjük a plazmid Izolálására. A második klónozásból származó egyetlen transzformáns telepből izolált DNS-t nitrocellulóz szűrőn szűrő hibridizációs módszerrel vizsgáljuk (Wallace és munkatársai, Nucleic Acids Research, 6, 3542-3556, 1979) a próbát P³²-radioizotóppal jelzett oligomerjel végezzük, amit a mutagenezishez használtunk. így biztos, hogy a megfelelő hasított cDNS homoduplexet izoláljuk. A hasított szekvenciát tartalmazó kiónokat izoláljuké_{s a} kódoló szál 3'-végének további kezelésére izoláljuk a plazmid DNS-t.

A változó szakaszokat meghatározó cDNS Pstl enzimes kezeléssel kihasítható. Az előzőekben ismerteit in vitro mutagenezis megismétlésével, ahol egy ATG (start) kodont juttatunk be a kész polipeptid N-terminális aminosavat leíró kodon elé, egy stop kodont juttatunk be a változó régiók C-terminális végéhez. Az előzőekben megadottak szerint eljárva oligonukleotidokat állítunk elő, amelyek komplementer szekvenciával rendelkeznek a cDNS változó régióit leíró kódoló (sense) száljával.

Az alábbiakban megadjuk az oligonukleotidokat és a stop kodon beépítési szkémáját a változó szakaszok végéhez. Az e. pontban ismertetjük a stop kodon beépítését a könnyű láncba, míg a stop kodon be16

-161

196.84¹ juttatását a nehéz láncba az f. pontban adjuk meg. A szkémában a stop kodont (TGA) aláhúzzuk.

e. 5’-------GAA ATC AAA CGT GCT GAT GCT TCA CC-------3’

3’------CTT TAG TTT GCA CGA CTA CGA CGT GG------5’

1) Denaturálás

2) 3’ - TTT CCA ACT ACG ACG TGG -5 < -_A±\™cc__________,

3’ - TTT GCA - - -A CTA CGA CGT GG - 5’

Klenow-fragmens * dNTP-k GC * / \

-_____AAA CGT T GAT GCT GCA CC -3

3’-------TTT GCA___A CTA CGA CGT GG -5’

c. szerint kezelve

5’---------AAA CGT TGA TGC TGC ACC - 3’

3’---------TTT GCA ACT ACG ACG TGG -5’

f. 5----3’---5’5’----3---- ACC GTC TCC TCA GCC AAA ACG ACA-------- 3’

-TGC CAG AGG AGT CGG TTT TGC TGT---------5’

1' Denaturálás ,

2) 3’ - GAG GAG TAC TTT TGT CTG T- 5

J, /^GCC\

-ACC GTC TCC TCA AAA ACG ACA - -------3’

- G AGG AGT TTT TGC TGT -5 \ACT^

Klenow-fragmens és dNTP-k GCC ^Ψ / \

-ACC CTC TCC TCA AAA ACG ACA -3 ______G AGG AGT TTT TGC TGT -5’ 'ACT^Z _{5 f} c. szerint kezelve ₅’--------ACC CTC TCC TCA TGA AAA ACG ACA -3’

3’------TGG GAG AGG AGT ACT TTT TGC TGT -5’

A Klenow-fragmens és a négy dezoxi-nukleotid-trifoszfát hatására a kódoló szál 3’-vége az oligomerrel nem komplementer első nukleotiddaj együtt lehasad és az oligomer 3 -vége a kódoló szál,5 -végének irányában komplementer kiegészítödik. így a konstans régiót meghatározó szekvencia, az oligonukleotiddaj komplementer néhány nukleotidot kivéve lehasad.de az ellenkező irányban kétszálú DNS épül fel.

A könnyű és nehéz lánc változó szakaszának hasított szekvenciáját tartalmazó heteroduplexcket ezután PstI linkerekhez kötjük, PstI endonukleázzal hasítjuk és beépítjük a pBR322 PstI helyére. Klónozást és újraklónozást követően a változó régió végén stop kodont tartalmazó hasított kétszálú cDNS-t tartalma17

-171 zó plazmidokat izoláljuk és a változó régiókat meghatározó szekvenciákat (amelyek a vezető szekvenciákat is tartalmazhatják) Pstl restrikciós endonukleázza] kihasítjuk a pBR322 plazmidból és felhasználjuk az rl v polipeptid láncok kifejezésére.

A változó régiók kifejezésére a pGMI (pVH253 Δ trpLEl413, Miozarri és Yanofsky, J. Bact., 133, 1457-1466, 1978) plazmidot használjuk. A plazmidot módosítjuk úgy, hogy Pstl helyet juttatunk be, így lehetőségünk lesz, az f-met kodonnal (ATG) együtt változó régiókat meghatározó szekvenciák beépítésére, mégpedig a Shine-Dalgarno szekvenciához képest megfelelő pozícióban. Az alábbi oligonukleotid szekvenciát állítjuk elő:

AGCTGCAGCTTTCGTT pg pGMI DNS-t egyik szálán EcoRI endonukleázzal (Boehringer Manheim, 1000 egység) hasítunk 1 ml 100 mM trisz-hidrogén-kloridot (pH 7,2), 50 mM nátrium-kloridot, 3 mM magnézium-acetátot, 0,01% ΝΡ-40-et és 150 Mg/ml etidiurn-bromidot tartalmazó reakcióelegyben, 1 órán át 37 °C hőmérsékleten. 10 mM EDTA (végkoncentráció) adagolása után 3x10 ml vízzel telített izobutanollal, majd 1 alkalommal fenol és kloroform 1:1 arányú elegyével, kétszer éterrel, végül egyszer izobutanollal extraháljuk az elegyet a térfogat 0,1 ml-re csökkentése érdekében. 0,5 ml térfogatú Sephadex G-25 oszlopon át centrifugálva sómentesítjük az oldatot, majd etanollal kicsap juk a DNS-t. 5 pg hasított DNS-t 40 egység exonuk leáz IH-mal (BRL) inkubálunk 20 pl, 10 mM trisz-hidrogén-kloridot, pH 7,5, 2 mM magnézium-kloridot, és 1 mM β-merkapto-etanolt tartalmazó reakcióelegyben. Az inkubálást 37 °C hőmérsékleten 90 percen át végezzük. Adagolással 15 mM trisz-hidrogén-kiorid, pH 7,5, 7 mM nátrium-klorid, 7 mM magnézium-klorid és 7 mM ditio-treitol koncentrációt állítunk be. 20 egység bakteriális alkálikus foszfatázt (BBL)és 5 egység Hinfl-et (BRL) adagolunk, majd 30 percen át emésztünk, 37 °C hőmérsékleten. Adagolással 10 mM EDTA koncentrációt állítunk be, kétszer fenol és kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk, az extrakciót éterrel megismételjük és 0,5 ml vízzel kiegyenlített Sephadex G-25 gyantával, centrifugálás közben sómentesítjük az elegyet.

Az így előállított köralakú egyszálú DNS nagy részét 50 pM mennyiségű, az előzőekben megadott 5 -foszforilezett oligonukleotiddal keverjük a Pstl hely bejuttatására. A reakciót 38 pl, 200 mM nátrium-kloridot, 13 mM trisz-hidrogén kloridot, pH 7,5, 9 mM magnézium-acetátot és 20 mM 0-merkapto-etanolt tartalmazó reakcióelegyben végezzük. A reakcióelegyet 30 percen át forraljuk, majd azonnal 0 °C-ra hűtjük. Ezután az alábbi összetételű elegyet adagoljuk: összesen 4 pl a 4 mM-os négy dNTP-ből, 0,5 pl 100 mM-os ATP, 3 pl (3 egység) DNS-polimeráz (Klenow-fragmens) és<4 pl (10 egység) T4 DNS-ligáz. Egy éjszakán át 12 °C hőmérsékleten inkubáljuk az E. coli HB101 sejtek transzformálására. A transzformánsokat tenyésztjük, izoláljuk és folt-hibridizációs módszerrel, izotóppal jelzett P^{3 2} -oügomert használva analizáljuk az új Pstl helyet tartalmazó hasított szekvenciát hordozó kiónok kimutatására.

A hasított pGMl-et izoláljuk és Pstl endonukleázzal részlegesen emésztjük és a fentiekben megadottak szerint előállított, a könnyű és nehéz láncok változó régióit meghatározó DNS-szekvenciákat egyenként, a fentiekben megadottak szerint eljárva beépítjük a hasított helyre, amikor két olyan plazmidot kapunk, amelyek könnyű (pGMIL), illetve nehéz pGMIL) láncot kódoló DNS-szekvenciákat tartalmaznak. A kapott plazmidokkal E. coli HB101 sejteket transzformálunk, és a könnyű és nehéz láncok változó szakaszait leíró szekvenciákat megfelelő orientációban tartalmazó kiónokat restrikciós térképezéssel azonosítjuk és tisztítjuk.

A könnyű és nehéz láncot felismerő antiszérumot az adott lánc antigénként való felhasználásával állítjuk elő, az antiszérumot izoláljuk és ismert módon kovalensen kapcsoljuk egy Sepharose gyantához (March és munkatársai, Anal. Biochem., 60, 149-152, 1972), a terméket affinitás kromatográfiához használjuk fel.

A transzformánsokat milliliterenként 10’ sejtet tartalmazó sejtsűrűségig tenyésztjük, majd centrifugálással összegyűjtjük'. Az üledéket 50 pl, alábbi öszszetételű elegyben szuszpendáljuk: 50 mM trisz-hidrogén-kiorid, pH 8,0, 50 mM EDTA, 15% szacharóz, 1 mg/ml lizozim, 0,5% NP40. 30 percen át 0 °C hőmérsékleten tartjuk a szuszpenziót, majd 10 pl 150 mM-os trisz-hidrogén-kloridot, pH 7,5, 280 mM magnézium-kloridot, 4 mM kalcium-kíoridot és 1 pg DNázt adagolunk hozzá, és ezt követően 15 percen át 12 000 g-n centrifugáljuk.

A felülúszót az üledékről leszívjuk és izoláljuk a fehérjéket. A felülúszót trisz-hidrogén-kiorid, pH 7,5, oldattal kiegyenlített, 0,15 ml térfogatú immunszorbens oszlopon engedjük át. Az rFv könnyű és nehéz láncait 2,5 pH-jú mólos ecetsavval eluáljuk, az eluátumokat összegyűjtjük és 0,1 M nátrium-lűdroxid oldattal 0 °C hőmérsékleten pH 5,5-re semlegesítjük. 3x100 térfogat nátrium-acetát puffénál, pH 5,5, szemben dializáljuk az eluátumot, majd a dialízist 3x100 térfogat pH 7-es PBS-sel szemben megismételjük.

Ha a renaturált könnyű és nehéz rFV láncok azonos forrásból származnak, úgy atokat tovább tisztíthatjuk az rFV komponenseket tartalmazó eluátumok egyesítésével és DNP-affinitás kromatográfiával. (A megadott példában kapott nehéz és könnyű láncok különböző forrásból származnak, így ezt a lépést nem kell elvégeznünk). A DNP-affinitás oszlopot és az eljárás Kooistra és Richard írja le. (Biochem., 17, 345351, 1978). A kötött rFV-t 1 mólos ecetsavval eluáljuk, majd a fentiek szerint végzett egymást követő dialízisekkel renaturáljuk. Azonkívül a szulfhidrilcsoportok megőrzésére jód-acetamiddal kezelünk Kooistra és Richards (1. fent) szerint eljárva.

A találmány szerinti eljárással olyan protein komplexekből álló homogén készítményt állítunk elő, amely előre meghatározott heptan hellyel erős kötőképességgel rendelkező, két peptid láncból álló komplexet képez. A két lánc egy rFv-t alkot, amely specifikusan kapcsolódik egy adott ligandhoz, mivel a természetben előforduló immunglobulint utánoz. A konstans régiók nélkül az előállított rFv csökkent ímmungenecitással rendelkezik, és nem tartalmaz adott felhasználási területen, például a komplement fixáláskor előnytelen funkciókkal rendelkező peptid szekvenciákat.

A találmány szerinti rFv célra, diagnózisra és terápiás célokra használható fel. A készítmény homogén és ezért mindig reprodukálható immungenetikus értékkel rendelkezik. A termék csökkent molekulasúlya

-181 miatt, emlős szervezetbe injektálva, rövid ideig marad a testben. Ez különösen akkor fontos, ha az rFv veszélyes jelzéssel, például radioizotóppal, nehéz fémmel, citotoxikus szerrel és hasonlókkal ellátva kerül diagnózis vagy terápiás okokból a szervezetbe. A rövid tartózkodási idő előnyös abban az esetben is, ha az rFv-vel in vivő élettani szempontból aktív anyagokat, például hormonokat, enzimeket, felületi receptorokat, limfocitákat vagy más sejteket vagy hasonlókat gátiunk.

Az egységes készítmény szabályozott jelzést tesz lehetővé, növeli a konjugátum képességét egy adott hely jelzésére az egyik vagy másik, vagy mindkét láncon. A homogenitás szabályozott konjugációt tesz lehetővé, pontosan meghatározhatjuk a terápiás aktivitást, könnyen megfigyelhetjük a terápiás hatást, növelhető az eredmények reprodukálhatósága és szabályozhatjuk, illetve könnyen megfigyelhetjük a mellékhatásokat.

A találmány szerinti eljárással olyan polipeptid láncok pontos szintézise végezhető el, amelyek összekapcsolva egy előre meghatározott epitopikus helyre nézve kötő pontot tartalmaznak. Az eljárással előállított könnyű ás nehéz láncok a ligand jelenlétében vagy anélkül kapcsolhatók össze. A találmány szerinti eljárással lehetőségünk nyílik egy adott célra felhasznált, például radiojódozásra használt tirozin esetén, egy lánc bármelyik végére egy adott aminosav beépítésére. A változó régiókat meghatározó DNS forrásaként monoklónozott hibridomákat használva a természetes kötőképesség megmarad és a kötő-affinitás széles határok között változtatható.

Claims (20)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Eljárás egy előre meghatározott ligandra specifi kus immunoglobulin könnyű vagy nehéz láncának vál tozó szakaszát meghatározó kétszálú, az 5 -végen ini ciációs és a 3 -végen terminációs kodont hordozó dez oxi-ribonukleinsav-szekvenciát tartalmazó - mel> szekvencia az adott változó szakaszon kívüleső aminosav-csoportokat meghatározó nukleotidoktól mén tes - transzformáló kifejeződő vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a fenti láncot meghatározó mRNS-ből az adott könnyű vagy nehéz lánc legalább egyikét kódoló kétszálú cDNS-t állítunk elő, a kapott kétszálú cDNS-ről eltávolítjuk a változó szakaszon kívüleső nukleotid-szekvenciákat, és a változó szakaszt kódoló hasított kétszálú cDNS előállítására az 5 -véget iniciációs, a 3’-véget terminációs kodonnal látjuk el, és a a kapott Kialakított kétszálú cDNS-t ennek kifejezésére egy kifejeződő vektorba építjük be.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az iniciációs és terminációs kodonokat in vitro mutagenezissel építjük be.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a beépítés előtt a kétszálú cDNS legalább egy nukleotidját egy, az eredetiből különböző aminosavat meghatározó kodon kialakítására kicseréljük.
4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy

   a) kétszálú, egy Immunglobulin könnyű vagy egy nehéz láncát meghatározó cDNS-t állítunk elő, ahol mindegyik lánc egy állandó és egy változó szakaszból áll, és ahol a változz szakasz mintegy 95-125 aminosavat tartalmaz, oly módon, hogy az adott láncot kódoló mRNS-t izoláljuk, egyszálú cDNS előállítására reverz transzkriptázzal kezeljük az mRNS-t, DNS polimerázzal az egyszálú cDNS-re komplementer szálat szintetizálunk, amikor a könnyű vagy nehéz láncot meghatározó, kódoló száljai rendelkező kétszálú cDNS-t kapunk, amelyben a koüoló szál 5 -3-irányban az immunglobulin vezető szekvenciáját.a változó és az állandó régiókat meghatározó ONS-szekvenciákat tartalmaz, majd a kétszálú cDNS-í klónozzuk,

   b) a klónozott kétszálú cDNS-ből egy kódoló vagy nem kódoló egyszálú cDNS-t állítunk elő, majd ezután deef vagy cedf sorrendben elvégezzük a c., d., e. és f. lépéseket,

   c) a vezető és a változó szakaszt meghatározó kódoló szekvencia végpontjára eső nem kódoló szálhoz egy iniciációs helyet meghatározó iniciációs kodont tartalmazó első oligonukleotid prímért hibridizálunk, majd az így kapott első duplexet enzimatikusan kezeljük az első oligonukleotid primer a nem kódoló egyszálú cDNS-re 5’-3-irányban komplementer meghosszabbítására és ezután N-terminálisan meghatározott és kialakított kétszálú cNDS előállítására a kódoló egyszálú cDNS-t az első oligonukleotid primerre komplementer szekvenciáig a másik irányban leemésztjük,

   d) a változó és az állandó szakasz végpontját meghatározó DNS-szekvenciáboz a kódoló szálra egy második, stop anti-kodont tartalmazó ob'gonukleotid prímért hibridizálunk, majd az így kapott második duplex molekulát enzimatikusan kezeljük a második oligonukleotid primer 5 -3 -irányban az adott kódoló szálra komplementer meghosszabbítására és végül C-terminálisan meghatározott és kialakított kétszálú cDNS előállítására az adott kódoló egyszálú cDNS-t a második oligonukleotid primerre komplementer szekvenciáig a másik irányban leemésztjük,

   e) az így kapott C- vagy N-terminálisan meghatározott és kialakított kétszálú cDNS-t klónozzuk, a Cvagy N-terminálisan meghatározott és kialakított így kapott kétszálú cDNS-t kódoló és nem kódoló szálakra választjuk szét és felhasználjuk a kódoló szálat, ha a d. lépés következik, illetve a nem kódoló szálat, ha a c. lépést végezzük el, végül

   f) az előállított N- és C-terminálisan meghatározott és kialakított kétszálú cDNS-t klónozzuk, azután az N- és C-terminálisan meghatározott és kialakított kétszálú, az adott kódoló szekvenciát tartalmazó cDNS-t a transzkripciós és transzlációs szabályozó jelekkel megfelelő orientációban egy kifejeződő vektorba építjük be.
5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy

   a) egy immunglobulin könnyű vagy nehéz láncát meghatározó kétszálú cDNS előállítására, ahol a láncok mindegyike egy állandó és egy változó régióból áll, és ahol a változó régiók mintegy 95-125 aminosavból állnak, izoláljuk az adott láncot meghatározó mRNS-t, egyszálú cDNS előállítására az mRNS-t reverz transzkriptázzal kezeljük, kétszálú cDNS előállítására DNS poUmerázzal kezeljük az egyszálú cDNS-t, amikor a szálra komplementer szál szintetizálódik és amikor

   -191 olyan kétszálú cDNS-t kapunk, amelynek kódoló szálja az adott könnyű vagy nehéz láncot határozza meg, és ahol a kódoló szál 5 -3’-irányban az adott Immunglobulin vezető szekvenciáját, változó szakaszát és konstans régióját meghatározó DNS-szek vénei át tartalmaz, majd az így kapott kétszái( cDNS-t klónozzuk,

   b) az adott könnyű vagy nehéz lánc változó szakaszán túleső régiókat meghatározó DNS legalább egy részét a klónozott kétszálú cDNS-t kódoló és nem kódoló szálakra szétválasztva eltávolítjuk, a nem kódoló szálhoz egy első duplex előállítására egy változó régió kifejezését meghatározó inicíációs helyet leíró inicíációs kodont hordozó első oligonukleotid prímért hibridizálunk, amely első olígonukleotid primer komplementer a vezető szakasz N-terminális részét meghatározó szekvenciára vagy részlegesen komplementer a vezető szakasz és változó régi kapcsolódási pontját meghatározó DNS-szekvenciára, és amely a kapcsolódási pontnál egy nem komplementer inicíációs kodont tartalmaz, az így kapott első duplexet az első oligonukleotid primer 5 -3 -irányban a nem kódoló egyszálú cDNS-re komplementer meghosszabbítására enzimmel kezeljük és a nem kódoló egyszálú cDNS-t N-terminálisan meghatározott kétszálú cDNS előállítására az első oligonukleotid prímemé komplementer szekvenciáig leemésztjük, a kapott N-terminálisan meghatárotott és kialakított kétszálú cDNS-t klónozzuk, a kapott N-terminálisan meghatározott és kialakított kétszálú cDNS-t kódoló és nem kódoló szálakra választjuk szét, a kódoló szálhoz egy második duplex előállítására egy stop anti-kodont tartalmazó, de egyébként az adott változó és adott állandó régió kapcsolódási pontján lévő szekvenciára komplementer második oligonuldeotidot hibridizálunk, ahol a stop anti-kodon a kapcsolódási helyen van és így az adott változó régió terminális végére egy stop kodon kerül, az így kapott duplexet a második oligonukleotid primer a kódoló szálra komplementer 5'-3-irányú meghosszabbítására enzimmel kezeljük, majd a második oligonukleotid primerre komplementer szekvenciáig a másik irányban leemésztjük a kódoló egyszálú cDNS-t, amikor az adott immunglobulin konstans régióját nem leíró, a változó régió könnyű vagy nehéz láncát kódoló Nés C-terminálisan meghatározott és kialakított kétszálú cDNS-t kapunk, a kapott N- és C-termínálisan meghatározott és kialakított kétszálú cDNS-t klónozzuk, és az N- és C-terminálisan meghatározott és kialakított kétszálú cDNS-t az adott kódoló szekvencia szempontjából a transzkripciós és transzlációs szabályozó jelekkel megfelelő kapcsolatba tartva kifejeződő vektorba vagy plazmidba építjük be.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az első oligonukleotid prímért úgy hibridizáljuk, hogy homoduplexet alkosson az adott nem kódoló szállal az adott vezető szekvencia N-terminális végén.
7. 7. A 4, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az első oligonukleotid prímért az adott változó régiót meghatározó DNS-szekvencia N-terminális végére egy inicíációs kodont bejuttatva az adott vezető-szekvencia és az adott változó-szekvencta kapcsolódási helyére hibridizáljuk.
8. 8. A 4,, 6. és 7. Igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a beépítés előtt az N- és C-terminálisan meghatározott és kialakított kétszálú cDNS-be egy egyedülálló restrikció linkért ligálunk és ezúton kohézív végek előállítására a linkért enzimatikusan hasítjuk.
9. 9. A 4., 6. és 7. igénypontok bármelyike szerinti e^árás, azzal jellemezve, hogy a c) vagy d) lépés legalább egyikében olyan oligonukleotid printerrel hibridizálunk, maley csak részlegesen komplementer az adott cDNS-szálra.
10. 10. A 4 9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hibridizációs lépéseket követő klónozás során az adott első vagy második oligonukleotid-szekvenciát hordozó kiónokat szelektáljuk, az adott kétszálú cDNS-t tartalmazó DNS-t izoláljuk és újra kiónozzuk az adott kétszálú cDNS-t.
11. 11. Eljárás egy előre meghatározott ligandra specifikus immunglobulin könnyű vagy nehéz lánc változó régiójának legalább egy részét adó aminosav-szekvenciából álló kötő polipeptid előállítására, ahol az aminosav-szekvencia az analóg lánc kötőspecificitásával rendelkezik,azzal jellemezve , hogy az adott láncot meghatározó mRNS-böl a könnyű vagy nehéz láncok legalább egyikét kódoló kétszálú cDNS-t állítunk elő, a kétszálú cDNS-ről lehasítjuk az adott változó régiókon kívüleső részt leíró nukleotid-szekvenciát, és a változó régiót kódoló meghatározott kétszálú cDNS előállítására a DNS-szekvencia 5’-végébe inicíációs és 3-végébe terminációs kodont építünk be, a kétszálú cDNS kifejezésére kifejeződő vektorba építjük be a kialakított kétszálú cDNS-t és az adott, kialakított kétszálú cDNS-t tartalmazó kifejeződő vektorral egy erre alkalmas gazdasejtet transzformálunk, a transzformált gazdasejtet növesztjük, amikor az adott könnyű és nehéz láncok egyikének kötő polipeptidje kifejeződik, és izoláljuk az adott kötő polipeptidet.
12. 12. A II. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként baktériumot használunk.
13. 13. A 11, vagy 12. igénypont szerinti eljárás, a z zal jellemezve, hogy az immunglobulinként IgG-t állítunk elő.
14. 14. A 11-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nehéz lánc változó régiójaként D-szekvenciát tartalmazó régiót állítunk elő.
15. 15. Eljárás egy előre meghatározott ligandra specifikus immunglobulint könnyű vagy nehéz láncának változó szakaszát meghatározó kétszálú, az 5-végen inicíációs éa 3-végen terminációs kodont hordozó dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát tartalmazó - mely szekvencia az adott változó szakaszon kívüleső aminosav-csoportokat meghatározó nukleotidoktól mentes — transzfornáló kifejező vektorral transzformált gazdasejtek előállítására, azzal jellemezve, hogy az említett láncot meghatározó mRNS-ből a könynyű vagy nehéz láncok legalább egyikét kódoló kétszálú cDNS-t állítunk elő, a kétszálú cDNS-ről lehasítjuk az adott változó régión kívüleső részt leíró nukleotid-szekvenciát, és a változó régiót kódoló meghatározott kétszálú cDNS

    -201

    196.842 előállítására a DNS-szekvencia 5-végébe iniciációs és 3-végébe terminális kodont építünk be, a kétszálú eDNS kifejezésére kifejeződő vektorba 5 építjük be a kialakított kétszálú cDNS-t, és a kifejeződő vektorral egy gazdasejtet transzformálunk.
16. 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal j e 1 le m e z ve , hogy az iniciációs és terminációs kodonokat mutagenezisse] építjük be. 10
17. 17. A 15. vagy 16. igénypont szerinti eljárás, a z zaljellemezve, hogy a beépítés előtt a kétszálú cDNS legalább egy nukleotidját egy, az eredetitől különböző aminosavat meghatározó kodon kialakítására kicseréljük. , g
18. 18. A 15-17. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként baktériumot használunk.
19. 19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként E. colit használunk.
20. 20. Eljárás egy előre meghatározott ligandra specifikus immunglobulin könnyű vagy nehéz láncának változó szakaszát meghatározó kétszálú, az 5’-végen iniciációs és a 3’-végen terminációs kodont hordozó dezoxi-ríbonukleinsav-szekvenciát tartalmazó - mely szekvencia az adott változó szakaszon kívüleső aminosav-csoportokat meghatározó nukleotidoktól mentes - transzformáló kifejeződő vektorral transzformált gazdasejtek előállítására, a zzal jellemezv e , hogy a gazdasejtet az 1 -10. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított transzformáló kifejeződő vektorral transzformáljuk.