JPH06277092A

JPH06277092A - 複合ハイブリッド蛋白質、その調製方法、その診断薬としての、治療用の薬剤としての又はメディカルイメージングにおいて使用できる試薬としての応用

Info

Publication number: JPH06277092A
Application number: JP5024368A
Authority: JP
Inventors: Jean-Claude Boulain; ブーランジャン−クロード; Frederic Ducancel; ドカンセルフレデリク; Daniel Gillet; ジレーダニエル; Andre Menez; メネスアンドレ
Original assignee: Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Current assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 1992-02-11
Filing date: 1993-02-12
Publication date: 1994-10-04
Also published as: FR2687157A1; ATE202799T1; DE69330390T2; FR2687157B1; EP0556111B1; DE69330390D1; CA2089139A1; EP0556111A1

Abstract

(57)【要約】【構成】他の蛋白質Ｐと融合した免疫グロブリンフラグ
メントを含むタイプのハイブリッド蛋白質であって、
（１）ＳＵ₁はＬ鎖免疫グロブリンの可変および不変領
域を有し、ＳＵ₂はＨ鎖免疫グロブリンの少なくとも可
変領域およびＣ_H１ドメインを有し、該ペプチド鎖ＳＵ
₁およびＳＵ₂が互いに少なくとも１つのジスルフィド
架橋によって結合している、２種の異なるペプチド鎖Ｓ
Ｕ₁およびＳＵ₂；および（２）ペプチド鎖ＳＵ₁およ
びＳＵ₂の１種のＮ末端を介して融合した２量体蛋白質
Ｐの２つのサブユニットの１種の機能性フラグメントの
少なくとも１種からなる基本単位Ｕを有し；基本単位Ｕ
が、基本単位Ｕと同一または異なる他の基本単位Ｕ´
と、蛋白質Ｐのサブユニットまたはそのフラグメントに
より結合している複合ハイブリッド配列からなることを
特徴とするハイブリッド蛋白質。【効果】蛋白質の定量等を簡単に行えるようになった。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、免疫グロブリン（抗
体）のＬ鎖およびＨ鎖の可変領域及び特定の不変ドメイ
ン（constant domain ）およびその他のホモ−若しくは
ヘテロ二量体蛋白質並びに、その製造方法および診断薬
（特にこれらのハイブリッド蛋白質から得られる二価組
換え体及び可染色抗体（possibly colorimetric antibo
dy））、治療薬向の薬品又はメディカルイメージング
（medical imaging ）において使用できる試薬としての
応用に関する。

【０００２】

【従来の技術】最初は、１９７５年にコラー（KOLHER）
及びミルシュタイン（MILSTEIN）が記述したハイブリド
ーマ法（ネイチャー（Nature），２５６，４９５−４９
７）を用いてモノクローナル抗体を得ていた。その後、
免疫グロブリンをコードするヌクレオチド配列を操作で
きる多数の技術が発達してきた。このように、それらを
製造する生物体を選択すること及び希望する用途に適す
るようにそれらの構造を修飾することが可能になってき
た。

【０００３】免疫グロブリンの基本的な構造は、ジスル
フィド橋で連結した二つの同じ軽ポリぺプチド鎖及び二
つの同じＨ鎖からなる。重（Ｈ）鎖の及び軽（Ｌ）鎖の
Ｎ末端領域は、それぞれＶ_H及びＶ_L領域と呼ばれる可変
（Ｖ）配列により特徴付けられる。その分子の残部は相
対的に不変の構造を有する。Ｌ鎖の不変部分はＣ_L領域
と呼ばれ、Ｈ鎖の不変部分は少なくとも三つの異なる領
域：Ｃ_H１、Ｃ_H２及びＣ_H３（例えばＩｇＧ）からな
る；鎖内（intracatenary ）ジスルフィド橋によって安
定化するこれらの球状領域はまた“ドメイン”と呼ばれ
る。これら二つの抗原結合部位は、各々可変ドメイン
（Ｖ_H及びＶ_L）の集合からなり、エフェクター機能（ef
fector functions）（補体結合、単球への結合及び胎盤
の通過）は主にＣＨ₃ドメインに位置する；蝶番領域は
Ｃ_H１とＣ_H２との間に位置する。種々の蛋白質分解酵素
による開裂によって、少なくとも一つの機能性抗原結合
フラグメントを保存すると同時に、免疫グロブリンの大
きさを縮小することができる。このように、ペプシン
は、蝶番領域によって結合する二つのＦａｂフラグメン
トからなる二価のＦ（ａｂ´）₂フラグメントを遊離す
る。パハインは、ＩｇＧ分子を開裂し、抗原に結合する
二つの一価の同じＦａｂフラグメントを放出する。完全
な抗原結合部位を含む最小のフラグメントは、Ｖ_H及び
Ｖ_Lドメインの会合からなるＦｖフラグメントである。
しかしながら、このフラグメントを単離することは難し
い。そのうえ、抗原に対するアフィニティー及びその安
定性は縮小する（ジェイ．エス．フストン（ＨＵＳＴ
ＯＮ）ら，１９８８，ピー．エヌ．エー．エス．（Ｐ．
Ｎ．Ａ．Ｓ．）８５，５８７９−５８８３）。

【０００４】先行技術に記述されているように、モノク
ローナル抗体の製造に関する改良は以下を含む：抗体の
遺伝子工学的手法は、免疫グロブリンの合成を促す遺伝
情報にアクセスすること、必要に応じてこの情報を変更
すること及び１９７５年のコラーおよびミルシュタイン
（ネイチャー（Nature），２５６，４９５−４９７）に
よる初期の研究に記述された手順によって得られるハイ
ブリドーマ細胞に変更した又はしないで再び導入するこ
とを可能にし、所定の特異性を有する抗体の均質な一組
を得ることを可能にし、治療及び診断分野で使用され、
又は種々の微生物、特に相当する蛋白質を製造する種々
の微生物に使用される。

【０００５】免疫グロブリンに関係する分子のＥ．ｃｏ
ｌｉにおける生産を報告する最初の研究は１９８４年か
らはじまる。その研究は、一つ又は二つの免疫グロブリ
ン鎖の細胞質内生産に関する（キャリレイ（CARRILLY）
ら，ピーエヌエーエス（PNAS) ，１９８４，８１，３２
７３−３２７７；ロス（ROSS）ら，Nucl. Acids Res.，
１９８４，１２，３７９１−３８０６）。これらの細胞
質内合成からの機能性抗体の調製には、インビトロでの
骨が折れ且つ難しい精製、可溶化及び再生ステップを要
した。

【０００６】それから、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて天然の及
び機能的状態の抗体フラグメントを直接生産することが
可能になってきた。両鎖の（又は一本鎖フラグメント
の）分離し同時のセシエーション（ｓｅｃｉｅｔｉｏ
ｎ）のみにより、現在、この結果を得ることができる。
このように、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、ｄＡｂ、Ｆｃ、
ｍｒｕフラグメント（上記のウインター（WINTER）及び
ミルシュタイン（MILSTEIN）によるレビューにおける命
名法参照）が生産されてきた；バクテリオファージの表
面にこれらの分子をさらすこともまた可能にする（マカ
ファーティ（McCAFFERTY）ら，１９９０，ネイチャー
３４８，５５２−５５４；クラクソン（CLACKSON）ら，
１９９１，ネイチャー３５２，６２４−６２８）。

【０００７】しかしながら、全ての場合に、得られる分
子が一価であること、すなわち、それらが一つの抗原部
位のみを含むこと、に注意しなければならない。

【０００８】真菌、酵母菌、哺乳動物の細胞、植物細胞
又はバキュロウィルスを用いるシステムような混合ファ
ージ／宿主細胞発現システムなどの多数の他の生物体に
おける抗体又は誘導体の生産もまた記述されている。

【０００９】バクテリア又はファージによって生産され
る免疫グロブリン由来し、従来技術に記述されている分
子は、以下の利点を有する：遺伝操作が、実行すること
が容易であり且つ大きい可能性を有する（ファージによ
って開発されたスクリーニングシステム参照）、それに
よってこれら新しい蛋白質の大量生産もまた簡単にな
る；しかしながら、これらの分子は、一つの抗原結合部
位のみを有する、一価の免疫グロブリン部分を有すると
いう大きな不利を有する。

【００１０】生産のこれらの異なる方法を利用すること
により、抗体の構造を変更すること、新しい性質を有す
る組換え抗体、即ち人の（humanised ）、二重特異性の
ハイブリッド抗体を製造することが可能になる；先行技
術は特に以下の点を記述している： −それらを人間に投与する場合、特にこれらの抗体に対
する免疫応答を減ずる目的でネズミ（rodent）抗体を
“ヒューマナイズ（humanised ）”する；このような抗
体は、特にヒト免疫グロブリンの不変領域とネズミ免疫
グロブリンの可変領域の結合によって得られ、ハイブリ
ドーマ細胞によって生産されるこのような抗体は、減弱
した免疫原生を有する（ジー．ウィンター（G. WINTER
）及びシー．ミルシュタイン（C.MILSTEIN），ネイチ
ャー，３４９，２９３−２９９）。

【００１１】−異なる特異性を有する二つの抗原結合部
位（抗体の二重特異性）をそれぞれ有する抗体が製造さ
れてきた；それらは標的細胞に及びトキシンに又は細胞
傷害性のＴ細胞に同時に結合でき標的細胞の破壊の原因
になる（ジェー．エル．フェルプス（J.L. PHELPS ）
ら，J.Immunol.，１９９０，１４５，４，１２００−１
２０４）；このような抗体は例えばハイブリッドハイブ
リドーマによって又は二つの異なる特異性を有する免疫
グロブリンをコードする配列のメラノーマ細胞への導入
によって生産できる（ティー．エー．ワルドマン（T.A.
WALDMANN ），１９９１，サイエンス（Science ），２
５２，１６５７−１６６２）。

【００１２】−新しい機能の導入は、他の蛋白質との免
疫グロブリンフラグメントの融合によってもまた実行で
きる。例えば、上記のようにヌーベルガー（NEUBERGER
）ら（ネイチャー，１９８４，３１２，６０４−６０
８）は、先端を切った重免疫グロブリン鎖をコードする
遺伝子と、細菌ヌクレアーゼ又は発がん性の蛋白質ｍｙ
ｃをコードする遺伝子の融合を実行し、且つ、メラノー
マ細胞において対応するＬ鎖でこれらのハイブリッドを
発現させた。同じ原理によってシュニー（SCHNEE）ら，
（１９８７，ピーエヌエーエス，８４，６９０４−６９
０８）は、特にフィブリンを認識する免疫グロブリン部
分からなる二機能性ハイブリッド蛋白質および組織プラ
スミノーゲンアクチベータ領域（ｔ−ＰＡ）からなる二
機能性ハイブリッド蛋白質を製造し、これにより、トロ
ンボリティック作用（thrombolytic action ）を有する
蛋白質を形成した。カサデイ（CASADEI ）ら，（１９９
０，ピーエヌエーエス，８７，２０４７−２０５１）
は、その部分として、抗体−アエクオリン（antibody-a
equorin ）ハイブリッドを構築した。宿主細胞として
Ｅ．ｃｏｌｉを選択することによって、コーダリー（CH
AUDHARY ）ら（１９８９，ネイチャー，３３９，３９４
−３９７）は、免疫グロブリンの一本鎖Ｆｖフラグメン
ト（ｓＦｖ）と細胞内で発現するシュードモナス外毒素
との間のハイブリッドを生産した。最近の研究（ブリン
クマン（BRINKMANN ）ら，１９９１，ピーエヌエーエ
ス，８８，８６１６−８６２０）は、これらの構築物の
一つがマウスにおいて研究されたヒトカルチノーマの処
置に有効であることを示す。

【００１３】これら種々の文献においては、得られた融
合遺伝子は、二機能性融合蛋白質、即ち、組み立てられ
る両蛋白質（免疫グロブリン及び他の蛋白質）に属する
機能を有するを発生させる。これらの二機能性ハイブリ
ッド分子は、モノクローナル免疫グロブリンの応用の分
野（癌、血栓症、診断薬など）を広げたけれども、それ
にもかかわらずこれらの組換え蛋白質の組織化の問題が
ある。ヌーベルガー（NEUBERGER ）ら及びカサデイら
は、彼等の文献の中で、Ｆｃ領域に代わる、二次蛋白質
（second protein）（ヌクレアーゼ又はアエクオリン）
の存在に帰すべきように見える二つの重免疫グロブリン
鎖の会合に関する問題を指摘している。シェニー（SCHN
EE）らは、プラスミノーゲン活性化因子の存在がハイブ
リドーマにおけるハイブリッド蛋白質の発現の相当な減
少に帰することを明記している。最後に、コーダリーら
がＥ．ｃｏｌｉにおいて得たハイブリッド蛋白質は、細
胞質内に位置しており、精製して再生しなければならな
い。さらに、それらは、対照として採用したＦａｂフラ
グメントと比較すると、抗原との親和力が縮小した一本
鎖Ｆｖフラグメントからなるただ一つの抗原結合部位を
所有する。

【００１４】上記の従来技術は、他の蛋白質と会合した
二価抗体からなるハイブリッド蛋白質の生産の普及（ge
neralization）が、両蛋白質の機能を保護すると同時
に、容易ではなく及び非常に多くの因子が制御（特に重
と軽鎖との対形成）もされず法則化もできないことが明
白であることを示す。

【００１５】特に、細菌によるハイブリッド蛋白質の生
産は、二価、即ち二つの（融合された両蛋白質の機能を
有する）二機能性抗原結合部位を所有している免疫グロ
ブリン部分を有し、構造及び活性型で直接的に生産され
ることが解明されていない。その上、現在まで単に一価
のフラグメントのみが得られてきたので、細菌を使用す
る機能性二価抗体フラグメント（他の蛋白質と融合して
いない）のより直接的な生産も解明されていない。

【００１６】

【発明が解決しようとする課題】本出願会社は、その欧
州特許出願４０７２５９において免疫グロブリンフラグ
メント（ｓＦｖ）を有する輸出され且つ自然に組織化さ
れた二機能性及び二価ハイブリッド蛋白質の微生物にお
ける生産の普及化の問題を解決した。

【００１７】本出願において、解決しようとする課題
は、免疫グロブリン蛋白質を有し、他の機能性蛋白質と
会合し、Ｆ（ａｂ）₂型構造をした二機能蛋白質の直接
的な生産に関する。

【００１８】結果として、本発明の目的は、特にそれら
がＦｖフラグメントよりも自然部位に近い抗原結合部位
を有し、且つ抗原に対するより大きな特異性及びアフィ
ニティーを有する点において特に、先行技術の二機能性
及び抗体形成ハイブリッド蛋白質よりも実用的な用途の
要求により適当な、Ｆ（ａｂ）₂型構造の免疫グロブリ
ンフラグメントからなるこのようなハイブリッド蛋白質
を提供することにあり、それにより、特にこれらの新規
ハイブリッド蛋白質が使用される免疫試験に十分な改善
をもたらすものである。

【００１９】

【課題を解決するための手段】以下のことは、本発明の
範囲内にあると理解される： −免疫グロブリンフラグメント及び他の蛋白質を有し、
それを構成する両蛋白質に由来する機能を示す二機能性
ハイブリッド蛋白質； −１つの抗原結合部位のみを含む上記に定義した一価ハ
イブリッド蛋白質； −２つの抗原結合部位を含む上記に定義した二価および
二機能性のハイブリッド蛋白質；二つの部位が同じ場合
には、ハイブリッド蛋白質を単一特異性（monospecifi
c）と呼び、二つの結合部位が異なる場合には、ハイブ
リッド蛋白質を二特異性（bispecific）と呼ぶ。

【００２０】本発明の主題は、他の蛋白質Ｐと融合した
免疫グロブリンフラグメントを含む型のハイブリッド蛋
白質であり、それは以下の複合ハイブリッド配列からな
ることを特徴としている。

【００２１】・以下からなる基本単位Ｕ・二つの異なるペプチド鎖ＳＵ₁及びＳＵ₂；ＳＵ₁は免
疫グロブリンＬ鎖の可変及び不変領域からなり、且つ、
ＳＵ₂は少なくとも免疫グロブリンＨ鎖の可変領域及び
Ｃ_H１ドメインからなり、これらのペプチド鎖ＳＵ₁及び
ＳＵ₂は、少なくとも一つのジスルフィド橋によって相
互に結合している。

【００２２】・そのＮ−末端によって、ペプチド鎖ＳＵ
₁又はＳＵ₂の一つと融合した、二量体蛋白質Ｐの二つの
サブユニットの一つの少なくとも一つの機能性フラグメ
ント、・この基本単位Ｕは、Ｕ単位と同じか又は異なる他の基
本単位Ｕ´と、蛋白質Ｐサブユニット又はそのフラグメ
ントによって、会合している。

【００２３】蛋白質Ｐサブユニットを二量体化によって
集合させ、機能性蛋白質Ｐを形成させる。本発明の範囲
においては、機能性フラグメントは、その蛋白質Ｐの望
ましい特性を有することができる蛋白質Ｐフラグメント
を意味し、そのフラグメントは一般に二量体の形態であ
る。

【００２４】本発明によるハイブリッド蛋白質は、複合
ハイブリッド蛋白質と呼ばれ、それが発現される単細胞
宿主細胞、例えば細菌又は真菌（E. coli, Bacillus, S
treptomyces ）、酵母菌、哺乳動物の細胞、植物細胞又
はバキュロウィルスを使用するシステムのような混合フ
ァージ／宿主細胞発現システムから輸出される場合、に
以下のものを有する機能性二量体を形成する： −同じか又は異なり、且つ、そのハイブリッド蛋白質の
基本単位（Ｕ、Ｕ´等のような）の一つによってそれぞ
れ運ばれる少なくとも二つの抗原結合部位、 −付加的なホモ−又はヘテロ二量体蛋白質の固有の特性
に関連する生物学的機能。

【００２５】これらの新しい蛋白質は、メラノーマ細胞
において生産される先行技術の二機能性ハイブリッド蛋
白質と比較して、実際的な用途における必要性に特に好
適であり、本発明による複合ハイブリッド蛋白質におい
て、二つのＦａｂフラグメントの会合が免疫グロブリン
鎖又は鎖フラグメントと融合した二量体蛋白質の二つの
サブユニット間に形成された自然相互作用によってもた
らされた場合には、一つ又はそれ以上のジスルフィド橋
の形成によるＦ（ａｂ´）₂フラグメントへの二つのＦ
ａｂフラグメントの会合は、他の蛋白質の存在下に変更
してもよい。さらに、それらは、同時に、二機能性であ
り且つ二特異性であることができるという利点を有す
る。

【００２６】この複合ハイブリッド蛋白質の有利な態様
によると、該ペプチド鎖ＳＵ₁及びＳＵ₂は、Ｎ−末端の
上流で、細菌又は真菌（E. coli, Bacillus, Streptomy
ces)、酵母菌、哺乳動物の細胞、植物細胞およびバキュ
ロウィルスを使用するシステムのような混合ファージ／
宿主細胞発現システムからなる群から選ばれる単細胞宿
主細胞によって輸出され又は分泌される蛋白質Ｐ₁のフ
ラグメントを含有する。

【００２７】この実施態様の有利な形によると、蛋白質
Ｐ₁は蛋白質Ｐと異なる。

【００２８】この実施態様の他の有利な形によると、蛋
白質Ｐ₁は蛋白質Ｐと同じである。

【００２９】この複合ハイブリッド蛋白質の他の有利な
実施態様によると、蛋白質Ｐは、ホモ−又はヘテロ二量
体蛋白質からなる群から選ばれる。

【００３０】特に有利な蛋白質Ｐとしては、ホモ二量体
毒素（例えば、破傷風菌毒素、ボツリヌス菌毒素）、フ
ォスファターゼ、特に天然の又は酵素活性を高めるため
に遺伝的に修飾した種々の起源のアルカリフォスファタ
ーゼのようなホモ二量体酵素を挙げることができる（ク
スクス（XUXU）ら，バイオケミストリー（Biochem.），
１９９１，３０，７７８９−７７９６）；ヘテロ二量体
蛋白質、特にサブユニットが二つとも表面において、例
えば、塩橋（salt bridge ）又はヘテロ二量体毒素若し
くはリガンド／溶解性受容体フラクション複合体をあべ
こべにすることにより相補的に修飾されたヘテロ二量体
蛋白質が挙げられる。。

【００３１】本発明によると、前記複合ハイブリッド蛋
白質は、以下からなる同じか又は異なる二つの基本単位
Ｕ及びＵ´を有する： −適当な免疫グロブリンのＬ鎖の可変又は不変領域（Ｖ
_L＋Ｃ_L）を有するペプチド鎖ＳＵ₁、同一の免疫グロブ
リンのＨ鎖の可変領域及びＣ_H１ドメイン（Ｖ_H＋Ｃ
_H１）を有するペプチド鎖ＳＵ₂、この鎖ＳＵ₁及びＳＵ₂
は少なくとも１つのジスルフィド橋によって相互に結合
している、 −及び適当な宿主細胞により輸出又は分泌され、そのＮ
−末端を通じて鎖ＳＵ₁又はＳＵ₂の一つと融合したアル
カリフォスファターゼ（蛋白質Ｐ）の機能性フラグメン
ト、その基本単位Ｕ及びＵ´は、その二量体アルカリフ
ォスファターゼの二つのサブユニットの会合によって連
結している。驚くべきことに、この免疫グロブリンに相
当する二つの機能性抗原結合部位及び付加的な二量体蛋
白質の特有の特性に関する生物学的機能を有する機能性
テトラマーがこのようにして得られる。

【００３２】付加的蛋白質（Ｐ）が酵素、特にアルカリ
フォスファターゼ（alkaline phosphatase）の場合、こ
の複合ハイブリッド蛋白質は、診断の分野（診断薬、メ
ディカルイメージングの試薬）でそのまま使用できる
“比色抗体（colorimetric antibody ）”となる。

【００３３】本発明の主題は、また、本発明の複合ハイ
ブリッド蛋白（complex hybrid protein）の転写単位
（Ｔ１）にも係り、これは、連続的に少なくとも：・１種の適当なプロモーター、・第１のリボソーム結合部位（シャイン−ダルガノ配
列）、・宿主細胞から運び去られるか（export）または排出さ
れ（excrete ）、関連する免疫グロブリンの輸出（expo
rt）をすることが可能な蛋白質Ｐ₁のシグナル配列を含
む第１の配列Ａ、・少なくとも免疫グロブリンのＨ鎖の可変領域及びＣ_H
１ドメインをコードする配列又は免疫グロブリンＬ鎖を
コードする配列からなる核酸配列Ｃ、・少なくとも２量体の（dimeric ）蛋白質Ｐ₁の成熟配
列のサブユニットの機能的なフラグメントをコードする
配列Ｄ、・少なくとも１つのストップコドン、・第２のリボソーム結合部位（シャイン−ダルガノ配
列）、・上記で定義したような第２の配列Ａ、・上記配列Ｃによってコードされていない鎖の配列をコ
ードする核酸配列Ｅ、・１つ又は複数のストップコドン及び・少なくとも１つの転写ターミネーターを含むことを特徴とする。

【００３４】驚くべきことに、そのような構築によっ
て、適当に発現されるときに、診断試薬として特に直接
使用できる、上記で定義したような複合ハイブリッド蛋
白を得ることができる。

【００３５】該転写単位Ｔ１の有利な態様によれば、そ
れは加えて、第１の配列Ａ及び配列Ｃ間並びに第２の配
列Ａ及び上記配列Ｅ間に、成熟蛋白Ｐ₁のＮＨ₂−末端フ
ラグメントをコードする核酸配列Ｂを含有する。

【００３６】この態様の有利な形によれば、Ｐはホモ又
はヘテロの２量体蛋白質（homo- orheterodimeric prot
ein）を含有する群から選択される。

【００３７】この態様の他の有利な形によれば、Ｐ₁と
Ｐは、同一である。

【００３８】後者の形によれば、該転写単位Ｔ１は：・適当なプロモーター、・第１のリボソーム結合部位（シャイン−ダルガノ配
列）、・宿主細胞により運び去られるかまたは分泌されるホモ
又はヘテロの２量体蛋白質の構造遺伝子のシグナル配列
を含む第１の配列Ａ、・成熟したホモ又はヘテロの２量体蛋白質のＮＨ₂−末
端フラグメントをコードする核酸配列を含有する配列
Ｂ、・免疫グロブリンのＨ鎖の可変領域及びＣ_H１ドメイン
をコードする核酸配列又は免疫グロブリンＬ鎖をコード
する配列からなる群から選ばれた配列からなる配列Ｃ、・少なくとも該ホモ又はヘテロの２量体の蛋白質の成熟
配列の機能的なフラグメントをコードするフラグメント
からなる配列Ｄ、・少なくとも１つのストップコドン、・第２のリボソーム結合部位、・上記で定義したような第２の配列Ａ、・成熟のホモ又はヘテロの２量体蛋白質のＮＨ₂−末端
フラグメントをコードする核酸配列を含有する配列Ｂ、・上記配列Ｃによってコードされていない免疫グロブリ
ンの鎖をコードする核酸配列からなる配列Ｅ、・少なくとも１つのストップコドン及び・少なくとも１つの転写ターミネーターからなり、これらすべてのフラグメントは、すべてリー
ディングフレーム（reading frame ）中に存在し、上記
で定義したような複合ハイブリッド蛋白をコードし、該
蛋白は、酵素の特性と免疫グロブリンのＦａｂフラグメ
ントのある特性（相当する抗原を認識する能力）を共に
有する。

【００３９】Ｐがより具体的にはアルカリフォスファタ
ーゼである時、該転写単位Ｔ１は： −以下のもの：・適当なプロモーター、・第１のリボソーム結合部位（シャイン−ダルガノ配
列）、・関連する免疫グロブリンの輸出を可能にする、蛋白質
Ｐ₁のシグナル配列を含む第１の配列Ａ、・免疫グロブリンのＨ鎖の可変領域及びＣ_H１ドメイン
をコードする配列又は免疫グロブリンのＬ鎖をコードす
る配列からなる群から選ばれる核酸配列Ｃ、・アルカリフォスファターゼをコードする配列Ｄ、・少なくとも１つのストップコドン、・第２のリボソーム結合部位、・上記で定義したような第２の配列Ａ、・該免疫グロブリンの上記配列Ｃによってコードされて
いない鎖をコードする核酸配列Ｅ、・少なくとも１つのストップコドン及び・少なくとも１つの転写ターミネーターであり、その転写単位は、加えて、とくに免疫グロブリ
ンをコードするフラグメントの挿入を許すためと、リー
ディングフレーム内、配列Ｃの上流及び／又は下流並び
に配列Ｅの上流及び／又は下流にこれらフラグメントの
全部を配置するために適当な核酸フラグメントを含有
し、且つその転写単位はリーディングフレーム内で上記
で定義したようなハイブリッド蛋白をコードする； −若しくは（Ｐ₁がＰと同一）のもの：・適当なプロモーター、・第１のリボソーム結合部位（シャイン−ダルガノ配
列）、・アルカリフォスファターゼ構造遺伝子のシグナル配列
を含む第１の配列Ａ、・成熟アルカリフォスファターゼの６個のＮ−末端アミ
ノ酸をコードするフラグメントＢ、・免疫グロブリンのＨ鎖の可変領域及びＣ_H１ドメイン
をコードする配列又は免疫グロブリンのＬ鎖をコードす
る配列からなる群から選ばれる核酸配列からなる配列
Ｃ、・残存する該２量体酵素の成熟配列の４４４個のＣ−末
端アミノ酸をコードするフラグメントからなる配列Ｄ、・少なくとも１つのストップコドン、・第２のリボソーム結合部位、・上記で定義したような第２の配列Ａ、・成熟したアルカリフォスファターゼの６個のＮ−末端
アミノ酸をコードするフラグメントＢ、・該免疫グロブリンの上記配列Ｃによってコードされて
いない鎖をコードする上記で定義したような核酸配列
Ｅ、・少なくとも１つのストップコドン及び・少なくとも１つの転写ターミネーターからなる。

【００４０】本発明の転写単位Ｔ１は、その中に配列Ｃ
が成熟のアルカリフォスファターゼの第６のアミノ酸を
コードする第１のトリプレットの後に挿入され且つ配列
Ｅがアルカリフォスファターゼの第６のアミノ酸をコー
ドする第２のトリプレットの後に挿入されているが、特
に、少なくとも１つのユニーク制限部位（unique restr
iction site)を、上記で定義した各挿入位置で、アルカ
リフォスファターゼ−コーディング配列内に挿入するこ
とによって調製される。このアルカリフォスファターゼ
の第６のアミノ酸をコードする第１のトリプレットの領
域中の制限部位は、ｐｈｏＡ遺伝子のリーディングフレ
ームをシフトさせ、アルカリフォスファターゼの発現を
阻害するが、一方、該部位の領域中配列Ｃを挿入するこ
とで、本発明の条件下、アルカリフォスファターゼ遺伝
子が同じ位相に戻りその２量体の形態で発現されるよう
になる。

【００４１】第６のアミノ酸をコードする第２のトリプ
レットの領域中に少なくとも１つの制限部位を挿入する
ことおよびＥ配列を導入することは、フォスファターゼ
の活性に影響を及ぼさない。

【００４２】該転写単位Ｔ１の好ましい変異体（varian
t ）によれば、それは、アルカリフォスファターゼの構
造遺伝子の第１のシグナル配列Ａ、アルカリフォスファ
ターゼの６個のＮ−末端アミノ酸をコードする第１の配
列Ｂ、ＢｇｌII制限部位、免疫グロブリンのＨ鎖の可変
領域及びＣ_H１ドメインをコードする配列又は免疫グロ
ブリンのＬ鎖をコードする配列からなる群から選ばれる
配列Ｃ、ＳａｌＩ制限部位、アルカリフォスファターゼ
の残存する４４４個のＣ−末端アミノ酸をコードするフ
ラグメントＤ、第２の配列Ａ、第２の配列Ｂ、ＳａｃＩ
制限部位、配列Ｃによってコードされていない配列をコ
ードする配列Ｅ、ＸｂａＩ制限部位、少なくとも１つの
ストップコドン及び１つの転写ターミネーターを含有す
る。

【００４３】そのような転写単位Ｔ１は、特に複製起源
を含む適当なベクターに挿入される時、本発明の複合ハ
イブリッド蛋白を直接コードすることができるから、蓄
積される（charged ）と言われる。

【００４４】本発明の主題は、転写単位Ｔ２にも係り、
これは：・１種の適当なプロモーター、・リボソーム結合部位（シャイン−ダルガノ配列）、・蛋白質Ｐ₁における構造遺伝子の第１のシグナル配列
Ａ、２量体の蛋白Ｐの成熟配列の機能的なフラグメント
をコードすることができる配列Ｄおよび第１の配列Ａお
よび配列Ｄ間のジャンクション（junction）に位置し、
上記で定義した配列Ｃを受け取ることができる１つ又は
複数のユニーク制限部位、・少なくとも１つのストップコドン、・１つのリボソーム結合部位（シャイン−ダルガノ配
列）、・上記で定義したような第２の配列Ａ及び配列Ａの下流
に位置し、上記で定義した配列Ｅを受け取ることができ
る１つ又は複数のユニーク制限部位、・少なくとも１つのストップコドン及び・少なくとも１つの転写ターミネーターを含むことを特徴とする。

【００４５】転写単位Ｔ２の有利な態様によれば、それ
は、・適当なプロモーター、・リボソーム結合部位（シャイン−ダルガノ配列）、・蛋白質Ｐ₁における構造遺伝子の第１のシグナル配列
Ａ、・該成熟蛋白質Ｐ₁のＮＨ₂−末端フラグメントをコード
する第１の配列Ｂ、・・成熟蛋白質Ｐ又は蛋白質Ｐ₁の
フラグメントをコードすることができる配列Ｄ及び蛋白
質Ｐ₁をコードする配列のＮＨ₂−末端フラグメントと蛋
白質Ｐをコードする配列の間のジャンクションに位置
し、上記で定義した配列Ｃを受け取ることができる１つ
又は複数のユニーク制限部位、・少なくとも１つのストップコドン、・少なくとも１つのリボソーム結合部位（シャイン−ダ
ルガノ配列）、・上記で定義したような第２の配列Ａ、・上記で定義した第２の配列Ｂ及び配列Ａの下流に位置
し、上記で定義した配列Ｅを受け取ることができる１つ
又は複数のユニーク制限部位、・少なくとも１つのストップコドン及び・少なくとも１つの転写ターミネーターを含む。

【００４６】この態様の有利な形として、Ｐ₁とＰは、
同一である（ホモ又はヘテロの２量体蛋白質）。

【００４７】本発明によれば、プロモーターは、ｐｈｏ
Ａ遺伝子のプロモーター及び任意の他のプロモーターを
含む群から選択される。

【００４８】本発明の主題は、また、本発明の複合ハイ
ブリッド蛋白質における発現及び／又はクローニングベ
クターのファミリーにあり、各々のベクターが、適当な
遺伝子構造物、特にプラスミド、ファージ、コスミド又
は適当な染色体の内部に挿入された本発明の転写単位Ｔ
₁を含有することで特徴付けられる。

【００４９】該ベクターの有利な態様によれば、遺伝子
構造物はプラスミドであり、転写単位Ｔ１は、蛋白質Ｐ
が２量体の酵素である蛋白質Ｐと同一の蛋白質Ｐ₁をコ
ードする遺伝子又は遺伝子フラグメントを含有する。

【００５０】本発明の主題は、また、本発明の複合ハイ
ブリッド蛋白質のための発現及び／又はクローニングベ
クターの別のファミリーにあり、各々のベクターが、適
当な遺伝子構造物、特にプラスミド、ファージ、コスミ
ド又は適当な染色体から選ばれた遺伝子構造物の内部に
挿入された本発明の転写単位Ｔ₂を含有することで特徴
付けられる。

【００５１】そのようなベクターを、ｐＬＩＰ２と呼ば
れる。

【００５２】該構造物がプラスミドである時、後者（プ
ラスミド）は、チャージされないといわれる；配列Ｃ及
びＥが上記で定義したユニーク制限部位の領域に挿入さ
れると、その様なベクターは、本発明のハイブリッド配
列を含有し、直接ハイブリッド蛋白、特に上記で定義し
たような比色抗体（colorimetric antibodies ）を直接
発現する。

【００５３】その様なベクターは、特にｐＬＩＰ１と呼
ばれるチャージされていない（uncharged ）ベクターか
ら調製され、ｐＬＩＰ１は、出願人の会社の名称で出願
されている欧州特許出願第４０７２５９号に記載されて
いる。

【００５４】本発明の主題は、遺伝子の形質転換によっ
て得られる微生物にも係り、これは本発明のベクターを
用いた大腸菌株の適当な修飾、特に該ベクターがプラス
ミドであるとき、形質転換によって得られることで特徴
付けられる。

【００５５】本発明の１つの態様によれば、該微生物
は、上記で定義した転写単位Ｔ２を含有するチャージし
ていないベクターによって形質転換された大腸菌株ＣＣ
１１８が有利である。

【００５６】この態様の有利な形によれば、該微生物
は、１９９２年１月３１日にアンスティテュパストゥ
ールによって開かれているコレクシオンナシオナル
ドクルチュールデミクロオルガニスムスに、番号
Ｉ−１１６８で寄託された。

【００５７】他の宿主細胞は、また本発明の複合ハイブ
リッド分子を産生するために使用される；特に、限定す
ることなく、バクロウイルス類（baculoviruses ）を用
いたシステムのような、（大腸菌、バチルス(Bacillu
s)、ストレプトマイセス(Streptomyces)等の）バクテリ
アや菌類の株、酵母、動物細胞、植物細胞又は混合され
たファージ／宿主細胞の発現システムが挙げられる。

【００５８】本発明の複合ハイブリッド蛋白は、特許出
願４０７２５９で定義したように、ハイブリッド蛋白の
有利さ（安定性、直接使用、２つの蛋白質フラグメント
に存在する機能的特性）を有し、より特異的には、その
ような複合ハイブリッド蛋白は、２つの関連するＦａｂ
フラグメントを保有し、それは蛋白質Ｐの２量化のため
に、環境に依存して、同一または異なっている。

【００５９】蛋白質Ｐがアルカリフォスファターゼの場
合は、バクテリア大腸菌中で産生される比色抗体が、製
造しやすい新規な診断道具を構成する。その２価の性質
（２つの抗原結合部位）が、１価のフラグメントのアフ
ィニティよりも強く認識されるこの抗原の明瞭なアフィ
ニティを与える。それは、実質的により高い検出感受性
となる。

【００６０】化学的に生成されたホモロガスな化合物と
比較して、バクテリアによって合成されるハイブリッド
蛋白質は、ずっと容易に生産でき；実際、化学的に効果
的なトレーサーを調製するために、当業者はモノクロー
ナル抗体を精製し、その存在が特に非特異的な相互作用
をもたらすＦｃフラグメントを除去するための酵素法を
用いてそれを切断し、化学カップリング法を用いて選ば
れた酵素に結合するＦ（ａｂ´）₂フラグメントを精製
し、その後複合体は最終的に精製される。

【００６１】本発明において、該バクテリアは、単純な
抽出工程の後に使用できる２つの機能を有するＦ（ａ
ｂ）₂／アルカリフォスファターゼ複合体を合成し、運
び出し、集合させる。更に、この再生産能は、一般に化
学法によってなされる調製物での場合にはあてはまらな
い調製間に達成される。

【００６２】本発明の主題は、また診断試薬に係り、そ
れは、本発明の複合ハイブリッド蛋白質からなることを
特徴とする。

【００６３】そのような試薬は、特に、受容体の検出に
おいて及び免疫化学マーカーとして免疫酵素アッセイに
適応が見付けられる。

【００６４】本発明の主題は、蛋白質の免疫酵素アッセ
イにおける方法にも係り、それは： −適当な生物学的試料を本発明の診断試薬と接触させる
こと、および −適当な非色反応を用いて複合体及び／又は遊離の形態
で、その診断試薬を検出することで特徴付けられている。

【００６５】更に、本発明の主題は、該免疫酵素学的ア
ッセイを行うにあたり、使用する準備のできたキットに
も係り、それは、アッセイを行うのに要求される適当な
量のバッファー及び試薬に加えて、適当な量の本発明の
試薬を含有することを特徴としている。

【００６６】本発明の試薬は、直接使用できるところが
有利であるが、通常ＥＩＡ又はＥＬＩＳＡアッセイの枠
組みの中で、抗原又は抗体は、酵素に共有結合し、カッ
プリングは化学的になされ；効果的には、そのようなカ
ップリングは、２つの高度に精製された試薬を用いて行
われなければならない。

【００６７】本発明の主題は、治療に使用される薬剤
（agent ）にも関し、それは、本発明の複合ハイブリッ
ド蛋白質からなることを特徴とする。

【００６８】該薬剤の有利な態様によれば、蛋白質Ｐ
は、細胞毒性物質であり、基本単位中に関連する免疫グ
ロブリンフラグメントは、ヒト起源であり、それらは事
前に選択した標的細胞に対して特異性を示す。

【００６９】更に、本発明の主題は、２価で２つの特異
性を有する抗体を産生する方法にも係り、それは： −免疫グロブリンのドメインをコードする部分が異なる
２つの転写単位Ｔ１が、本発明のベクター中で産生さ
れ、該転写単位は、同じプロモーター及び同じ転写ター
ミネーターの制御下にあり、もし必要であれば、 −基本単位Ｕが基本単位Ｕ´とは異なるハイブリッドが
産生され、それはアフィニティークロマトグラフィーに
よって特に選択される。

【００７０】前述の形態に加えて、本発明は、以下に記
載される他の形態も含み、それは本発明の主題である方
法の例示の態様に言及される。

【００７１】しかしながら、これら実施例は、単に本発
明の主題を例示したものに過ぎず、これに限定されない
ことを理解されるべきである。

【００７２】実施例１：微生物中で産生された単一特異
的二価比色定量抗体（Monospecific bivalent colorime
tric antibody ）１）その一つがアルカリホスファターゼに融合している
二つの免疫グロブリンを共発現(co-express)するように
設計されたジシストロンユニット(dicistronicunit)の
構築ａ．ベクターｐＬＩＰ１（欧州特許出願４０７２５９参
照）のＳｍａI 部位への二つの制限部位の導入ベクターｐＬＩＰ１は、その天然プロモーターの制御下
にあるＥ．Ｃｏｌｉアルカリホスファターゼをコードす
る遺伝子を含むプラスミドである。成熟アルカリホスフ
ァターゼに対するコドン＋６と＋７との間に挿入された
ユニークなＳｍａI 制限部位は、ｐｈｏＡ遺伝子のリー
ディングフレームをシフトさせ、各種ヌクレオチド配列
の挿入を可能とする。二つの相補的なオリゴヌクレオチ
ドの合成により得られるカセットを該ＳｍａI 部位に挿
入する。それは、二つのユニークなＢｇｌIIおよびＳａ
ｌI 制限部位を含み、アルカリ性ホスファターゼ遺伝子
のリーディングフレームのシフトを、それがベクターｐ
ＬＩＰ１中に存在するように保存しする。これは、適当
なフラグメント、この場合、免疫グロブリンのＶ_H及び
Ｃ_H１ドメインをコードするヌクレオチド配列がこれら
部位間に挿入されたクローンを次に選択をするためであ
る。

【００７３】ｂ．アルカリホスファターゼ遺伝子の終止
コドン（termination codon ）と同遺伝子の転写終了の
ためのシグナルとの間への合成カセットの導入。これ
は、連続的に（転写ユニットＴ１）下記を含む：・リボソーム結合配列（シャイン−ダルガノ配列）を含
むｐｈｏＡ遺伝子のノンコーディング５´部分・アルカリホスファターゼの最初の６つのアミノ酸及び
シグナルペプチドをコードする配列・二つのユニークな制限部位ＳａｃI 及びＸｂａI ・二つの終止コドン。

【００７４】該ベクターのこの部分は、ｐｈｏＡプロモ
ーターの制御下で、Ｖ_H＋Ｃ_H１／ｐｈｏＡハイブリッ
ドを特定する遺伝子と共に共転写(cotranscribed) さ
れ、蛋白質に翻訳されるべきＶ_L＋Ｃ_Lイムノグロブリ
ン鎖を受けるように設計されており、これはＦｉｇ１に
示されている。Ｆｉｇ１に示されているのは、基本ユニ
ットＵであり、これは、ホモ−又はヘテロダイマー性蛋
白質（homo- or heterodimeric protein）Ｐのサブユニ
ットのＮ−末端と融合したイムノグロブリン鎖（Ｓ
Ｕ₁）を含む。他方のイムノグロブリン鎖（ＳＵ₂）
は、二つのイムノグロブリン鎖を結合するジスルフィド
架橋を介して、ハイブリッド蛋白質に結合している。

【００７５】得られた遺伝子は、Ｆｉｇ２ａに示されて
いる。

【００７６】Ｆｉｇ２ａは、（イムノグロブリンフラグ
メントを有しない）転写ユニットＴ２（空(empty) のｐ
ＬＩＰ２）を示し、プロモーターから出発して順に、シ
ャイン−ダルガノ配列（Ｓ．Ｄ．）、アルカリホスファ
ターゼのシグナル配列（ＳＳ）、成熟アルカリホスファ
ターゼの残基＋１＋６（＋１＋６）、ＢｇｌII制限
部位、ＳａｌI 制限部位、アルカリ性ホスファターゼを
コードするフレームシフト(frameshifited) した遺伝子
（４４４アミノ酸）（フレームシフト化ｐｈｏＡ）、停
止コドン（stop codon）、シャイン−ダルガノ配列
（Ｓ．Ｄ．）、ホスファターゼのシグナル配列（Ｓ
Ｓ）、成熟ホスファターゼの残基＋１＋６（＋１＋
６）、ＳａｃI 制限部位、ＸｂａI 制限部位、二つの停
止コドン及び転写ターミネーター（Ｔ．Ｔ．）を含んで
いる。

【００７７】Ｆｉｇ２ｂは、転写ユニットＴ１（チャー
ジ(charge)されたｐＬＩＰ２）を示し、これは、イムノ
グロブリンフラグメント：即ち、ＢｇｌII制限部位とＳ
ａｌI 制限部位との間のイムノグロブリン重鎖の可変ド
メイン及び最初の定常ドメイン（Ｖ_H＋Ｃ_H１）、およ
びＳａｃI 制限部位とＸｂａI 制限部位の間のイムノグ
ロブリン軽鎖の可変ドメイン及び定常ドメインを有して
いる。

【００７８】プロモーターから出発して、ＲＮＡポリメ
ラーゼは、転写ターミネーター（Ｔ．Ｔ．）で停止する
ユニークな転写物(transcript)を合成する。二つのリボ
ソーム結合部位（Ｓ．Ｄ．）が存在することにより、翻
訳フェーズの間に、二つの異なる蛋白質が合成される。
その第１は、アルカリホスファターゼのＮ−末端に結合
したＩｇＧ重鎖の可変ドメイン及び最初の定常ドメイン
からなる。その第２は、軽ＩｇＧ鎖のみからなる。

【００７９】２）免疫グロブリンをコードするＤＮＡフ
ラグメントの調製考えられるモノクローナル抗体は、蛇神経毒（short sn
ake neurotoxin）に特異的な抗体（ＩｇＧ２ａｋ）Ｍ
α２−３であり、これは、同定され物性が調べられてい
る（トレミュら(TREMEAU et al.)1986、FEBS LETT.、20
8 、２３６−２４０）。

【００８０】Ｆｉｇ３ａは、Ｈ鎖抗体（heavy antibody
chain）Ｍα２−３由来の核酸配列および推定される蛋
白質配列を示す。

【００８１】Ｆｉｇ３Ｂは、Ｌ鎖抗体（light antibody
chain）Ｍα２−３由来の核酸配列および推定される蛋
白質配列を示す。

【００８２】ベクターｐＬＩＰ２に挿入され、適当な制
限部位を導入するフラグメントを、特異的に増幅するの
に使用されるヌクレオチドプライマーの位置は、矢印に
よって示す。これらプライマーの配列は以下の通りであ
る。

【００８３】・Ｈ鎖プライマー

【００８４】

【化１】

【００８５】・Ｌ鎖プライマー

【００８６】

【化２】

【００８７】メッセンジャーＲＮＡを、抗体Ｍα２−３
を分泌するハイブリドーマ細胞から抽出する。従来の技
術を用いて、逆転写酵素によって２本鎖のＲＮＡ／ＤＮ
Ａを得ることができる。その後、鋳型ＲＮＡ鎖を破壊
し、第２のＤＮＡ鎖をＤＮＡポリメラーゼによって合成
する。Ｌ鎖（Ｖ_L＋Ｃ_L）のＤＮＡ配列及びＨ免疫グロブ
リン鎖（Ｖ_H＋Ｃ_H１）のフラグメントを、ポリメラーゼ
連鎖反応技術（ＰＣＲ）に従って、対応する配列の特異
的な増幅によって得る。この増幅に使用されるオリゴヌ
クレオチドプライマーは、増幅されるフラグメントの末
端部分（ends）に相補的であり、それらの５´末端に、
実施例１．１に記載されたベクターへの導入に要求され
る制限部位の配列を保有している。

【００８８】３）免疫グロブリンのＤＮＡフラグメン
トの発現ベクターへの導入Ｈ鎖のＶ_H＋Ｃ_H１のフラグメントを、ベクターのＢｇｌ
IIとＳａｌI 部位へ導入する（ｐｈｏＡ遺伝子の融
合）。挿入後のアルカリフォスファターゼのリーディン
グフレームを位相（phase ）に戻すことができるので、
比色スクリーニングがこの挿入に利用できる。このスク
リーニングにより、免疫グロブリン鎖と融合したアルカ
リフォスファターゼは、全部又は部分的なその酵素の特
性、特に輸出したり、機能的な２量体に結合したりする
能力を保存する。Ｌ鎖（Ｖ_L＋Ｃ_L）を、ベクターのＳａ
ｃI とＸｂａI の部位に導入する。その存在は、制限研
究によって変化する。全構築物を、その後配列化し、全
体のコーディング部分を評価する。期待されるハイブリ
ッド蛋白質、即ち、この構築物の翻訳生成物を、Ｆｉｇ
４に示すが、２つの同一の基本単位Ｕ及びＵ´を含有す
る。これは、複合ハイブリッド蛋白アルカリフォスファ
ターゼ／Ｆ（ａｂ）₂である。

【００８９】４）得られる組換え蛋白質の特徴付けと
特性第１に、得られるバクテリアクローンは、適当な条件
下、それらが含むベクターがＨ鎖フラグメント単独また
はＨ鎖フラグメント及びＬ鎖フラグメントを含む時、ペ
トリ皿中で基質Ｘ−Ｐを加水分解する。Ｌ鎖のみでチャ
ージされたベクターまたは空のベクターは、それが基質
を加水分解する能力を形質転換するバクテリアを与えな
い。同様の結果が、基質ｐＮＰＰの溶液中で得られる。
アルカリフォスファターゼドメインを保有するポリペプ
チド鎖は細胞質膜を通り、活性のある酵素の２量体の中
に結合する。

【００９０】抗アルカリフォスファターゼまたは抗マウ
ス免疫グロブリン抗体でなされる免疫沈殿物は、酵素と
Ｖ_H＋Ｃ_H１免疫グロブリンフラグメントのハイブリッド
蛋白質の存在を示す。

【００９１】Ｆｉｇ５は、バクテリアの周辺細胞質の抽
出（periplasmic extract ）を用いて、抗フォスファタ
ーゼモノクローナル抗体（ＶＩＡＰ）（ウエルＡ、Ｃ、
Ｅ及びＧ）又は抗Ｈ又はＬ鎖ポリクローナル血清（anti
-(H+L)）（ウエルＢ、Ｄ、Ｆ及びＨ）でなされた免疫沈
殿物を例示する。

【００９２】バクテリアは、以下のもののいずれかによ
って形質転換される： i) ベクターｐＬＩＰ１及びｐＬＩＰ２を構築するのに
使用され、天然のアルカリフォスファターゼ遺伝子を含
有した最初のプラスミド（ウエルＡ及びＢ）、 ii) Ｌ鎖のみをコードする配列を含有するプラスミド
ｐＬＩＰ２（ウエルＣ及びＤ）、 iii) ハイブリッド遺伝子Ｖ_H−Ｃ_H１−ｐｈｏＡのみを
含有するプラスミドｐＬＩＰ２（ウエルＥ及びＦ）又は iv) Ｖ_H−Ｃ_H１−ｐｈｏＡ及びＶ_L−Ｃ_L遺伝子が同時
に存在する、完全にチャージされた２つのシストロン性
の（dicistronic ）オペロン（Ｆｉｇ２ｂ参照）を含有するプラスミドｐＬＩＰ２（ウエルＧ及びＨ）。

【００９３】コントロールの実験として、使用される２
種の抗体溶液が空のベクターで形質転換されたバクテリ
アのいかなる周辺細胞質蛋白を沈殿させないことを確認
した。ｐｈｏＡのみの分子量のバンドの存在（ウエル
Ａ）及び非存在（ウエルＢ）は、使用した２種の抗体溶
液の選択性を特徴付ける。２種の中間の構築物、Ｌ鎖の
み及びＶ_H−Ｃ_H１−ｐｈｏＡハイブリッドは、それぞ
れ、ウエルＣ、Ｄ及びＥ、Ｆで特徴付けられる。

【００９４】Ｌ鎖は、抗（Ｈ＋Ｌ）血清によってのみ免
疫沈殿される（２４ｋＤのバンド）が、Ｖ_H−Ｃ_H１−ｐ
ｈｏＡハイブリッドは、その部分のために、ＶＩＡＰ及
び抗（Ｈ＋Ｌ）血清によって明らかにされる（７２ｋＤ
のバンド）。これらの結果により、Ｆｉｇ２Ａおよび２
Ｂに示される２つのシストロン性のオペロンが機能的で
あることが、明確に判明する。最後に、チャージされた
プラスミドｐＬＩＰ２／Ｆａｂで形質転換されたバクテ
リアは、それらの周辺細胞質内で、Ｌ鎖とハイブリッド
Ｈ鎖の期待する分子量の２つの蛋白質を産生する。これ
ら化合物は共に、ＶＩＡＰ及び抗（Ｈ＋Ｌ）血清によっ
て、等しく免疫沈殿される。

【００９５】追跡の実験を、フォスフェートの添加によ
るｐｈｏＡプロモーターをブロックすることによって行
った。１時間の追跡の後、免疫沈殿したバンドの減少は
観察されず、分解物のバンドも現れなかった。合成され
るハイブリッド蛋白質はそれゆえ安定である。これは、
酸性のアフィニティカラム精製条件に表れる抵抗性によ
って確認される。

【００９６】Ｌ及びＨのハイブリッド鎖間のジスルフィ
ド結合の存在は、精製されたハイブリッド上で観察され
る。確かに、蛋白質を非還元のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに
のせると、９７ｋＤの優勢な蛋白質バンドの存在が明ら
かになり、それは、還元条件下で、完全に２４及び７２
ｋＤの２つのバンドに解離する。これらの結果全てによ
って、チャージされたベクター（ｐＬＩＰ２／Ｆａｂ）
で形質転換されたバクテリアが、それらの周辺細胞質中
で、ジスルフィド結合を介してＨｐｈｏＡ鎖と結合す
るＬ鎖からなるハイブリッド化合物を産生することが明
瞭に判明する。

【００９７】Ｆ（ａｂ）₂−ｐｈｏＡハイブリッドの結
合特性を、アフィニティカラム（セファロースゲルに結
合したアルファ−トキシン）で精製したハイブリッドを
用いて研究した。放射免疫実験を、以前ボーラインら
（BOULAIN et al., バイオケミストリー(Biochemistr
y)、1982、2910-2915 ）によって記載された方法に従っ
て、精製したハイブリッドと種々の濃度のトリチウム化
されたアルファ−トキシン（１２Ｃｉ／mmol）間で行っ
た。得られた飽和曲線によって（Ｆｉｇ６）、Ｆ（ａ
ｂ）₂−ｐｈｏＡハイブリッドは、特異的に且つ飽和状
態でトリチウム化されたアルファ−トキシンに結合した
ことが示される。この曲線から得られるスカッチャード
プロット（Ｆｉｇ６）によって、ホモロガスなハイブリ
ッドなポピュレーションを示す直線が得られる。直線の
勾配から推定される見掛けの解離定数は、１３ｎＭであ
り、天然の抗体を使用して同条件下で得られる１０ｎＭ
に匹敵する値である。結論としては、Ｆａｂフラグメン
トのＣ末端でのｐｈｏＡの存在は、２つの免疫グロブリ
ンの鎖の結合も、そのターゲットである抗体フラグメン
トのアフィニティも破壊しない。

【００９８】実施例２：本発明のハイブリッド蛋白質を
使用する免疫酵素学的試験トキシンが吸着するプレートを使用して行うＥＬＩＳＡ
試験によって、酵素活性を有するハイブリッド蛋白質の
トキシンへの特異的な結合を可視化することが可能にな
る。

【００９９】Ｆｉｇ７に、本発明のハイブリッド蛋白
質、Ｆ（ａｂ）₂−ｐｈｏＡの吸着されたα−トキシン
（１μｇ／ｍｌ）上への結合阻害カーブを、遊離のα−
トキシンの濃度を増加することによって例示する。この
ハイブリッド蛋白質の推定されるＩＣ₅₀は、２×１０^-8
Ｍである。

【０１００】Ｆｉｇ８に、ハイブリッド蛋白質、Ｆ（ａ
ｂ）₂／ｐｈｏＡ又は公知の化学カップリングによって
得られる試薬Ｍα２−３／ペルオキシダーゼを使用し
て、遊離のα−トキシンの濃度を増加することによっ
て、該ハイブリッド蛋白質の吸着されたα−トキシン上
への結合阻害カーブの比較を例示する。これら２つの試
薬から得られるＩＣ₅₀値は、それぞれ２×１０^-8Ｍ及び
０．９×１０^-8Ｍであり、これは、本発明のハイブリッ
ド蛋白質が、特異的な有利さ及び長くで困難な精製ステ
ップのない非常に単純なその生産工程を有し、基質の存
在下で２４時間以上酵素活性が持続するので、バクテリ
アによる産生中の及び酵素試験中の安定性を補助する一
方で、診断試薬として、化学試薬の感受性と同タイプの
感受性を保持していることを示している。

【０１０１】実施例３：２価の比色抗体の産生１）ハイブリッド遺伝子の特徴と構築別の比色抗体を、ｐｈｏＡと、ヒト免疫グロブリンのＩ
ｇＧクラスのＦａｂフラグメントに非常に特異的な、Ｉ
ｇＧ１／カッパータイプのマウスモノクローナル抗体
（Ｍａｂ１７Ｆ１２）間で構築した。

【０１０２】実施例１と比較して、この第２の構築物は
以下の点で特徴付けられる： i) Ｈ抗体鎖のサブクラス、 ii) タイプＩｇＧヒト抗体の存在を検出できるので、血
清学的診断分野で明らかに興味のある抗体の特異性。

【０１０３】実際的視点から、このハイブリッドの構築
物に適合した方法は、実施例１に記載したそれと同一で
ある。ＰＣＲ実験中使用するプライマーのみが異なり、
新しい抗体の配列に適合している。チャージされたプラ
スミドは、Ｆ（ａｂ）₂／１７Ｆ１２／ｐｈｏＡと呼ば
れる。

【０１０４】２）組換え蛋白質の特徴付けと特性適当な条件下、ハイブリッドＨ鎖のみの遺伝子を含むプ
ラスミド又はＬ鎖の遺伝子と結合したハイブリッドＨ鎖
の遺伝子を含有するプラスミドで形質転換されたバクテ
リアは、フォスファターゼ活性を保持しており、ペトリ
皿中色素生産性の基質（Ｘ−Ｐ）を加水分解する。同様
な結果が、基質ｐＮＰＰの溶液中で得られる。

【０１０５】チャージされたベクターで形質転換された
バクテリアの周辺細胞質中の両方のハイブリッド抗体鎖
（Ｖ_H−Ｃ_H１−ｐｈｏＡ及びＶ_L＋Ｃ_L）が同時に存在す
ることが、実施例１に記載したのと同様なラベル化及び
免疫沈殿実験によって可視化される。

【０１０６】ゲル上に得られる蛋白質プロフィールは、
実施例１のＦｉｇ５に記載したのと厳密に同様であっ
た。

【０１０７】これらの実験すべてから、本発明の比色抗
体−産生システムは、種々のサブクラスの免疫グロブリ
ンに適用できることが明らかに示される。

【０１０８】実施例４：実施例３に従ってハイブリッド
蛋白質を使用するＥＬＩＳＡタイプの免疫酵素試験ハイブリッドＦ（ａｂ）₂／１７Ｆ１２／ｐｈｏＡの特
異性を、種々のクラス及びサブクラスのヒト及び動物の
免疫グロブリンが吸着されているマイクロタイタープレ
ートを用いてＥＬＩＳＡ試験によって研究した。（ラム
ダ又はカッパＬ鎖で結合している）ＩｇＧ１のサブクラ
ス２、３又は４、ヒトＩｇＭｓ及びラット、ヤギ及びウ
サギＩｇＧｓを試験した。以下の表１に本来のモノクロ
ーナル抗体の特性及び組換えハイブリッドの特性を比較
する。

【０１０９】

【表１】

【０１１０】これらの結果により、比色抗体の形態でバ
クテリア中に発現する抗体の抗原特異性が厳密に保存さ
れていることが判る。

【０１１１】クラスＧヒト免疫グロブリンに特異的なの
で、そのような試薬は、診断分野において特に興味深
い。

【０１１２】この試薬は、特に抗体の捕獲に基づく血清
試験において価値がある。

【０１１３】これら試験の一般的な原理は、以下のよう
である：抗体は、抗原を保持する固相上に特異的にトラ
ップされる。本発明の比色抗体は、捕獲された抗体の存
在を明らかにする。

【０１１４】それゆえ、この実施例によって本発明は１
つの抗体サブクラスから他のものへの通過が許されるこ
とが示され、それような通過は、発現の問題又はハイブ
リッド分子の安定性の問題を特に示さない。

【０１１５】上述したことから明らかなように、本発明
は、明快に示した説明、態様及び適用に限られることは
なく、一方、本発明の枠組み又は範囲から離れること無
く従来技術によって起こり得るすべての変異体を含むも
のである。

【０１１６】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：３２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GGGGGAGATC TCAGATCCAG CTGCAGCAGT CT 32 配列番号：２配列の長さ：３４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GGGGGAGTCG ACCAATTTTC TTGTCCACCT TGGT 34 配列番号：３配列の長さ：３３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GGAGCTCAGT ATTGTGATGA CCCAGACTCC CAA 33 配列番号：４配列の長さ：２８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GTCTAGATTA ACACTCATTT CTGTTGAA 28 配列番号：５配列の長さ：１５８１配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列 CCCCGGGTAC CGAGCTCGAA TTCGCGGCCG CCACAGTTCC TGAAGACACT GACTCTAACC 60 ATG GGA TGG AGC TGG ATC TTT CTT TTC CTC CTG TCA GGA ACT GCA GGT 108 Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly -19 -15 -10 -5 GTC CAT TGC CAG ATC CAG CTG CAG CAG TCT GGA CCT GAG CTG GTG AAG 156 Val His Cys Gln Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys -1 1 5 10 CCA GGG GCT TCA GTG AAG ATA TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTC 204 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 15 20 25 ACT GAC TAC TAT ATA AAC TGG GTG AAG CAG AAG CCT GGA CAG GGA CTT 252 Thr Asp Tyr Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu 30 35 40 45 AAA TGG ATT GGA TGG ATT TAT CCT GCA AGC GGT AAT ACT AAG TAC AAT 300 Lys Trp Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Ala Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn 50 55 60 GAG AAC TTC AAG GGC AAG GCC ACA TTG ACT GTA GAC ACA TCC TCC AGC 348 Glu Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser 65 70 75 ACA GCC TAC ATG CAG CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC ACT GCT GTC 396 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val 80 85 90 TAT TTC TGT GCA AGA GCT ATG GGG GCT ACG GCT ACA CTT TTG GAC TAC 444 Tyr Phe Cys Ala Arg Ala Met Gly Ala Thr Ala Thr Leu Leu Asp Tyr 95 100 105 TGG GGC CAA GGC ACC ACT CTC ACA GTC TCC TCA GCC AAA ACA ACA GCC 492 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala 110 115 120 125 CCA TCG GTC TAT CCA CTG GCC CCT GTG TGT GGA GAT ACA ACT GGC TCC 540 Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser 130 135 140 TCG GTG ACT CTA GGA TGC CTG GTC AAG GGT TAT TTC CCT GAG CCA GTG 588 Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 ACC TTG ACC TGG AAC TCT GGA TCC CTG TCC AGT GGT GTG CAC ACC TTC 636 Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe 160 165 170 CCA GCT GTC CTG CAG TCT GAC CTC TAC ACC CTC AGC AGC TCA GTG ACT 684 Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr 175 180 185 GTA ACC TCG AGC ACC TGG CCC AGC CAG TCC ATC ACC TGC AAT GTG GCC 732 Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala 190 195 200 205 CAC CCG GCA AGC AGC ACC AAG GTG GAC AAG AAA ATT GAG CCC AGA GGG 780 His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly 210 215 220 CCC ACA ATC AAG CCC TGT CCT CCA TGC AAA TGC CCA GCA CCT AAC CTC 828 Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu 225 230 235 TTG GGT GGA CCA TCC GTC TTC ATC TTC CCT CCA AAG ATC AAG GAT GTA 876 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val 240 245 250 CTC ATG ATC TCC CTG AGC CCC ATA GTC ACA TGT GTG GTG GTG GAT GTG 924 Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 255 260 265 AGC GAG GAT GAC CCA GAT GTC CAG ATC AGC TGG TTT GTG AAC AAC GTG 972 Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val 270 275 280 285 GAA GTA CAC ACA GCT CAG ACA CAA ACC CAT AGA GAG GAT TAC AAC AGT 1020 Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser 290 295 300 ACT CTC CGG GTG GTC AGT GCC CTC CCC ATC CAG CAC CAG GAC TGG ATG 1068 Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met 305 310 315 AGT GGC AAG GAG TTC AAA TGC AAG GTC AAC AAC AAA GAC CTG CCA GCG 1116 Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala 320 325 330 CCC ATC GAG AGA ACC ATC TCA AAA CCC AAA GGG TCA GTA AGA GCT CCA 1164 Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro 335 340 345 CAG GTA TAT GTC TTG CCT CCA CCA GAA GAA GAG ATG ACT AAG AAA CAG 1212 Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln 350 355 360 365 GTC ACT CTG ACC TGC ATG GTC ACA GAC TTC ATG CCT GAA GAC ATT TAC 1260 Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr 370 375 380 GTG GAG TGG ACC AAC AAC GGG AAA ACA GAG CTA AAC TAC AAG AAC ACT 1308 Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr 385 390 395 GAA CCA GTC CTG GAC TCT GAT GGT TCT TAC TTC ATG TAC AGC AAG CTG 1356 Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu 400 405 410 AGA GTG GAA AAG AAG AAC TGG GTG GAA AGA AAT AGC TAC TCC TGT TCA 1404 Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser 415 420 425 GTG GTC CAC GAG GGT CTG CAC AAT CAC CAC ACG ACT AAG AGC TTC TCC 1452 Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser 430 435 440 445 CGG ACT CCG GGT AAA TGAGCTCAGC ACCCACAAAA CTCTCAGGTC CAAAGAGACA 1507 Arg Thr Pro Gly Lys ４５０ＣＣＣＡＣＡＣＴＣＡＴＣＴＣＣＡＴＧＣＴＴＣＣＣＴＴＧＴＡＴＡＡＡ
ＴＡＡＡＧＣＡＣＣＣＡＧＣＡＡＴＧＣＣＴＧＧＧＡＣＣＡ１５６７ＴＧＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
1581 配列番号：６配列の長さ：８８２配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列 GTA TTT CTA CTG CTC TGT GTG TCT GGT GCT CAT GGG AGT ATT GTG ATG 48 Val Phe Leu Leu Leu Cys Val Ser Gly Ala His Gly Ser Ile Val Met -12 -10 -5 -1 1 ACC CAG ACT CCC AAA TTC CTG CTT CTA TCA GCA GGA GAC AGG GTT ACC 96 Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Leu Ser Ala Gly Asp Arg Val Thr 5 10 15 20 ATA ACC TGC AAG GCC AGT CAG AGT GTG AGT AAT GAT GTA GCT TGG TAC 144 Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Ala Trp Tyr 25 30 35 AAG CCA GGG CAG TCT CCT AAA CTG CTG ATA CAA CAG TAC TAT GCA TCC 192 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser 40 45 50 AGT CGC TAC ACT GGA GTC CCT GAT CGC TTC ACT GGC AGT GGA TAT GGG 240 Ser Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Tyr Gly 55 60 65 ACG GAT TTC ACT TTC ACC ATC AGC ACT GTG CAG GCT GAA GAC CTG GCA 288 Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala 70 75 80 GTT TAT TTC TGT CAG CAG GAT TAT AGC TCT TAC ACG TTC GGA GGG GGG 336 Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Tyr Thr Phe Gly Gly Gly 85 90 95 100 ACC AAG CTG GAA ATA AAA CGG GCT GAT GCT GCA CCA ACT GTA TCC ATC 384 Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile 105 110 115 TTC CCA CCA TCC AGT GAG CAG TTA ACA TCT GGA GGT GCC TCA GTC GTG 432 Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val 120 125 130 TGC TTC TTG AAC AAC TTC TAC CCC AAA GAC ATC AAT GTC AAG TGG AAG 480 Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys 135 140 145 ATT GAT GGC AGT GAA CGA CAA AAT GGC GTC CTG AAC AGT TGG ACT GAT 528 Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp 150 155 160 CAG GAC AGC AAA GAC AGC ACC TAC AGC ATG AGC AGC ACC CTC ACG TTG 576 Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu 165 170 175 180 TAT GAA CGA CAT ACC AAG GAC GAG AAC AGC TAT ACC TGT GAG GCC ACT 624 Tyr Glu Arg His Thr Lys Asp Glu Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr 185 190 195 CAC AAG ACA TCA ACT TCA CCC ATT GTC AAG AGC TTC AAC AGG AAT GAG 672 His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu 200 205 210 TGT TAGAGACAAA GGTCCTGAGA CGCCACCACC AGCTCCCCAG CTCCATCCTA 725 Cys 213 TCTTCCCTTC TAAGGTCTTG GAGGCTTCCC CACAAGCGAC CTACCACTGT TGCGGTGCTC 785 CAAACCTCCT CCCCACCTCC TTCTCCTCCT CCTCCCTTTC CTTGGCTTTT ATCATGCTAA 845 TATTTGCAGA AAATATTCAA AAAGTGAGTC TTTGCAC ８８
２

【図面の簡単な説明】

【図１】基本ユニットＵを示す。

【図２】Ｆｉｇ２ａは、空のベクターに相当する転写単
位を示し、Ｆｉｇ２ｂは、チャージされたベクターに相
当する転写単位を示す。

【図３】Ｈ鎖抗体Ｍα２−３由来の核酸配列および推定
される蛋白質配列を示す。

【図４】Ｈ鎖抗体Ｍα２−３由来の核酸配列および推定
される蛋白質配列（つづきその１）を示す。

【図５】Ｈ鎖抗体Ｍα２−３由来の核酸配列および推定
される蛋白質配列（つづきその２）を示す。

【図６】Ｌ鎖抗体Ｍα２−３由来の核酸配列および推定
される蛋白質配列を示す。

【図７】Ｌ鎖抗体Ｍα２−３由来の核酸配列および推定
される蛋白質配列（つづき）を示す。

【図８】本発明の複合ハイブリッド蛋白質を示す。

【図９】バクテリアの周辺細胞質の抽出（ｐｅｒｉｐｌ
ａｓｍｉｃｅｘｔｒａｃｔ）を用いて、抗フォスフ
ァターゼモノクローナル抗体（ＶＩＡＰ）（ウエルＡ、
Ｃ、Ｅ及びＧ）又は抗Ｈ又はＬ鎖ポリクローナル血清
（anti-(H+L)）（ウエルＢ、Ｄ、Ｆ及びＨ）でなされた
免疫沈殿物を例示する。

【図１０】Ｆ（ａｂ）₂−ｐｈｏＡハイブリッドの結合
特性を、放射免疫実験により検討した結果を示すグラフ
である。但し、解離定数Ｋ（直線の勾配）は１３ｎＭで
ある。

【図１１】本発明のハイブリッド蛋白質、Ｆ（ａｂ）₂
−ｐｈｏＡの吸着されたα−トキシン（１μｇ／ｍｌ）
上への結合阻害カーブを、遊離のα−トキシンの濃度を
増加することによって例示する。

【図１２】ハイブリッド蛋白質、Ｆ（ａｂ）₂／ｐｈｏ
Ａ又は公知の化学カップリングによって得られる試薬Ｍ
α２−３／ペルオキシダーゼを使用して、遊離のα−ト
キシンの濃度を増加することによって、該ハイブリッド
蛋白質の吸着されたα−トキシン上への結合阻害カーブ
の比較を例示する。●は、Ｂ／Ｂｏ（％）：Ｆａｂ２／
ＰｈｏＡを示し、○は、Ｂ／Ｂｏ（％）Ｍα２−３／ペ
ルオキシダーゼを示す。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成６年２月１４日

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】】

【図１１】

【図９】

【図１０】

【図１２】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｇ０１Ｎ 33/531 Ａ 8310−2Ｊ // Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｎ 8310−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者ダニエルジレーフランス国 75020 パリリュドベルビユ 154 (72)発明者アンドレメネスフランス国 78470 サンレミレシュブルーズマニーレザモーアベニュクロードニコラルドウ 109

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】他の蛋白質Ｐと融合した免疫グロブリンフ
ラグメントを含むタイプのハイブリッド蛋白質であっ
て、（１）ＳＵ₁はＬ鎖免疫グロブリン（light immuno
globulin chain）の可変（variable) および不変（cons
tant）領域を有し、ＳＵ₂はＨ鎖免疫グロブリン（heav
y immunoglobulin chain）の少なくとも可変領域および
Ｃ_H１ドメインを有し、該ペプチド鎖ＳＵ₁およびＳＵ
₂が互いに少なくとも１つのジスルフィド架橋によって
結合している、２種の異なるペプチド鎖ＳＵ₁およびＳ
Ｕ₂；および（２）ペプチド鎖ＳＵ₁およびＳＵ₂の１
種のＮ末端を介して融合した２量体蛋白質Ｐの２つのサ
ブユニットの１種の機能性フラグメントの少なくとも１
種からなる基本単位Ｕを有し；基本単位Ｕが、基本単位
Ｕと同一または異なる他の基本単位Ｕ´と、蛋白質Ｐの
サブユニットまたはそのフラグメントにより結合してい
る複合ハイブリッド配列からなることを特徴とするハイ
ブリッド蛋白質。
【請求項２】ペプチド鎖ＳＵ₁およびＳＵ₂が、そのＮ
末端の上流側の、バクテリアまたは真菌類（イー．コ
リ，バチルス，ストレプトマイセス（Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ，ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）など）、
酵母類、哺乳類細胞、植物細胞、およびバクロウイルス
を用いるシステムのような混合ファージ／宿主細胞発現
システムからなる群から選ばれる単細胞の宿主細胞によ
り輸送（exported）または分泌される（secreted）蛋白
質Ｐ₁のフラグメントを有することを特徴とする請求項
１に記載のハイブリッド蛋白質。
【請求項３】蛋白質Ｐ₁が蛋白質Ｐと異なることを特徴
とする請求項２に記載のハイブリッド蛋白質。
【請求項４】蛋白質Ｐ₁が蛋白質Ｐと同一であることを
特徴とする請求項２に記載のハイブリッド蛋白質。
【請求項５】蛋白質Ｐが、ホモ−またはヘテロ−２量体
蛋白質からなる群から選ばれることを特徴とする請求項
１〜４のいずれかに記載のハイブリッド蛋白質。
【請求項６】前記複合ハイブリッド蛋白質が、同一また
は異なった２種の基本単位ＵおよびＵ₁を有し、その各
々が：（１）適当な免疫グロブリンのＬ鎖の可変及び不変領域
（Ｖ_L＋Ｃ_L）を有するペプチド鎖ＳＵ₁からなり、お
よび、同一の免疫グロブリンのＨ鎖の可変領域及びＣ_H
１ドメイン（Ｖ_H＋Ｃ_H１）を有するペプチド鎖ＳＵ₂
からなり、鎖ＳＵ₁およびＳＵ₂が少なくとも１種のジ
スルフィド架橋により互いに結合されている；および
（２）ＳＵ₁またはＳＵ₂鎖の１種のＮ末端を介して融
合した、適当な宿主細胞により輸送または排出されるア
ルカリフォスファターゼ（alkaline phosphatase）の機
能性フラグメントからなり、基本単位ＵおよびＵ´が２
量体のアルカリフォスファターゼの２つのサブユニット
の集合（assembling）によって連結されている；ことを
特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のハイブリッ
ド蛋白質。
【請求項７】少なくとも以下のものを連続的に含有する
ことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の複合
ハイブリッド蛋白質のための転写ユニット：・１つの適当なプロモーター・第１のリボソーム結合部位（シャイン−ダルガノ（Sh
ine-Dalgano)配列）、・宿主細胞によって輸出または排出され、結合する免疫
グロブリン類の輸送を許容し得る蛋白質Ｐ₁のシグナル
配列を有する第１配列Ａ、・免疫グロブリンのＨ鎖の少なくとも可変領域およびＣ
_H１ドメインをコードする配列、または免疫グロブリン
のＬ鎖をコードする配列からなる群から選ばれる配列か
らなる核酸配列Ｃ、・少なくとも２量体蛋白質Ｐの成熟配列のサブユニット
の機能性フラグメントをコードする配列Ｄ、・少なくとも１つのストップコドン、・第２のリボソーム結合部位（シャイン−ダルガノ配
列）、・上記に定義された第２配列Ａ、・上記配列Ｃによってはコードされない鎖配列をコード
する核酸配列Ｅ、・１または２種以上のストップコドン、および・１種の転写ターミネーター。
【請求項８】第１配列Ａと配列Ｃの間および第２配列Ａ
と上記配列Ｅの間で、成熟蛋白質Ｐ₁のＮＨ₂末端フラ
グメントをコードする核酸配列Ｂをさらに有することを
特徴とする請求項７に記載の転写ユニット。
【請求項９】蛋白質Ｐ₁が蛋白質Ｐと同一であることを
特徴とする請求項８に記載の転写ユニット。
【請求項１０】蛋白質Ｐが、ホモ−またはヘテロ−２量
体蛋白質からなる群から選ばれることを特徴とする請求
項９に記載の転写ユニット。
【請求項１１】以下のものからなり：・１つの適当なプロモーター・第１のリボソーム結合部位（シャイン−ダルガノ配
列）、・宿主細胞によって輸送または分泌される、ホモ−また
はヘテロ−２量体蛋白質の構造遺伝子のシグナル配列を
有する第１配列Ａ、・成熟したホモ−またはヘテロ−２量体蛋白質のＮＨ₂
末端フラグメントをコードする核酸配列を有する配列
Ｂ、・免疫グロブリンのＨ鎖の可変領域およびＣ_H１ドメイ
ンをコードする核酸配列、または免疫グロブリンのＬ鎖
をコードする配列からなる群から選ばれる配列からなる
配列Ｃ、・前記ホモ−またはヘテロ−２量体蛋白質Ｐの成熟配列
の機能性フラグメントの少なくとも１種をコードするフ
ラグメントからなる配列Ｄ、・少なくとも１つのストップコドン、・第２のリボソーム結合部位、・上記に定義された第２配列Ａ、・成熟したホモ−またはヘテロ−２量体蛋白質のＮＨ₂
−末端フラグメントをコードする核酸配列を有する配列
Ｂ・上記配列Ｃによってはコードされない前記免疫グロブ
リンの鎖をコードする核酸配列からなる配列Ｅ、・少なくとも１種のストップコドン、および・少なくとも１種の転写ターミネーターこれらフラグメントの全てがリーディングフレーム中に
あり、請求項１〜６のいずれかに記載の複合ハイブリッ
ド蛋白質をコードし、酵素としての性質および免疫グロ
ブリンのＦａｂフラグメントの一定の性質をいずれも有
することを特徴とする請求項８〜１０のいずれかに記載
の転写ユニット。
【請求項１２】前記ホモ−およびヘテロ−２量体蛋白質
がアルカリフォスファターゼであることを特徴とする請
求項１１に記載の転写ユニット。
【請求項１３】以下のものからなることを特徴とする請
求項１２に記載の転写ユニット：・１つの適当なプロモーター・第１のリボソーム結合部位（シャイン−ダルガノ配
列）、・アルカリフォスファターゼ構造遺伝子のシグナル配列
を有する第１配列Ａ、・成熟アルカリフォスファターゼの６個のＮ−末端アミ
ノ酸をコードするフラグメントＢ・免疫グロブリンのＨ鎖の可変領域およびＣ_H１ドメイ
ンをコードする配列、または免疫グロブリンのＬ鎖をコ
ードする配列からなる群から選ばれる核酸配列からなる
配列Ｃ、・前記２量体酵素の成熟配列の残余の４４４個のＣ末端
アミノ酸をコードするフラグメントからなる配列Ｄ、・少なくとも１つのストップコドン、・第２のリボソーム結合部位、・上記に定義された第２配列Ａ、・成熟アルカリフォスファターゼの６個のＮ−末端アミ
ノ酸をコードするフラグメントＢ・前記免疫グロブリンの上記配列Ｃによってはコードさ
れない鎖をコードする上記に定義された核酸配列Ｅ、・少なくとも１種のストップコドン、および・少なくとも１種の転写ターミネーター。
【請求項１４】特に免疫グロブリンをコードするフラグ
メントの挿入を可能にし、且つ該フラグメントの全体を
リーディングフレーム内に配置するために、さらに配列
Ｃの上流および／または下流、および配列Ｅの上流およ
び／または下流に適当な核酸フラグメントを有し、転写
ユニットがリーディングフレーム中で請求項１〜６のい
ずれかに記載のハイブリッド蛋白質をコードすることを
特徴とする請求項１３に記載の転写ユニット。
【請求項１５】アルカリフォスファターゼ構造遺伝子の
第１シグナル配列Ａ、アルカリフォスファターゼの６個
のＮ−末端アミノ酸をコードする第１の配列Ｂ、Ｂｇｌ
II制限部位、免疫グロブリンのＨ鎖の可変領域およびＣ
_H１ドメインをコードする配列、または免疫グロブリン
のＬ鎖をコードする配列からなる群から選ばれる配列
Ｃ、ＳａｌI 制限部位、アルカリフォスファターゼの残
余の４４４個のＣ末端アミノ酸をコードするフラグメン
トＤ、第２配列Ａ、第２配列Ｂ、ＳａｌI 制限部位、配
列Ｃによってはコードされない配列をコードする配列
Ｅ、ＸｂａＩ制限部位、少なくとも１種のストップコド
ンおよび１種の転写ターミネーターを有することを特徴
とする請求項１４に記載の転写ユニット。
【請求項１６】以下のものを有することを特徴とする転
写ユニットＴ２：・１つの適当なプロモーター・リボソーム結合部位（シャイン−ダルガノ配列）、・蛋白質Ｐ₁の構造遺伝子の第１シグナル配列Ａ、２量
体蛋白質Ｐの成熟配列の機能性フラグメントをコードし
得る配列Ｄおよび、第１配列Ａと配列Ｄの間の接合部
（junction）に位置し、免疫グロブリンのＨ鎖の可変領
域およびＣ_H１ドメインをコードする配列、または免疫
グロブリンのＬ鎖をコードする配列からなる群から選ば
れる配列Ｃを受け入れることができる１または２以上の
ユニーク制限部位（unique restriction site ）、・少なくとも１つのストップコドン、・１つのリボソーム結合部位（シャイン−ダルガノ配
列）、・上記の定義された第２配列Ａおよび前記配列Ａの下流
側に位置し且つ、上記配列Ｃによってはコードされない
配列をコードする配列Ｅを受け入れることのできる１ま
たは２種以上のユニーク制限部位、・少なくとも１種のストップコドン、および・１種の転写ターミネーター。
【請求項１７】以下のものを有することを特徴とする請
求項１６に記載の転写ユニットＴ２：・１つの適当なプロモーター・リボソーム結合部位（シャイン−ダルガノ配列）、・蛋白質Ｐ₁の構造遺伝子の第１シグナル配列Ａ、・成熟蛋白質Ｐ₁のＮＨ₂末端フラグメントをコードす
る配列Ｂ、成熟蛋白質Ｐまたは成熟蛋白質Ｐのフラグメ
ントをコードし得る配列Ｄ、および蛋白質Ｐ₁をコード
する配列のＮＨ₂末端フラグメントと蛋白質Ｐをコード
する配列のジャンクションに位置し、上記に定義された
配列Ｃを受け入れることができる１または２以上のユニ
ーク制限部位、・少なくとも１つのストップコドン、・１つのリボソーム結合部位（シャイン−ダルガノ配
列）、・上記に定義された第２配列Ａ・上記に定義された第２配列Ｂおよび該配列Ａの下流側
に位置し、上記配列Ｅを受け入れることができる１また
は２以上のユニーク制限部位、・少なくとも１種のストップコドン、および・１種の転写ターミネーター。
【請求項１８】蛋白質Ｐ₁が蛋白質Ｐと同一であること
を特徴とする請求項１７に記載の転写ユニット。
【請求項１９】前記プロモーターが、ｐｈｏＡ遺伝子の
プロモーターおよび他の任意のプロモーターからなる群
から選ばれることを特徴とする請求項７〜１７のいずれ
かに記載の転写ユニット。
【請求項２０】各ベクターが、特にプラスミド類、ファ
ージ類、コスミド類または適当な染色体からなる群から
選ばれる適当な遺伝子構造物の内側に挿入された請求項
７〜１５および１９のいずれかに記載の転写ユニットＴ
₁を含有することを特徴とする請求項１〜６のいずれか
に記載の複合ハイブリッド蛋白質用の発現および／また
はクローニングベクターのファミリー。
【請求項２１】遺伝子構造物がプラスミドであり、転写
ユニットＴ₁が蛋白質Ｐと同一の蛋白質Ｐ₁をコードす
る遺伝子または遺伝子フラグメントを有し、蛋白質が２
量体酵素であることを特徴とする請求項２０に記載のベ
クターのファミリー。
【請求項２２】各ベクターが、特にプラスミド類、ファ
ージ類、コスミド類または適当な染色体からなる群から
選ばれる適当な遺伝子構造物の内側に挿入された請求項
１６〜１９のいずれかに記載の転写ユニットＴ₂を含む
ことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の複合
ハイブリッド蛋白質用の発現および／またはクローニン
グベクターのファミリー。
【請求項２３】本発明のベクターを用いるＥ．ｃｏｌｉ
株の適当な修飾、特に形質転換により得られることを特
徴とする、遺伝子形質転換により得られる微生物。
【請求項２４】有利には、請求項１６に記載のチャージ
されていないベクターにより形質転換されたＥ．ｃｏｌ
ｉのＣＣ１１８株であることを特徴とする請求項２３に
記載の微生物。
【請求項２５】アンスティテュパスツール（l'Instit
ut Pasteur）により設立されたコレクシオンナシオナ
ルデクルトゥールドミクロオルガニスム（Coll
ection Nationale des Cultures de Microorganismes）
に番号Ｉ−１１６８の下に１９９２年１月３１日に寄託
されたことを特徴とする請求項２３または２４に記載の
微生物。
【請求項２６】請求項１〜６のいずれかに記載の複合ハ
イブリッド蛋白質からなることを特徴とする診断薬。
【請求項２７】（１）好適な生物学的試料を請求項２６
に記載の診断薬と接触させ、および（２）適当な比色反
応（colorimetric reaction ）を用いた複合体および／
または遊離の形態で前記診断薬を検出することを特徴と
する蛋白質の免疫酵素試験方法。
【請求項２８】試験の実施に必要な適量の緩衝液および
試薬に加えて適量の請求項２６に記載の試薬を有するこ
とを特徴とする請求項２６に記載の免疫酵素試験を実施
するための使用の準備のできたキット。
【請求項２９】請求項１〜６のいずれかに記載の複合ハ
イブリッド蛋白質からなることを特徴とする治療用途の
ための薬剤。
【請求項３０】蛋白質Ｐが細胞障害性物質であり、基本
単位と結合した免疫グロブリンフラグメントがヒト由来
であり、それらが事前に選択された標的細胞に特異性を
示すことを特徴とする請求項２９に記載の治療薬。
【請求項３１】以下のことを特徴とする二価（bivalen
t）および二特異性（bispecific）抗体の製造方法：（１）請求項２０〜２２のいずれかに記載のベクター中
で、免疫グロブリンドメインをコードする部分が異なる
２種の転写ユニットＴ１を製造し、該ユニットが同一の
プロモーターおよび同一の転写ターミネーターの制御下
にあり、必要ならば、（２）基本単位Ｕが基本単位Ｕ´
と異なるように製造されたハイブリッドが、特にアフィ
ニティークロマトグラフィーにより選択される。