JPH0216974A - 抗ヒトリンホトキシンモノクローナル抗体およびそれを用いるヒトリンホトキシンの検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はヒトリンホトキシン（以下、ＬＴと略記するこ
とがある）に対するモノクローナル抗体（以下、Ｍ　ｏ
　Ａ　ｂと略記することがある）およびヒトＬＴ−Ｃ端
ペプチドに対するポリクローナル抗体（以下、ＰｏＡｂ
と略記することがある）に関する。

本発明は又、上記の２種の抗体を用いてヒトＬＴを高感
度かつ特異的に測定する免疫化学的検出法に関する。

本明細書においてアミノ酸およびペプチドはＩＵＰＡＣ
−ＩＵＢ生化学命名委員会（ＣＢＮ）で採用された略記
法により表示さ九、例えば下記の略号が使用される。な
お、アミノ酸などに関し光学異性体があり得る場合は、
特に明示しなければＬ体を示すものとする。

Ｇｉｎ：グルタミン残基 Ａ　ｓ　ｐ　：アスパラギン酸残基 Ｐｒｏ　ニブロリン残基 Ｔｙｒ：チロシン残基 Ｖａｌ：バリン残基 Ｌｙｓ：リジン残基 Ｇｌｕ：グルタミン酸残基 Ａ　ｌ　ａ　：アラニン残基 Ａｓｎ：アスパラギン残基 Ｌｅｕ　：ロイシン残基 Ｐｈｅ：フェニルアラニン残基 Ｇｌｙニゲリシン残基 Ｈｉｓ：ヒスチジン残基 ８ｅｒ：セリン残基 Ｔｈｒ：スレオニン残基 １１ｅ：イソロイシン残基 Ｔｒｐニトリブトファン残基 Ａ　ｒ　ｇ　：アルギニン残基 Ｍｅｔ：メチオニン残基 本明細書においてデオキシリボ核酸（以下、ＤＮＡと略
す）のポリマー、又はオリゴマーは下記の如き略号の配
列により表記する。

Ａ’：２’　−デオキシアデニル酸残基Ｃ：２′−デオ
キシシチジル酸残基 Ｇ：２’　−デオキシグアニル酸残基 Ｔ：チミジル酸残基 特にことおらない限り、配列の左から右への方向は５′
から３′への方向を示すものとする。

〔従来の技術〕

ＬＴは１７１個のアミノ酸からなるリンパ球由来の蛋白
で、マクロファージ由来の癌壊死因子（以下、ＴＮＦと
略す）と共に選択的抗腫瘍活性を有することから抗癌剤
として期待されている。近年、遺伝子操作技術の進歩と
共に組換型蛋白の量産が可能となり〔ネイチャー　（Ｎ
ａｔｕｒｅ）、　３１２巻、　（１９８４年）、　７２
１頁および７２４頁〕、これら組換型ＴＮＦやＬＴの臨
床応用の結果、実際に幾つかの治療効果も認められてい
る〔オンコロシア（Ｏｎｃｏｌｏｇｉａ）　。

２０巻、　（１９８７年）、　１０５頁〕。

〔発明が解決しようとする課題〕

一方、これらの技術の進歩、さらには臨床例の増加に伴
い、組換型ヒトＬＴの微生物又は細胞培養液よりの抽出
・精製の方法および血清あるいは尿などの臨床検体中の
ヒトＬＴの高感度微量測定法の設定が重要な問題となっ
ている。

ヒトＬＴと反応する抗体およびそれを用いる酵素免疫測
定法（以下、ＥＬＩＳＡと略記することがある）につい
てはすでにブリングマンらの報告〔ハイブリドーマ（Ｈ
ｙｂｒｉｄｏｍａ）、　６巻（１９８７年）。

４８９頁〕がある。彼らは抗体の調製については、免疫
原として天然型および組換型のヒトＬＴで１７１個のア
ミノ酸からなるものを主成分として用いている。しかし
一方で、ヒトＬＴについては生物活性に関係のないＮ端
部領域が最も免疫原性の高い部位といわれており、ヒト
ＬＴ　（１−１７１）を主成分とする抗原で動物を免疫
すると中和活性のないＮ端部抗体が多く産生される。実
際にブリングマンらの報告によれば、得られた１３種の
マウスモノクローナル抗体の内、７種が中和能をもたな
いＮ端抗体であった。また上記の免疫原で得られたウサ
ギのＰ　ｏ　Ａ　ｂを用いるヒトＬＴのサンドインチ（
以下、ＳＷと略記することがある）−ＥＬＩＳＡの検出
範囲は０．４−２５　ｎｇ　ＬＴ／ｍｕで必ずしも良好
ではない６２種の抗体を用いて測定対象抗原のヒトＬＴ
をはさむＳＷ法は検液中の非特異成分による妨害を受け
にくい優れたアッセイ系であるが、用いる２種の抗体の
組合せの不良が感度低下につながることが多い。またバ
イオアッセイによる測定値とＥＬＩＳＡ測定値との相関
を良好とするためには、適切な中和抗体の使用が望まし
い。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、かかる技術的背景のもとに、遺伝子操作
技術で抗腫瘍活性の高いＮ端欠損ヒトＬＴムティンを作
成し、これを免疫原としてマウスに免疫し、その肺臓よ
り中和能の高い抗ヒトＬＴ抗体産生ハイブリドーマを作
成できることを見出した。またヒトＬＴ−Ｃ端部の合成
ペプチドをキャリヤー蛋白に結合させ、ウサギに免疫す
ることにより、意外にも非常に中和能の高い抗ヒトＬＴ
抗体が得られるという新知見も得た。さらに上記２種の
抗ヒトＬＴ抗体を組合せて用いる５Ｗ−ＥＬＩＳＡがヒ
トＬＴを高感度にかつ生物活性を有するヒトＬＴのみを
特異的に測定できることを見出し、これらに基づいてさ
らに研究した結果本発明を完成したものである。

すなわち本発明は、次の如きアミノ酸配列を有するＮ末
端欠損ヒトＬＴで免疫した動物の腫細胞もしくはリンパ
節細胞と、骨髄腫細胞とを融合させることによって得ら
れる。ヒトリンホトキシン中和モノクローナル抗体産生
性のハイブリドーマ、およびそのハイブリドーマの産生
するモノクロ−ナル抗体に関するものである。

ｔｌ−（Ｎｅｔ　）ｎ−Ｒ，−Ｒ２−Ａ　１ａ−Ｈｉｓ
−５ｅｒ−Ｔｈ　ｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａ　ｌ
ａ−Ａｌａ−１（ｉｓ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ａｓ
ｐ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−５ｅｒ
−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｎ−
Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇ
ｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−５ｅ
ｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ
−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｔｙｒ−
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｖａ　ｌ−
Ｖａｌ−Ｐｈｅ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｔ
ｙｒ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｓｅ
ｒ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ
−Ｆｌｉｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ
−３ｅｒ−５ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−
Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−５
ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｒ
ｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ
−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−５ｅｒ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｔ
ｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−５ｅ
ｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−１１ｅ
−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−
Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇ
ｌｙ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＨ〔式中、
Ｒ１はＰｒｏ又はＰｈｅ、Ｒ，はＡ　１ａ−Ｇ　１ｎ−
Ｔｈｒ−Ａ　１ａ−Ａ　ｒｇ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ
−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕで示されるペプチド
またはその一部を示し、ｎは０又は１を示す。〕 また本発明は、次の如きアミノ酸配列を有するヒトＬＴ
−Ｃ端ペプチドで免疫した動物より採取される抗ヒトＬ
Ｔ中和抗体に関するものである。

Ｈ−Ｒ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｖａ　１−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−
Ｇｌｙ−Ａ　ｌａ−Ｐｈｅ−Ａ　１ａ−Ｌｅｕ−ＯＨ〔
式中、ＲはＬｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇ］、ｙ−Ａｓｐ
−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−１（ｉ　５−Ｔｈ
ｒ−Ａ　５ｐ−Ｇ　１ｙ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｌ
ｅｕ−Ｖａ　１−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｐｒｏで示されるペ
プチド又はその一部を示す〕。

さらに本発明は上記２種の抗体を、担体上に保持される
抗体と標識剤を結合させる抗体として、それぞれ使用す
ることを特徴とするヒトＬＴの免疫化学的測定方法、特
にＥＬＩＳＡに関するものである。上記２種の抗体とし
ては、一方がＬＴ−３−１１あるいはＬＴ３−１３５で
あるマウスモノクローナル中和抗体であり、他方が、Ｌ
Ｔ−Ｒ１゜ＬＴ−Ｒ２あるいはＬＴ−Ｒ３であるウサギ
中和抗体である測定法が挙げられる。

本発明のモノクローナル抗ヒトＬＴ抗体産生ハイブリド
ーマの作成にあたっては、免疫原とじてＮ末端欠損ＬＴ
が用いられる。このためにまず、例えば、下記の方法に
よりＮ末端欠損ＬＴをコードするＤＮＡを調製する。

１．１２−０−テトラデカノイルホルボール−１３−ア
セテート（ＴＰＡ）およびコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ
）でＬＴ合成を誘導させたヒト末梢リンパ球より公知の
方法でｍ　−ＲＮ　Ａを採取することができ、そらにそ
れから約５Ｘ１０’個のｃＤＮＡライブラリーを作製す
ることができる。

２、ＬＴの部分ペプチド鎖をコードする通常１０−ｍａ
ｒから５０−＋ｎｅｒのオリゴヌクレオチドを合成しプ
ローブとして使用し、ＬＴｃＤＮＡのスクリーニングを
実施する。例えば、Ｃ末端側１．８−ｍａｒ　（Ｔ　Ｃ
ＣＡＡＡＧＡＡＧＡＣＡＧＴＡＣＴ）の合成ヌクレオチ
ドを使用した時、約５０個のクローンを得ることができ
る。

３、得られたＬＴｃＤＮＡクローンからプラスミドを単
離し塩基配列を決定する。既報のＬＴのアミノ酸配列を
コードするプラスミドを選択し、これを適当な制限酵素
で切断し、適宜発現ベクターに導入して、そのＤＮＡを
含む組み換えＤＮＡを作製することができる。

４、３．で調製されたベクターを使用して各種宿主、例
えば大腸菌を形質転換し、ＬＴをコードするＤＮＡを保
持する菌株を得ることができる。

５、４．で調製した形質転換体を培養しプラスミドを単
離したのち、以下のようにしてＮ末端欠損ＬＴをコード
するＤＮＡを調製できる。

■　ヒトＬＴ遺伝子の場合には、Ｎ末端側より２０−２
１番目のメチオニン−ヒスチジンをコードする領域に制
限酵素Ｎ５ｉｌ認識部位が存在する。そこでＬＴ遺伝子
をＮ５ｉｌ　　で切断することにより、Ｎ末端欠損ＬＴ
をコードするＤＮＡ断片を得ることができる。この断片
に ＤＮＡ断片に化学合成したＤＮＡを結合させる。

その際、ＬＴのＮ末端１０番目のアラニンから２０番目
のメチオニンまでのペプチド鎖をコードするＤＮＡか、
あるいは該ペプチド鎖内の一部のアミノ酸またはペプチ
ドを欠損もしくは他のものに置換したペプチドをコード
するＤＮＡを使用することができ、読み枠を正しく保つ
ように合成すればよい。

■　同様にヒトＬＴ遺伝子の場合、Ｎ末端側より９−１
０番目のセリン−アラニンをコードする領域に制限酵素
Ｐｖｕｆｆ認識部位が存在する。そこでＬＴ遺伝子をＰ
ｖｕｌｌで切断し、Ｎ末端欠損ＬＴをコードするＤＮＡ
断片を得ることができる。この断片に ３′　　　　　　　　　　　５′ の配列を含む適当なアダプターを結合させることにより
ＬＴ　（２０−１，７１）をコードするＤＮＡを作製し
、適当なベクターに挿入する。

■　Ｎ５ｉｌ切断後のＮ末端欠損ＬＴをコードするの配
列を含む適当なアダプターを結合させることによりＬＴ
　（１０−１７１）をコードするＤＮＡを作製し、適当
なベクターに挿入する。

■　Ｐｖｕｌｌ切断後のＮ末端欠損ＬＴをコードするＤ
ＮＡ断片をさらにエキソヌクレアーゼ、例えばヌクレア
ーゼＥＡＬ３１で１−１０個のアミノ酸をコードする領
域を除去し、その中で遺伝子の読み枠が正しく保たれて
いるものを選び出すことによりＬＴ　（ｘ　　１７１）
、　ｘ＝１０〜２０をコードするＤＮＡを調製すること
ができる。

■　また特定部位指向性変異（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔ
ｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｓｍｉｔｈ、Ｍ、ａ
ｎｄ　Ｇｉｌｌａｍ、Ｓ、ｒジェネティックエンジニア
リング（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）Ｊ
＋３　、１　（１９８１））の手法を応用することもで
きる。すなわちＰｖｕＵ切断後のＮ末端欠損ＬＴをコー
ドするＤＮＡ断片をベクターＭ１３に挿入し、これを大
腸菌Ｊ　Ｍ２Ｏ３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｐ−Ｌ　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）に感染させる。成育後、ブロス
中に放出されたＭ１３ファージをポリエチレングリコー
ルで沈殿させ、ついでフェノール処理によってＭ１３フ
ァージ１本鎖ＤＮＡを得ることができる。

次にＬＴのＮ末端側１０番目のアラニンから２０番目の
メチオニンまでのペプチド鎖内の一部のアミノ酸または
ペプチドを欠損もしくは他のものに置換したペプチドを
コードするＤＮＡを化学合成によって作製しプライマー
として使用できる。このプライマーと先に調製したＭ１
３ファージＤＮＡとを混合し、ＤＮＡポリメラーゼＩラ
ージ・フラグメントの作用によって２本鎖にしたのち、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼの作用によって環状化することがで
きる。この環状ＤＮＡを大腸菌ＪＭ］、０３に導入し、
放出されてくるＭ１３ファージＤＮＡをフィルターに転
移させたのち、３２ｐで標識した該合成プライマーを用
いてプラーク・ハイブリダイゼイション［Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ、Ｔ、ら「モレキュラークローニング。

ア　ラボラトリイー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍ
ａｎｎｕａｌ）Ｊ、Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａ
ｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｐ、３１２（１９８２
））を行う。強いシグナルが検出されたファージからＤ
ＮＡを調製し、適当な制限酵素で切り出し、このＤＮＡ
断片をプラスミドに組み込むことにより修飾されたＮ末
端欠損ＬＴをコードするＤＮＡが得られる。

ヒｌ−Ｌ　Ｔ遺伝子の全体または一部を含むプラスミド
ＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡなどを特定部
位指向性変異のための鋳型ＤＮＡとして用いることがで
きる。Ｍ１３ファージやφｘ１７４ファージは、１本鎖
ＤＮＡが容易に調製できるので、鋳型ＤＮＡとしてより
望ましい。例えばＭ１３ファージやφｘ１７４ファージ
にヒトＬＴ遺伝子の全体または一部が組み込まれたもの
を使用する時は、ブロス中に存在するファージ粒子をポ
リエチレングリコールで沈殿させ、フェノール処理で除
蛋白を行い、ついでエタノール沈殿を行いファージ粒子
内にあった１本鎖ＤＮＡを得ることができる。また鋳型
ＤＮＡとしてヒトＬＴ遺伝子の全体または一部が組み込
まれた２本鎖のプラスミドＤＮＡやコスミドＤＮＡを用
いる時は、２本鎖ＤＮＡを１００℃で１分から１０分、
望ましくは３分から５分熱処理した後、氷水で急冷し１
本鎖ＤＮＡに変性させて使用することができる。

特定部位指向性変異のためのプライマーは、変換しよう
とするＤＮＡ配列を持ち、鋳型ＤＮＡとハイブリダイズ
してＤＮＡ合成時のプライマーとして機能しうるもので
あれば、どのようなりＮＡ配列のものでもよい。またプ
ライマーの作製は、どのような方法でもよいが、化学合
成で適当な配列の１本鎖ＤＮＡを作ることが望ましい。

このようなプライマーと先に調製した１本鎖ＤＮＡとを
混合し、ＤＮＡポリメラーゼ■ラージ・フラグメントの
作用によって２本鎖ＤＮＡに修復した後、Ｔ４　ＤＮＡ
リガーゼの作用によって環状化することができる。この
環状ＤＮＡを大腸菌に導入した後、ラジオアイソトープ
で標識したプライマーをプローブに用いて、プラーク・
ハイブリダイゼイション（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、ら
「モレキュラークローニング、アラポラトリイー・マニ
ュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｎａｎｎｕａｌ）Ｊ、　Ｃｏ１ｄ
　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
、Ｐ、３１２　（１９８２））や、コロニー・ハイブリ
ダイゼイション〔同Ｐ、３２６）を行い、目的とする変
異体を選び出すことができる。このようにして得られた
プラークやコロニーからファージＤＮＡやプラスミドＤ
ＮＡを調製し、該ＤＮＡを用いてＮ末端欠損ＬＴ遺伝子
を調製することができる。

次いで、このようにして得られるＮ末端欠損ＬＴをコー
ドするＤＮＡを各種宿主（例、大腸菌。

枯草菌、酵母、動物細胞）で機能するプロモーター領域
の３′末端に挿入することにより、Ｎ末端欠損ＬＴをコ
ードするＤＮＡを発現させうる組み換えＤＮＡを構築す
ることができる。

プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼが結合するこ
とによってｍＲＮＡ合成を開始させるのに必要な部位を
含む領域であれば、いかなるものであってもよい。

たとえば大腸菌を宿主として用いる場合、Ｎ末端欠損Ｌ
ＴをコードするＤＮＡを大腸菌で機能しうるプロモータ
ー領域の３′末端に挿入すれば、Ｎ末端欠損ＬＴをコー
ドするＤＮＡを発現しつる組み換えＤＮＡが構築できる
。またこのように大腸菌を宿主とする場合のベクターと
してｐＢ　Ｒ３２２゜ｐＢＲ３２５，ｐｔｒｐ７８１．
ｐＵＣ８，ｐＵＣ９，ｐＪＢ８などが用いられ、これに
Ｎ末端欠損ＬＴをコードするＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガー
ゼの作用により挿入する。　この反応液を用いて、大腸
菌（例、Ｃ６００株、　ＭＭ２９４株、ＤＨＩ株、　Ｗ
３１１０株、ＲＲＩ株。

ＰＲ１３株など）を公知の方法（Ｃｏｈｅｎ、Ｓ、Ｎ、
ら、［プロシージングオブナショナルアカデミーオブサ
イエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ｌ
Ｊ、Ｓ、Ａ）　Ｊ　６９゜２１１０（１９７２））もし
くはそれに準する方法によって形質転換する。

使用するプロモーターは、ｔｒｐプロモーター（ｔｒド
ρ）に限定する必要はなく、たとえばｒｅＣＡプロモー
ター〔特開昭５９−６５０９９号Ｌ　ｌａｃプロモータ
ーλＰＬプロモーターなどを使用してもよい。

上記のようにして得られたＮ末端欠損ＬＴをコードする
ＤＮＡを含む組み換えプラスミドＤＮＡを保持する形質
転換体は、たとえばアンピシリン耐性、テトラサイクリ
ン耐性あるいはこれら両薬剤耐性を表現形として選ぶこ
とができる。

上記の形質転換体をそれ自体公知の培地で培養する。培
地としては、例えばＬブロス、ペナセイ（Ｐｅｎａｓｓ
ａｙ）ブロスおよびグルコース、カザミノ酸を含むＭ−
９培地（Ｍｉｌ、ｌｅｒ、Ｊ、、ｒエクスペリメンツイ
ンモレキュラージェネテイクス（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）Ｊ
、４３１−４３３（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ
ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９７
２））が挙げられる。ここに、必要によりプロモーター
を効率よく働かせるために、たとえば３β−インドリル
アクリル酸のような薬剤を加えることができる。

該形質転換体の培養は通常１５〜４３℃、好ましくは２
８〜４０℃で２〜２４時間、好ましくは４〜１６時間行
い、必要により通気や攪拌を加えることもできる。

培養後、公知の方法で菌体を集め、大腸菌の形質転換体
の場合には菌体を適当な緩衝液、例えばトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ７，５）に懸濁し、超音波処理、リゾチーム
および／または凍結融解によって菌体を破壊したのち、
遠心分離によりＮ末端欠損ＬＴを含む上澄液を得る方法
などが適宜用い得る。好ましくは、菌体を集めて緩衝液
に懸濁しリゾチームを加えて、０〜１０℃でｌＯ分〜３
時間インキュベートし、０〜１０℃で３０秒〜５分間超
音波処理後、遠心分離して上澄を得る方法が用いられる
。

抽出液からのＮ末端欠損ＬＴの分離、精製たとえばゲル
ろ過、ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー
、イオン交換カラムクロマトグラフィー、超遠心、ヒト
ＬＴ抗体を用いるアイニティクロマトグラフィーにより
行うことができる。

以上により、本発明者がＮ末端欠損Ｌ　Ｔの遺伝子を取
得し、この遺伝子を用いるＮ末端欠損ＬＴの製造方法が
示されたが、製法は以上に限定されるものではない。

上記のＮ末端欠損ＬＴを動物に接種し、抗ヒトＬＴ抗体
の産生を促す。接種動物としては、例えばウサギ、ラッ
ト、マウス、モルモットなどが用いられるが、Ｍ　ｏ　
Ａ　ｂ製造の場合にはマウスが特に好ましく用いられる
。

接種方法としては、通常実施される方法に従えばよく、
例えばマウスに１回１〜１００μｇ、好ましくは１０〜
２５μｇを等容量（０，１ｍ　（１）の生理食塩水およ
びフロイントの完全アジュバントで乳化して、背部・腹
部の皮下あるいは腹腔内に２〜３週毎に３〜６回接種す
る方法がとら九る。

これらの免疫動物、例えばマウスから抗体価の高い個体
を選び、最終免疫３〜５日後に肺臓あるいはリンパ節を
採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と
融合させる。融合操作は既知の方法に従い実施でき、融
合促進剤としてはポリエチレングリコール（以下、ＰＥ
Ｇと略す）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好
ましくはＰＥＧが用いられる。骨髄腫細胞としてはＮＳ
−１、Ｐ　３　Ｕ　Ｉ　、　Ｓ　ｐ　２　／　Ｏなど、
特にＰ３ＵＩが好ましく用いられる。例えば脾細胞と骨
髄腫細胞との好ましい比率は１：１〜１０：１で、これ
に重合度１，０００〜６，０００のＰＥＧが１０〜８０
％の濃度で添加され、２０〜３７℃、好ましくは３０〜
３７℃で３〜１０分インキュベートするのが良い。

ヒトＬＴ抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには
種々の方法が使用できるが、例えばヒトＬＴを吸着させ
たマイクロプレートにハイブリドーマ培養上清を添加し
、次にホース・ラディッシュペルオキシダーゼ（以下、
ＨＲＰと略す）で標識した抗マウス免疫グロブリン抗体
を加え、プレート固相に結合した抗ヒトＬＴモノクロー
ナル抗体を検出するＥＬＩＳＡ法などが挙げられる。抗
体活性陽性のハイブリドーマは直ちにクローニングに供
されるが、通常これは限界希釈法などで容易に実施され
る。クローン化されたハイブリドーマ培養上清の抗体価
を上記の方法で測定し、安定的に力価の高い抗体を産生
ずるハイブリドーマを選択し、目的とするモノクローナ
ルなハイブリドーマを取得することができる。

以上のような製造法に従って作製した抗ヒトＬＴ抗体産
生ハイブリドーマの例として、後述の実施例１に示した
マウスハイブリドーマＬＴ３−１１またはＬＴ３−１３
５が挙げられる。

次に本発明のヒトＬＴ−Ｃ端ペプチドに対する抗体の作
成にあたっては、免疫原としてのヒトＬＴ−Ｃ端ペプチ
ドが化学合成される。該Ｃ端ペプチドは、ペプチド合成
の公知の常套手段で製造され、固相合成法、液相合成法
のいずれかによってもよい。そのようなペプチド合成の
手段としては、たとえば「ザペプチズ（Ｔｈｅ　Ｐｅｐ
ｔｉｄｅｓ）Ｊ第１巻（１９６６）、５ｅｈｒδｄｅｒ
　ａｎｄ　Ｌｕｂｋｅ著、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓ
ｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｕ、Ｓ、Ａあるいは１′ペプチド
合成″、泉屋ら著、丸善株式会社（１９７５年）に記載
された方法、たとえばアジド法、クロライド法、酸無水
物法、混合無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、ウッ
ドワード試薬Ｋを用いる方法、カルボジイミダゾール法
、酸化還元法、ＤＣＣ／アディティブ（例、ＨＯＮＢ、
ＨＯＢｔ、ＨＯ８ｕ）法などがあげられる。

得られたペプチドはキャリヤー用蛋白、例えば牛血清ア
ルブミン（以下、ＢＳＡと略す）、牛チログロブリン（
以下、ＢＴＧと略す）、卵白アルブミン（以下、ＯＶＡ
と略す）などに結合させ動物に接種させる方法がとられ
る。接種する動物としてはウサギ、ヒツジ、ヤギ、ラッ
ト、モルモットマウスなどが挙げら九、例えばウサギに
１回１〜２■を等容量（１＋ＩＱ、）の生理食塩水およ
びフロイントの完全アジュバントで乳化して、背部なら
びに後肢掌皮下に３〜４週毎に４〜６回接種して抗体を
産生させ得る場合が多い。最終免疫後、７〜１２日で耳
静脈から採血し抗ヒトＬＴ抗体含有血清が得られる。

以上の製造法に従って作製した抗ヒトＬＴ−Ｃ端ペプチ
ド抗体として、後述の実施例２に示したウサギ抗体ＬＴ
−Ｒ１，ＬＴ−Ｒ２またはＬＴ−Ｒ３が挙げられる。

本発明のヒｌ〜のＬＴ免疫化学的測定方法においては、
互いに抗原決定部位を重複しない２種の抗体を用いる、
いわゆるサンドインチ（ＳＷ）法が用いられる。その測
定原理を説明すると下記の如くである。

サンドインチ法；未知量の抗原を含む被検液に担体上に
保持された過剰量の抗体を加えて反応させ（第１反応）
、次に標識剤で標識した過剰量の抗体の一定量を加えて
反応させる（第２反応）。

担体上に保持された標識剤もしくは担体上に保持されな
かった標識剤の活性を測定する。第１反応、第２反応は
同時に行なってもよいし、時間をずらして行なってもよ
い。

このＳＷ法は一般に競合法に比べて、被検液中のＬＴ以
外の非特異成分の影響を受けにくく、短時間での測定が
可能である。

本発明では、第１反応で用いる同相抗体と、第２反応で
用いるｉｇ諏抗体とが互いに抗原決定部位を重複しない
異種由来の２種の抗体であり、いずれもヒトＬＴの生物
活性を中和する特異抗体である。

固相抗体の調製には、公知の常套手段を応用し得るが、
たとえば″代謝”　、　８．６９６　（１９７１）に記
載されているブロムシアン法、グルタルアルデヒド（以
下、ＧＬＡと略す）法などが挙げられる。

また、より簡便でかつ好ましい方法として抗体をマイク
ロプレートやポリスチレン粒子上に物理的に吸着させる
方法などがある。

第２反応で用いるＳ識抗体における標識剤としては、放
射性同位元素（以下、ＲＩと略す）、酵素、酵素基質、
蛍光物質、発光物質、ビオチンなどが挙げられる。これ
ら抗体と標識剤との結合には、公知の常套手段であるク
ロラミンＴ法〔ネーチャ（Ｎａｔｕｒｅ）、　１９４．
４９５　（１９６２））　、過ヨウ素酸法〔ジャーナル
・オブ・ヒストケミストリー・アンド・サイトケミスト
リー（Ｊ、　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ
、）、　２２．１０８４　（１９７４））　、マレイミ
ド法［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、）、　７９．２３３　（１９７６）］　
、活性化ビオチン法〔ジャーナル・オブ・アメリカン・
ケミカル・ソサイアティ　（Ｊ、　Ａｍ、Ｃｈｅｍ、　
Ｓｏｃ、）、１００．３５８５　（１９７８））などが
用いられる。

ヒトリンホトキシンのＳＷ法による特異的免疫化学的測
定方法を実施するには、（１）未知量のヒトＬＴを含有
する被検試料に、公知の常套手段で物理的もしくは化学
的に抗体を結合させた固相を加えて反応させる（第１反
応）。固相を洗浄したのち、標識剤で標識した抗体の一
定量を加えて反応させる（第２反応）。次に通常、同相
をよく洗浄し、固相上に結合している標識剤の活性を測
定する。標識剤がＲＩである場合、ウェルカウンターも
しくは液体シンチレーションカウンターで測定する。標
識剤が酵素である場合、基質を加えて放置し、比色法も
しくは蛍光法で酵素活性を測定する。標識剤が蛍光物質
、発光物質であっても、それぞれ公知の方法に従って測
定する。上述のアッセイ方法において、第１反応と第２
反応の間における洗浄を省略してもよいし、さらに簡略
化するために被検液、抗体結合固相および標識剤で標識
した抗体を同時に加えて反応させてもよい。即ち、本発
明で用いられた抗体は互いに抗原決定部位が異なってい
るため、試薬の添加順序、添加時間、洗浄操作の有無な
どによって影響を受けにくいという極めて優れた特色を
有するものである。

［実施例〕 以下に参考例・実施例により本発明を具体的に説明する
が、これらが本発明の範囲を制限するものでないことは
いうまでもない。

本発明の実施にあたり組み換えＤＮＡの作製、組み換え
体の微生物への導入は特に断わらない限り下記の実験書
に従って実施した。

（１）　Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓ
ｃｈ、　Ｊ、　５ａｎｂｒｏｏｋ。

「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ
１ｏＣ１ｏ−ｎ１ｎ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ
ｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ刊（米国）（２）高木康
敬編著「遺伝子操作実験法」講談社刊なお、実施例に開
示するマウス−マウスハイブリドーマ　Ｉ、Ｔ３−１１
およびＬＴ３−１３５はそれぞれ財団法人発酵研究所に
受託番号Ｉ　Ｆ　Ｏ５０１６７およびＩ　Ｆ　Ｏ５０１
６４として、また通商産業省工業技術院微生物工業技術
研究所（ＦＲＩ）に受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−１８１３
およびＦＥＲＭ　ＢＰ−１８１４として寄託されている
。

プラスミドｐ’ｒ　Ｂ　６１８、ｐＴ　Ｂ　６２２およ
びｐｔｒｐ７８１を保持する大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ　ｃｏｌｉ　Ｄ　Ｈ１株およびＣ６００株（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｄ　Ｈ１／　ｐＴ　Ｂ　
６１８、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｃ６００
／　ｐＴ　Ｂ　６２２およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　
ｃｏｌｉ　Ｄ　Ｈ１／　ｐｔｒｐ７８１）はそれぞれ丁
ＦＯに受託番号Ｉ　Ｆ　Ｏ１４５４２、Ｉ　Ｆ　Ｏ１４
５４４およびＩ　Ｆ　Ｏ１４５４６として、またＦＲＩ
に受託番号ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１５８７、ＦＥＲＭ　　
ＢＰ−１５８９およびＦＥＲＭ　ＢＰ−１５９１として
寄託されている。

参考例　１．　　Ｌ９２９細胞障害活性評価ＬＴの細胞
毒性能はＬ９２９細胞を用いて〔ジャーナル・オブ・イ
ムノロジー（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、）、　１２６巻（
１９８１年）２３５頁〕あるいは〔ジャーナル・オブ・
イムノロジカル・メソッズ（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ）。

７０巻（１９８４年）２５７頁〕の方法に準じて測定し
た。

即ち、９６穴の組織培養用マイクロプレート（フローラ
ボラトリー社）を用いて１０％のウシ胎児血清（Ｆｅ２
）を含むＲＰＭＩ　１６４０培地で２倍階段希釈した試
料５０μＱにマイトマイシンＣ４μｇ／ｍＱを含む上記
培地に懸濁した４Ｘ１０’個／１ＩＩＱの濃度のＬ９２
９細胞５０μ℃を添加し５％炭酸ガス中３７℃、４８時
間培養した。培養終了後ジメチルチアゾイル・ジフェニ
ルテトラゾリウム臭酸塩（ＮＴＴ）を用いて生細胞を染
色し１０％５ＤＳ−０，ＯＩＮ　Ｈ（Ｊで溶解後５９０
ｎｍにおける吸光度をタイターチック・マルチスキャン
（フローラボラトリー社）で測定した。得られた吸光度
は生細胞数に比例する。Ｌ９２９細胞の５０％を殺すた
めに必要な生物活性量を１ユニツト／　ｍ　ｎと定義し
試料の生物活性をユニット／ｍΩで表した６参考例２．
天然の（Ｎａｔｕｒａｌ）　Ｌ　Ｔの採取Ｈｉｎｕｍａ
ら（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｉｎｍｕｎｏｌ、　　２８
巻　（１９ｇ４年）９３５頁〕の方法に従い、ＴＰＡと
ＣｏｎＡとで活性化した正常ヒト末梢リンパ球を、１０
％ＦＣ５含有ＲＰＭＩ　１６４０培地中３７℃、５％Ｃ
Ｏ□で２〜３日間培養し、その培養上清からＬＴ含有液
を得た。

参考例　３．形質転換用大腸菌株の作製ＤＨＩ、　Ｃ６
００，ＭＭ　２９４の各種大腸菌株のコロニーをＳＯＢ
培地〔実験書（１）６９頁）］ＯｍＭを用いて５５０ｎ
Ｉ１１の吸光度が０．３になるまで培養した。

水冷後遠心分離し得られた菌体を５ｍＭの１０ｍＭ　Ｎ
ａＣＱで洗浄した。菌体を５ｎ＋２の５０ｍＭ　ＣａＣ
Ｑ　２に再懸濁し水冷下１５分間放置した。遠心分離後
、０．５ｍＭの５０ｍＭ　ＣａＣＱ２に懸濁し直ちに使
用した。

参考例　４．Ｎ末端　　ヒトリンホトキシンの１近 ヒト末梢血より調製したリンパ球をＴＰＡ（１５ｎｇ／
ｍＡ）とＣｏｎＡ　（４０μｇ／ｍＱ）とを含むＲＰＭ
１１６４０培地（１０％ＦＣ５を含む）中、３７℃で培
養し、ＬＴを誘導させた。２４時間後、この誘導したｌ
Ｘ１０１０個のヒトリンパ球を５Ｍグアニジンチオシア
ネート、５％メルカプトエタノール ＨＣ（１　、ｐＨ　７．６，　１０　ｍＷ　Ｅ　ＤＴＡ
溶液中でテフロンホモゲナイザーによって破壊変性した
後Ｎーラウロイリルザルコシン酸ナトリウムを４％にな
るように加え、均質化した混合物を５．７Ｍ塩化セシウ
ム溶液（　５．７Ｍ塩化セシウム、０．１Ｍ　ＥＤＴＡ
）６ｍＭ上に重層し、ベックマン　ＳＷ２８のローター
を用いて１５℃で２４，ＯＯＯｒｐｍ＋　４８時間遠心
処理を行い、ＲＮＡ沈殿を得た。このＲＮＡ沈殿を０．
２５％Ｎーラウロイルザルコシン酸ナトリウム溶液にと
かした後、エタノールで沈殿させ，　１０ｍｇのＲＮＡ
を得た。このＲＮＡを高塩溶液（０．５Ｍ　Ｎａ（Ｆｌ
　、　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（ＩＦＩ　ｐＨ　７．６
．　１ｍＭ　ｔ！ＤＴＡ，０．３％ＳＯＳ）中でオリゴ
（ｄＴ）セルロースカラムに吸着させ、ポリ（Ａ）を含
むｍＲＮＡを低塩溶液（　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ　
ｎ　・ｐＨ　７．６．　１ｍＭ　ＥＤＴＡ，　０．３％
ＳＯＳ　）で溶出させることにより、ポリ（Ａ）を含む
ｍＲ　Ｎ　Ａ　３００μｇを分取した。

このｍＲＮＡ　　をさらにエタノールで沈殿させ、０、
２ｍＭの溶液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ　ｐＨ　７
．６．　２ｍＭ　ＥＤＴＡ，０．３％ＳＯＳ）に溶かし
、６５℃で２分間処理して１０−３５％シヨ糖密度勾配
遠心処理（ベックマンＳＷ２８のローターを用いて２０
℃，２５，ＯＯＯｒｐｍで２１時間遠心分離）すること
により分画した。この各分画につきＲＮＡの一部づつを
、アフリカッメガエルの卵母細胞に注入し、合成される
蛋白質中のＬＴ活性を測定し、沈降定数１６８近辺に相
当する分画にＬＴの活性を検出した。この分画のＬＴ　
ｍＲＮＡは約２５μｇであった。

このポリ（Ａ）ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡライブラリ
ーをＯｋａｙａｍａとＢｅｒｇの方法〔モレキュラーア
ンドセルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ。

Ｂｉｏｌ．）＋　２巻（１９８２年）１６１頁；同誌，
３巻（１９８３年）２８０頁）に従ってｐｃＤＶ１ベク
ター、ｐＬ１リンカ−を用いて作製した６環状化したｃ
ＤＮＡを含むベクタープラスミドは大腸菌ＤＨＩに感染
させ、５μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡより出発して約５Ｘ１
０’個のクローンよりなる大腸菌ＤＨＩを宿主としたｃ
ＤＮＡライブラリーを得ることができた。

■　ヒトＬＴｃＤＮＡを　むプラスミドの　　とその塩
基　」の 上記大腸菌ＤＨＩを用いたヒトｃＤＮＡライブラリーを
ニトロセルロースフィルター（ミリボア社、ＨＡＴＦフ
ィルター）上に約３Ｘ１０’クローン／フイルターとな
るように１０枚まき、このフィルターをマスターフィル
ターとしている各２枚ずつを１組としたレプリカフィル
ター計２０枚を作製した。このレプリカフィルター上の
大ｇｊ菌を０．５ＮＮａＯＨ溶液でとかし露出変性した
プラスミドＤＮＡをフィルター上に乾燥固定した［Ｇｒ
ｕｎｓｔｅｉｎ　。

Ｍ、＆　Ｈｏｇｎｅｓｓ、Ｄ、Ｓ、、　ｒプロシージン
グ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス
Ｊ　（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、７２巻（１９
７５年）　３９６１頁〕。

一方、既に報告されているＬＴ遺伝子の塩基配列（Ｇｒ
ａｙ、ら、［ネイチ’ｒ　−（Ｎａｔｕｒｅ）　Ｊ３１
２巻（１９８４年）７２１頁〕の一部（アミノ酸Ｎｏ、
１６２−１６７に対応する遺伝子部分）に相当するオリ
ゴヌクレオチドを合成してヒトＬＴｃＤＮＡのスクリー
ニングプローブとした。

をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ、〔γ−３２Ｐ〕ＡＴ
Ｐを用いて３２Ｐで標識した。

標識したプローブをＤＮＡを固定したレプリカフィルタ
ーに別々に会合させた。会合反応は１０μＣｉの標識プ
ローブを含む５　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ（０，１５ＭＮａＣＱ
　、　０．０１５Ｍ　Ｓｏｄｉｕｍ　ｃｉｔｒａｔｅ）
、　５　ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ。

０．１％Ｓ　Ｄ　Ｓ　、　１１００ｐ／ｒｎＡ変性サケ
精子ＤＮＡ溶液１０ｍ１２中で４０℃１６時間行い、反
応後、フィルターを６ＸＳＳＣ，Ｏ，１％　ＳＤＳ溶液
で室温で３０分ずつ３回、さらに４３℃で６０分ずつ２
回洗浄した。〔実験帯（１）３０９頁〕。洗浄したフィ
ルターよりラジオオートグラムをとり、プローブに対し
て反応する菌株を１組２枚のレプリカフィルターのラジ
オオートグラムを重ね合わせることにより探した。この
方法により約３Ｘ１０’ｃ。

１ｏｎｉｅｓより、プローブに対して反応する５０株の
Ｅ。

ｃｏｌｉＤＨ１株を得た。

これらの菌株よりプラスミドＤＮＡをアルカリ法［Ｂｉ
ｒｎｂｏｉｍ、Ｈ，Ｃ，＆　Ｄｏｌｙ、Ｊ、、ｒヌクレ
イツク　アシラズリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ
ｓ　Ｒｅｓ、　）　、１１巻（１９７９年）　１５１３
頁〕によって抽出精製した。ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨ
Ｉ（全酒造製）で切断し、アガロースゲル電気泳動で分
画した後、ＤＮＡ断片をアガロースゲル中よりニトロセ
ルロースフィルター（ニスアンドニス社、ＢＡ８５）上
に移した〔サザンブロッティング法、実験帯（１）３８
２頁〕。このフィルターを前記のオリゴヌクレオチドプ
ローブと会合させると、プラスミドＤＮＡ断片はプロー
ブと反応した。

そこで、これらのうち最大のＢａｍＨＩＤＮＡ断片（ｃ
ＤＮＡ部分）を生じたプラスミドを有する１株足、吐に
１２　ＤＨＩ／ｐＴＢ６１８を選び出した。このプラス
ミドＤＮＡのｃＤＮＡ部分の塩基配列をジデオキシヌク
レオチド合成鎖停止法［Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇら、［ヌク
レイツク　アシッズリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１
ｄｓ　Ｒｅｓ、）、９巻（１９８１年）３０９頁〕によ
って決定した。

その結果、プラスミドｐＴＢ６１ｇに含まれるＬＴ遺伝
子は完全ではなく３′末端側非翻訳部分より上流側Ｎｏ
、１８のアミノ酸であるＰｒｏのコドンＣＣＣの第３番
目のＣまでを含むことが判明した。

上記で作製したプラスミドｐＴＢ６１８を制限酵素Ｎ５
ｉｌ（全酒造製）とＢａｍＨＩで切断し、ＬＴ遺伝子を
含む１．１キロ塩基対（以下、Ｋｂｐと略す）のＤＮＡ
断片を分離した。このＤＮＡにＴ４　　ＤＮＡポリメラ
ーゼ（ＰＬ社製）を反応させ、末端を平滑化させた後、
フレームが合うように、１６−ｍａｒのＡＴＧつきＥｃ
ｏＲＩリンカ−（ＡＡＣＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＴ）
をＴ４ＤＮＡリガーゼによって結合させた。Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼを６５℃１０分間の熱処理によって失活させた
のちさらに制限酵素ＥｃｏＲＴで切断し、アガロース電
気泳動でリンカ−の結合したＬＴ遺伝子を含む０．６Ｋ
ｂｐのＤＮＡ断片を分離した。

一方（Ｋ　ｕｒｏｋａｗａ　、　Ｔ、ら、、「ヌクレイ
ツク　アシッズリサーチ（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ
５）Ｊ　１１巻（１９８３年）３０７７頁〕に記載のプ
ラスミドｐｔｒｐ７８１を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し
、５″末端のリン酸をアルカリ性ホスファターゼ処理に
よって除去した。このＤＮＡと、ＡＴＧつきＥｃｏＲＩ
リンカ−の結合した、０．６　ＫｂρのＬＴ　ＤＮＡ断
片を混合し、Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼを作用させて、ト
リプトファンプロモーターの下流にＬＴ遺伝子の挿入さ
れた、大腸菌のヒトＬＴ発現ベクターＰ”ｒ　Ｂ　６２
２を構築した。

上記の如く作製したプラスミドｐＴＢ６２２を用いて参
考例３記載の大腸菌ＤＪ（１株を形質転換させた。

得られた形質転換体をＭ９−ＣＡ培地〔実験書（１）６
９頁３２．５ｆｉ中３７℃、４時間培養し、インドール
アクリル酸２５μｇ　／　ｍ　Ｑ添加し、さらに４時間
培養を継続した。集菌後、０．０１％リゾチームおよび
１０％庶糖を含むトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）　
Ｌｏｏｍ　１１に懸濁し５℃で１時間反応後、水冷下５
分間超音波処理した。

次いで該抽出液を遠心分離後、５ｍＭリン酸緩ロースＣ
Ｌ−６Ｂ　（ファルマシア社）のカラムに添加した。同
緩衝液で洗浄後０．１Ｍ　Ｎ　ａ　ＣＱを含む同緩衝液
で溶出し比活性？、８　Ｘ　１０’　Ｕ　／■の粗精製
液を得た。

上記粗精製液を塩酸を用いてｐＨ６，０に調整後、０．
１ＭＮａＣＱ含有５ｍＭリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ６，０）
で平衡化したブルーセファロースＣＬ−６Ｂカラムに添
加し十分洗浄後、０．５Ｍ　ＮａＣＱを含む５ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ８，０）で溶出した。同溶出液の比活性
は７．４　Ｘ　１０’　Ｕ　／■であった。

さらに、この溶出液を５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，３
）で平衡化したセファクリルＳ−２００のカラムでゲル
ろ過し、比活性１．６　Ｘ　１０７Ｕ　／■の精製液を
得た。

実施例１．マウス　ヒトＬＴモノクローナル夙聚青 ■■ 参考例４−■に記載のヒトＬＴ精製標品２００μｇ　／
　ｍ　Ｑ生理食塩水溶液に等量のフロイント完全アジュ
バントを添加し十分乳濁後、ＢＡＬＢ／ｃマウス（♀、
ｎ　＝１（１：　　２０ｔｔ　ｇ　１０．２　ｍ　ｍ　
／マウス）に腹腔および背部皮下投与し、３週間隔で追
加免疫を実施した。４回の追加免疫後、２週で最大の血
清抗体価を示した個体について、同じＬＴ抗原液（５０
μｇ７０．１ｍｆｉ生理食塩水／マウス）を静脈内投与
した。

■１１敗査 最終免疫後３日で肺臓を摘出し、腫細胞懸濁液を常法に
より調製した（約１０”個）。次いでマウス骨髄腫細胞
（Ｐ３Ｕ、１）　２Ｘ　１０’個を添加し。

ＰＥＧ６０００を用いてケーラーとミルスタインの方法
〔ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、　２５６．４９５　（
１９７５）　）に準じて細胞融合に供した。

融合終了後、細胞混液をヒボキサンチン・アミノプテリ
ンおよびチミジンを含む、いわゆるＨＡＴ培地中に懸濁
し１０日間培養した。以後は親細胞の選択が終了次第、
ＨＡＴ培地から７ミノプテリンを除いたＨＴ培地に代え
培養を続けた。

■ハ　ブ１ドーマの　　およびクローニング同相に精製
ヒトＬＴを吸着させたマイクロプレートを用いるＥＬＩ
ＳＡ法でハイブリドーマ培養上清の抗体価を測定した。

融合１０日から２０日後でハイブリドーマの出現を認め
、かつヒトＬＴに結合する抗体の出現がみられた。特に
結合活性の強いハイブリドーマについて、限界希釈法に
よるクローニングに供した。

クローン化したハイブリドーマの培養上清を同様にＥＬ
ＩＳＡ法のスクリーニングに供し、ヒトＬＴ結合能の強
いものを選択した。これらについては、さらに参考例１
記載のＬ９２９細胞障害活性試験を用いて、ヒトＬＴの
活性に対する中和能を測定した。すなわち、ヒトＬＴ１
００ユニット／ｍρに等量のハイブリドーマ培養上清を
加え、３７℃で１時間反応後、Ｌ９２９細胞障害活性試
験に供した。

これらの結果、ヒトＬＴと結合し、かつ、その細胞障害
活性を中和するＭ　ｏ　Ａ　ｂ産生ハイブリドーマＬＴ
３−１１およびＬＴ３−１３５が得られた。これらの免
疫グロブリンクラス・サブクラスはオークターロ二−法
による測定で、それぞれＩｇＧ２ｂおよび工ｇ０２ａで
あった。

■モノクローナル　　の クローン化されたハイブリドーマを、１０％ＦＣ８を含
むイスコツ−ハム混合培地（Ｉ−Ｈ培地）中３７℃、５
％ｃ　ｏ、濃度インキュベーターを用いて培養し、その
上清より抗体を得た。

一方、多量の抗体を得るためには、予め０．５１１Ｑ鉱
油を腹腔的投与したＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスに５
×１０′個のハイブリドーマを腹腔内接種した。約１０
−１５日後に腹水の貯溜が見られた。

抗体の精製は常法により、４５−５０％飽和硫酸アンモ
ニウムで分画後、ＤＥＡＥ−セルロースおよびプロティ
ンＡカラムクロマトグラフィーに供し実施した。

公知の固相合成法でペプチド合成機（アプライド・シス
テム、モデル４３０Ａ型）を用いて作成されたヒトＬＴ
−Ｃ端ペプチド（１５２−１７１）の１０■１５ｍＱ水
溶液をＢ　ＴＧ４０ｍｇ／　５＋＋＋ｆｌ水溶液に加え
、軽く超音波処理後、２％ＧＬＡ溶液１ｍＱ氷冷下、静
かに滴下し５時間反応させた。生理食塩水で３回透析後
（３ＱＸ３）、凍結保存し免疫原として用いた。

０組 ペプチド−ＢＴＧ複合体４■／１．５ｍＱ生理食塩水溶
液に等量のフロイント完全アジュバントを加え、ウサギ
（Ｓ　、　ｎ　＝　３　：　１．３ｍｇ／　１ｍｎ　／
ウサギ）の背部ならびに後肢掌皮下への免疫を開始した
。

追加免疫は免疫原に等量のフロイント不完全アジュバン
トを加えて、４週毎に５回接種し実施した。

■策生夏聚逍 最終免疫後７〜１０日に耳静脈から採血し、遠心分離し
て抗血清を得た。

特異抗体の製造については、上記の血清を公知の方法に
従い、塩析およびカラムクロマト処理に供し、さらに得
られた抗体ＩｇＧ画分を不溶化ヒトＬＴ−セルロファイ
ン力ラムのアフィニティークロマトで精製した。すなわ
ち、０．１５Ｍ　ＮａＣＱを含む０．０２Ｍホウ酸緩衝
液（ｐＨ８，０）で平衡化したヒトＬＴ結合カラムにウ
サギ抗ヒトＬＴ−ＩｇＧ画分を添加し十分に洗浄後、０
．０２Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２，３）で溶出す
ることにより、ヒトＬＴに親和性の高い中和特異抗体Ｌ
Ｔ−Ｒ１。

ＬＴ−Ｒ２およびＬＴ−Ｒ３が得られた。

実施例３．ヒトＬＴのＥＬＩＳＡ ■　　　　　八　　　の 実施例１および２で得られた精製抗体（ＬＴ３−１１お
よびＬＴ−Ｒ２）を１０Ｍｇ／ｍＱの濃度にリン酸食塩
緩衝液（以下、ＰＢＳと略す）、ｐＨ７゜７で希釈し、
９６穴のマイクロプレートに１００μＱ／ウエル添加し
た。５℃で一夜放置後、抗体液を除去し２％ＢＳＡおよ
び０．０５％チメロサールを含むＰ　Ｂ　Ｓ　１００μ
Ｑを添加し、用時まで冷所保存した。■ビオチン　　ヒ
　　の ヒトＬＴ特異抗体ＬＴ３−１１およびＬＴ−Ｒ２の１　
ｍｇ／　１＋ｎＱ　Ｐ　Ｂ　Ｓ溶液１ｍＱにＮ−ヒドロ
キシスクシンイミド・ビオチン（ＮＨ８−ビオチン）（
フナコシ薬品・販売）の０．５■／　ｍ　Ｑエタノール
−判− 溶液２０μ氾を静かに滴下・攪拌し反応させた。室温で
２時間反応後、ＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ−
２５カラムに供し、未反応のＮＨ３−ビオチンを除去し
た。得られた蛋白画分の内、最大の抗体活性を示したフ
ラクションを分取しビオチン標識化抗体を得た。

■精製ヒトＬＴの測 ２％ＢＳＡ含有ＰＢＳを用いて、参考例４で得ら九た精
製ヒトＬＴを希釈し、その１００Ｐｆｌを上記■で調製
した抗体結合マイクロプレートの各ウェルに添加し、室
温で２時間反応させた。反応終了後、０．１％Ｔｗｅｅ
ｎ　２０を含むＰＢＳ　（以下、Ｔｗ−ＰＢＳと略す）
でプレートを洗浄１次いで■で調製したビオチン４＃！
識化抗体の１０００倍希釈液１００μＱを添加した。室
温で２時間反応後、再びＴｗ−ＰＢＳで洗浄、次いでＨ
ＲＰ標識アビジン（フナコシ薬品・販売）５００倍希釈
液１００μＱを加えて室温で１時間放置した。反応終了
後、マイクロプレートをＴｗ−ＰＢＳで良く洗浄し、酵
素基質液（４０ｍＭ　ｏ−フェニレンジアミンと６ｍＭ
過酸化水素とを含む０．１Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ５，
５）１００μＱを添加、１０分間発色反応を行わせた。

ｌＮ−Ｈ，ＳＯ２で反応停止後、４９２ｎｍ　における
吸光度を測定した。

ＬＴ３−１１を固相抗体、ＬＴ−Ｒ２を標識抗体に用い
る系（Ａ）と、ＬＴ−Ｒ２を固相抗体、ＬＴ３−１１を
標識抗体に用いる系（Ｂ）との比較を第１図のヒトＬＴ
標準曲線に示した。（Ｂ）の系で約２ユニツト／　ｍ　
４１、Ｏ，Ｉｎｇ／　ｍ　ｆｌ、１０　ｐｇ／ウェルの
ヒトＬＴが測定できる。

測定値は生物活性と良く相関した。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒトＬＴの標準曲線を、第２図はヒトＬＴの含
有検液におけるＥＬＩＳＡとバイオアッセイとの比較結
果を、それぞれ表わす。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）Ｎ末端欠損ヒトリンホトキシンで免疫した動物の
   脾細胞もしくはリンパ節と骨髄腫細胞とを融合させるこ
   とによって得られ、かつヒトリンホトキシンに対するモ
   ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
2. （２）Ｎ末端欠損ヒトリンホトキシンが下記のアミノ酸
   配列を有する組み換え型ヒトリンホトキシンである、請
   求項１記載のハイブリドーマ。 【遺伝子配列があります。】 〔式中、Ｒ＿１はＰｒｏ又はＰｈｅ、Ｒ＿２は【遺伝子
   配列があります。】 で示されるペプチドまたはその一部を示し、ｎは０又は
   １を示す。〕
3. （３）マウスーマウスハイブリドーマＬＴ３−１１、又
   はＬＴ３−１３５である請求項１記載のハイブリドーマ
   。
4. （４）請求項１記載のハイブリドーマより産生される抗
   ヒトリンホトキシンモノクローナル抗体。
5. （５）請求項３記載のマウス−マウスハイブリドーマＬ
   Ｔ３−１１、又はＬＴ３−１３５より産生され、ヒトリ
   ンホトキシンの細胞毒性を中和するマウスＩｇＧモノク
   ローナル抗体。
6. （６）ヒトリンホトキシン−Ｃ端ペプチドで免疫した動
   物より採取される抗ヒトリンホトキシン抗体。
7. （７）ヒトリンホトキシン−Ｃ端ペプチドが下記のアミ
   ノ酸配列を有する合成ペプチドである、請求項６記載の
   抗ヒトリンホトキシン抗体。 【遺伝子配列があります。】 〔式中、Ｒは【遺伝子配列があります。】 で示されるペプチド又はその一部を示す〕。
8. （８）抗ヒトリンホトキシン抗体がヒトリンホトキシン
   の細胞毒性を中和するウサギ抗体ＬＴ−Ｒ１、ＬＴ−Ｒ
   ２およびＬＴ−Ｒ３である請求項７記載の抗ヒトリンホ
   トキシン抗体。
9. （９）被検液と担体上に保持された抗ヒトリンホトキシ
   ン抗体を反応させ、さらに標識剤で標識された抗ヒトリ
   ンホトキシン抗体を反応させた後担体上に保持された標
   識剤または担体上に保持されなかった標識剤の活性を測
   定する、被検液中のヒトリンホトキシンの免疫化学的測
   定方法であって、担体上に保持される抗体と標識剤で標
   識される抗体とが互いに抗原決定部位を重複しない２種
   の抗体であり、該抗体のうち一方がヒトリンホトキシン
   −Ｃ端のペプチドと反応する抗体であり、他方が抗ヒト
   リンホトキシンモノクローナル抗体であることを特徴と
   する方法。