ES2924499T3 - Método de selección de terapia para pacientes que padecen glioblastoma - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método de selección de terapia para pacientes que padecen glioblastoma. Usando enfoques in vitro e in vivo, los inventores demostraron el papel crítico de CD90 en la migración/invasión de GBM. Demostraron que la señalización de CD90 a través de SRC, FAK y RhoA promueve la migración celular y, lo que es más importante, que la alta expresión de CD90 afecta la respuesta celular al inhibidor de SRC dasatinib. En particular, la presente invención se refiere a un método para predecir si un sujeto será elegible para un tratamiento con un fármaco seleccionado del grupo que consiste en inhibidor de SRC, inhibidor de FAK o inhibidor de RhoA mediante la determinación del nivel de expresión de CD90 en una muestra obtenida de el tema. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método de selección de terapia para pacientes que padecen glioblastoma

Campo

La presente divulgación se encuentra en el campo de la medicina, en particular, de la oncología.

Antecedentes

El glioblastoma (GBM) es uno de los cánceres humanos más letales con una incidencia de aproximadamente 3.5/100.000 al año en todo el mundo (Cloughesy, T.F., W.K. Cavenee, y P.S. Mischel, Glioblastoma: from molecular pathology to targeted treatment. Annu Rev Pathol, 2014. 9: págs. 1-25). A pesar del tratamiento habitual agresivo actualmente usado que incluye cirugía, quimioterapia y radioterapia, el pronóstico sigue siendo malo con -15 meses de supervivencia global (Weathers, S.P. y M.R. Gilbert, Advances in treating glioblastoma. F1000Prime Rep, 2014. 6: pág. 46). La recidiva inevitable de GBM está asociada con: (i) resistencia a radioterapia y quimioterapia; (ii) características difusas debidas a las propiedades de invasividad de células tumorales a lo largo de todo el parénquima cerebral circundante y (iii) heterogenicidad observada entre pacientes con GBM, pero también dentro del mismo tumor (Cloughesy, T.F., W.K. Cavenee, y P.S. Mischel, Glioblastoma: from molecular pathology to targeted treatment. Annu Rev Pathol, 2014. 9: págs. 1-25) (Huse, J.T., E. Holland, y L. M. DeAngelis, Glioblastoma: molecular analysis and clinical implications. Annu Rev Med, 2013. 64: págs. 59­ 70).

CD90 (Thy-1) es un marcador para células estromales/madre mesenquimatosas (Bradley, J.E., G. Ramirez, y J.S. Hagood, Roles and regulation of Thy-1, a context dependent modulator of cell phenotype. Biofactors, 2009.

35(3): págs. 258-65) y recientemente se ha notificado en células madre de GBM humano (GSC) (He, J., et al., CD90 is identified as a candidate marker for cancer stem cells in primary high-grade gliomas using tissue microarrays. Mol Cell Proteomics, 2012. 11(6): pág. M111 010744.), células estromales asociadas con GBM (GASC) (Clavreul, A., et al., Isolation of a new cell population in the glioblastoma microenvironment. J Neurooncol, 2012. 106(3): págs. 493-504) y pericitos de tipo células madre mesenquimatosas (Ochs, K., et al., Immature mesenchymal stem cell-like pericytes as mediators of immunosuppression in human malignant glioma. J Neuroimmunol, 2013. 265(1-2): págs. 106-16), reflejando de ese modo la heterogenicidad celular en GBM. CD90 es una proteína de superficie celular anclada a glicofosfatidilinositol (GPI) N-glicosilada, originalmente descrita en timocitos murinos (Haeryfar, S.M. y D.W. Hoskin, Thy-1: more than a mouse pan-T cell marker. J Immunol, 2004. 173(6): págs. 3581-8.). CD90 también se expresa en muchos tipos de células incluyendo células endoteliales, fibroblastos y neuronas (Bradley, J.E., G. Ramirez, y J.S. Hagood, Roles and regulation of Thy-1, a context dependent modulator of cell phenotype. Biofactors, 2009. 35(3): págs. 258-65) (Rege, T.A. y J.S. Hagood, Thy-1 as a regulator of cell-cell and cell-matrix interactions in axon regeneration, apoptosis, adhesion, migration, cancer, and fibrosis. FASEB J, 2006. 20(8): págs. 1045-54) (Barker, T.H. y J.S. Hagood, Getting a grip on Thy-1 signaling. Biochim Biophys Acta, 2009. 1793(5): págs. 921-3) (Leyton, L. y J.S. Hagood, Thy-1 modulates neurological cell-cell and cell-matrix interactions through multiple molecular interactions. Adv Neurobiol, 2014. 8: págs. 3-20). CD90 se ha implicado en la inhibición de la excrecencia de neuritas, activación y apoptosis de células T, adhesión y migración de leucocitos y células de melanoma, supresión de tumor en cánceres de ovarios proliferación y migración de fibroblastos en cicatrización de heridas y fibrosis. Aunque los mecanismos de acción exactos de CD90 siguen sin estar claros, se ha propuesto una función en interacciones célula-célula/matriz (Rege, T.A. y J.S. Hagood, Thy-1 as a regulator of cell-cell and cell-matrix interactions in axon regeneration, apoptosis, adhesion, migration, cancer, and fibrosis. FASEB J, 2006. 20(8): págs. 1045-54) (Leyton, L. y J.S. Hagood, Thy-1 modulates neurological cell-cell and cell-matrix interactions through multiple molecular interactions. Adv Neurobiol, 2014. 8: págs. 3-20). Sin embargo, hasta ahora, el estado de la técnica no describe la implicación de CD90 en el mecanismo de GBM (Seon Rang Woo et al., Glioblastoma specific antigens, GD2 and CD90, are not involved in cancer sternness. Anat Cell Biol., marzo de 2015; 48(1): 44-53).

A.A. Bahnassy et al. Enseña CD90 como biomarcador de quimiorresistencia en el tratamiento con cisplatino en hepatoblastoma (Bahnassy AA, Fawzy M, El-Wakil M, Zekri AR, Abdel-Sayed A, Sheta M. Aberrant expression of cancer stem cell markers (CD44, CD90, and CD133) contributes to disease progression and reduced survival in hepatoblastoma patients: 4-year survival data. Transl Res. 2015; 165(3): 396-406. Doi: 10.1016/j.trsl.2014.07.009).

D. Campioni et al. Enseña que una positividad reducida para CD90 en células estromales mesenquimatosas humanas (MSC) está asociada con una pérdida de actividad inmunosupresora mediante MSC (Campioni D, Rizzo R, Stignani M, et al. A decreased positivity for CD90 on human mesenchymal stromal cells (MSCs) is associated with a loss of immunosuppressive activity by MSCs. Cytometry B Clin Cytom. 2009; 76(3): 225-230. Doi: 10.1002/cyto.b.20461).

M. -K. Kang et al. Enseña CD90 como biomarcador de quimiorresistencia en el tratamiento de BNCU en glioma cerebral (Kang MK, Kang SK. Tumorigenesis of chemotherapeutic drug-resistant cancer stem-like cells in brain glioma. Stem Cells Dev. 2007; 16(5): 837-847. Doi: 10.1089/scd.2007.0006).

J. Kitayama et al. Enseña que las células de tipo mesoteliales CD90(+) en líquido peritoneal fomentan la metástasis peritoneal formando un microentorno permisivo para tumor en el contexto de cáncer gastrointestinal (Kitayama J, Emoto S, Yamaguchi H, Ishigami H, Watanabe T. CD90+ mesothelial-like cells in peritoneal fluid promote peritoneal metastasis by forming a tumor permissive microenvironment. PloS One. 2014; 9(1): e86516. Publicado el 21 de enero de 2014. Doi: 10.1371/journal.pone.0086516).

M. Amoui et al. Enseña que el inhibidor de tirosina cinasa selectivo para la familia de Src, PP1, inhibe la activación mediada por Thy-1 en el contexto de células de leucemia basófila (Amoui M, Dráber P, Dráberová L. Src family-selective tyrosine kinase inhibitor, PP1, inhibits both Fc epsilonRI- and Thy-1-mediated activation of rat basophilic leukemia cells. Eur J Immunol. 1997; 27(8): 1881-1886. Doi: 10.1002/eji.1830270810).

V. Milano et al. Enseña el uso de dasatinib, un inhibidor de src, en el tratamiento de glioblastoma (Milano V, Piao Y, LaFortune T, de Groot J. Dasatinib-induced autophagy is enhanced in combination with temozolomide in glioma. Mol Cancer Ther. 2009; 8(2): 394-406. Doi: 10.1158/1535-7163.MCT-08-0669).

Sumario de la invención

La presente invención se define por las reivindicaciones.

La siguiente descripción detallada, figuras y ejemplo no se encuentran dentro del alcance de la presente invención y se presentan únicamente con fines de comprensión e ilustración.

Descripción detallada

De manera interesante, se ha mostrado que la expresión de CD90 no se restringe solo a células de tipo células madre de GBM sino que también se observa en células de GBM diferenciadas (líneas adherentes primarias) y en muestras de GBM recién disociadas. En pacientes con GBM, CD90 también está asociado con una firma génica de adhesión/migración celular y con características de IRM de tumor multifocal/multicéntrico y con potenciación con cruce de línea media. Usando enfoques in vitro e in vivo, se demostró la función crítica de CD90 en la migración/invasión de GBM. Se mostró que la señalización de CD90 a través de SRC, FAK y RhoA fomenta la migración celular y, de manera importante, que una alta expresión de CD90 tiene un impacto sobre la respuesta celular frente al inhibidor de SRC, dasatinib. Se propone un modelo en el que la expresión de CD90 puede representar una herramienta de estratificación novedosa para seleccionar pacientes que van a tratarse con dasatinib. Además, los presentes datos muestran que dasatinib alterará no solo la adhesión/migración de células tumorales altamente diferenciadas con CD90, sino también la proliferación de GSC CD90alto, aumentando de ese modo su potencial terapéutico.

Métodos de predicción de la divulgación

Un primer aspecto de la presente divulgación se refiere a un método para predecir si un sujeto que padece glioblastoma será elegible para un tratamiento con un inhibidor de SRC que comprende i) determinar el nivel de expresión de CD90 en una muestra obtenida a partir del sujeto, ii) comparar el nivel de expresión determinado en la etapa i) con un nivel de referencia predeterminado y iii) y concluir que el sujeto será elegible para un tratamiento con un inhibidor de SRC cuando el nivel determinado en la etapa i) es superior al nivel de referencia predeterminado o concluir que el sujeto no será elegible para un tratamiento con un inhibidor de SRC cuando el nivel determinado en la etapa i) es inferior al nivel de expresión predeterminado.

Tal como se usa en el presente documento, el término glioblastoma (GBM), también denominado glioblastoma multiforme o “astrocitoma de grado IV” según la clasificación de la OMS, tiene su significado general en la técnica y se refiere a un tumor primario del sistema nervioso central derivado a partir de células de la glía. GBM es uno de los cánceres humanos más letales con una incidencia de aproximadamente 3.5/100.000 al año en todo el mundo (Cloughesy, T.F., W.K. Cavenee, y P.S. Mischel, Glioblastoma: from molecular pathology to targeted treatment. Annu Rev Pathol, 2014. 9: págs. 1-25). A pesar del tratamiento habitual agresivo actualmente usado que incluye cirugía, quimioterapia y radioterapia, el pronóstico sigue siendo malo con -15 meses de supervivencia global (Weathers, S.P. y M.R. Gilbert, Advances in treating glioblastoma. F1000Prime Rep, 2014.

6: pág. 46).

Tal como se usa en el presente documento, el término “sujeto” designa un mamífero, tal como un roedor, un felino, un canino y un primate. Preferiblemente, un sujeto según la divulgación es un ser humano. En particular, el sujeto es un sujeto que no puede operarse y que no puede someterse a radiación. En particular, el sujeto tiene un tumor que comprende dos o más lóbulos.

Tal como se usa en el presente documento, el término “muestra” se refiere a cualquier sustancia de origen biológico. Los ejemplos de muestras incluyen, pero no se limitan a, sangre, tumor, saliva, orina, líquidos cefalorraquídeos o cualquiera de otros líquidos o tejidos biológicos.

En particular, la muestra es una muestra de tumor. Tal como se usa en el presente documento, el término “muestra de tumor” significa cualquier muestra de tumor tisular derivada a partir del sujeto. Dicha muestra tisular se obtiene con el fin de la evaluación in vitro. En particular, la muestra de tumor puede resultar del tumor resecado a partir del sujeto. En particular, la muestra de tumor puede resultar de una biopsia realizada en el tumor primario del sujeto o realizada en una muestra metastásica distante del tumor primario del sujeto. En particular, la muestra de tumor es una muestra de células tumorales circulantes. Tal como se usa en el presente documento, el término “célula tumoral circulante” o “CTC” se refiere a una célula cancerosa derivada a partir de un tumor canceroso que se ha desprendido del tumor y está circulando en el torrente circulatorio del sujeto. Normalmente, las CTC se aíslan a partir de la muestra de sangre usando un filtro y/o un método basado en marcador.

Tal como se usa en el presente documento, “tratamiento” o “tratar” es un enfoque para obtener resultados beneficiosos o deseados incluyendo resultados clínicos. Para los fines de esta divulgación, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: aliviar uno o más síntomas resultantes de la enfermedad, disminuir el alcance de la enfermedad, estabilizar la enfermedad (por ejemplo, prevenir o retrasar el empeoramiento de la enfermedad), prevenir o retrasar la propagación de la enfermedad, prevenir o retrasar la recidiva de la enfermedad, retrasar o ralentizar la progresión de la enfermedad, mejorar el estado patológico, proporcionar una remisión (parcial o total) de la enfermedad, reducir la dosis de uno o más de otros medicamentos requeridos para tratar la enfermedad, retrasar la progresión de la enfermedad, aumentar la calidad de vida y/o prolongar la supervivencia. El término “tratamiento” abarca el tratamiento profiláctico. Tal como se usa en el presente documento, el término “prevenir” se refiere a la reducción del riesgo de adquirir o desarrollar un estado dado.

Tal como se usa en el presente documento, “cantidad terapéuticamente eficaz” significa una cantidad suficiente de inhibidor de SRC para su uso en un método para el tratamiento de GBM con una relación beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico. Se entenderá que el uso diario total de los compuestos y las composiciones de la presente divulgación se decidirá por el médico encargado dentro del alcance del criterio médico razonable. El nivel de dosis terapéuticamente eficaz específico para cualquier sujeto particular dependerá de una variedad de factores, incluyendo la gravedad de GBM, la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del sujeto; el tiempo de administración, vía de administración y tasa de excreción del compuesto específico empleado; la duración del tratamiento; y factores similares bien conocidos en las ciencias médicas. Por ejemplo, se encuentra correctamente dentro de las habilidades de la técnica comenzar dosis del compuesto a niveles inferiores a los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosificación hasta que se logra el efecto deseado. Sin embargo, la dosificación diaria de los productos puede hacerse variar a lo largo de un amplio intervalo de desde 0,01 hasta 1.000 mg por adulto al día. Normalmente, las composiciones contienen 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100, 250 y 500 mg del principio activo para el ajuste sintomático de la dosificación al sujeto que va a tratarse. Un medicamento contiene normalmente desde aproximadamente 0,01 mg hasta aproximadamente 500 mg del principio activo, normalmente desde 1 mg hasta aproximadamente 100 mg del principio activo. Una cantidad eficaz del fármaco se administra habitualmente a un nivel de dosificación de desde 0,0002 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal al día, especialmente desde aproximadamente 0,001 mg/kg hasta 7 mg/kg de peso corporal al día.

Los términos “administrar” o “administración” se refieren a la acción de inyectar o administrar físicamente de otro modo una sustancia tal como existe fuera del organismo (por ejemplo, inhibidor de SRC) al interior del sujeto. Cuando está tratándose una enfermedad, o un síntoma de la misma, la administración de la sustancia se produce normalmente tras la aparición de la enfermedad o síntomas de la misma. Cuando está previniéndose una enfermedad o síntomas de la misma, la administración de la sustancia se produce normalmente antes de la aparición de la enfermedad o síntomas de la misma.

Tal como se usa en el presente documento, el término “predecir” se refiere a una probabilidad o posibilidad de que un paciente responda al tratamiento con un inhibidor de SRC. Tal como se usa en el presente documento, el término “grado de respuesta” se refiere a la capacidad de evaluar la posibilidad de que tratamiento sea clínicamente eficaz o no.

Tal como se usa en el presente documento, el término “nivel de referencia predeterminado” se refiere a los niveles de expresión de CD90 en muestras obtenidas a partir de la población general o a partir de una población de sujetos seleccionada (muestras de tumor de pacientes con GBM). Un “nivel de referencia predeterminado” puede determinarse, por ejemplo, determinando el nivel de expresión de ácidos nucleicos o polipéptidos codificados de CD90, en una muestra correspondiente obtenida a partir de uno o más sujetos de control. Cuando se usa un nivel de referencia predeterminado de este tipo, un nivel superior o aumentado determinado en una muestra (es decir, una muestra de prueba obtenida a partir del sujeto) es indicativo, por ejemplo, de que dicho paciente es elegible para un tratamiento con un inhibidor de SRC.

Tal como se usa en el presente documento, el término “CD90” (grupo de diferenciación 90), también conocido como Thy-1 (antígeno de diferenciación de timocitos 1) tiene su significado general en la técnica y se refiere a una proteína de superficie celular anclada a glicofosfatidilinositol (GPI) N-glicosilada (referencia de Uniprot: P04216 para Homo sapiens y P01831 para Mus musculus). CD90 se codifica por el gen de CD90 (también denominado gen de Thy1) (ID de gen de NCBI: 7070 para Homo sapiens y 21838 para Mus musculus).

Tal como se usa en el presente documento, el término “SRC” tiene su significado general en la técnica y se refiere a proteína tirosina cinasa protooncogénica, también conocida como c-Src protooncogénico (referencia de Uniprot para Homo sapiens: P12931). SRC es una proteína tirosina cinasa no receptora que fosforila residuos de tirosina específicos en otras proteínas. SRC se codifica por el gen de SRC (ID de gen de NCBI: 6714 para Homo sapiens).

Tal como se usa en el presente documento, el término “FAK” (cinasa de adhesión focal), también conocida como PTK2 (proteína tirosina cinasa 2), tiene su significado general en la técnica y se refiere a una proteína cinasa asociada con la adhesión focal implicada en procesos de propagación y adhesión celular (referencia de Uniprot: Q05397 para Homo sapiens y P34152 para Mus musculus). FAK se codifica por el gen de FAK (también denominado gen de PTK2) (ID de gen de NCBI: 5747 para Homo sapiens y 14083 para Mus musculus).

Tal como se usa en el presente documento, el término “RhoA” (familia génica de homólogo de Ras, miembro A) tiene su significado general en la técnica y se refiere a una pequeña proteína de GTPasa de la familia de Rho (referencia de Uniprot: P61586 para Homo sapiens y Q9QUI0 para Mus musculus). RhoA se codifica por el gen de RHOA (ID de gen de NCBI: 387 para Homo sapiens y 11848 para Mus musculus).

Tal como se usa en el presente documento, el término “inhibidor de SRC” tiene su significado general en la técnica y se refiere a cualquier compuesto, natural o sintético, que bloquea, suprime o reduce la actividad biológica de SRC o a cualquier compuesto que inhibe la expresión génica de SRC.

Tal como se usa en el presente documento, el término “inhibidor de FAK” tiene su significado general en la técnica y se refiere a cualquier compuesto, natural o sintético, que bloquea, suprime o reduce la actividad biológica de FAK o a cualquier compuesto que inhibe la expresión génica de FAK.

Tal como se usa en el presente documento, el término “inhibidor de RhoA” tiene su significado general en la técnica y se refiere a cualquier compuesto, natural o sintético, que bloquea, suprime o reduce la actividad biológica de RhoA o a cualquier compuesto que inhibe la expresión génica de RHOA.

En particular, el inhibidor de SRC es dasatinib. Tal como se usa en el presente documento, el término “dasatinib” tiene su significado general en la técnica y se refiere a un fármaco contra el cáncer que inhibe Bcr-Abl tirosina cinasa y tirosina cinasa de la familia de Src. El nombre de la IUPAC de dasatinib es N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il]-2-metilpirimidin-4-il]amino]-1,3-tiazol-5-carboxamida. La fórmula (I) de dasatinib es:

En particular, el inhibidor de SRC es bosutinib. Tal como se usa en el presente documento, el término “bosutinib” tiene su significado general en la técnica y se refiere a un inhibidor de proteína cinasa e inhibidor de P-glicoproteína. El nombre de la IUPAC de bosutinib es 4-(2,4-dicloro-5-metoxianilino)-6-metoxi-7-[3-(4-metilpiperazin-1-il)propoxi]quinolin-3-carbonitrilo. La fórmula (II) de bosutinib es:

En particular, el inhibidor de SRC es saracatinib. Tal como se usa en el presente documento, el término “saracatinib” tiene su significado general en la técnica y se refiere a un inhibidor específico doble de proteína tirosina cinasa Src y Abl. El nombre de la IUPAC de saracatinib es N-(5-cloro-1,3-benzodioxol-4-il)-7-[2-(4-metilpiperazin-1-il)etoxi]-5-(oxan-4-iloxi)quinazolin-4-amina. La fórmula (III) de saracatinib es:

En particular, el inhibidor de SRC es KX2-391. Tal como se usa en el presente documento, el término “KX2-391” tiene su significado general en la técnica y se refiere a un inhibidor de src oral. El nombre de la IUPAC de KX2-391 es N-bencil-2-[5-[4-(2-morpholin-4-iletoxi)fenil]piridin-2-il]acetamida.

Otros ejemplos de inhibidores de SRC se describen en los siguientes documentos:

- Stephen Hiscox PhD y Robert I Nicholson PhD (2008) Src inhibitors in breast cancer therapy, Expert Opinion on Therapeutic Targets, 12:6, 757-767;

- Jade Homsi, Christopher Cubitt y Adil Daud (2007) The Src signaling pathway: a potential target in melanoma and other malignancies, Expert Opinion on Therapeutic Targets, 11:1,91-100;

Métodos para determinar el nivel de expresión de CD90

La determinación del nivel de expresión del gen de CD90 puede realizarse mediante una variedad de técnicas. Generalmente, el nivel de expresión tal como se determina es un nivel de expresión relativa. Por ejemplo, la determinación comprende poner en contacto la muestra con reactivos selectivos tales como sondas o ligandos, y de ese modo detectar la presencia, o medir la cantidad, de ácidos nucleicos o polipéptidos de interés originalmente en dicha muestra. La puesta en contacto puede realizarse en cualquier dispositivo adecuado, tal como una placa, placa de microtitulación, tubo de ensayo, pocillo, vidrio, columna y así sucesivamente. En particular, la puesta en contacto se realiza sobre un sustrato recubierto con el reactivo, tal como una matriz de ácidos nucleicos o una matriz de ligandos específicos. El sustrato puede ser un sustrato sólido o semisólido tal como cualquier soporte adecuado que comprende vidrio, plástico, nailon, papel, metal, polímeros y similares. El sustrato puede ser de diversas formas y tamaños, tales como un portaobjetos, una membrana, una perla, una columna, un gel, etc. La puesta en contacto puede realizarse en cualquier condición adecuada para que se forme un complejo detectable, tal como un híbrido de ácido nucleico o un complejo de anticuerpo-antígeno, entre el reactivo y los ácidos nucleicos o polipéptidos de la muestra biológica.

En particular, el nivel de expresión del gen de CD90 puede determinarse determinando la cantidad de ARNm.

En la técnica se conocen bien métodos para determinar la cantidad de ARNm. Por ejemplo, en primer lugar se extrae el ácido nucleico contenido en las muestras según métodos convencionales, por ejemplo, usando enzimas líticas o disoluciones químicas o se extrae mediante resinas de unión a ácido nucleico siguiendo las instrucciones del fabricante. Después se detecta el ARNm extraído mediante hibridación (por ejemplo, análisis de transferencia tipo Northern) y/o amplificación (por ejemplo, RT-PCR). Se prefiere RT-^pC^r cuantitativa o semicuantitativa. La RT-PCR cuantitativa o semicuantitativa en tiempo real es particularmente ventajosa.

Los ácidos nucleicos que tienen al menos 10 nucleótidos y que muestran complementariedad u homología de secuencia con respecto al ARNm de interés en el presente documento encuentran utilidad como sondas de hibridación. Se entiende que no se necesita que tales ácidos nucleicos sean idénticos, pero normalmente son idénticos al menos en aproximadamente el 80% a la región homóloga de tamaño comparable, más preferiblemente idénticos al 85% e incluso más preferiblemente idénticos al 90-95%. Las sondas comprenden normalmente ácidos nucleicos monocatenarios de entre 10 y 1000 nucleótidos de longitud, por ejemplo, de entre 10 y 800, más preferiblemente de entre 15 y 700, normalmente de entre 20 y 500. Las sondas y los cebadores son “específicos” para los ácidos nucleicos a los que se hibridan, es decir, que preferiblemente se hibridan en condiciones de hibridación de alta rigurosidad (correspondientes a la temperatura de fusión más alta Tf, por ejemplo, formamida al 50%, SCC 5* o 6*. SCC es NaCl 0,15 M, citrato de Na 0,015 M).

En el contexto de la divulgación, “hibridación” se refiere al hecho de obtener una estrecha interacción de la sonda de nucleótidos y la región diana que se espera que se revele mediante la detección de la sonda de nucleótidos.

Una interacción de este tipo puede lograrse mediante la formación de enlaces de hidrógeno entre la sonda de nucleótidos y la secuencia diana, lo cual es típico de las interacciones entre moléculas de nucleótidos complementarias que pueden formar pares de bases. Pueden encontrarse enlaces de hidrógeno, por ejemplo, en el apareamiento de dos cadenas complementarias de ADN.

Resultará ventajoso usar ácidos nucleicos en combinación con medios apropiados, tales como una etiqueta detectable, para detectar la hibridación. En la técnica se conoce una amplia variedad de indicadores apropiados incluyendo ligandos fluorescentes, radioactivos, enzimáticos u otros.

Los métodos y reactivos convencionales para aislar ARN a partir de una muestra comprenden kit de aislamiento de miARN de alta pureza (Roche), Trizol (Invitrogen), extracción con tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo, kit de aislamiento de miARN PureLink™ (Invitrogen), sistema de purificación de ARN total PureLink Micro-to-Midi (invitrogen), kit RNeasy (Qiagen), kit Oligotex (Qiagen), extracción con fenol, extracción con fenol-cloroformo, precipitación con TCA/acetona, precipitación con etanol, purificación en columna, purificación en membrana de gel de sílice, PureYield™ RNA Midiprep (Promega), sistema PolyATtract 1000 (Promega), sistema Maxwell® 16 (Promega), aislamiento de ARN total SV (Promega), kit de ARN/ADN geneMAG (Chemicell), TRI Reagent® (Ambion), kit RNAqueous (Ambion), kit ToTALLY RNA™ (Ambion), kit Poly(A)Purist™ (Ambion) y cualquier otro método, comercialmente disponible o no, conocido por el experto.

En particular, el nivel de expresión de uno o más ARNm se determina mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (QPCR). La QPCR puede realizarse usando productos químicos y/o máquinas de una plataforma comercialmente disponible. La QPCR puede realizarse usando máquinas de QPCR de cualquier plataforma comercialmente disponible; tales como los sistemas de PCR en tiempo real Prism, geneAmp o StepOne (Applied Biosystems), LightCycler (Roche), RapidCycler (Idaho Technology), MasterCycler (Eppendorf), sistema BioMark™ HD (Fluidigm), sistema iCycler Iq, sistema Chromo 4, CFX, sistemas MiniOpticon y Opticon (Bio-Rad), sistema SmartCycler (Cepheid), sistema RotorGene (Corbett Lifescience), sistemas MX3000 y MX3005 (Stratagene), sistema DNA Engine Opticon (Qiagen), sistemas de Qpcr Quantica (Techne), sistema de ciclador InSyte y Syncrom (BioGene), DT-322 (DNA Technology), ciclador térmico Exicycler Notebook, sistema TL998 (lanlong), sistemas Line-Gene-K (Bioer Technology) o cualquier otra plataforma comercialmente disponible. La QPCR puede realizarse usando productos químicos de cualquier plataforma comercialmente disponible, tal como Qpcr Ncode EXPRESS o Qpcr EXPRESS (Invitrogen), sistemas de Qpcr Taqman o SYBR green (Applied Biosystems), reactivos de PCR en tiempo real (Eurogentec), mezcla iTaq (Bio-Rad), mezclas y kits de Qpcr (Biosense) y cualquier otro producto químico, comercialmente disponible o no, conocido por el experto. Los reactivos de QPCR y sistema de detección pueden estar basados en sondas o pueden estar basados en la quelación de un producto químico fluorescente a oligonucleótidos bicatenarios.

La reacción de QPCR puede realizarse en un tubo; tal como un único tubo, una tira de tubos o una placa, o puede realizarse en una tarjeta de microfluidos en la que ya están integrados las sondas y/o los cebadores relevantes.

En particular, el nivel de expresión del gen de CD90 puede determinarse determinando la cantidad de proteína codificada por el gen de CD90.

Tales métodos comprenden poner en contacto la muestra con una pareja de unión que puede interaccionar selectivamente con la proteína presente en dicha muestra. La pareja de unión es generalmente un anticuerpo que puede ser policlonal o monoclonal, preferiblemente monoclonal.

Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo monoclonal” se refiere a una población de moléculas de anticuerpo que solo contiene una especie de sitio de combinación de anticuerpo que puede inmunorreaccionar con un epítopo particular. Por tanto, un anticuerpo monoclonal presenta normalmente una única afinidad de unión para cualquier epítopo con el que inmunorreacciona. Por tanto, un anticuerpo monoclonal puede contener una molécula de anticuerpo que tiene una pluralidad de sitios de combinación de anticuerpo, cada uno de ellos inmunoespecífico para un epítopo diferente, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal biespecífico. Aunque históricamente un anticuerpo monoclonal se ha producido mediante inmortalización de una línea de células secretoras de inmunoglobulina clonalmente pura, también puede prepararse una población monoclonalmente pura de moléculas de anticuerpo mediante los métodos de la divulgación.

En la técnica se conocen bien métodos de laboratorio para preparar anticuerpos monoclonales (véase, por ejemplo, Harlow et al., 1988). Pueden prepararse anticuerpos monoclonales (AcM) mediante inmunización de CD90 purificado en un mamífero, por ejemplo, un ratón, rata y mamíferos similares. Se aíslan las células productoras de anticuerpo en el mamífero inmunizado y se fusionan con células de mieloma o heteromieloma para producir células híbridas (hibridoma). Las células de hibridoma que producen los anticuerpos monoclonales se usan como fuente del anticuerpo monoclonal deseado. Este método convencional de cultivo de hibridoma se describe en Kohler y Milstein (1975).

Aunque pueden producirse AcM mediante el cultivo de hibridoma, la divulgación no debe limitarse a lo mismo.

También se contempla el uso de AcM producidos mediante un ácido nucleico de expresión clonado a partir de un hibridoma de esta divulgación. Es decir, el ácido nucleico que expresa las moléculas secretadas por un hibridoma de esta divulgación puede transferirse a otra línea celular para producir un transformante. El transformante es genotípicamente distinto del hibridoma original, pero también puede producir moléculas de anticuerpo de esta divulgación, incluyendo fragmentos inmunológicamente activos de moléculas de anticuerpo enteras, correspondientes a las secretadas por el hibridoma. Véanse, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 4.642.334 a nombre de Reading; las publicaciones de patente europea n.° 0239400 a nombre de Winter et al. y n.° 0125023 a nombre de Cabilly et al.

También se contemplan técnicas de generación de anticuerpos que no implican inmunización tales como, por ejemplo, usando tecnología de presentación en fagos para examinar bibliotecas no expuestas previamente (a partir de animales no inmunizados); véanse Barbas et al. (1992), y Waterhouse et al. (1993).

Alternativamente, pueden usarse agentes de unión distintos de anticuerpos con el fin de la divulgación. Pueden ser, por ejemplo, aptámeros, que son una clase de molécula que representa una alternativa a anticuerpos en cuanto a reconocimiento molecular. Los aptámeros son secuencias de oligonucleótidos u oligopéptidos con la capacidad de reconocer prácticamente cualquier clase de molécula diana con alta afinidad y especificidad. Tales ligandos pueden aislarse mediante evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX) de una biblioteca de secuencias aleatoria, tal como se describe en Tuerk C. y Gold L., 1990. La biblioteca de secuencias aleatoria puede obtenerse mediante síntesis química combinatoria de ADN. En esta biblioteca, cada miembro es un oligómero lineal, eventualmente modificado químicamente, de una única secuencia. Se han revisado posibles modificaciones, usos y ventajas de esta clase de moléculas en Jayasena S.D., 1999. Los aptámeros peptídicos consisten en una región variable de anticuerpo restringida por conformación presentada por una proteína de plataforma, tal como tiorredoxina A de E. coli que se seleccionan de bibliotecas combinatorias mediante dos métodos híbridos (Colas et al., 1996).

Las parejas de unión de la divulgación, tales como anticuerpos o aptámeros, pueden marcarse con etiqueta con una molécula o sustancia detectable, tal como una molécula fluorescente, una molécula radiactiva o cualquier otra etiqueta conocida en la técnica. En la técnica se conocen etiquetas que proporcionan generalmente (de manera o bien directa o bien indirecta) una señal. Tal como se usa en el presente documento, se pretende que el término “marcado con etiqueta”, con respecto al anticuerpo o aptámero, abarque el marcado con etiqueta directo del anticuerpo o aptámero mediante acoplamiento (es decir, unión física) de una sustancia detectable, tal como un agente radiactivo o un fluoróforo (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC) o ficoeritrina (PE) o indocianina (Cy5)) al anticuerpo o aptámero, así como el marcado con etiqueta indirecto de la sonda o anticuerpo mediante reactividad con una sustancia detectable. Un anticuerpo o aptámero de la divulgación puede marcarse con etiqueta con una molécula radiactiva mediante cualquier método conocido en la técnica.

Los ensayos anteriormente mencionados implican generalmente el recubrimiento de la pareja de unión (es decir, anticuerpo o aptámero) en un soporte sólido. Los soportes sólidos que pueden usarse en la práctica de la divulgación incluyen sustratos tales como nitrocelulosa (por ejemplo, en forma de membrana o pocillo de microtitulación); poli(cloruro de vinilo) (por ejemplo, láminas o pocillos de microtitulación); látex de poliestireno (por ejemplo, perlas o placas de microtitulación); poli(fluoruro de vinilidino); papel diazotado; membranas de nailon; perlas activadas, perlas magnéticamente sensibles y similares.

En particular, la medición de CD90 en la muestra puede lograrse mediante un sistema de matriz de perlas citométrico en el que los anticuerpos que se unen a los biomarcadores están recubiertos directa o indirectamente sobre las perlas. Normalmente, puede usarse la tecnología Luminex® que es una nueva tecnología basada en la detección fluorescente usando un citómetro de flujo, microperlas teñidas con múltiples colores fluorescentes y detección por láseres. Por tanto, puede usarse el kit de CD90 humano de ensayo de rendimiento Luminex®, comercializado por R&D Systems, Inc., dentro del contexto de la divulgación.

Por ejemplo, el nivel de una proteína de biomarcador tal como CD90 puede medirse usando técnicas electroforéticas y de inmunodiagnóstico convencionales, incluyendo inmunoensayos tales como ensayos de tipo de competencia, reacción directa o sándwich. Tales ensayos incluyen, pero no se limitan a, inmunotransferencias de tipo Western; pruebas de aglutinación; inmunoensayos mediados y marcados por enzimas, tales como ELISA; ensayos de tipo biotina/avidina; radioinmunoensayos; inmunoelectroforesis; inmunoprecipitación.

Más particularmente, puede usarse un método de ELISA, en el que los pocillos de una placa de microtitulación están recubiertos con un conjunto de anticuerpos contra CD90. Entonces se añade una muestra que contiene o se sospecha que contiene c D90 a los pocillos recubiertos. Después de un periodo de incubación suficiente para permitir la formación de complejos de anticuerpo-antígeno, la(s) placa(s) puede(n) lavarse para eliminar restos no unidos y añadirse una molécula de unión secundaria marcada de manera detectable. Se deja reaccionar la molécula de unión secundaria con cualquier proteína de marcador de muestra captada, se lava la placa y se detecta la presencia de la molécula de unión secundaria usando métodos bien conocidos en la técnica.

Medir el nivel de una proteína de biomarcador tal como CD90 (con o sin métodos basados en inmunoensayos) también puede incluir la separación de las proteínas: centrifugación basada en el peso molecular de la proteína; electroforesis basada en la masa y la carga; HPLC basada en hidrofobia; cromatografía de exclusión molecular basada en el tamaño; y afinidad en fase sólida basada en la afinidad de la proteína por la fase sólida particular que se usa. Una vez separado, puede identificarse CD90 basándose en el “perfil de separación” conocido, por ejemplo, tiempo de retención, para esa proteína y medirse usando técnicas convencionales.

Alternativamente, las proteínas separadas pueden detectarse y medirse, por ejemplo, mediante un espectrómetro de masas.

Kits de la divulgación

Un objeto adicional de la divulgación es el uso de un kit para predecir si un sujeto será elegible para un tratamiento con un inhibidor de SRC que comprende:

- al menos unos medios para determinar el nivel de expresión de CD90 en una muestra obtenida a partir de un sujeto,

- instrucciones de uso.

Normalmente, el kit puede incluir cebadores, sondas, un anticuerpo o un conjunto de anticuerpos. En particular, el anticuerpo o conjunto de anticuerpos están marcados con etiqueta. El kit también puede contener otros reactivos y materiales envasados de manera adecuada necesarios para el protocolo de detección particular, incluyendo matrices en fase sólida, si es aplicable, y patrones.

La divulgación se ilustrará adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos.

Figuras

Figura 1: CD90 se expresa por todas las células de GBM, está asociado con firmas génicas de adhesión y migración y características invasivas de IRM de pacientes con GBM. Se disociaron muestras de GBM humano, se tiñeron con controles de isotipo o anticuerpos anti-CD90 específicos y se analizaron directamente para determinar la expresión de proteína CD90 mediante citometría de flujo. Se muestran histogramas representativos en (A). Los niveles de expresión de proteína CD90 se expresan como media de intensidad de fluorescencia específica de la expresión de proteína determinada en al menos tres experimentos diferentes, tal como se describe en la sección de materiales y métodos (B). Se analizaron tres secciones de tumor correspondientes mediante inmunohistoquímica para determinar la expresión de proteína CD90 (C). Se extrajo ARNm total a partir de muestras de GBM (n=77) y se usó para un perfil de expresión génica mediante micromatriz de transcriptoma. Se dividieron pacientes con GBM en dos grupos distintos de tumores CD90bajo (n=16, blanco) y CD90alto (n=16, negro) según su nivel de expresión de ARNm de CD90 (D). Se analizaron proteínas específicas asociadas con el grupo CD90alto para determinar su interacción conocida mediante STRING (puntuación de confianza > 0,8). Se vinculó una red robusta a funciones de adhesión celular (blanco y negro) y migración celular (gris y negro) (E). Se analizaron IRM de 89 pacientes con GBM a partir del conjunto de datos de TCGA según características de VASARI. Se muestran casos representativos en (F): tumores con (i) y sin (ii) cruce de línea media; tumores multicéntricos (iii, con dos focos diferenciados) y tumores focales (iv). Se compararon los niveles de expresión de ARNm de CD90 entre diferentes características de VASARI y fueron estadísticamente diferentes en pacientes con GBM con tumor focal frente a tumores multifocales/multicéntricos y también en tumores con y sin cruce de la línea media (G). (*): p < 0,05; (**): p < 0,01.

Figura 2: CD90 controla la migración de células de GBM in vitro e in vivo. Se modificaron líneas de células de GBM U251 positiva para CD90 y U87 negativa para CD90, respectivamente, para expresar de manera reducida y sobreexpresar molécula CD90. Se analizó la expresión de CD90 en células U251 parentales (wt), de control (vacías y shCTR n.°, n=2), con expresión reducida de CD90 (shCD90 n.°, n=3); así como células U87 parentales (wt), de control (CTR n.°, n=2) y que expresaban CD90 (CD90 n.°, n=3) mediante citometría de flujo tal como se describe en la figura 1 (A y C). Se sometieron a prueba células U251 parentales (wt), de control (vacías y shCTR n.°, n=2), con expresión reducida de CD90 (shCD90 n.°, n=3) (B); células U87 parentales (wt), de control (CTR n.°, n=2) y que expresaban CD90 (CD90 n.°, n=3) (D); así como células RNS (n=4, símbolo cuadrado) y RADH (n=4, símbolo circular) CD90bajo (azul) y CD90alto (naranja) (E), en un ensayo de migración en cámara de Boyden de 24 horas tal como se describe en la sección de materiales y métodos. Se muestran campos representativos en (B, D, E). El índice de migración correspondía al número de células migrantes obtenidas por campo. Se sometieron a prueba células de control shCTR n.° y con expresión reducida de CD90 shCD90 n.°, RNS (n=3, símbolo cuadrado) y RADH (n=3, símbolo circular), en un ensayo de migración en cámara de Boyden de 24 horas y se muestran campos representativos en (F). Se implantaron por vía ortotópica células U87 parentales y que expresaban CD90 (G) o células RNS CD90bajo y CD90alto (H y I) en el cerebro de ratones inmunocomprometidos. Se sacrificaron ratones que portaban células parentales (n=7) y U87 CD90 (n=7) 28 días tras la inyección; para las células RNS, se sacrificaron ratones cuando aparecieron los signos clínicos. Se extirparon los cerebros y se analizaron secciones tras tinción con H&E (G) o para determinar la expresión de vimentina mediante inmunohistoquímica (H). Se muestran lados de sección posterior en (G) para células U87 y (H) para células RNS. Se determinó el área tumoral tal como se describe en la sección de materiales y métodos (I) . (**): p < 0,01; (***): p < 0,001.

Figura 3: CD90 señaliza a través de moléculas de SRC, FAK y RhoA y la migración dependiente de CD90 se bloquea mediante dasatinib in vitro e in vivo. Se cultivaron células U251 parentales (wt), de control (shCTR n.°), con expresión reducida de CD90 (shCD90 n.°, n=3); así como células U87 parentales (wt), de control (CTR n.°) y que expresaban CD90 (CD90 n.°, n=3) a una baja densidad celular, se sometieron a lisis y se analizaron mediante inmunotransferencia de tipo Western para determinar la expresión de fosfoSRC, SRC, fosfoFAK, FAK y p-actina. Se calcularon los niveles de fosforilación de proteínas tal como se describe en la parte de materiales y métodos (A). Se analizaron células RNS (n=12, símbolo cuadrado) y RADH (n=6, símbolo circular) CD90bajo (negro) y CD90alto (blanco) mediante inmunotransferencia de tipo Western para determinar la expresión de fosfoSRC, SRC, fosfoFAK, FAK y p-actina. Se calcularon los niveles de fosforilación de proteínas en (B). Se sometieron a prueba células U251 parentales que expresaban CD90 y células U87 CD90 n.° 1 en un ensayo de migración en cámara de Boyden de 24 horas tal como se describe en la figura 2 en presencia de DMSO (como control), PP2, dasatinib (ambos inhibidores de SRC), Y15 (inhibidor de FAK) e Y-27632 (inhibidor de ROCK) (C). Se transfectaron células U251 parentales que expresaban CD90 y U87 CD90 n.° 1 sin (si0), con ARNip G^l2 (control) o ARNip RhoA durante 48 horas y se sometieron a prueba en un ensayo de migración en cámara de Boyden de 24 horas (D). Se sometió a prueba la expresión de RhoA mediante inmunotransferencia de tipo Western (D). La migración vino dada por el número de células migradas obtenidas por campo (C y D). Se sometieron a prueba células RNS (n=4, símbolo cuadrado) y RADH (n=4, símbolo circular) CD90alto en un ensayo de migración en cámara de Boyden de 24 horas en presencia de DMSO o dasatinib (E). Se muestran campos representativos en (E). Se implantaron por vía ortotópica células U87 que expresaban CD90 en cerebro de ratones inmunocomprometidos. Una semana tras la inyección, se alimentó a los ratones vehículo de control (n=7) o dasatinib (40 mg/kg/día, n=7) durante 20 días. Se sacrificaron los ratones de control y tratados con dasatinib 28 días tras la inyección. Se extirparon los cerebros y se analizaron secciones tras tinción con H&E (F). (*): p < 0,05; (**): p < 0,01; (***): p < 0,001.

Figura 4: la representación esquemática de cinasas implicadas en la señalización aguas abajo de CD90 con sus inhibidores químicos y genéticos correspondientes se representa en (A). La representación esquemática de los efectos de dasatinib sobre células madre y no madre de GBM descritos en este estudio se representa en (B).

Ejemplo

Material y métodos

Reactivos y anticuerpos - Todos los reactivos no especificados a continuación se adquirieron de Sigma-Aldrich (St Quentin Fallavier, Francia). Los anticuerpos contra CD90 humano, FAK y fosfoFAK se obtuvieron de BD Biosciences (Le Pont de Claix, Francia); anticuerpo anti-CD90 usado para inmunohistoquímica de Novus Biologicals (Bio-Techne, Lille, Francia); anticuerpo anti-RhoA de Santa Cruz Biotechnology (CliniSciences, Nanterre, Francia); anticuerpos anti-SRC y anti-fosfoSRC de Cell Signaling Technology (Saint Quentin Yvelines, Francia).

Muestras de tumor y cultivo celular - Se obtuvieron muestras de GBM tras obtener el consentimiento informado de pacientes ingresados en el departamento de neurocirugía en el hospital universitario de Rennes para resección quirúrgica según el comité ético local. Los tumores usados en este estudio se diagnosticaron mediante histología como astrocitoma de grado IV según los criterios de la OMS. Para el análisis del transcriptoma, se incluyó de manera retrospectiva una cohorte local de 77 pacientes con GBM tratados con radioterapia y temozolomida concurrente/adyuvante según el tratamiento habitual. Se congelaron las muestras de tumor inmediatamente tras al resección. Todas las muestras presentaban al menos el 70% de células tumorales. El alcance de la cirugía se evaluó con una obtención de imágenes por resonancia magnética (IRM) potenciada realizada dentro del plazo de 24 horas tras la resección. Se obtuvieron líneas de células primarias de GBM adherentes (RADH) y neuroesferas (RNS) (enriquecidas con células madre) a partir de muestras de GBM tal como se describe en Avril et al., 2010 (Avril, T., et al., Distinct effects of human glioblastoma immunoregulatory molecules programmed cell death ligand-1 (PDL-1) and indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) on tumour-specific T cell functions. J Neuroimmunol, 2010. 225(1-2): págs. 22-33). Se hicieron crecer células RADH en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Lonza, Verviers, Bélgica) complementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) (Lonza). Se hicieron crecer células RNS en DMEM/Ham:F12 (Lonza) complementado con aditivos B27 y N2 (Invitrogen, Cergy Pontoise, Francia), EGF (20 ng/ml) y FGF básico (20 ng/ml) (Peprotech, Tebu-Bio). Todas las células RNS y RADH de GBM se usaron entre el 5° y 15° pases para los experimentos. Se cultivaron líneas de célula de G^b M U251 y U87 humanas inmortalizadas en D^m E^m con FBS al 10%.

Preparación de líneas de células de GBM U251 con silenciamiento de CD90 y U87 que expresan CD90 - Se transfectaron células U251 con plásmidos pLK0.1-puro que contenían constructos de ARNhp que seleccionan como diana ARNm de CD90 y que seleccionan como diana ARNm no de mamífero (Sigma-Aldrich) usando el reactivo Lipofectamine 2000 (Life Technologies, St Aubin, Francia) según las instrucciones del fabricante. Tras una semana de cultivo con el antibiótico selectivo puromicina usado a 10 |jg/ml, se amplificaron las células U251 transfectadas y después se clonaron en placas de 96 pocillos a 0,1 célula/pocillo. Se expandieron líneas de células U251 con silenciamiento de CD90 y se seleccionaron para detectar su expresión reducida de CD90. Se transfectaron células U87 con ADNc de CD90 (GeneWiz, Sigma-Aldrich) clonado en el plásmido pLK0.1-puro con enzimas EcoRI y BamHI usando el reactivo Lipofectamine 2000. Se obtuvieron líneas de células U87 que expresaban CD90 tal como se describió anteriormente con U251 y se seleccionaron para detectar su alta expresión de CD90.

Preparación de líneas de células primarias de GBM RADH y RNS con silenciamiento de CD90 - Se infectaron células RADH y RNS con partículas lentivirales generadas a partir de células T HEK293 usando el sistema de envasado de una sola vez Lenti-X (Takara, Ozyme) y plásmidos pLK0.1-puro que contenían constructos de ARNhp que seleccionan como diana ARNm de CD90 y CTR que selecciona como diana ARNm no de mamífero usándolos según las instrucciones del fabricante. Tras una semana de cultivo con selección con puromicina usada a 10 jg/ml, se amplificaron las células RNS y se seleccionaron para detectar su regulación por disminución de la de expresión de CD90.

Modelo de ratón ortotópico - Se alojaron ratones NOD-SCID Balb/c machos de ocho semanas de edad (Janvier, Saint Berthevin, Francia) en una unidad de cuidado de animales autorizada por los ministerios franceses de agricultura y de investigación (Biosit, Rennes, Francia, acuerdo n.° B35-238-40). Se implantaron por vía ortotópica células U87 parentales transfectadas (50.000 células/ratón) y células RNS (50.000 células/implantación) en ratones inmunocomprometidos tal como se describe en Drogat, B., et al., 2007 (Drogat, B., et al., IRE1 signaling is essential for ischemia-induced vascular endothelial growth factor-A expression and contributes to angiogenesis and tumor growth in vivo. Cancer Res, 2007. 67(14): págs. 6700-7). Se monitorizó clínicamente a los ratones a diario y se sacrificaron 28 días tras la implantación. Se recogieron los cerebros de ratones, se fijaron en disolución de formaldehído al 4% y se incrustaron en parafina para su análisis histológico tras la tinción con H&E. Se comparó la carga tumoral en los diferentes grupos de ratones y se analizó usando el software ImageJ. Para el tratamiento con dasatinib, se alimentó a los ratones diariamente dasatinib (40 mg/kg, Selleckchem, Euromedex, Souffelweyersheim, Francia) una semana tras la implantación y durante 3 semanas.

Análisis de datos de expresión génica - Para el análisis de transcriptoma usando una cohorte de GBM local, se aisló ARN total con el kit NucleoSpin RNAII (Macherey-Nagel, Hoerdt, Francia). Se confirmó la integridad del ARN (número de integridad de ARN > 8) con un bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies, Les Ulis, Francia). Se llevó a cabo la determinación de perfiles de expresión génica con el kit de micromatriz de genoma humano completo Agilent 8x60K (Agilent Technologies). Se extrajo el ARN total, se marcó con etiqueta y se hibridó según las recomendaciones del fabricante del kit. Se sometieron los datos de intensidad sin procesar a transformación de log2 y se normalizaron (ajuste a escala dentro de la matriz y entre matrices) usando el software GeneSpring (Agilent Technologies). Se usaron pruebas de la t de Student con una aproximación de Welch para comparar los valores de expresión entre condiciones. Se calcularon valores de p ajustados controlando la tasa de descubrimientos falsos con el procedimiento de Benjamini y Hochberg. Se consideró que los genes se expresaban de manera significativamente diferente si el valor de p estaba por debajo de 0,05 y el cambio en veces absoluto era mayor de 2.

Inmunotransferencia de tipo Western - Se sometieron células a lisis en tampón de lisis helado (Tris-HCl 30 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, CHAPS al 1,5%). Se resolvieron las proteínas mediante electroforesis en SDS-gel de poliacrilamida (geles de poliacrilamida al 12%, 10% y 7% para proteínas FAK y RhoA, fosfotirosina, SRC respectivamente) y se transfirieron a membrana de nitrocelulosa para inmunotransferencia. Se bloquearon las membranas con albúmina de suero bobino al 3% en Tween 20 al 0,1% en PBS y se incubaron con los anticuerpos primarios diluidos (1/1000). Se detectó la unión de anticuerpo con los anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa del rábano apropiados (1/7000) (anticuerpos anti-conejo o anti-ratón) (Dako) y se visualizaron con ECL (KPL, Eurobio, Courtaboeuf, Francia) según las instrucciones del fabricante. Las intensidades de fosforilación de cinasa fueron relativas con respecto a las señales de cinasa correspondientes totales usando ImageJ.

Inmunohistoquímica - Se desparafinizaron secciones de cerebro de ratón y de GBM humano con disolución EZ prep (Ventana Medical Systems, Tucson, Estados Unidos de América) a 75°C durante 8 minutos. Se realizó una recuperación de antígenos usando disolución de tampón basada en Tris, CC1, a 95°C durante 48 minutos y se bloqueó la peroxidasa endógena. Tras aclarar, se incubaron los portaobjetos a 37°C durante 60 minutos con anticuerpos primarios diluidos (1/50) contra CD90. Se realizó una potenciación de señal usando el kit DABMap (Ventana Medical Systems). Se optimizó el procedimiento del kit de detección en el instrumento de descubrimiento (Ventana Medical Systems).

Citometría de flujo - Se lavaron las células en PBS con FBS al 2% y se incubaron con concentraciones saturantes de inmunoglobulinas humanas y anticuerpos primarios marcados con etiqueta fluorescente durante 30 minutos a 4°C. Después se lavaron las células con PBS con FBS al 2% y se analizaron mediante citometría de flujo usando un citómetro de flujo FACSCanto II (BD Biosciences). Se seleccionó la población de interés según sus criterios de FSC/SSC. En la mayoría de los experimentos, se excluyó la población de células muertas usando tinción con 7-amino-actinomicina D (7AAD) (B^d Biosciences). Se analizaron los datos con el software FACSDiva (BD Biosciences) o FlowJo (Tree Star Inc., Ashland, Estados Unidos) y se expresaron los resultados como intensidad de fluorescencia específica dada por la razón de media geométrica de la prueba / media geométrica del control de isotipo.

Ensayo de migración en cámara de Boyden - Se lavaron en DMEM líneas de células U251 y U87 parentales, de control y transfectadas, se colocaron en cámaras de Boyden (105 células/cámara en DMEM) que se colocaron en DMEM con FBS al 20% y se incubaron a 37°C durante 24 horas. Tras 24 horas, se lavaron las cámaras de Boyden en PBS y se fijaron las células en PBS con paraformaldehído al 0,5%. Se eliminaron las células que no migraron dentro de las cámaras y después se tiñeron las células con Giemsa (RAL Diagnostics, Martillac, Francia). Tras los lavados en PBS, se tomaron fotografías de 5 campos diferentes. La migración vino dada por la media del número de células migradas observadas por campo. Para la inhibición con fármacos químicos, se incubaron previamente las células 15 minutos con 10 |jM de inhibidores de cinasas de la familia de SRC, PP2 (Sigma-Aldrich) y dasatinib; de inhibidor de ROCK, Y27632 (Selleckchem) y con 1 j M de inhibidor de FAK, Y15 (Sigma-Aldrich). Se mantuvieron los inhibidores de cinasas durante el tiempo del ensayo de migración. Para la inhibición con siRhoA, se transfectaron las células sin (si0), con siGL2 (control) y siRhoA 48 horas antes del ensayo de migración.

Análisis de IRM - Se analizaron ochenta y nueve pacientes con GBM que no habían recibido tratamiento (hombres: n=59; mujeres: n=30; mediana de la edad = 59 años; desde 14 hasta 89 años) de la cohorte del Atlas del genoma del cáncer (TCGA) para determinar la expresión de CD90 a partir de datos de transcriptoma y datos de obtención de imágenes por RM antes del tratamiento correspondientes. Se descargaron las imágenes del archivo de imágenes de cáncer (TCIA) del NCI (http://cancerimagingarchive.net/). Se proporcionaron variables de obtención de imágenes cualitativas y semicuantitativas preoperatorias mediante el conjunto de características de imágenes de Rembrandt visualmente accesibles (VASARI). Anteriormente se publicaron detalles de las variables de obtención de imágenes y la adquisición (Zinn, P.O., et al., Radiogenomic mapping of edema/cellular invasion MRI-phenotypes in glioblastoma multiforme. PLoS One, 2011. 6(10): pág. e25451). Se compararon las medianas del nivel de expresión de ARNm de CD90 entre cada característica de VASARI usando la prueba de Mann-Whitney. Se usó el análisis de Kaplan-Meier para estimar la diferencia de supervivencia entre diferentes características de obtención de imágenes.

Estadística - Los valores representan la media ± DE de n experimentos diferentes. Se aplicó la prueba de la t de Student usando una distribución bilateral de dos condiciones de varianzas diferentes o iguales en grupos de datos obtenidos en experimentos. El nivel de significación era de p < 0,05.

Resultados

CD90 se expresa en células de GBM madre y no madre.

CD90 se expresa en GSC, GASC y pericitos de tipo células madre mesenquimatosas humanos. Sin embargo, anteriormente se observó la expresión de CD90 en células de GBM primarias adherentes humanas, que no presentan características de tipo células madre. Para aclarar esta discrepancia, un análisis de muestras de GBM disociadas (n=36) reveló que CD90 se expresaba en la mayoría de las muestras de GBM sometidas a prueba (34 de 36) (figuras 1A y 1B) con diversas intensidades (una variación de aproximadamente 3 log de intensidad de fluorescencia específica) (figura 1B). Se confirmó la expresión de CD90 usando inmunohistoquímica en muestras con expresión de CD90 alta (GBM n.° 179) e intermedia (GBM n.° 217) con una clara tinción en la mayoría de las células tumorales y en vasos sanguíneos (figura 1C). Una tinción restringida a los vasos se observó únicamente en la muestra CD90bajo (GBM n.° 233) (figura 1C). Estos resultados muestran que la expresión de CD90 no está restringida a células de GBM de tipo células madre, sino que también se expresa en células tumorales más diferenciadas.

CD90 está asociado con una firma génica de adhesión/migración celular y tumores invasivos en pacientes con GBM.

Para caracterizar mejor la función de CD90 en GBM, se realizó una determinación de perfiles de expresión génica en una cohorte interna de 77 muestras de GBM (tabla 1). Se definieron dos grupos de 16 pacientes con GBM según su nivel de expresión de CD90 en los datos de micromatriz: los pacientes CD90bajo mostraron un valor de expresión de CD90 inferior al percentil 20 de la distribución de expresión de CD90, y los pacientes CD90alto tenían un valor de expresión de CD90 superior al percentil 80 de la distribución de expresión de CD90 (figura 1D). La determinación de perfiles de expresión génica diferencial reveló que los tumores CD90alto mostraban una firma génica de adhesión/migración celular (tablas 2) que también estaba comprendida dentro de una red altamente conectada (figura 1E). Estos resultados muestran que la expresión de CD90 está vinculada a unas firmas génicas de adhesión/migración celular en pacientes con GBM. Después se correlacionaron los presentes datos con los obtenidos en tumores de los pacientes a partir de la cohorte de TCGA (Mazurowski, M.A., A. Desjardins, y J.M. Malof, Imaging descriptors improve the predictive power of survival models for glioblastoma patients. Neuro Oncol, 2013. 15(10): págs. 1389-94). De hecho, se analizó el conjunto de características de imágenes de Rembrandt visualmente accesibles (VASARI) en 89 pacientes con GBM a partir de la cohorte de TCGA (Zinn, P.O., et al., Radiogenomic mapping of edema/cellular invasion MRI-phenotypes in glioblastoma multiforme. PLoS One, 2011. 6(10): pág. e25451) y se sometieron a prueba para determinar asociaciones con la expresión de CD90. Entre todas las características de VASARI, el nivel de expresión de ARNm de CD90 fue significativamente diferente en tumores sin potenciación con cruce de línea media frente a aquellos sin cruce de la línea media; y en características multifocales/multicéntricas frente a tumores focales (figuras 1F y 1G). Estos datos demuestran que la expresión de CD90 en células tumorales está asociada con un fenotipo tumoral más invasivo.

La modulación de la expresión de CD90 afecta a la migración de células de GBM in vitro.

Para estudiar la función de CD90 en células de GBM, se silenció CD90 en células U251 CD90alto y se restauró la expresión de CD90 en células U87 negativas para CD90. Se verificó la eficacia del silenciamiento usando tanto citometría de flujo (figuras 2A y 2C). A continuación, se analizaron la viabilidad y proliferación celular a lo largo de 5 días. La expresión reducida de CD90 en U251 o la expresión aumentada de CD90 en U87 no afectaron ni a la viabilidad celular ni a la proliferación (datos no mostrados) en comparación con líneas celulares parentales o sometidas a transfección simulada. Después se evaluó la migración celular usando ensayos de migración basados en cámara de Boyden (figuras 2B y 2D). En ambos casos, la expresión reducida de CD90 en células U251 redujo la migración y la reexpresión de CD90 en U87 aumentó la migración. De manera similar, líneas primarias de GBM CD90alto mostraron índices de migración más fuertes que sus homólogos CD90bajo (figura 2E). Además, el silenciamiento mediado por ARNhp de CD90 en líneas primarias de GBM CD90alto redujo drásticamente la migración celular (figura 2F). En conjunto, estos resultados muestran que la expresión de CD90 no tiene un impacto sobre la viabilidad o proliferación de células de GBM, pero está implicada en sus propiedades de migración.

La expresión de CD90 afecta a la forma de tumor de GBM en ratones.

Se sometieron a prueba células U87 parentales y que expresaban CD90 para determinar su tumorigenicidad en un modelo de ratón de xenoinjerto ortotópico. La mayoría de los ratones que portaban células U87 parentales desarrollaron una clara masa tumoral encapsulada 28 días tras la inyección que se evaluó mediante IRM y en secciones de cerebro teñidas mediante tinción con H&E (figura 2G; n=5 de 7). No se detectó formación de tumor en ratones a los que se les inyectaron células U87 CD90 usando IRM. Sin embargo, la tinción con H&E reveló la presencia de tumores con una forma irregular/invasiva en ratones a los que se les inyectaron células U87 CD90 (n=5 de 7), mientras que los ratones a los que se les inyectaron células U87 parentales mostraron un tumor encapsulado con bordes regulares (figura 2G). Además, se inyectaron células RNS que expresaban CD90bajo y CD90alto (n=2 y 4, respectivamente) en un modelo de ratón de xenoinjerto ortotópico. Aparecieron signos clínicos entre 76 y 140 días tras la implantación, dependiendo de la línea celular, pero independiente de la expresión de CD90 (datos no mostrados). Se observó una infiltración de tumor masiva dentro del parénquima cerebral con células RNS CD90alto restringidas observándose una invasión más limitada con células RNS CD90bajo (figuras 2H y 21). Estos datos son compatibles con los resultados obtenidos en pacientes de la cohorte de TCGA y demostraron que la expresión de CD90 en células tumorales está asociada con un fenotipo tumoral más invasivo.

CD90 señaliza a través de moléculas de SRC y FAK.

Para investigar las rutas de señalización dependientes de CD90, se analizaron transfectantes de U251 shCD90 y U87 CD90 para determinar las proteínas que contenían fosfotirosina totales usando inmunotransferencia de tipo Western en comparación con células parentales y U251 shCTR y U87 CTR, respectivamente (figura 3A). Anteriormente se describió que las cinasas FAK y SRC interaccionan con CD90 (Rege, T.A., et al., Thy-1, via its GPI anchor, modulates Src family kinase and focal adhesion kinase phosphorylation and subcellular localization, and fibroblast migration, in response to thrombospondin-1/hep I. Exp Cell Res, 2006. 312(19): págs. 3752-67) y SRC y FAK totales no variaron en líneas celulares CD90alto y CD90bajo (figura 3A). Sin embargo, se observó un aumento en la fosforilación de tirosina de SRC y FAK en células U87 CD90alto (figura 3A). En cambio, se observó una disminución en la fosforilación de SRC y FAK con U251 silenciada con respecto a CD90 (figura 3A). Finalmente, se observó un aumento en la fosforilación de SRC y FAK en células primarias de GBM CD90alto en comparación con células primarias CD90bajo (figura 3B). Estos datos indican que la expresión de CD90 se correlacionaba con la activación de la señalización de SRC y FAK.

La migración dependiente de CD90 está mediada por SRC, FAK, RhoA y ROCK.

Para confirmar la expresión de la señalización dependiente de CD90 hacia la migración celular en células U251 y U87, se sometieron a prueba los inhibidores químicos PP2 y dasatinib, Y15 e Y27632 respectivamente para cinasas de la familia de SRC, cinasas FAK y ROCK en ensayos de migración en cámara de Boyden usando células U251 parentales y U87 CD90 (figura 3C). Estos inhibidores no tuvieron ningún efecto sobre la viabilidad celular durante el tiempo del ensayo y no tuvieron ningún impacto sobre la baja propiedad de migración de células U251 shCD90 n.° 1 y U87 parentales (datos no mostrados). Los inhibidores de cinasas de la familia de SRC, PP2 y dasatinib, redujeron drásticamente la migración de células U251 y U87 CD90. También se observó inhibición de la migración tras el tratamiento con el inhibidor de ROCK, Y27632 (reducción del 53% y el 76% usando células U251 y U87 CD90 respectivamente), pero en menor medida. En cambio, el inhibidor de FAK, Y15, no tuvo ningún efecto o tuvo un efecto limitado sobre la migración de células U251 y U87 CD90. Además, el silenciamiento de RhoA mediado por ARNip eliminó completamente la migración de células U251 y U87 CD90 (figura 3D). De manera interesante, dasatinib también redujo drásticamente la migración de líneas de GBM primarias CD90alto (figura 3E). Estos resultados indican que la migración mediada por CD90 depende principalmente de las cinasas de la familia SRC, de ROCK y en menor medida de FAK (figura 4A).

Dasatinib inhibe la migración mediada por CD90 de células de GBM in vivo.

Para evaluar los efectos dependientes de CD90 de dasatinib in vivo, se usaron células U87 CD90 en un modelo de ratón de xenoinjerto ortotópico. Se trataron los ratones con dasatinib (40 mg/kg) durante 20 días tras tan solo una semana tras la implantación. Se analizaron los ratones usando IRM 28 días tras la inyección y se sacrificaron. La IRM de ratones de control no tratados que portaban U87 CD90 no reveló ninguna formación de tumor detectable mientras que se observó una masa tumoral irregular tras la tinción con H&E (figura 3F, n=6 de 7). En cambio, se observaron tumores encapsulados claros con bordes regulares usando tanto IRM (n=3 de 4) como tinción con H&E (figura 3F, n=4 de 7) en ratones a los que se les inyectó U87 CD90 y tratados con dasatinib. En conjunto, los datos demuestran que dasatinib inhibe las propiedades de migración/invasión de tumor de CD90 in vivo.

Discusión

En este estudio se muestra que se expresa CD90 en todas las células tumorales de GBM (tanto células madre como diferenciadas) y se demuestra que la expresión de CD90 controla la migración de células tumorales mediante señalización de SRC, RhoA y ROCK. Además, se muestra que la expresión de CD90 regula las características invasivas del tumor en modelos de ratón y en tumores humanos. CD90 también está implicado en propiedades de adhesión célula-célula/matriz de células de GBM. Finalmente, se proporcionan evidencias de que dasatinib reduce drásticamente la invasividad mediada por CD90 de células U87 CD90 in vivo en un modelo de ratón de xenoinjerto ortotópico y que la expresión de CD90 tiene un impacto sobre la sensibilidad a dasatinib en líneas celulares derivadas de pacientes. De manera colectiva, este estudio revela la importancia de CD90 en la migración/invasión de GBM y puede apuntar hacia la expresión de CD90 como factor de predicción de la respuesta a dasatinib en pacientes con GBM.

Anteriormente se ha descrito CD90 como marcador candidato para células madre cancerosas a partir de gliomas primarios de alto grado. Más recientemente, se asociaron células positivas para CD90 con vasos sanguíneos en tejidos de GBM humanos y se caracterizaron como pericitos de tipo células madre mesenquimatosas inmaduros. Sin embargo, se observó la expresión de CD90 en células de GBM primarias adherentes humanas y se notificaron altas cantidades de ARNm de CD90 en líneas de células de GBM primarias y convencionales, así como en muestras de tumor. Usando enfoques de citometría de flujo e inmunohistoquímica con muestras de GBM, se encontró que CD90 se expresaba altamente en células endoteliales dentro del tumor y en neuronas presentes en el parénquima cerebral tal como se describió anteriormente (Bradley, J.E., G. Ramirez, y J.S. Hagood, Roles and regulation of Thy-1, a context-dependent modulator of cell phenotype. Biofactors, 2009. 35(3): págs. 258-65) (Rege, T.A. y J.S. Hagood, Thy-1 as a regulator of cell-cell and cell-matrix interactions in axon regeneration, apoptosis, adhesion, migration, cancer, and fibrosis. FASEB J, 2006. 20(8): págs. 1045-54). También se observó expresión de CD90 en células madre derivadas de GBM y células madre más diferenciadas usando tanto líneas celulares como muestras de tumor humano.

Una de las importantes características de GBM es la invasión difusa de células tumorales a través del parénquima cerebral circundante (Louis, D.N., et al., The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system. Acta Neuropathol, 2007. 114(2): págs. 97-109), haciendo que una resección quirúrgica completa sea imposible (Zhong, J., et al., Mesenchymal migration as a therapeutic target in glioblastoma. J Oncol, 2010.

2010: pág. 430142). Se mostró que tumores CD90alto derivados de U87 o RNS presentaban un fenotipo más invasivo en un modelo de ratón ortotópico en comparación con sus homólogos CD90bajo. Esta observación se correlacionó con datos de los pacientes dado que los tumores CD90alto también presentaban características invasivas de VASARI. Entonces se analizaron estas características invasivas dependientes de CD90 tanto en cuanto a niveles de expresión génica como en cuanto a características de señalización. De manera interesante, los GBM CD90alto se caracterizaron por una firma génica de adhesión/migración y mostraron una expresión elevada de marcadores mesenquimatosos tales como aSMA, COL1A1, COL1A2 y MMP-2 y 9. La sobreexpresión de estos genes específicos puede estar relacionada con la invasividad aumentada observada en tumores CD90alto. Estas propiedades de células tumorales CD90alto también pueden implicar la activación de rutas de señalización específicas aguas abajo de CD90. De hecho, se sabe que CD90 interacciona con múltiples moléculas de señalización tales como p100, CD45, las cinasas de la familia de SRC (SFK) LYN y FYN y proteínas G pequeñas. CD90 también regula la reorganización del citoesqueleto de tubulina y actina, desensamblaje focal, conduciendo a la modulación de la migración celular. En el presente documento, se demuestra que CD90 controla la migración/invasión de células de GBM a través de cinasas de SRC, RhoA, ROCK y parcialmente a través de FAK. La relevancia de la señalización de SRC en líneas de células primarias de GBM CD90alto se confirmó mediante la identificación de la firma génica de SRC anteriormente descrita por Bild et al. (Bild, A.H., et al., Oncogenic pathway signatures in human cancers as a guide to targeted therapies. Nature, 2006. 439(7074): págs. 353-7) en esas células en comparación con los homólogos CD90bajo. Sin embargo, no puede descartarse que otros miembros de la familia de SFK también puedan estar implicados. Recientemente se han implicado las cinasas SRC y c-YES en la migración de células madre de glioma (Han, X., et al., The role of Src family kinases in growth and migration of glioma stem cells. Int J Oncol, 2014. 45(1): págs. 302-10). Sin embargo, no se observó ninguna activación de c-YES en las líneas U251 y U87 modificadas para la expresión de CD90 (datos no mostrados). CD90 también está asociado con la formación de fibras de estrés de actina en células de GBM como resultado de la activación de RhoA y ROCK. Estos acontecimientos de señalización impulsan el remodelado del citoesqueleto y están coordinados con cambios en las propiedades de adhesión fomentando de ese modo la migración celular.

En los últimos años, programas de investigación intensiva han identificado nuevos agentes terapéuticos que seleccionan como diana la migración/invasión de glioma (Zhong, J., et al., Mesenchymal migration as a therapeutic target in glioblastoma. J Oncol, 2010. 2010: pág. 430142.). Por ejemplo, la inhibición de metaloproteinasas, el bloqueo de integrinas, la selección como diana de la reorganización del citoesqueleto y la inhibición de moléculas de señalización tales como FAK y SFK mostraron efectos prometedores sobre la invasividad de GBM in vitro y la progresión de GBM en modelos de ratón. Algunas de estas moléculas también se han usado en recientes ensayos clínicos de GBM. Como tal, marimastat, un inhibidor de MMP, mostró efectos alentadores sobre pacientes con GBM con recidiva (Groves, M.D., et al., Phase II trial of temozolomide plus the matrix metalloproteinase inhibitor, marimastat, in recurrent and progressive glioblastoma multiforme. J Clin Oncol, 2002. 20(5): págs. 1383-8) pero no logró mejorar la supervivencia de pacientes en un ensayo clínico de fase III (Levin, V.A., et al., Randomized, double-blind, placebo-controlled trial of marimastat in glioblastoma multiforme patients following surgery and irradiation. J Neurooncol, 2006. 78(3): págs. 295-302). Cilengitida, un antagonista de integrinas avp3 y avp5, en combinación con temozolomida mostró efectos limitados en pacientes con GBM (Stupp, R., et al., Cilengitide combined with standard treatment for patients with newly diagnosed glioblastoma with methylated MGMT promoter (CENTRIC EORTC 26071-22072 study): a multicentre, randomised, open-label, phase 3 trial. Lancet Oncol, 2014. 15(10): págs. 1100-8). Dasatinib mostró un efecto prometedor sobre la inhibición de la invasión de células de glioma inducida por bevacizumab en una fase preclínica, pero no logró mejorar a pacientes con GBM con recidiva tratados con bevacizumab en un ensayo de fase II (Lassman, A.B., et al., Phase 2 trial of dasatinib in target-selected patients with recurrent glioblastoma (RTOG 0627). Neuro Oncol, 2015. 17(7): págs. 992-8). De manera interesante, cinasa de la familia de SFK incluyendo SRC, FYN y c-YES están implicadas en la proliferación y movilidad de glioma in vitro. LYN y c-YES tienen efectos opuestos sobre la supervivencia en un modelo de xenoinjerto ortotópico de glioma. Sin embargo, en el presente estudio se muestra que dasatinib afecta a la viabilidad de células RNS CD90alto y bloquea la migración de GBM mediada por CD90 in vivo. Se propone un modelo que resume los presentes datos subyacentes al fundamento para usar dasatinib en pacientes con GBM CD90alto seleccionando como diana la proliferación de GSC, así como la migración de GBM (figura 4B). Los presentes resultados enfatizan fuertemente la necesidad de volver a considerar la respuesta a dasatinib en pacientes con GBM tras una estratificación basada en CD90.

En conclusión, los presentes datos apuntan hacia CD90 como marcador de invasión de tumor y también puede considerarse como una herramienta de estratificación de GBM para ensayos clínicos que someten a prueba nuevos agentes terapéuticos que seleccionan como diana la migración/invasión de GBM dependiente de SRC. Los presentes resultados también pueden abrir nuevas direcciones para enfoques terapéuticos que seleccionan como diana CD90 y su señalización aguas abajo que van a aplicarse a pacientes con GBM.

TABLA 1: características demográficas y clínicas de pacientes

Sexo Hombre n=54

Mujer n=23

Edad (años) mediana [intervalo] 60 [36-75]

Puntuación de rendimiento de Karnofsky (%) mediana [intervalo] 90 [50-100]

< 70% 12

> 70% 38

no presente 12

Tratamiento (resección) Biopsia n=4

Parcial n=17

Completo n=55

no presente n=1

Estado de MGMT Metilado n=29

no metilado n=48

Estado de IDH1 tipo natural n=20

Mutado n=1

no presente n=56

Subtipos Clásico n=17

Mesenquimatoso n=28

Neuronal n=14

Proneuronal n=18

Supervivencia global (meses) mediana [IC del 95%] 17,5 [15,9-19,6] Supervivencia libre de progresión (meses) mediana [IC del 95%] 10,8 [9,6-13,9]

TABLA 2: 10 genes principales regulados por incremento en pacientes con GBM CD90bajo y CD90alto* Cambio en Símbolo de gen Nombre de sonda Nombre de gen ^veces

_{(CD90alto /} p CD90ba¡o)

MMP9 A_23_P40174 Metaloproteinasa de matriz 9 8,69 >0,0001 COL1A1 A_33_P3304668 Cadena alfa 1(I) de colágeno 8,05 >0,0001 POSTN A_33_P3511265 Periostina 6,83 0,0027 NOS2 A 23 P502464 Óxido nítrico sintasa, inducible 6,69 0,0011 MXRA5 A_23_P258136 ^{Proteína asociada al remodelado de la}

_{matriz 5} 6,33 >0,0001 PXDNL A_23_P258310 Proteína de tipo peroxidasina 6,22 0,0002 SPON2 A_23_P121533 Espondina 2 6,21 >0,0001 BDKRB2 A_23_P304897 Receptor de bradiquinina B2 5,66 >0,0001 CD248 A_33_P3337485 Endosialina 5,50 >0,0001 COL1A2 A_24_P277934 Cadena alfa 2(I) de colágeno 5,34 >0,0001 HBD A 24 P75190 Subunidad delta de hemoglobina -3,10 0,0017 RGS1 A_23_P97141 ^{Regulador de la señalización de proteína G}

₁ -2,94 0,0003 RNU2-2 A_33_P3279708 ARN pequeño nuclear U22 -2,85 0,0009 SLC1A3 A_21_P0000065 Transportador de aminoácidos excitador 1 -2,68 0,0004 HBB A 23 P203558 Subunidad delta de hemoglobina -2,68 0,0021 SNHG5 A_19_P00322944 ^{Gen huésped de ARN pequeño nuclear 5}

_{(no codificante de proteína)} -2,54 0,0011 LYG1 A 23 P165707 Proteína de tipo lisozima g 1 -2,53 0,0001 CCDC7 A_33_P3385842 ^{Proteína que contiene dominio de}

_{superhélice 7} -2,35 0,0005 SNORA71B A_21_P0000294 ARN pequeño nuclear, H/ACA caja 71B -2,34 0,001 SNORA16B A_21_P0000494 ARN pequeño nuclear, H/ACA caja 16B -2,33 0,0001 * Los tumores CD90bajo y CD90alto muestran perfiles génicos diferenciales, tal como se describe en la figura 4. En esta tabla se indican los 10 genes principales regulados por incremento para los grupos CD90baj° (□) y CD90alt° (W).

Bibliografía

A lo largo de esta solicitud, diversas referencias describen el estado de la técnica al que se refiere esta divulgación.

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Método para predecir si un sujeto que padece glioblastoma será elegible para un tratamiento con un inhibidor de SRC que comprende i) determinar el nivel de expresión de CD90 en una muestra obtenida a partir del sujeto, ii) comparar el nivel de expresión determinado en la etapa i) con un nivel de referencia predeterminado y iii) concluir que el sujeto será elegible para un tratamiento con un inhibidor de SRC cuando el nivel determinado en la etapa i) es superior al nivel de referencia predeterminado o concluir que el sujeto no será elegible para un tratamiento con un inhibidor de SRC cuando el nivel determinado en la etapa i) es inferior al nivel de expresión predeterminado.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el inhibidor de SRC es dasatinib.

3. Inhibidor de SRC para su uso en un método de tratamiento de glioblastoma en un sujeto que lo necesita que comprende i) predecir si un sujeto será elegible para un tratamiento con un inhibidor de SRC realizando el método según la reivindicación 1 y ii) administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de SRC cuando se concluye que el sujeto será elegible para un tratamiento con un inhibidor de SRC.

4. Inhibidor de SRC para su uso según la reivindicación 3, en el que el inhibidor de SRC es dasatinib.

5. Método según la reivindicación 1, en el que la muestra es una muestra de tumor.

6. Uso de un kit para predecir si un sujeto que padece glioblastoma será elegible para un tratamiento con un inhibidor de SRC según la reivindicación 1, que comprende:

- al menos unos medios para determinar el nivel de expresión de CD90 en una muestra obtenida a partir de un sujeto,

- instrucciones de uso.