KR20210006945A - 치료에 대한 암 반응 결정 - Google Patents

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조슈아 티 버지스
엠마 볼더슨
데릭 제이 리처드
케네스 제이 오바이른
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퀸스랜드 유니버시티 오브 테크놀로지
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Abstract

SASH1의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함하는, PARP와 같은 파손된 DNA 가닥의 복구를 매개하는 효소를 억제할 수 있는 항암제로 암을 치료하거나 이에 대한 암의 반응성을 예측하는 방법이 본원에서 제공된다. SASH1의 발현 및/또는 활성을 증가시키는 약제의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법이 또한 제공된다. 암 치료에 사용하기 위한 SASH1의 발현 및/또는 활성을 조절하는 약제를 확인하는 방법이 본원에 추가로 제공된다.

Description

치료에 대한 암 반응 결정
본 발명은 암에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 암, 특히 폐암 및 유방암과 같은 생식계암의 치료 방법 및/또는 치료 및/또는 예후에 대한 반응성 결정 방법에 관한 것이다.
유방암은 전 세계에서 두 번째로 흔한 암으로 전체 여성 암의 25%를 차지한다. 개선된 관리 전략으로 인해 지난 수십 년에 걸쳐 생존율이 증가하였다. 그러나 이 질병은 여전히 여성의 암 관련 사망의 두 번째로 높은 원인이다 [1]. 현재 유방암 환자를 위한 치료 전략은 주로 환자 종양의 병리학적 특성에 기반한다. 호르몬 (에스트로겐 (ER) 및 프로게스테론) 및 인간 표피 성장 인자 2 (HER2) 수용체의 발현은 현재 유방암에서 가장 강력한 예후 및 예측 바이오마커이기 때문에 진단 실무에서 일상적으로 평가된다. 치료 옵션은 이러한 수용체에 대해 음성인 종양에 대해 가장 제한적이다 ('삼중 음성') [2, 3]. 따라서 유방암뿐만 아니라 보다 폭넓은 암에 대한 예후 마커와 함께 새로운 치료법의 개발이 여전히 필요하다.
올라파립과 같은 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제 (PARP) 억제제는 원래 BRCA 돌연변이 또는 삼중 음성 유방암 (기능성 BRCA1 또는 2의 손실은 종종 "BRACAness"라고 함)을 치료하도록 설계되었지만, BRCA1 및 2는 이러한 치료제에 대한 민감성에 대해 신뢰할 수 있는 바이오마커가 되지 못하였다. 그럼에도 "BRCAness" 및 LOH (이형접합성 상실: Loss of Heterozygosity)는 현재 PARP 억제제에 대한 환자 민감도에 대한 보완 진단으로 남아 있는데 이들 판독값은 약물 반응에 대한 높은 신뢰도 예측자가 아니다. 이로 인해 생존/진행 혜택을 입증하기 위한 대규모 3 상 임상 시험이 필요하였다. 그럼에도 불구하고 난소암, 전립선암, 유방암 및 폐암을 포함한 다양한 고형암 유형에서 PARP 억제제의 효과에 관한 수많은 임상 시험이 수행되고 있다. 따라서, 암에서 PARP 억제제 치료에 대한 개선된 동반/상보적 진단제의 개발이 여전히 필요하다.
SAM 및 SH3 도메인 함유 1 (SASH1)은 인접한 정상 조직에 비해 유방암, 폐암, 갑상선암 및 대장암에서 유의하게 낮은 mRNA 수준의 검출을 기반으로 초기에 추정 종양 억제 유전자로 확인되었다 [4, 5]. 낮은 SASH1 발현은 또한 대장암에서 공격적인 종양 성장, 전이 및 불량한 예후와 관련이 있다 [6]. 74% 정도로 많은 유방암이 감소된 SASH1 전사체 발현을 보여준다 [4]. 이 관찰은 나중에 인접한 정상 조직에 비해 유방암에서 SASH1의 발현이 감소된 것을 발견한 면역조직화학 연구에서 확인되었다 [7]. SASH1 프로모터, 특히 CpG_26.27 및 CpG_54.55의 메틸화는 유방암에서 SASH1 억제와 관련이 있다 [7].
정상 조직과 암에서 SASH1의 정확한 기능은 아직 명확하지 않지만, 단백질은 핵에 국한되어 있는 것으로 알려져 있으며 SAM 및 SH3 도메인은 신호 전달, 어댑터 및/또는 분자 스캐폴드 기능을 내포한다 [8, 9]. SASH1의 제안된 종양 억제 역할은 고갈이 A549 폐암 세포에서 세포 생존력, 증식 및 이동을 증가시키는 [5, 10-12] 반면 과발현은 아폽토시스의 상당한 증가를 초래한다는 것을 보여주는 연구 [5]와 일치한다. 또한 전위성 SASH1 발현이 캐스파제 3을 포함한 아폽토시스 단백질의 발현을 촉진하는 것으로 나타났다 [10]. 발현, 돌연변이 상태 및 DNA 메틸화를 조사하는 연구를 제외하고 유방암에서 SASH1의 역할은 잘 알려져 있지 않다.
요약
본 발명은 광범위하게 PARP 억제제로의 치료에 대한 암 반응의 예측 및/또는 예후 마커로서 SASH1의 발현 수준을 결정하는 것에 관한 것이다. 일부 측면에서, 본 발명은 또한 광범위하게 SASH1 발현을 유도 및/또는 증가시키는 약제를 사용한 암 치료에 관한 것이다. 특정 형태에서 암은 유방암과 같은 생식계 암이다.
제1 측면에서, 본 발명은 대상체에서 항암제에 대한 암의 반응성을 예측하는 방법을 제공하며, 여기서 항암제는 파손된 DNA 가닥의 복구를 매개하는 효소의 활성을 적어도 부분적으로 억제하고, 상기 방법은 대상체의 하나 또는 다수의 암 세포, 조직 또는 기관에서 SASH1 단백질 또는 코딩 핵산의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 SASH1 단백질 또는 코딩 핵산의 발현 수준은 항암제에 대한 암의 상대적으로 증가 또는 감소된 반응성을 나타내거나 이와 관련된다.
특정 실시양태에서, 상대적으로 감소된 수준의 SASH1 단백질 또는 코딩 핵산은 항암제에 대한 암의 상대적으로 증가된 반응성을 나타내거나 이와 관련되고/되거나; 상대적으로 증가된 수준의 SASH1 단백질 또는 코딩 핵산은 항암제에 대한 암의 상대적으로 감소된 반응성을 나타내거나 이와 관련된다.
하나의 실시양태에서, 본 측면의 방법은 대상체에서 암을 치료하는 추가 단계를 포함한다.
제2 측면에서, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상체의 하나 또는 다수의 암 세포, 조직 또는 기관에서 SASH1 단백질 또는 코딩 핵산의 발현 수준을 결정하는 단계, 및 상기 이루어진 결정에 기초해 암 치료를 개시, 계속, 수정 또는 중단하는 단계를 포함한다.
적합하게는, 암 치료는 파손된 DNA 가닥의 복구를 매개하는 효소의 활성을 억제하는 치료적 유효량의 항암제의 투여를 포함한다.
특정 실시양태에서, 암 치료는 SASH1의 발현 및/또는 활성을 억제 또는 예방하는 약제의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
제3 측면에서, 본 발명은 파손된 DNA 가닥의 복구를 매개하는 효소의 활성을 억제하는 항암제와 조합하여 SASH1의 발현 및/또는 활성을 억제 또는 예방하는 약제의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
제1, 제2 및 제3 측면과 관련하여, 효소는 적합하게는 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제 (PARP)이다.
제4 측면에서, 본 발명은 SASH1의 발현 및/또는 활성을 증가시키는 약제의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
적합하게는, 약제는 작은 유기 분자이다.
제1, 제2, 제3 및 제4 측면과 관련하여, 항암제 또는 암 치료제는 적합하게는 PARP 억제제이거나 이를 포함한다. 바람직하게는, PARP 억제제는 올라파립, 벨리파립, 루카파립, 이니파립, 탈라조파립, 니라파립, 3-아미노벤즈아미드, ME0328, PJ34, AG-14361, INO-1001, UPF-1069, AZD-2461, CEP 9722, A-966492 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
제5 측면에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 대상체에서 암 치료에 사용하기 위한 약제를 확인하거나 생성하는 방법을 제공한다:
(a) SASH1 핵산 또는 단백질을 발현하는 세포를 후보 약제와 접촉시키는 단계; 및
(b) 후보 약제가 SASH1의 발현 및/또는 활성을 조절하는지 여부를 결정하는 단계.
특정 실시양태에서, 후보 약제는 SASH1의 발현 및/또는 활성을 적어도 부분적으로 감소, 제거, 억압 또는 억제한다. 대안적 실시양태에서, 후보 약제는 적어도 부분적으로 SASH1의 발현 및/또는 활성을 증가시킨다.
적합하게는, 약제는 항체 또는 작은 유기 분자이다.
제6 측면에서, 본 발명은 제4 측면의 방법에 의해 확인되거나 생성된 약제를 제공한다.
제7 측면에서, 본 발명은 대상체에서 항암제에 대한 암의 반응성을 예측하기 위한 키트를 제공하며, 여기서 항암제는 파손된 DNA 가닥의 복구를 매개하는 효소의 활성을 억제하며, 키트는 대상체의 하나 또는 다수의 암 세포, 조직 또는 기관에서 SASH1 단백질 또는 코딩 핵산의 발현 수준을 결정할 수 있는 적어도 하나의 시약을 포함하며, 여기서 SASH1 단백질 또는 코딩 핵산의 발현 수준은 항암제에 대한 암의 상대적으로 증가 또는 감소된 반응성을 나타내거나 이와 관련된다.
특정 실시양태에서, 상대적으로 감소된 수준의 SASH1 단백질 또는 코딩 핵산은 항암제에 대한 암의 상대적으로 증가된 반응성을 나타내거나 이와 관련되고/되거나; 상대적으로 증가된 수준의 SASH1 단백질 또는 코딩 핵산은 항암제에 대한 암의 상대적으로 감소된 반응성을 나타내거나 이와 관련된다.
본 측면과 관련하여, 효소는 적합하게는 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제 (PARP)이다. 따라서, 항암제는 적합하게는 PARP 억제제이거나 이를 포함한다. 바람직하게는, PARP 억제제는 올라파립, 벨리파립, 루카파립, 이니파립, 탈라조파립, 니라파립, 3-아미노벤즈아미드, ME0328, PJ34, AG-14361, INO-1001, UPF-1069, AZD-2461, CEP 9722, A-966492 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
적합하게는, 본 키트는 SASH1 단백질 또는 코딩 핵산의 발현 수준과 항암제에 대한 암의 반응성 사이의 상관 관계 데이터를 포함하는 데이터 수집을 추가로 포함한다.
적절하게는, 데이터 수집은 컴퓨터 판독 가능 매체에 있다.
특정 실시양태에서, 키트는 전술한 측면의 방법에 사용하기 위한 것이다.
적합하게는, 전술한 측면의 암은 생식계암이다. 바람직하게는, 생식계암은 유방암, 난소암, 자궁경부암, 자궁암, 전립선암 또는 고환암을 포함한다. 보다 바람직하게는 생식계암은 유방암이다.
다른 실시양태에서, 전술한 측면의 암은 폐암이거나 이를 포함한다. 바람직하게는, 폐암은 편평세포 암종, 선암종, 대세포 암종, 소세포 암종 및 중피종을 포함한다.
제8 측면에서, 본 발명은 하나 또는 다수의 암 세포, 조직 또는 기관에서 SASH1 핵산 또는 단백질의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함하는, 대상체에서 유방암에 대한 예후를 결정하는 방법을 제공하며, 여기서 SASH1의 발현 수준은 상기 유방암에 대해 덜 또는 더 유리한 암 예후를 나타내거나 이와 관련된다.
특정 실시양태에서, 유방암은 ER 양성 (ER+) 유방암 또는 ER 음성 (ER-) 유방암이다.
적합하게는, 상기 측면의 대상체는 포유동물, 바람직하게는 인간이다.
문맥 상 달리 요구하지 않는 한, 용어 "포함하다", "포함한다" 및 "포함하는" 또는 유사한 용어는 인용된 요소 또는 특징의 목록이 언급되거나 나열된 요소만을 포함하지 않고, 나열되거나 명시되지 않은 기타 요소 또는 특징을 포함할 수 있도록 하는, 비배타적인 포함을 의미한다.
여기서 부정 관사 'a' 및 'an'은 단수 또는 복수 요소 또는 특징을 지칭하거나 포함하는 데 사용되며 "하나" 또는 "단일" 요소 또는 특징을 의미하거나 정의하는 것으로 간주해서는 안된다. 예를 들어, "a" 셀은 하나의 셀, 하나 이상의 셀 및 복수의 셀을 포함한다.
도 1. 캐스파제-3에 의한 SASH1의 절단이 아폽토시스에 필요하다. A) 재조합 캐스파제-3은 아미노산 230과 231 사이의 SASH1을 절단한다. B) SASH1 절단 단편의 과발현은 SASH1의 절단이 아폽토시스 역할에 필요함을 나타낸다.
도 2. SASH1 또는 SASH1 절단된 C-말단 231-1247의 과발현은 NF-κB 핵 단백질 수준을 증가시킨다. A) 면역형광을 통한 NF-κB 핵 단백질 수준의 정량화.
도 3. SASH1이 상동 재조합 및 게놈 안정성에 필요하다. A) SASH1 단백질 수준은 DNA 손상 자극후 축적된다. B) SASH1이 고갈되면 상동 재조합 효율이 크게 감소한다. C) SASH1이 DNA 손상 마커 yH2AX의 효율적인 제거에 필요하다. D) SASH1 고갈은 코멧 분석 (comet assay)을 통해 측정된 게놈 불안정성을 초래한다.
도 4. SASH1 단백질 수준은 올라파립, 탈라조파립 및 벨리파립 민감도와 관련된다. A) 유방, D) 폐 및 E) 난소암 세포주에서 PARP 억제제 올라파립 IC50 및 SASH1 단백질 수준의 상관 관계. B) 유방암 세포주에서 PARP 억제제 탈라조파립 IC50 및 SASH1 단백질 수준의 상관 관계. C) 유방암 세포주에서 PARP 억제제 벨리파립 IC50 및 SASH1 단백질 수준의 상관 관계.
도 5. SASH1의 고갈은 올라파립에 대한 암 세포 민감성을 증가시킨다. A) SASH1이 고갈된 세포주는 올라파립에 대한 IC50이 감소하였다. B) 올라파립에 대한 IC50의 상당한 감소를 보여주는 SASH1 고갈과 세포주의 결합 데이터.
도 6. SASH1의 과발현은 U2OS 세포에서 올라파립에 대한 내성을 유추한다.
도 7. SASH1과 알려진 PARP 억제제 민감도 마커 BRCA1 또는 BRCA2 사이에는 상관 관계가 없다. SASH1 및 A) BRCA1 또는 B) BRCA2의 mRNA 발현의 상관 관계. 온라인 데이터베이스 COXPRES.
도 8. SASH1 발현은 유방암의 재발 및 생존과 관련이 있다. (A) ER 양성 및 ER 음성 유방암에서 SASH1 mRNA (왼쪽) 또는 단백질 (오른쪽) 발현과 임상 결과 간의 관계에 대한 Kaplan Meier 분석. BCSS, 유방암 특이적 생존. 로그 순위 p 값과 위험 비율 (HR, 괄호 안에 95% 신뢰 구간)이 표시된다. (B) 유방암 조직 마이크로 어레이 코어의 대표적인 SASH1 IHC 이미지. 음성 및 강한 양성 핵 SASH1 발현을 갖는 2 개의 등급 3 (G3) 침습성 유관 암종 (IDC)이 저배율 및 고배율로 나타난다. (C, D) ER+ 질환에서 BCSS의 SASH1 계층화는 Ki67 발현 (C) 또는 유사분열 점수 (D)에 따라 높고 낮은 증식 지수를 가진 하위 그룹에서 유사한 경향을 보여주었다. SASH1-고 및 -저 사례의 비율은 증식 지수가 높거나 낮은 ER+ 하위 그룹에서 다르지 않았다 (X2 = 카이 제곱 검정).
도 9. 유방암 세포주에서 SASH1 단백질 발현. 유방암 세포주가 면역 블롯팅에 의해 SASH1의 발현에 대해 분석되었다. 대표적인 면역 블롯은 (A)에 표시되고, (B)는 β 액틴에 대한 SASH1 발현의 밀도 측정 정량화를 보여준다. 표시된 데이터는 MCF7로 임의로 정규화된 세 독립적인 실험에서 +/- 표준 편차를 의미한다.
도 10. 전위성 SASH1 발현은 세포사를 증가시킨다. (A) 면역 블롯팅에 의한 SASH1 과발현의 확인. 유방암 세포주를 PCMV6-SASH1-GFP 융합 단백질 또는 PCMV6-GFP 단독을 코딩하는 발현 구조물로 형질감염시킨 다음, 용해물 제조 및 SASH1/β-액틴 면역 블롯팅을 위해 48 시간 후 수확하였다. OE, 과발현 (B) SASH1 과발현은 유방암 세포주 사멸을 증가시킨다. 세포주를 위와 같이 형질감염시킨 다음 48 시간 후에 Hoechst 33342 및 요오드화프로피듐 (PI)으로 염색하고 디지털 형광 현미경을 사용하여 정량화하였다. 표시된 데이터는 GFP-양성, PI-양성 (사멸 및 후기 아폽토시스) 세포의 평균 상대 비율 +/- 세 독립적인 실험의 표준 편차이다. SASH1-GFP와 GFP 대조군 배양물 간의 차이를 양측 t-검정을 사용하여 평가하였다. * p <0.05, ** p <0.005.
도 11. 클로로피라민은 유방암 세포주에서 SASH1 발현을 증가시킨다. (A-H) 세포를 25 또는 50 μM 클로로피라민으로 24 시간 동안 처리한 다음 용해물을 제조하고 면역 블롯팅을 사용하여 SASH1 단백질 발현을 분석하였다. 면역 블롯 밴드 강도는 세 번의 독립적인 실험에서 b-액틴에 비해 정량화되었다. 치료에 따른 SASH1 발현 변화의 재현성과 유의성을 양측 t-검정을 사용하여 평가하였다. *p <0.05, **p <0.005.
도 12. 클로로피라민은 아폽토시스를 포함하는 유방암 세포주 성장의 용량 의존적 감소를 유도한다. (A-H) 클로로피라민 처리 후 부착성 유방암 세포주 합류의 변화. 세포를 96 시간 동안 클로로피라민으로 처리하고 광학 현미경을 사용하여 이미지화하고 비처리 대조군 배양물에 대한 합류를 평가하기 위해 디지털 방식으로 분석하였다. (I-K) 클로로피라민은 유방암 세포주에서 아폽토시스를 유도한다. 세포를 클로로피라민 처리 48 시간 후 요오드화프로피듐 및 애넥신 V-FITC 항체 접합체로 염색하고 유세포 분석으로 분석하였다. 표시된 모든 데이터는 세 독립적인 실험으로부터 +/- 표준 편차를 의미한다. 양측 t-검정을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. * p <0.05, ** p <0.005, *** p <0.0005.
도 13. SASH1 고갈은 유방암 세포주에서 클로로피라민 유발 아폽토시스를 부분적으로 구제한다. (A) 세포를 음성 대조군 또는 SASH1 esiRNA로 형질도입시켰다. 72 시간 후, 세포 용해물을 준비하고 SASH1 발현을 면역 블롯팅에 의해 β-액틴에 대해 분석하였다. KD, 녹다운. (B-D) 세포를 위와 같이 형질 도입하고 클로로피라민을 형질감염 24 시간 후에 첨가하였다. 배양물을 광학 현미경으로 이미지화하고 처리 후 96 시간에 비처리 대조군에 대한 합류를 평가하기 위해 디지털 방식으로 분석하였다. 표시된 데이터는 세 독립적인 실험으로부터 +/- 표준 편차를 의미한다. t-검정을 사용하여 각 클로로피라민 용량에서 SASH1 고갈 유무에 따른 세포 합류를 비교하였다. * p <0.05.
도 14. (a) BRCA 결핍 및 BRCA 풍부 종양에서 SASH1 단백질 수준; (b) 루카파립 치료에 대한 반응성과 SASH1 수준의 상관 관계.
상세한 설명
본 발명은 SASH1이 암에서 PARP 억제제 치료의 예측 바이오마커라는 놀라운 발견에 적어도 부분적으로 근거한다. 추가로, 본 명세서에 기술된 발명은 SASH1 발현을 조절, 특히 증가시키는 것이 효과적인 항암 치료일 수 있다는 발견에 근거한다. 또한, 본 발명은 SASH1이 유방암과 같은 생식계암뿐만 아니라 폐암 및 위암과 같은 다른 고형 종양의 예후 마커라는 발견에 적어도 부분적으로 근거한다.
한 특정 측면에서, 본 발명은 대상체에서 항암제에 대한 암의 반응성을 예측하는 방법에 관한 것이며, 여기서 항암제는 파손된 DNA 가닥의 복구를 매개하는 효소의 활성을 억제하고, 상기 방법은 대상체의 하나 또는 다수의 암 세포, 조직 또는 기관에서 SASH1 핵산 또는 코딩 단백질의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 SASH1 핵산 또는 코딩 단백질의 변경되거나 조정된 발현 수준은 항암제에 대한 암의 상대적으로 증가 또는 감소된 반응성을 나타내거나 이와 관련된다.
당업자는 SASH1 유전자가 단백질 SAM 및 SH3 도메인-함유 단백질 1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다는 것을 이해할 것이다. SASH1에 대한 다른 이름은 프롤린-글루타메이트 반복-함유 단백질 3, 2500002E12Rik, DJ323M4.1, KIAA0790, DJ323M4, SH3D6A 및 PEPE1이다. 당 업계에 잘 알려진 바와 같이 인간에서 SASH1 유전자의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 코딩 단백질을 가리키는 수탁 번호의 비제한적인 예는 NM_015278 및 NP_056093.3을 포함한다. 본원에서 일반적으로 사용되는 "SASH1"은 달리 명시되지 않는 한 SASH1 핵산 또는 코딩 단백질을 지칭할 수 있다.
본 발명의 목적 상, "단리된"은 자연 상태에서 제거되거나 그렇지 않으면 인간에 의해 조작된 물질을 의미한다. 단리된 물질은 일반적으로 그의 자연 상태에서 동반되는 구성 요소가 실질적으로 또는 본질적으로 없을 수 있거나, 일반적으로 자연 상태에서 동반되는 구성 요소와 함께 인공 상태가 되도록 조작될 수 있다. 단리된 물질은 천연, 화학적 합성 또는 재조합 형태일 수 있다.
본원에 사용된 "유전자"는 프로모터 및 기타 5' 비번역 서열, 인트론, 폴리아데닐화 서열 및 기타 3' 비번역 서열을 제한없이 포함하는 하나 이상의 아미노산 코딩 뉴클레오티드 서열 및 하나 이상의 비코딩 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있는 게놈의 구조적, 유전적 단위인 핵산이다. 대부분의 세포 유기체에서 유전자는 이중 가닥 DNA를 포함하는 핵산이다.
본원에 사용된 용어 "핵산"은 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 및 RNA를 지칭한다. DNA에는 게놈 DNA와 cDNA가 포함된다. RNA에는 mRNA, RNA, RNAi, siRNA, cRNA 및 자가 촉매 RNA가 포함된다. 핵산은 또한 DNA-RNA 하이브리드일 수 있다. 핵산은 전형적으로 A, G, C, T 또는 U 염기를 포함하는 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 그러나, 뉴클레오티드 서열은 이노신, 메틸릴사이토신, 메틸리노신, 메틸아데노신 및/또는 티오우리딘과 같은 다른 염기를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
또한, SASH1의 자연 발생 (예를 들어, 대립유전자) 변이체 및 오르솔로그 (예를 들어, 상이한 종 유래)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 "변이체" 핵산이 포함된다. 바람직하게는, 핵산 변이체는 본원에 개시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 70% 또는 75%, 바람직하게는 적어도 80% 또는 85% 또는 더 바람직하게는 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다.
핵산 단편도 포함된다. "단편"은 각각 뉴클레오티드 서열의 100% 미만을 구성하는 핵산의 세그먼트, 도메인, 부분 또는 영역이다. 비제한적인 예는 증폭 산물 또는 프라이머 또는 프로브이다. 특정 실시양태에서, 핵산 단편은 예를 들어 상기 핵산의 적어도 10, 15, 20, 25, 30 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000 및 7500 개의 인접 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "폴리뉴클레오티드"는 80 개 이상의 인접 뉴클레오티드를 갖는 핵산인 반면, "올리고뉴클레오티드"는 80 개 미만의 인접 뉴클레오티드를 갖는다. "프로브"는 예를 들어 노던 또는 서던 블롯팅에서 상보적 서열을 검출할 목적으로 적합하게 표지된 단일 또는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. "프라이머"는 일반적으로 상보성 핵산 "주형"에 어닐링할 수 있고 Taq 폴리머라제, RNA 의존성 DNA 폴리머라제 또는 SequenaseTM과 같은 DNA 폴리머라제의 작용에 의해 주형 의존적 방식으로 확장될 수 있는 바람직하게는 15 내지 50 개의 인접 뉴클레오티드를 가지는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이다. "주형" 핵산은 핵산 증폭을 거치는 핵산이다.
"단백질"은 아미노산 중합체를 의미한다. 아미노산은 당 업계에 잘 알려진 바와 같이 천연 또는 비천연 아미노산, D- 또는 L-아미노산일 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 용어 "단백질"은 또한 그 범위 내에 단백질의 인산화된 형태 (즉, 인 단백질) 및/또는 단백질의 당화된 형태 (즉, 당 단백질)를 포함한다. "펩티드"는 아미노산이 50 개 이하인 단백질이다. "폴리펩티드"는 아미노산이 50 개를 초과하는 단백질이다.
또한 SASH1의 자연 발생 (예를 들어, 대립유전자 변이체) 및 오르솔로그와 같은 단백질 "변이체"가 제공된다. 바람직하게는, 단백질 변이체는 본원에 개시되거나 당 업계에 공지된 SASH1의 아미노산 서열과 적어도 70% 또는 75%, 바람직하게는 적어도 80% 또는 85% 또는 더 바람직하게는 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다.
또한 전체 아미노산 서열의 100% 미만을 구성하는 펩티드 단편을 포함한 단백질 단편이 제공된다. 특정 실시양태에서, 단백질 단편은 예를 들어 상기 단백질의 적어도 10, 15, 20, 25, 30 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150 및 1200 개의 인접 아미노산을 포함할 수 있다.
본원에서 일반적으로 사용되는 용어 "암", "종양", "악성인" 및 "악성"은 종종 종양 발생, 종양 마커의 발현, 종양 억제자 발현 또는 활성의 상실 및/또는 이상 또는 비정상적인 세포 표면 마커 발현과 관련된 하나 이상의 유전적 돌연변이 또는 기타 유전적 변화를 포함한 이상 또는 비정상적인 분자 표현형을 수반하는 이상 또는 비정상적인 세포 증식, 분화 및/또는 이동을 특징으로 하는 질환 또는 상태, 또는 그 질환 또는 상태와 관련된 세포 또는 조직을 의미한다.
암에는 육종, 암종, 림프종, 백혈병 및 모세포종을 예로 들 수 있으나 이에 제한되지 않는 모든 주요 암 형태를 포함하여 NCI 암 색인 (http://www.cancer.gov/cancertopics/alphalist)에 나열된 공격적이거나 잠재적으로 공격적인 암, 종양 또는 기타 악성 종양이 포함될 수 있다. 여기에는 유방암, 폐선암을 포함한 폐암, 난소암, 자궁경부암, 자궁암 및 전립선암을 포함한 생식계암, 뇌 및 신경계 암, 두 경부암, 결장암, 대장암 및 위암을 포함한 위장 암, 간암, 신장암, 흑색종 및 피부암종과 같은 피부암, 림프구암 및 골수단핵구 암을 포함하는 혈액세포암, 췌장암 및 뇌하수체 암과 같은 내분비계 암, 뼈 및 연조직 암을 포함한 근골격암이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
현재 및 이후 설명되는 측면과 관련하여, 암은 적절하게는 유방암, 난소암, 자궁경부암, 자궁암, 전립선암 또는 고환암과 같은 생식계의 암이다. 바람직하게는, 생식계암은 유방암이다. 이를 위해, 당업자는 유방암이 삼중 음성 유방암, 등급 2 유방암, 등급 3 유방암, 림프절 양성 (LN+) 유방암, HER2 양성 (HER2+) 유방암, ER 음성 (ER-) 유방암 및 ER 양성 (ER+) 유방암과 같은 당 업계에 공지된 임의의 공격적 유방암 및 암 아형을 포함할 수 있음을 인식할 것이다.
다른 실시양태에서, 본원에 개시된 측면의 암은 폐암이거나 이를 포함한다. 이 경우, 폐암은 비소세포 암종 (즉, 편평세포 암종, 선암 및 대세포 암종), 소세포 암종 및 중피종과 같이 당 업계에 알려진 임의의 공격성 폐암 및 암 아형을 포함할 수 있음이 명백할 것이다.
용어 "파손된 DNA 가닥"은 DNA 이본쇄의 단일 가닥이 절단되거나 파손된 경우 (단일 가닥 파손) 및 DNA 이본쇄의 두 가닥이 절단되거나 파손된 경우 (이중 가닥 파손)를 포함한다. 이러한 DNA 가닥 파손은 음식이나 환경에 존재하는 전리 방사선, 자외선, 작용제 또는 기타 돌연변이와 같은 외부 요인 또는 신진 대사 과정에서 생성되는 활성 산소 및 DNA 복제시 오류(들) 등의 내재적 요인에 의해 발생할 수 있다.
특정 실시양태에서, 암은 DNA 가닥 파손을 복구하는 능력 또는 용량이 감소되거나 손상되었고/거나, 파손된 DNA 가닥의 감수성 또는 발생률 증가를 나타낸다. 이와 관련하여, 암 세포는 DNA 가닥 파손 복구의 결함 또는 이의 증가된 발생률을 입증할 수 있으며, 이는 적어도 부분적으로 이의 비정상적인 성장, 분화 및/또는 이동 특성에 기여한다. 따라서, 그러한 암세포는 그 안에서 파손된 DNA 가닥의 유도에 특히 민감해질 수 있다. 일부 암세포는 하나 이상의 특정 DNA 가닥 파손 복구 경로 또는 메커니즘에서 결함을 획득하고 이후에 생존하기 위해 보상 메커니즘에 의존하게 된다. 따라서 DNA 손상 유도와 함께 이러한 보상 메커니즘의 표적 억제는 암세포를 선택적으로 죽일 수 있으면서도 정상적인 대응물을 보존할 수 있다 (즉, 합성 치사).
본 측면과 관련하여, 상기 파손된 DNA 가닥의 복구를 매개하는 효소는 당 업계에 공지된 임의의 것일 수 있다. 바람직하게는, 효소는 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제 (PARP)이다.
폴리(ADP-리보스) 폴리머라제 (PARP)는 일반적으로 여러 세포 과정, 특히 DNA 복구 및 프로그램된 세포사에 관여하는 단백질 계열이다. PARP 계열에는 촉매 도메인에서 특정 수준의 상동성을 나타내지만 전형적으로 세포 기능이 상이한 약 18 개의 단백질 (예를 들어, PARP1, PARP2, VPARP (PARP4), 탄키라제-1 및 -2 (PARP-5a 또는 TNKS, 및 PARP-5b 또는 TNKS2), PARP3, PARP6, TIPARP (또는 "PARP7"), PARP8, PARP9, PARP10, PARP11, PARP12, PARP14, PARP15, 및 PARP16이 포함된다. PARP-1 및 PARP-2는 파손된 DNA 가닥의 발생에 의해 촉매 활성이 자극된다는 점에서 상기 계열의 독특한 구성원으로 간주된다. 이와 관련하여 PARP는 DNA 단일 또는 이중 가닥 파손을 인식하고 신속하게 결합하는 능력을 통해 DNA 손상 신호에 연루되어 있다.
상기와 관련하여, 항암제는 적합하게는 PARP 억제제이거나 이를 포함한다. 본원에서 일반적으로 사용되는 용어 "PARP 억제제"는 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제 활성의 억제제 또는 길항제를 지칭한다. 특정 실시양태에서, PARP 억제제는 특정 PARP 단백질 또는 단백질들, 예컨대 PARP1 및/또는 PARP2를 특이적으로 억제한다. PARP 억제제가 대상체에게 투여될 때 대상체 내의 PARP 활성이 변경되고, 보다 바람직하게는 감소된다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 하나 이상의 PARP 발현의 발현 수준을 감소시킬 수 있는 약물도 PARP 억제제로 간주된다. 하나의 실시양태에서, PARP를 억제하는 생체 내 화합물로 전환되는 PARP 억제제의 전구 약물이 대상체에게 투여된다.
PARP 억제제는 모든 유형의 화합물일 수 있다. 예를 들어, 화합물은 작은 유기 분자 또는 항체 또는 효소와 같은 생물학적 화합물일 수 있다. 이를 위해, 당업자는 화합물이 당 업계에 공지된 임의의 수단에 의해 PARP 활성 및/또는 발현을 억제할 수 있는지 여부를 결정할 수 있을 것이다. PARP 활성 및/또는 이의 억제를 평가하기 위한 예시적인 분석에는, 예를 들어, 삼중 수소 기질 NAD 또는 PARP 활성에 의해 형성된 중합체쇄에 대한 특정 항체의 방사성 분석을 사용하여 폴리 ADP-리보스 사슬을 형성하는 PARP의 직접적인 활성을 측정하는 도트 블롯 및 BER 분석이 포함된다.
PARP 억제제는 올라파립, 벨리파립, 루카파립, 이니파립, 탈라조파립, 니라파립, 3-아미노벤즈아미드, ME0328, PJ34, AG-14361, INO-1001, UPF-1069, AZD-2461, CEP 9722, A-966492 및 이들의 임의의 조합과 같은 당 업계에 공지된 임의의 것일 수 있음이 인정될 것이다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, SASH1 핵산 또는 코딩 단백질의 발현 수준은 대조군 또는 참조 샘플의 발현 수준 또는 역치 발현 수준과 비교하여 상대적으로 (i) 더 높거나, 증가하거나, 크거나; 또는 (ii) 더 낮거나, 저하되거나, 감소할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 발현 수준은 참조 집단의 평균 및/또는 중앙 발현 수준을 초과하는 경우 더 높은 증가 또는 큰 것으로 분류될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 발현 수준은 참조 집단의 평균 및/또는 중앙 발현 수준 미만인 경우 더 낮거나, 저하 또는 감소된 것으로 분류될 수 있다. 이와 관련하여, 참조 집단은 발현 수준이 결정되는 상기 포유동물과 동일한 암 유형, 하위 군, 단계 및/또는 등급을 갖는 대상체 그룹일 수 있다.
본원에 사용된 "더 높은", "증가된" 및 "더 큰"과 같은 용어는 대조군 또는 참조 수준 또는 양과 비교하여 생물학적 샘플 등에서 SASH1 핵산 또는 단백질의 상승된 양 또는 수준을 지칭한다. SASH1 핵산 또는 단백질의 발현 수준은 상대적이거나 절대적일 수 있다. 일부 실시양태에서, SASH1 핵산 또는 단백질의 발현은 발현 수준이 대조군 또는 참조 수준 또는 양에서 SASH1 핵산 또는 단백질의 발현 수준보다 약 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%를 초과하는 경우 더 높거나, 증가하거나 더 크다.
본원에 사용된 용어 "낮은", "저하된" 및 "감소된"은 대조군 또는 참조 수준 또는 양과 비교하여 생물학적 샘플 등에서 SASH1 핵산 또는 단백질의 낮은 양 또는 수준을 지칭한다. SASH1 핵산 또는 단백질의 발현 수준은 상대적이거나 절대적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현 수준이 대조군 또는 참조 수준 또는 양에서 SASH1 핵산 또는 단백질의 발현 수준보다 약 95%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30, 20% 또는 10% 미만인 경우, 또는 심지어 약 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.01%, 0.001% 또는 0.0001% 미만인 경우, SASH1 핵산 또는 단백질의 발현은 더 낮거나, 저하되거나 감소된다.
용어 "대조군 샘플"은 전형적으로 암에 걸리지 않은 (건강한) 비질병 개체로부터의 생물학적 샘플을 의미한다. 하나의 실시양태에서, 대조군 샘플은 암이 없는 것으로 알려진 대상체로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 대조군 샘플은 암의 관해된 대상체로부터 얻은 것일 수 있다. 대조 샘플은 풀링, 평균 또는 개별 샘플일 수 있다. 내부 대조군은 시험중인 동일한 생물학적 샘플의 마커이다.
본원에 사용된 발현 수준은 발현된 핵산 또는 단백질의 절대 또는 상대적 양일 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, SASH1 유전자 및/또는 이의 산물의 발현 수준은 하나 또는 다수의 "하우스 키핑" 유전자 및/또는 포유동물의 하나 이상의 암 세포, 조직 또는 기관 중 단백질의 유전자 및/또는 단백질의 발현 수준과 같은 대조군 발현 수준과 비교된다.
추가 실시양태에서, SASH1 핵산 또는 코딩 단백질의 발현 수준은 비암성 조직에서의 유전자 및/또는 단백질 발현 수준과 같은 역치 발현 수준과 비교된다. 발현의 역치 수준은 일반적으로 SASH1의 정량화된 발현 수준이다. 전형적으로, 발현의 역치 수준을 초과하거나 미만으로 떨어지는 샘플에서 SASH1의 발현 수준은 특정 질병 상태 또는 결과를 예측한다. 발현의 역치 수준의 특성 및 수치 (존재하는 경우)는 예를 들어 포유동물에서 항암 요법 (예를 들어, PARP 억제제 요법)에 대한 예후 및/또는 반응을 결정하는 데 사용되는 하나 이상의 유전자 또는 이의 산물의 발현을 결정하기 위해 선택된 방법에 따라 일반적으로 변할 것이다.
당업자는 예를 들어, 항암 요법에 대한 예후 및/또는 반응을 결정하는데 사용될 수 있는 샘플에서의 SASH1 핵산 또는 단백질 발현의 역치 수준을 본원에 기재된 것과 같은 당 업계에 공지된 유전자 또는 단백질 발현을 측정하는 임의의 방법을 사용하여 결정할 수 있을 것이다. 하나의 실시양태에서, 역치 수준은 예를 들어 발현 수준이 결정되는 상기 포유동물과 동일한 암 유형, 하위 군, 단계 및/또는 등급을 갖는 참조 집단에서의 SASH1의 평균 및/또는 중앙 발현 수준 (중간 또는 절대)이다. 또한, 역치 수준의 발현 개념은 단일 값 또는 결과로 제한되어서는 안된다. 이와 관련하여, 발현의 역치 수준은 예를 들어 PARP 억제제 요법에 대한 반응의 높음, 중간 또는 낮은 확률을 의미할 수 있는 다중 역치 발현 수준을 포함할 수 있다.
하나의 실시양태에서, SASH1 핵산 또는 코딩 단백질의 낮은 발현 수준은 항암 치료에 대한 암의 상대적으로 증가된 반응성을 나타내거나 이와 관련된다. 대안적 실시양태에서, SASH1 핵산 또는 코딩 단백질의 낮은 발현 수준은 항암 치료에 대한 암의 상대적으로 감소된 반응성을 나타내거나 이와 관련된다.
특히 바람직한 하나의 실시양태에서, 항암 치료가 PARP 억제제이거나 이를 포함하는 경우, SASH1 핵산 또는 코딩 단백질의 상대적으로 낮은 발현 수준은 PARP 억제제에 대한 암의 상대적으로 증가된 반응성을 나타내거나 이와 관련된다. 유사하게, SASH1 핵산 또는 코딩 단백질의 상대적으로 더 높은 발현 수준은 PARP 억제제에 대한 암의 상대적으로 감소된 반응성을 적절하게 나타내거나 이와 관련된다.
적합하게는, SASH1의 감소 또는 저하 수준은 항암제에 대한 암의 상대적으로 증가된 반응성을 나타내거나 이와 관련된다. 반대로, SASH1의 증가된 수준은 항암제에 대한 암의 상대적으로 감소된 반응성을 나타내거나 이와 관련될 수 있다. 특정 실시양태에서, 감소된 수준의 SASH1은 PARP 억제제에 대한 암의 상대적으로 증가된 반응성을 나타내거나 이와 관련되고/되거나 증가된 수준의 SASH1은 PARP 억제제에 대한 암의 상대적으로 감소된 반응성을 나타내거나 이와 관련된다. 이와 관련하여, SASH1 발현 수준은 PARP 억제제 요법에 대한 대상체의 암의 민감성 및/또는 내성을 예측하는 데 유용하다.
용어 "결정하는", "측정하는", "평가하는", "산정하는" 및 "분석하는"은 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용되며, 이하에 설명되는 것과 같이 당 업계에 공지된 임의 형태의 측정을 포함할 수 있다.
RNA, mRNA 및 cDNA와 같은 SASH1의 핵산을 결정, 평가, 산정, 분석 또는 측정하는 것은 당 업계에 알려진 임의의 기술에 의해 수행될 수 있다. 이들은 핵산 서열 증폭, 핵산 혼성화, 뉴클레오티드 시퀀싱, 질량 분광법 및 이들의 임의의 조합을 포함하는 기술일 수 있다.
핵산 증폭 기술은 전형적으로 적절한 조건 하에서 하나 이상의 프라이머를 "주형" 뉴클레오티드 서열에 어닐링하고 폴리머라제를 사용하여 표적에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 합성함으로써 표적 뉴클레오티드 서열을 "증폭"하는 반복 주기를 포함한다. 핵산 증폭 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR); 가닥 변위 증폭 (SDA); 롤링 서클 복제 (RCR); 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA), Q-β 복제 효소 증폭; 헬리카제 의존 증폭 (HAD); 루프 매개 등온 증폭 (LAMP); 닉킹 효소 증폭 반응 (NEAR) 및 리콤비나제 폴리머라제 증폭 (RPA)을 포함할 수 있으나 이에만 한정되지 않는다. 본원에서 일반적으로 사용되는 "증폭 산물"은 핵산 증폭 기술에 의해 생성된 핵산 산물을 의미한다.
PCR에는 정량 및 반정량 PCR, 실시간 PCR, 대립유전자 특이 PCR, 메틸화 특이 PCR, 비대칭 PCR, 중첩 PCR, 멀티플렉스 PCR, 터치 다운 PCR, 디지털 PCR 및 "기본" PCR 증폭에 대한 기타 변형 및 조정이 포함된다.
핵산 증폭 기술은 세포 또는 조직 공급원에서 추출, 단리 또는 기타 방법으로 획득된 DNA 또는 RNA를 사용하여 수행할 수 있다. 다른 실시양태에서, 핵산 증폭은 적절하게 처리된 세포 또는 조직 샘플에서 직접 수행될 수 있다.
핵산 혼성화는 전형적으로 적절한 조건 하에서 표적 뉴클레오티드 서열에 전형적으로 프로브 형태의 뉴클레오티드 서열을 혼성화하고 이에 의해 혼성화된 프로브-표적 뉴클레오티드 서열을 후속적으로 검출하는 것을 포함한다. 비제한적인 예는 노던 블롯팅, 슬롯 블롯팅, 인시튜 혼성화 및 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 검출을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 핵산 혼성화는 세포 또는 조직 공급원에서 추출, 단리 또는 기타 방법으로 획득된 DNA 또는 RNA를 사용하여 추출, 단리, 증폭 또는 달리 세포 또는 조직 공급원에서 얻거나 적절하게 처리된 세포 또는 조직 샘플에서 직접 수행할 수 있다.
또한 핵산 증폭 및 핵산 혼성화의 조합이 이용될 수 있음을 인식할 것이다.
SASH1의 단백질 수준을 결정, 평가, 산정, 분석 또는 측정하는 것은 세포 표면 또는 세포 내 발현 여부에 관계없이 세포 또는 조직 발현 단백질 또는 조직 공급원의 세포로부터 단리, 추출 또는 기타 방법으로 획득된 단백질을 검출할 수 있는 당 업계에 알려진 임의의 기술에 의해 수행될 수 있다. 이들 기술에는 단백질에 결합하는 하나 이상의 항체를 사용하는 항체 기반 검출, 전기 영동, 등전 집속, 단백질 시퀀싱, 크로마토그래피 기술 및 질량 분광학 및 이들의 임의의 조합이 포함되나 이들에 제한되지 않는다. 항체 기반 검출은 SASH1에 결합하는 형광 표지된 항체를 사용하는 유세포 분석, ELISA, 면역 블롯팅, 면역 침전, 인시튜 하이브리드화, 면역조직화학 및 면역세포화학을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. TissueMicroArrayTM (TMA), MSD MultiArraysTM 및 멀티웰 ELISA 등 단백질 어레이를 사용하는 것과 같이 높은 처리량 및/또는 신속한 분석을 위해 적합한 기술이 적용될 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
SASH1의 발현을 결정하는 것은 핵산 증폭 및/또는 핵산 혼성화에 의한 것과 같이 이의 핵산 수준 및 이의 단백질 수준을 모두 결정하는 것을 포함할 수 있음이 이해될 것이다.
특정 실시양태에서, SASH1의 유전자 발현 수준은 유전자 발현을 조절하는 비코딩 RNA, 예컨대 miRNA의 측정에 의해 간접적으로 평가될 수 있다. MicroRNA (miRNA 또는 miR)는 표적 mRNA 전사체의 3' 비번역 영역 (3'UTR)에서 상보적 서열에 결합하는 전사 후 조절자로서, 일반적으로 유전자 침묵을 초래한다. miRNA는 평균 뉴클레오티드 길이가 22 개에 불과한 짧은 RNA 분자이다. 인간 게놈은 1000 개가 넘는 miRNA를 코딩할 수 있으며, 이는 포유동물 유전자의 약 60%를 표적으로 할 수 있으며 많은 인간 세포 유형에 풍부하다. 각 miRNA는 수백 개의 개별 mRNA의 발현을 변경할 수 있다. 특히, miRNA는 음성 조절 (예를 들어, 전사체 분해 및 격리, 번역 억제) 및/또는 양성 조절 (예를 들어, 전사 및 번역 활성화)에서 여러 역할을할 수 있다. 또한 비정상적인 miRNA 발현은 다양한 유형의 암에 연루된다.
본 발명의 추가 측면은 대상체의 암 치료에 관한 것이다.
하나의 특정 측면에서, 암 치료는 대상체의 하나 또는 다수의 암 세포, 조직 또는 기관에서 SASH1 단백질 또는 코딩 핵산의 발현 수준을 결정하고 이루어진 결정해 기초해 암 치료의 개시, 지속, 수정 또는 중단하는 것으로 수행된다. 이와 관련하여, PARP 억제제와 같은 항암제에 대한 암의 반응성을 예측하기 위한 본원에 기술된 방법은 치료적 유효량의 항암제를 포유동물에게 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있음을 인식할 것이다. 바람직한 실시양태에서, 항암 치료는 SASH1 발현 수준이 항암제에 대한 암의 상대적으로 증가된 반응성을 나타내거나 이와 관련되는 경우 투여된다.
특정 실시양태에서, 암 치료는 파손된 DNA 가닥의 복구를 매개하는 효소의 활성을 억제하는 항암제의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 암 치료는 SASH1의 발현 및/또는 활성을 억제 또는 예방하는 약제의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 특정 측면에서, 본 발명은 SASH1의 발현 및/또는 활성을 증가시키는 약제의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
적합하게는, 약제는 작은 유기 분자이다. 작은 유기 분자의 비제한적인 예는 클로로피라민이다.
특정 측면에서, 본 발명은 파손된 DNA 가닥의 복구를 매개하는 효소의 활성을 억제하는 항암제와 함께 SASH1의 발현 및/또는 활성을 억제 또는 예방하는 약제의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
적합하게는, 효소는 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제 (PARP)이다. 따라서, 항암제는 본원에서 앞서 기술된 것과 같은 PARP 억제제이거나 이를 포함할 수 있다.
앞서 언급한 바와 같이, 특정 암은 DNA 가닥 파손을 복구하는 능력 또는 용량의 감소 또는 손상을 보여줄 수 있고/있거나 하나 이상의 특정 DNA 가닥 파손 복구 경로에서 획득된 결함을 통해 잠재적으로 DNA 가닥 파손에 대한 감수성 증가 또는 발생률을 가질 수 있다. 결과적으로 이러한 암세포는 지속적인 DNA 손상에서 살아 남기 위해 SASH1과 같은 보상 메커니즘에 의존할 수 있다. 따라서, 예를 들어 PARP 억제제의 투여에 의한 암에서 파손된 DNA 가닥의 유도와 조합된 SASH1의 표적화된 억제는 본원에 제시된 바와 같이 암 세포를 선택적으로 죽이기 위해 구현될 수 있다. 이를 위해 PARP와 SASH1 간의 유전적 상호 작용은 합성 치사성으로 설명할 수 있다. 두 유전자 사이의 합성 치사율은 일반적으로 두 유전자의 개별 손실이 생명과 양립할 수 있는 경우 발생하지만 두 유전자가 동시에 손실되면 세포사에 이른다.
특정 실시양태에서, SASH1의 발현 및/또는 활성을 억제 또는 예방하는 약제는 항암제의 투여 (i) 전; (ii) 후; 또는 (iii) 그와 동시에 투여된다. 하나의 실시양태에서, SASH1의 발현 및/또는 활성을 억제 또는 예방하는 약제의 투여 및 항암제의 투여 (순차적으로 또는 동시에)는 다른 하나의 부재하에 상기 약제 또는 항암제 중 어느 하나의 투여로부터의 치료 또는 예방보다 더 큰 암의 치료 또는 예방으로 이어진다.
적합하게는, 약제(들)는 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물로서 대상체에게 투여된다. 이와 관련하여, 본원에 제공된 것과 같은 임의의 투여 형태 및 투여 경로가 대상체에게 본 발명의 조성물을 제공하기 위해 사용될 수 있다.
암 치료에는 약물 요법, 화학요법, 항체, 핵산 및 기타 생체 분자 요법, 방사선 요법, 수술, 영양 요법, 이완 또는 명상 요법 및 기타 자연 요법 또는 홀리스틱 요법 (holistic Therapy)이 포함될 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 일반적으로, 약물, 생체 분자 (예를 들어, 항체, siRNA와 같은 억제 핵산) 또는 화학요법제는 본원에서 "항암 치료제" 또는 "항암제"로 지칭된다.
암을 치료하는 방법은 방지적, 예방적 또는 치료적일 수 있으며 포유동물, 특히 인간의 암 치료에 적합하다. 본원에 사용된 "치료하는", "치료한다" 또는 "치료"는 암 및/또는 그 증상이 적어도 발병하기 시작한 후 암의 증상을 적어도 개선하는 치료적 개입, 작용 과정 또는 프로토콜을 지칭한다. 본원에 사용된 "예방하는", "예방한다" 또는 "예방"은 암의 발병 및/또는 암의 증상이 발현하기 전에 암이나 증상의 발생 또는 진행을 예방, 억제 또는 지연시키기 위해 개시된 치료적 개입, 작용 과정 또는 프로토콜을 의미한다.
용어 "치료적 유효량"은 특정 약제, 예컨대 PARP 억제제로 치료되는 대상체에서 원하는 효과를 달성하기에 충분한 상기 특정 약제, 예컨대 PARP 억제제의 양을 기술한다. 예를 들어, 이것은 암 또는 암 관련 질환, 장애 또는 상태를 감소, 완화 및/또는 예방하는 데 필요한, 본원에 기재된 파손된 DNA 가닥의 복구를 매개하는 효소의 활성을 억제하는 하나 이상의 약제를 포함하는 조성물의 양일 수 있다. 일부 실시양태에서, "치료적 유효량"은 암의 증상을 감소시키거나 제거하기에 충분하다. 다른 실시양태에서, "치료적 유효량"은 원하는 생물학적 효과를 달성하기에 충분한 양, 예를 들어 암 성장 및/또는 전이를 감소 또는 예방하는 데 효과적인 양이다.
이상적으로, 치료제의 치료적 유효량은 대상체에서 실질적인 세포 독성 효과를 일으키지 않으면서 원하는 결과를 유도하기에 충분한 양이다. 암을 감소, 완화 및/또는 예방하는 데 유용한 약제의 유효량은 치료되는 대상체, 관련 질환, 장애 및/또는 상태의 유형 및 중증도 (예를 들어, 임의의 관련 전이 수 및 위치) 및 치료 조성물의 투여 방식에 따라 달라진다.
적합하게는, 항암 치료제는 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물로서 포유동물에게 투여된다.
"약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제"는 전신 투여에 안전하게 사용할 수 있는 고상 또는 액상 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 특정 투여 경로에 따라서, 당분야에 잘 알려져 있는 다양한 담체를 사용할 수 있다. 이들 담체는 당, 전분, 셀룰로스 및 그 유도체, 맥아, 젤라틴, 탈크, 칼슘 설페이트, 리포좀 및 기타 리피드-기반 담체, 식물성 오일, 합성 오일, 폴리올, 알긴산, 인산염 완충 용액, 유화제, 등장 식염수 및 염, 가령 하이드로클로라이드, 브로마이드 및 설페이트를 포함하는 무기산염, 가령 아세테이트, 프로피오네이트 및 말로네이트를 포함하는 유기산 및 발열성 물질 제거수 (pyrogen-free water)를 포함하는 그룹으로부터 선택할 수 있다.
약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및 부형제를 서술한 유용한 참고문헌으로는 Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. N.J. USA, 1991)가 있고, 이는 참조에 의해서 본원에 포함된다.
환자에게 본 발명의 조성물을 제공하기 위해 임의의 안전한 투여 경로가 사용될 수 있다. 예를 들어, 경구, 직장, 비경구, 설하, 협측, 정맥 내, 관절 내, 근육 내, 피부 내, 피하, 흡입, 안구 내, 복강 내, 뇌 실내, 경피 등이 사용될 수 있다. 예를 들어, 면역 치료 조성물, 단백질성 백신 및 핵산 백신의 투여에는 근육 내 및 피하 주사가 적절하다.
투여 제형은 정제, 분산액, 현탁제, 주사제, 액제, 시럽제, 트로키제, 캡슐제, 좌약, 에어로졸, 경피 패치 등을 포함한다. 이들 투여 제형은 또한 상기 목적을 위해서 특별히 고안된 주입 또는 이식 제어방출 장치 또는 상기 형태로 추가로 작용하도록 변형된 다른 임플란트 형태를 포함할 수 있다. 치료제의 제어 방출은 아크릴 수지, 왁스, 고급 지방산 알콜, 폴리락트산 및 폴리글리콜산을 포함하는 소수성 중합체 및 특정 셀룰로스 유도체, 가령 하이드록시프로필메틸 셀룰로스로 코팅함으로써 달성될 수 있다. 또한, 상기 제어 방출은 다른 중합체 매트릭스, 리포좀 및/또는 마이크로스피어를 사용함으로써 달성될 수 있다.
경구 또는 비경구 투여에 적합한 본 발명의 조성물은 각각 미리 결정된 양의 본 발명의 하나 이상의 치료제를 함유하는 캡슐, 샤셰 또는 정제와 같은 별개의 단위, 분말 또는 과립 또는 수성 액체, 비수성 액체, 수중유 에멀젼 또는 유중수 액체 에멀젼 중의 용액 또는 현탁액으로 제공될 수 있다. 이러한 조성물은 임의의 제약 방법에 의해 제조될 수 있지만, 모든 방법은 하나 이상의 필요한 성분을 구성하는 담체와 상기 기재된 바와 같은 하나 이상의 약제를 결합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 조성물은 본 발명의 약제를 액체 담체 또는 미분된 고체 담체 또는 둘 모두와 균일하고 밀접하게 혼합한 다음, 필요한 경우 제품을 원하는 형태로 성형함으로써 제조된다.
상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여 제형에 적합한 방식에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 맥락에서 환자에게 투여되는 용량은 적절한 기간 동안 환자에게 유익한 반응을 일으키기에 충분해야 한다. 투여되는 약제(들)의 양은 치료할 대상의 연령, 성별, 체중 및 일반적인 건강 상태를 포함하여 의사의 판단에 따라 달라질 수 있는 요인에 따라 달라질 수 있다.
특정 실시양태에서, 항암 요법은 SASH1의 작용 억제 및/또는 그의 발현 감소를 지시할 수 있다. 다른 실시양태에서, 항암 요법은 SASH1의 작용 촉진 및/또는 활성 및/또는 발현 증가를 지시할 수 있다.
대안적 실시양태에서, 항암 치료는 SASH 이외의 유전자 또는 유전자 산물을 지시할 수 있다. 예를 들어, 항암 치료는 SASH1과 직접 또는 간접적으로 상호 작용하고/하거나 SASH1의 발현을 조절하는 것으로 알려진 유전자 또는 유전자 산물을 표적으로 할 수 있다.
따라서, 특정 실시양태에서, 암 치료는 효소의 활성을 억제하는 항암제, 예컨대 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제 (PARP)의 투여를 포함하며, 이는 전술한 바와 같은 파손된 DNA 가닥의 복구를 매개한다. 바람직하게는, 항암제는 본원에서 이전에 기술된 것과 같은 PARP 억제제이거나 이를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 암 치료에 관한 "동반 진단"을 제공하고, 이에 의해 SASH1의 발현 수준은 상기 암 치료의 안전하고/하거나 효과적인 투여를 위해 사용되는 임상의 등에 정보를 제공한다.
적합하게는, 암은 전술한 유형이나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 암은 SASH1의 변경되거나 조절된 발현 수준을 나타낸다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 대상체에서 암 치료에 사용하기 위한 약제를 확인하는 방법을 제공한다:
(a) SASH1 핵산 또는 코딩 단백질을 발현하는 세포를 후보 약제와 접촉시키는 단계; 및
(b) 후보 약제가 SASH1의 발현 및/또는 활성을 조절하는지 여부를 결정하는 단계.
특정 실시양태에서, 후보 약제는 SASH1의 발현 및/또는 활성을 적어도 부분적으로 감소, 제거, 억압 또는 억제한다. 본 개시 내용을 고려할 때, 이러한 약제는 본원에 제공된 PARP 억제제와 같은 파손된 DNA 가닥의 복구를 매개하는 효소의 활성을 억제하는 항암제와 조합하여 사용될 수 있음이 명백할 것이다.
대안적 실시양태에서, 후보 약제는 적어도 부분적으로 SASH1의 발현 및/또는 활성을 증가시킨다. 이를 위해, 약제는 단일 요법으로 또는 대안적으로 본원에 기재된 것과 같은 추가 항암제와 조합하여 사용될 수 있다.
적합하게는, 약제는 유의적인 표적 외 및/또는 비특이적 효과를 거의 또는 전혀 나타내지 않거나 보유하지 않는다.
바람직하게는, 약제는 항체 또는 작은 유기 분자이다.
항체 억제제와 관련된 실시양태에서, 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날, 천연 또는 재조합체일 수 있다. 항체 생산, 정제 및 사용에 적용 가능한 잘 알려진 프로토콜은 예를 들어 in Chapter 2 of Coligan et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (John Wiley & Sons NY, 1991-1994) and Harlow, E. & Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988에서 찾을 수 있으며, 둘 다 본원에 참조로 포함된다.
일반적으로, 본 발명의 항체는 SASH1의 단백질 산물의 단리된 단백질, 단편, 변이체 또는 유도체에 결합하거나 접합한다. 예를 들어, 항체는 폴리클로날 항체일 수 있다. 이러한 항체는 예를 들어 SASH1 단백질 산물의 단리된 단백질, 단편, 변이체 또는 유도체를 마우스 또는 토끼를 포함할 수 있는 생산 종에 주입하여 폴리클로날 항혈청을 수득함으로써 제조될 수 있다. 폴리클로날 항체를 생산하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 사용될 수 있는 예시적인 프로토콜은 예를 들어 Coligan et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, supra, and in Harlow & Lane, 1988, supra에 설명되어 있다.
모노클로날 항체는 예를 들어 본원에 참조로 포함되는 Koehler & Milstein, 1975, Nature 256, 495의 기사에 기술된 표준 방법 또는 예를 들어 Coligan et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, supra에 기술된 바와 같은 상기 방법의 보다 최신의 변경 방법을 사용하여 단리된 SASH1 단백질 산물 및/또는 그의 단편, 변이체 및/또는 유도체 중 하나 이상이 접종된 생산 종으로부터 유래된 비장 또는 다른 항체 생산 세포를 불멸화시킴으로써 생성될 수 있다.
전형적으로, 후보 억제제 항체의 억제 활성은 항체의 존재하에 SASH1 단백질의 발현 수준 및/또는 활성을 검출하거나 측정하는 시험관 내 및/또는 생체 내 분석에 의해 평가될 수 있다.
작은 유기 분자 억제제와 관련된 실시양태에서, 이것은 잠재적인 신약 또는 선도 화합물을 찾기 위해 수백 개의 분자 표적 중 어느 하나에서 생물학적 활성을 선별하거나 시험할 수 있는, 수십만 내지 수백만 개의 후보 억제제 (합성, 작은 유기 분자 또는 억제 펩티드 또는 단백질과 같은 천연 산물을 포함하는 화학 화합물)가 넘버링된 대형 화합물 라이브러리의 스크리닝을 포함할 수 있다. 스크리닝 방법은 컴퓨터 기반 ("인 실리코") 스크리닝 및 시험관 내 분석에 기반한 고 처리량 스크리닝을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
전형적으로, 이 초기 스크리닝 공정으로부터의 활성 화합물 또는 "적중물"은 활성 화합물을 추가로 특성화하기 위해 일련의 다른 시험관 내 및/또는 생체 내 시험을 통해 순차적으로 시험된다. 각 단계에서 점진적으로 적은 수의 "성공적인" 화합물이 후속 시험을 위해 선택되고, 결국 하나 이상의 약물 후보가 선택되어 인간 임상 시험에서 시험을 진행하게 된다.
임상 수준에서, 후보 약제의 스크리닝에는 대상체가 시험 화합물에 노출되기 전과 후에 대상체로부터 샘플을 얻는 것이 포함될 수 있다. SASH1 단백질 샘플에서의 수준을 측정하고 분석하여 SASH1 단백질의 수준 및/또는 활성이 후보 약제에 노출된 후 변하는지 여부를 결정할 수 있다. 예를 들어, 샘플에서 단백질 산물의 수준은 질량 분석법, 웨스턴 블롯, ELISA 및/또는 당업자에게 알려진 임의의 다른 적절한 수단에 의해 결정될 수 있다. 추가로, 항-아폽토시스 활성과 같은 단백질 산물의 활성이 당 업계에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 이것은 예를 들어 캐스파제 활성화 및/또는 절단, 애넥신 V 양성, 염색질 형태, 세포 외 포스파티딜세린 및 DNA 단편화 분석과 같은 아폽토시스 분석을 포함할 수 있다.
후보 약제로 치료받은 대상체가 치료로 인해 발생할 수 있는 모든 생리적 효과에 대해 일상적으로 검사될 수 있음이 이해될 것이다. 특히, 후보 약제는 대상체에서 암 발생 가능성 또는 발생을 감소시키는 능력에 대해 평가된다. 대안적으로, 후보 약제가 이전에 암 진단을 받은 대상체에게 투여되는 경우, 상기 후보 약제가 질환 완화를 유도할 뿐만 아니라 암의 진행을 늦추거나 중지시키는 능력에 대해 스크리닝될 것이다.
이와 관련하여, SASH1의 발현 수준 및/또는 활성을 감소, 제거, 억압 또는 억제할 수 있는 것으로 확인된 후보 약제는 암을 앓고 있거나 발병 위험이 있는 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, SASH1의 활성 및/또는 발현을 억제 또는 감소시키는 후보 약제의 투여는 바이오마커의 증가된 활성이 암의 진행 및/또는 발병에 적어도 부분적으로 관여하는 경우 암을 치료하고/하거나 암 위험을 감소시킬 수 있다.
관련 측면에서, 본 발명은 전술한 측면에 의해 생성 또는 확인된 항암제를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 항암제에 대한 암의 반응성을 예측하기 위한 키트를 제공하며, 여기서 항암제는 파손된 DNA 가닥의 복구를 매개하는 효소의 활성을 억제하며, 키트는 대상체의 하나 또는 다수의 암 세포, 조직 또는 기관에서 SASH1 단백질 또는 코딩 핵산의 발현 수준을 결정할 수 있는 적어도 하나의 시약을 포함하며, 여기서 SASH1 단백질 또는 코딩 핵산의 발현 수준은 항암제에 대한 암의 상대적으로 증가 또는 감소된 반응성을 나타내거나 이와 관련된다.
특정 실시양태에서, 상대적으로 감소된 수준의 SASH1 단백질 또는 코딩 핵산은 항암제에 대한 암의 상대적으로 증가된 반응성을 나타내거나 이와 관련되고/되거나; 상대적으로 증가된 수준의 SASH1 단백질 또는 코딩 핵산은 항암제에 대한 암의 상대적으로 감소된 반응성을 나타내거나 이와 관련된다.
본 측면과 관련하여, 효소는 적합하게는 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제 (PARP)이다. 따라서, 항암제는 적합하게는 PARP 억제제이거나 이를 포함한다. 바람직하게는, PARP 억제제는 올라파립, 벨리파립, 루카파립, 이니파립, 탈라조파립, 니라파립, 3-아미노벤즈아미드, ME0328, PJ34, AG-14361, INO-1001, UPF-1069, AZD-2461, CEP 9722, A-966492 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
적합하게는, 본 키트는 SASH1 단백질 또는 코딩 핵산의 발현 수준 및 항암제에 대한 암의 반응성을 연관시키기 위한 참조 데이터를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 참조 데이터는 컴퓨터 판독 가능 매체 (예를 들어, 본원에 설명된 방법 또는 기능 중 어느 하나 이상에 의해 구현되거나 사용되는 소프트웨어)에 있다. 컴퓨터 판독 가능 매체는 컴퓨터 메모리 (예를 들어, 하드 디스크 드라이브 또는 솔리드 스테이트 드라이브)와 같은 저장 장치에 포함될 수 있으며, 바람직하게는 프로세서에 의해 선택적으로 실행되는 경우 본 발명의 하나 이상의 측면을 구현하는 컴퓨터 판독 가능 코드 구성 요소를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 키트는 "동반 진단"을 제공하고, 이에 의해 SASH1 발현 수준에 관한 정보가 암 치료의 안전하고 효과적인 투여를 위해 임상의 등에 의해 활용된다.
적합하게는, 본 키트는 전술한 측면의 방법에 사용하기 위한 것이다.
추가의 광범위한 측면에서, 본 발명은 대상체의 하나 또는 다수의 암 세포, 조직 또는 기관에서 SASH1 핵산 또는 단백질의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함하는, 대상체에서 유방암에 대한 예후를 결정하는 방법을 제공하며, 여기서 SASH1의 발현 수준은 상기 유방암에 대해 덜 또는 더 유리한 암 예후를 나타내거나 이와 상관 관계가 있다.
적합하게는, 이러한 측면의 유방암은 ER 양성 (ER+) 유방암 또는 ER 음성 (ER-) 유방암이다.
용어 "예후" 및 "예후성"은 본원에서 임상 결과 (의학적 치료 유무에 관계없이)를 예측하고, 적절한 치료 과정 (또는 치료가 효과적인지 여부)을 선택하고/하거나 현재 치료를 모니터링하고 잠재적으로 치료의 변경을 대비할 수 있는 예후를 포함하기 위해 사용된다. 이는 추가 단백질 및/또는 다른 핵산 바이오마커의 발현 수준의 결정과 조합될 수 있거나, 이에 추가될 수 있는 SASH1의 발현 수준 결정에 적어도 부분적으로 기초할 수 있다. 예후는 또한 암이 성공적으로 치료되거나 해결된 후 대상체가 겪는 암의 지속적이거나 영구적인 신체적 또는 심리적 영향에 대한 예측, 전망 또는 예상을 포함할 수 있다. 더욱이, 예후는 전이 가능성 또는 발생 결정, 치료 반응성, 적절한 치료 요법 실행, 치료 후 암 재발 가능성, 가망성 또는 잠재성 결정 및 확립된 요법 (예를 들어, 화학요법)에 대한 내성 발달 예측 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 양성 예후는 전형적으로 대상체의 암 재발이 없는 장기 생존과 같은 유익한 임상 결과 또는 전망을 의미하고, 반면에 음성 예후는 일반적으로 암 재발 또는 진행과 같은 부정적인 임상 결과 또는 전망을 의미한다.
적합하게는, 본 측면의 방법은 덜 유리한 예후 또는 보다 유리한 예후를 갖는 것으로 상기 대상체를 진단하는 단계를 추가로 포함한다. 하나의 실시양태에서, SASH1 발현의 상대적 또는 절대적 감소는 대상체에서 덜 유리하거나 불량한 예후의 진단이다. 추가 실시양태에서, 유방암이 ER+ 유방암인 경우, SASH1 발현의 상대적 또는 절대적 증가는 대상체에서 보다 유리한 예후의 진단이다. 유방암이 ER- 유방암인 또 다른 실시양태에서, SASH1 발현의 상대적 또는 절대적 증가는 대상체에서 덜 유리하거나 불량한 예후의 진단이다.
상기와 관련하여, 암은 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는 특징 또는 요인의 조합 중 하나 이상으로 인해 상대적으로 불량한 예후를 가질 수 있다: 암 치료에 이용 가능한 치료법에 대해 적어도 부분적인 저항성; 침습성; 전이 가능성; 치료 후 재발; 및 낮은 환자 생존 확률. 특정 실시양태에서, SASH1 발현 수준은 공격성 질환, 특히 생화학적 재발까지 더 짧은 시간 및/또는 더 짧은 환자 생존 시간에 대한 예후이다. 추가 실시양태에서, SASH1 발현 수준은 전이성 암과 관련되거나 이를 나타낸다.
또한 SASH1 발현 수준은 하나 이상의 추가 항암 치료제로부터 특정 환자 그룹에 대한 전형적 또는 표준 항암 치료 요법으로 혜택을 받을 수 있는 더 크고/또는 더 높은 등급의 종양을 가진 환자와 같이 예후가 더 나쁜 환자를 식별하는 데 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
상기로부터 본 발명은 환자에 대한 암 예후를 결정하고/하거나 항암 치료에 대한 암의 반응성을 예측하는 방법을 제공한다는 것이 인정될 것이다. 특히, 본 발명의 광범위한 실시양태는 암 예후를 결정하고/하거나 항암 치료에 대한 암의 반응성을 예측한 후 환자를 치료하는 단계를 포함한다. 따라서, 이들 실시양태는 암 예후 및/또는 항암 치료에 대한 암의 예측된 반응성에 대해 얻은 정보를 사용하여 환자를 위한 항암 치료 요법을 구축하고 구현하는 것과 관련된다. 바람직한 실시양태에서, 이것은 치료 요법이 그 특정 환자에 대해 최적화되도록 특정 환자에게 개인화된다.
전술한 측면과 관련하여, 용어 "대상체"는 인간, 수행 동물 (예를 들어, 말, 낙타, 그레이하운드), 가축 (예를 들어, 소, 양, 말) 및 반려 동물 (예를 들어, 고양이와 개)을 포함한 포유동물이나 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 대상체는 인간이다.
본 발명의 바람직한 실시양태를 완전히 이해하고 실질적인 효과를 얻을 수 있도록 하기 비제한적 실시예가 참조된다.
실시예 1
추정 종양 억제 인자 SASH1은 아폽토시스 및 세포 증식에 연루된다. 본 발명자들의 연구는 또한 SASH1이 상동성 재조합 DNA 복구 경로를 통한 유전적 파손의 복구에도 필요함을 제시하였다. PARP 억제제는 합성 치사성으로 알려진 과정을 통해 상동 재조합 경로에 결함이 있는 암세포를 죽이도록 설계된 차세대 치료제이다. 현재까지 가장 많이 개발된 약물은 올라파립이다. 우리의 데이터는 상동성 재조합 경로에서 SASH1과 관련이 있기 때문에 낮은 SASH1 발현 세포 (상동성 재조합 활성이 감소했을 것임)가 PARP1 억제제에 민감한지 확인하고자 하였다.
결과
본 발명자들은 본 연구에 따라 SASH1이 아폽토시스에서 중요한 역할을 한다는 것을 밝혀냈다. SASH1은 아폽토시스 조절 인자인 캐스파제-3에 의해 절단되며, 이 절단 이벤트는 정상적인 아폽토시스 반응에 필요하다 (도 1). 또한 연결성 매핑으로 확인한 약물인 클로로피라민은 SASH1을 상향 조절하고 SASH1 및 UV 의존 방식으로 아폽토시스를 향상시킨다 (실시예 2 참조).
NF-κB는 UV 노출 후 아폽토시스 유도에 중요한 역할을 하며, NF-κB의 p65 서브 유닛은 UV 노출 후 세포질에서 핵으로 전위된다. 우리의 데이터는 캐스파제-3에 의한 SASH1 절단이 NF-κB의 p65 서브 유닛을 핵으로 운반하는 데 필요하며, 절단된 SASH1 형태의 전위성 발현이 NF-κB를 핵으로 운반하기에 충분함을 보여준다 (도 2).
SASH1은 hSSB1로 역조절되는 유전자로 확인되었다. hSSB1은 상동 재조합에 의한 이중 가닥 DNA 파손의 복구에서 기능한다. 이중 가닥 파손의 복구에서 hSSB1 및 BRCA1/2와 같이 SASH1이 필요한지 여부를 평가하기 위해 여러 분석을 수행하였다.
이온화 방사선 (IR)으로 인한 DNA 손상에 대한 SASH1의 반응을 평가하였다 (도 3A). 관찰된 반응은 단백질 수준의 안정화와 함께 다른 DNA 손상 반응 단백질의 반응과 유사하였다. 우리는 다음으로 GFP HR 리포터 세포주 MCF7DRGFP를 사용하여 상동 재조합에 의해 이중 가닥 DNA 파손을 복구하는 SASH1 고갈 세포의 능력을 조사하였다. 이것은 상동 재조합 활성이 SASH1의 손실에 의해 감소되었음을 나타낸다 (도 3B). 이 손상은 BRCA1 & 2 고갈 세포에서 관찰된 것과 유사하다. 후성 유전 학적 마커 γH2AX는 이중 가닥 DNA 파손의 간접 측정이므로 γH2AX 초점 계수를 통해 DNA 손상의 복구를 평가할 수 있다. 여기서 SASH1이 고갈된 세포는 IR에 의해 유도된 DNA 손상 후 γH2AX 초점 제거가 지연되는 것으로 밝혀졌다 (도 3C). 우리는 다음으로 코멧 분석을 사용하여 모의 처리된 세포와 비교하여 SASH1 고갈 세포 내의 게놈 불안정성의 정도를 평가하였다. SASH1 고갈은 이 고갈된 세포에서 게놈 불안정성이 발생했음을 나타내는 상당히 (p = 0.0003) 더 긴 코멧 꼬리를 초래하였다 (도 3D). 이들 데이터를 결합하면 SASH1은 상동 재조합 경로를 통한 DNA 복구 및 게놈 무결성 유지에 중요하다.
PARP 단백질은 염기 절제 복구 경로를 통해 단일 가닥 DNA의 검출 및 복구 기능을 수행한다 [9,10]. 따라서, 상동성 재조합이 결핍된 종양에서 PARP1을 표적화하는 것은 아폽토시스와 괴사를 통해 암 세포사를 유도하는 전략으로 확인되었다. 이러한 PARP 억제제를 암 치료제로 사용하는 것이 임상 시험으로 시험 중에 있으며, 현재 적어도 53 개의 연구 (표 1)가 일반적으로 화학요법과 함께 수행되고 있다.
Figure pct00001
이 접근법의 정당화는 주로 암 세포 내에서 BRCA1 및/또는 BRCA2 돌연변이의 존재 또는 두 유전자의 낮은 발현에 근거한다. "BRCAness"는 유방암, 전립선암, 난소암 및 폐암과 같은 고형 종양에서 기술되었다. BRCA1/2 단백질은 SASH1이 기능하는 동일한 경로인 상동성 재조합을 통한 DNA 이중 가닥 파손 복구에 필요하다. BRCA1 및 2의 이러한 돌연변이는 종종 이중 가닥 파손 복구 능력을 감소시킨다 [11]. PARP1의 억제는 해결되지 않은 단일 가닥 손상 사건을 초래하여 궁극적으로 이중 가닥 DNA 파손으로 이어진다. BRCA1/2 결핍 세포는 이러한 이중 가닥 파손을 복구할 수 없어 DNA 손상이 축적되고 세포가 사멸된다. BRCA 결핍 세포에서 PARP1 억제제에 의한 세포사 유도를 종종 합성 치사성이라고 한다.
우리는 SASH1 단백질 수준이 올라파립에 대한 암 세포 민감도와 선형 방식으로 상관 관계가 있음을 입증하였다 (도 4). siRNA를 사용한 SASH1의 고갈은 시험된 12 개 세포주 중 9 개에서 올라파립 처리에 대한 민감도를 증가시켰으며, SASH1 단백질 수준과 올라파립 민감도 간의 선형 상관 관계와 일치한다 (도 5).
이 외에, 우리는 재조합 SASH1을 전위성으로 발현하는 안정적인 U2OS 세포주를 만들었다. 이것으로 U2OS 세포주에서 재조합 SASH1의 과발현이 올라파립에 대한 저항성을 유도하기에 충분하다는 것을 입증하였다 (도 6).
SASH1과 게놈 안정성의 상관 관계는 BRCA1/2 고갈된 세포에서 볼 수 있는 것과 유사하다. 우리 그룹은 SASH1 mRNA 수준이 BRCA1/2 전사 수준과 상관 관계가 있는지 평가하였다. SASH1 및 BRCA1/2 mRNA 발현에 대한 온라인 생물 정보학 공동 발현 분석이 수행되었다 (도 7). SASH1과 BRCA1/2 mRNA 수준 사이에는 상관 관계가 없었다. 이것은 SASH1이 PARP 억제제 민감성의 독립적인 마커임을 나타낸다. 그러나 BRCA1/2의 돌연변이 평가는 이 분석에서 고려되지 않았다.
검토
우리의 데이터는 높은 SASH1 단백질 발현이 유방암 및 폐암 세포주 모두에서 올라파립 저항성과 관련이 있음을 분명히 보여준다. 대조적으로 낮은 SASH1 단백질 수준은 PARP1 억제에 대한 민감성과 관련이 있다. 실제로 SASH1 발현은 올라파립 민감도와 직접적인 선형 관계를 가졌으며 R2 값은 유방암 세포주에 대해 약 0.8이고 폐암 세포주에 대해 0.9이다.
이것이 SASH1 단백질 수준과 직접 관련이 있는지 확인하기 위해 siRNA를 사용하여 유방암 세포주에서 SASH1을 고갈시켰으며, 이는 올라파립에 대한 모든 세포주의 감작화로 이어졌으며 SASH1 수준과 올라파립 민감도의 상관 관계와 일치한다. 반대로 U2OS 세포에서 SASH1 과발현으로 올라파립에 대한 저항성을 추론하였다.
올라파립은 초기에 BRCA1 또는 2 개의 결핍된 종양을 치료하도록 설계되었지만 BRCA1 및 2는 민감성에 대한 신뢰할 수 있는 바이오마커가 되지 못하였다. 이와 일치하여, SASH1 발현은 올라파립 민감도와 직접적으로 연관되지만, SASH1은 BRCA1 또는 BRCA2 발현과 연관되지 않았으며, 이는 SASH1이 올라파립 민감도의 더 강력한 마커일 수 있음을 나타낸다.
본원에 제시된 우리의 데이터는 처음으로 아폽토시스에서 SASH1의 분자 역할을 확인한 것이다. 또한 SASH1 종양 억제 활성이 아폽토시스 경로뿐만 아니라 중요한 상동성 재조합 경로를 통해서일 수 있음을 확인한다. 우리는 SASH1이 종양 억제 인자, BRCA1 및 BRCA2와 함께 세포 독성 이중 가닥 DNA 파손의 상동성 재조합 수리에 작용한다는 것을 보여주었다. SASH1이 상동성 재조합에 필요한 것으로 보이므로 PARP1 억제제 올라파립을 사용하여 낮은 SASH1 발현 세포에서 합성 치사율을 유도할 수 있는지 시험하였다. 이것은 SASH1 발현과 올라파립 민감성 사이에 매우 강한 선형 관계가 있음을 나타내며, R2는 유방암 세포주에서 약 0.8이고 폐암 세포주에서 0.9이었다.
결론
이들 데이터는 종양의 SASH1 수준이 새로운 DNA 복구 표적 PARP1 억제제에 대한 예측 바이오마커임을 나타낸다. R2 값은 세포주 연구에서 SASH1이 올라파립과 같은 PARP1 억제제로 치료할 환자 선택에 큰 영향을 미칠 수 있는 강력한 마커임을 나타낸다. 더욱이, 본원에 제공된 세포주 데이터는 단지 암 세포 내에서 이 마커의 수준을 변경함으로써 올라파립 감수성이 제거되거나 유도될 수 있음을 나타낸다. 관련하여, 현재 PARP1 억제제 감수성에 대한 다른 효과적인 신뢰할 수 있는 단일 유전자/단백질 바이오마커는 없다.
참고 문헌
Figure pct00002
실시예 2
본 연구에서는 SASH1 발현 (mRNA와 단백질 모두)과 유방암 임상 병리학적 매개 변수 간의 관계를 분석하였다. 인 실리코 연결성 매핑 및 시험관 내 모델링을 사용하여 항히스타민 클로로피라민은 유방암 세포주 패널에서 SASH1 의존성 세포사를 유도하는 약물로 확인되었으며 이는 잠재적인 임상 적용을 조사하는 추가 연구가 필요함을 시사한다.
재료 및 방법
SASH1 mRNA 예후 유의성에 대한 인 실리코 분석: KM 플로터 유방암 데이터베이스를 사용하여 SASH1 mRNA 발현, 무재발 및 전체 생존율뿐 아니라 다변량 모델에서의 예후 유의성 간의 관계를 분석하였다 [13]. 세개의 상이한 SASH1 어레이 프로브를 분석하고 'JetSet' 최적 프로브의 대표적인 데이터를 제시하였다 [29] (도 8).
면역조직화학 (IHC) 및 조직 마이크로어레이 (TMA) 분석: 449 침습성 유방암종의 TMA (중복 샘플링) 및 20 년 이상의 생존 결과를 포함한 관련 임상 데이터를 포함하는 퀸즐랜드 유방암 추적 (QFU) 자료를 IHC 분석하여 유방암에서 SASH1 단백질 발현을 조사하였다 [30]. 이 연구에 사용된 환자 데이터와 임상 샘플의 사용은 퀸즐랜드 대학과 RBWH (Royal Brisbane and Women's Hospital)의 인간 연구 윤리위원회 승인을 받았다.
4 μm TMA 절편을 EDTA 버퍼 (pH 8.8)에서 항원 검색을 위해 15 분 동안 decloaker에서 처리한 다음, 항-SASH1 항체 (Sigma Prestige HPA029947; 1:850) 및 Mach 1 Universal HRP-중합체 검출 키트 (Biocare Medical)를 사용하여 IHC를 수행하였다. 그런 다음 해마톡실린-대비 염색된 장착 절편을 Aperio AT Turbo 슬라이드 스캐너 (Leica Biosystems)에서 40 배 배율로 스캔하였다. 개별 조직 코어의 디지털 이미지를 자격을 갖춘 병리학자 (AMM)가 종양 세포핵 및 세포질 강도 및 염색된 종양 세포의 비율에 따라 점수를 매겼다. 각 케이스에 대한 중복 조직 코어의 최대 점수를 사용하여 SASH1 발현과 임상 병리학적 변수 사이의 연관성을 카이 제곱 및 로그 순위 시험 (GraphPad Prism v6)를 사용하여 조사하였다.
세포 배양 및 형질감염: 유방암 세포주를 37 ℃에서 5% CO2 하에 10% FCS (MDA-MB-231, MDA-MB-361, T47-D 및 BT-549)를 가진 RPMI, 10% FCS (MCF7, MDA-MB-468 및 Hs578T)를 가진 DMEM 또는 5% FBS 및 10 μg/ml 재조합 인간 표피 성장 인자 (SUM1315)를 가진 Ham's F12에서 배양하였다. 인슐린을 MCF7, Hs578T, BT-549, T47-D 및 SUM1315 세포주에 대해 0.01 mg/mL로 보충하였다. 세포를 일상적으로 트립신과 함께 계대하고 낮은 계대에서 유지하였다. 클로로피라민 (Sigma-Aldrich)을 지시된 농도 (0-100 μM)로 시딩하고 24 시간 후에 부착 배양 세포에 첨가하였다. 세포 검증을 QIMR Berghofer의 Kerry Richard로 수행하였다. SPR 프로필은 2016 년 2 월 세포주에 대한 아동 종양학 그룹 세포 배양 및 이종 이식 저장소 (http://www.cogcell.org) STR 유전자형 데이터와 매칭되었다.
siRNA 실험을 위해 SASH1 또는 비특이적 대조군 올리고를 표적으로 하는 esiRNA (Sigma)를 제조업체의 지침에 따라 RNAiMax (Invitrogen)를 사용하여 형질감염시켰다. 이중 형질감염을 24 시간 간격으로 수행하였고, 최적 SASH1 고갈이 관찰된 초기 형질감염 72 시간 후 샘플을 분석하였다. 과발현 연구를 위해 전장 SASH1 cDNA를 포유동물 발현 벡터 PCMV6 (Origene)에 클로닝하였다. 3 μg의 DNA (SASH1-GFP 또는 GFP)와 6 μL의 리포펙타민 2000 (Invitrogen)을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 T25 플라스크에서 세포를 형질감염시켰다. 도 범례에 표시된 대로 최적의 과발현 및 사멸 평가를 위해 형질감염 후 24-48 시간에 세포를 수확하였다.
면역 블롯팅: 면역 블롯팅을 앞서 설명한 대로 수행하였다 [31]. 요약하면, 세포를 용해시키고 (20 mM Hepes pH 8.0, 150 mM KCl, 5% 글리세롤, 10 mM MgCl2, 0.5 mM EDTA, 0.02% NP-40, NaF, NaVO4, PMSF 및 프로테아제 억제제가 새로 보충), 초음파 처리하였다. 용해물을 원심분리에 의해 제거하고 단백질 농도를 Bradford 분석 (Bio-Rad)을 사용하여 추정하였다. 전형적으로, 50 μg의 단백질 용해물을 Bolt 4-12% 구배 겔 (Invitrogen)에서 분리하고 단백질을 니트로셀룰로오스 막 (Bio-Rad)으로 옮겼다. 막을 2% 어피 젤라틴, PBS (Sigma) 중 1% tween-20에서 1 시간 동안 차단하고 동일한 완충액에서 4 ℃에서 밤새 일차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 이차 항체와 함께 인큐베이션한 후, Li-COR Odyssey 적외선 스캐너를 사용하여 막을 시각화하였다. 형광 강도를 Image J 소프트웨어를 사용하여 로딩 대조군 (β-액틴 또는 히스톤 H3)에 대한 것으로 정량화하였다.
세포사 분석: 지시된 처리로 세포를 인큐베이션한 후, 요오드화프로피듐 (10 μg/ml) 및 Hoechst (1 μg/ml)를 이미징 30 분 전에 첨가하였다. 세포를 IN Cell Analyzer 2200 (GE Healthcare, 10x 대물 렌즈)에서 이미지화하였다. InCell 분석 소프트웨어를 사용하여 생/사 세포 분석을 수행하였다.
세포 합류 분석: 세포를 96 웰 플레이트 (Nunc)에 웰당 2,500 개 세포로 시딩하였다. 클로로피라민을 첨가하기 전에 세포를 24 시간 동안 부착한 다음 IncuCyte ZOOM® 생세포 이미저 (Essen Bioscience)에서 2 시간마다 96 시간 동안 이미지화하여 합류를 계산하였다.
애넥신 V/P요오드화프로피듐 (PI) 분석: 애넥신 V/PI 염색을 설명된 대로 수행하였다 [32]. 요약하면, 처리 또는 비처리 세포 (부착 및 부유)를 트립신 및 원심분리를 사용하여 수확하고 PBS에서 세척한 다음 Promega 애넥신 V-FITC 아폽토시스 검출 키트 프로토콜에 따라 염색하였다. 애넥신 V-양성 (아폽토시스) 세포를 Gallios 유세포 분석기 시스템을 사용하여 검출하고 Flow Jo 소프트웨어로 정량화하였다.
통계 분석: 대부분의 통계 시험은 Graph Pad Prism V6을 사용하여 수행되었다. 유방 종양 SASH1 발현과 임상 병리학적 변수 사이의 연관성은 카이 제곱 검정을 사용하여 조사하였다. 유방 종양 SASH1 발현과 무재발 또는 전체 생존 사이의 관계는 Kaplan Meier 곡선으로 표시하고 로그 순위 시험를 사용하여 분석하였다. 클로로피라민 처리 후 아폽토시스 및 증식의 SASH1 매개 변화 분석 및 SASH1 발현을 스튜던트 양측 t-검정을 통해 조사하였다. SASH1의 다변량 분석을 위해, mRNA 예후 유의성을 이용 가능한 매개 변수 (MKI67 및 ERBB2 발현)와 KM 플로터 데이터베이스의 내장 기능을 사용하여 수행하였다 [13].
ER+ 유방암에서 HER2 상태 (진단 기준에 따라 CISH에 의해 결정됨), Ki67 상태 (적어도 20% 종양 세포에서 핵 염색), 조직학적 등급 (경험있는 병리학자 (SRL) 및 종양 크기에 의해 평가됨 (임상 병리 보고서에서 유래))를 포함하는 SASH1 단백질 예후 유의성에 대한 다변량 분석을 위해 MedCalc® 소프트웨어 (v13.2)를 사용하여 단계적 Cox 회귀 분석을 수행하였다. 이들 데이터를 223 ER+ 케이스에 대해 완성하였다. p >0.05 값을 유의한 것으로 간주하였다.
연결성 매핑에 의한 약물 스크리닝: SASH1 발현을 유도할 수 있는 후보 화합물을 식별하기 위해 유전자 발현 연결성 매핑 접근법을 사용하였다. SASH1을 쿼리 유전자 서명을 형성하기 위해 Affymetrix HG-U133A 프로브 세트 ID에 매핑하였다. 이것을 sscMap 알고리즘을 사용하여 CMap02 데이터베이스의 참조 약물 발현 프로파일과 비교하였다 [33, 34]. 질의 유전자 특징에 통계적으로 유의미한 양성 연관성을 갖는 화합물을 기재된 바와 같이 추가 실험실 검증을 위한 후보 SASH1 유도 약물로 선택하였다.
결과
SASH1 발현의 예후적 유의성을 KM 플로터 데이터베이스로부터의 관련 임상 추적 정보와 함께 공개적으로 이용 가능한 유방암 유전자 발현 데이터의 메타 분석을 통해 mRNA 수준에서 평가하였다 [13]. Kaplan-Meier 분석은 전체 환자 코호트에서 SASH1 mRNA 발현의 손실이 불량한 예후와 관련이 있음을 보여주었다. 그러나, ER 상태에 따라 큰 KM 플로터 코호트를 하위 그룹으로 분리한 결과 SASH1 mRNA의 예후적 유의성은 상황에 따라 다른 것으로 나타났다. 진단 후 15 년 째에 더 높은 수준의 SASH1 발현은 ER-양성 유방암 환자에서 더 나은 결과와 관련이 있었지만 (p = 0.001; HR 1.4 (1.15-1.73)) ER-음성 질환에서 상당히 악화된 결과와 관련이 있었다 (p = 0.001; HR 0.5 (0.37-0.78)) (도 8A 및 표 2).
SASH1 단백질 발현과 임상 병리학적 매개 변수 사이의 관계를 조직 마이크로 어레이 (TMA)의 면역조직화학적 (IHC) 분석에 의해 379 개의 침습성 유방 종양으로 구성된 별도의 임상 주석 코호트에서 평가하였다 [14, 15]. 잘 특성화된 항-SASH1 항체를 사용하여, 유방 종양 세포에서 주로 다양한 강도의 핵 염색이 관찰되었으며, 이때 강도는 음성, 약/중간 양성 및 강 양성으로 점수가 매겨졌다 (도 8B). 염색된 종양 세포 핵의 백분율은 개별 조직 코어 내에서 상당히 균질하였다. 카이 제곱 검정으로 핵 SASH1 발현이 ER 발현과 관련이 있음을 입증했지만, 다른 임상 병리학적 매개 변수는 이용 가능하지 않았다 (표 3; p = 0.0035).
KM 플로터 데이터와 일치하여 ER+ 유방암에서 강력한 양성 핵 SASH1 발현과 유리한 유방암 특이 생존 (BCSS) 사이에 유의한 연관성이 발견되었다 (p = 0.0012; HR 1.4 [1.16-2.69]). ER+ 질환에서 결과의 SASH1 계층화는 Ki67 발현 또는 유사분열 점수에 따라 증식 지수가 높거나 낮은 하위 그룹에서 유사한 경향을 나타냈다. SASH1-고 및 -저 사례의 비율은 증식 활성이 높거나 낮은 ER+ 하위 그룹에서 유사하였다 (도 8C/D). HER2 상태, Ki67 상태, 종양 크기 및 조직학적 등급을 포함하는 ER+ 사례의 다변량 Cox 회귀 모델은 SASH1 발현이 BCSS와 독립적으로 연관되어 있음을 보여주었다 (HR = 0.45; 95% 신뢰 구간 0.27-0.77; p = 0.0037; 표 4). ER 음성 코호트의 경향은 SASH1 mRNA 데이터의 KM 분석과 유사했지만, 통계적 유의성에 도달하지 않았다 (p = 0.16). 약 5%의 사례 (n = 19/379)가 종양 세포 세포질 염색을 보였지만 생존을 비롯한 연구된 임상 병리학적 매개 변수와의 연관성은 없었다.
유방암에서 SASH1의 기능을 탐구하기 위해, 3 개의 ER-양성 및 5 개의 ER-음성 유방암 세포주에서의 단백질 발현을 면역 블롯 분석에 의해 정량화하였다. 이것은 3 개의 고발현 세포주, T47-D, BT-549 및 MDA-MB-231, 2 개의 중발현주, Hs578T 및 SUM-315 및 3 개의 저발현주 MCF7, MDA-MB-361 및 MDA-MB-468로 세포주 간에 가변 발현을 나타냈다 (도 9 A-B). 이 세포주 패널에서는 SASH1 발현과 ER 상태 사이에 명백한 연관성이 없었다.
SASH1은 이전에 종양 억제자로 기술되었으며, 과발현은 폐암, 흑색종, 골육종 및 신경교종 세포주에서 세포사를 증가시킨다 [5, 10-12]. 이를 조사하기 위해 SASH1-GFP 융합 단백질을 유방암 세포주에서 일시적으로 과발현시켰다. 과발현은 시험된 8 개 세포주 중 7 개 세포주에서 세포사를 초래했으며, 5 개 세포주에서 유의미했고, 캐스파제3 결핍 MCF7 세포만 반응을 보이지 않았다 (도 10).
SASH1 수준을 높이는 것이 암 치료에 대한 새로운 접근 방식일 수 있다는 가정하에, 우리는 cmap 데이터베이스 (Broad Institute [16])를 사용한 연결 화면을 사용하여 SASH1을 유도하는 약물을 식별하였다. 이것으로 클로로피라민 처리와 SASH1 mRNA 발현 사이의 직접적인 상관 관계를 확인하였다 (p = 0.000005, z-점수 2.431). 클로로피라민은 결막염 및 기관지 천식과 같은 알레르기 질환 관리를 위해 여러 유럽 국가에서 승인된 1 세대 가역성 H1 수용체 길항제이다.
단백질 수준에서 유방암 세포주에서의 SASH1의 클로로피라민 매개 유도를 검증한 후 (도 11), 우리는 이 치료가 세포 성장 및 생존에 대한 SASH1 과발현의 효과를 모방할 수 있는지 조사하였다. 클로로피라민 처리는 처리된 8 개 세포주 중 7 개 세포주에서 세포 성장을 억제하였다 (도 12A-H). 이것이 아폽토시스 유도에 의한 것인지를 조사하기 위해 우리는 가장 민감한 세 세포주인 T47-D, MDA-MB-231 및 BT-549에서 애넥신 V의 치료 후 수준을 분석하였다. 세 계통 모두 애넥신 V (도 12I-K)의 증가를 나타내어 아폽토시스 유도를 나타낸다.
클로로피라민으로 유도된 세포사가 SASH1 의존성인지 여부를 확인하기 위해 치료 전에 SASH1 표적 siRNA로 T47-D, MDA-MB-231 및 BT-549 세포를 형질 도입하였다. 이 실험은 SASH1 고갈이 세 계통 모두에서 세포사 반응을 부분적으로 구제했음을 입증했으며 (도 13A-D), 클로로피라민 유도 세포사가 SASH1 기능에 적어도 부분적으로 의존성임을 시사한다.
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검토
여러 인간 악성 종양에서 유리한 예후 [4-6, 10-12, 19, 20]와 시험관 내 암 세포주 생존 능력에 대한 부작용의 증거 [5, 10-12]와의 연관성을 바탕으로 SASH1은 종양 억제제로 제안되었다 [4-7, 10, 12, 21, 22]. 현재 기계적 연구는 일반적으로 부족하지만 SASH1이 PI3K 및 Akt 신호전달을 억제할 수 있다는 증거가 있다 [23]. 유방암의 예후 유의성은 다른 악성 종양보다 덜 규명되었기 때문에 우리는 주석이 풍부한 두 개의 임상 샘플 코호트를 사용하여 이를 조사하였다. 전반적으로 우리는 SASH1이 우호적인 예후와 관련이 있지만 ER 상태를 기반으로 사례를 계층화하면 이것이 보다 만연한 ER 양성 사례 (분석된 코호트의 75-80%)에 의해 주도된 것으로 나타났음을 발견하였다. 실제로 SASH1은 ER 음성 유방암의 불량한 결과와 관련이 있다. SASH1이 종양 억제제로 만들어졌더라도, ER 양성 및 음성 유방암으로부터의 대립 데이터는 이것이 그 역할을 너무 단순화할 수 있으며 전후사정이 중요함을 시사한다. 실제로 다른 KM 플로터 암 데이터 세트를 조사하여 SASH1 mRNA 발현과 폐암에서 더 나은 전체 생존율 사이에 강한 연관성을 찾았지만 위암에서는 매우 좋지 않은 결과를 발견하였다 (데이터 미표시).
이 연구는 8 개의 유방암 세포주 패널에서 SASH1 발현과 ER 상태 사이에 명백한 연관성을 발견하지 못하였다. 또한 SASH1의 전위성 발현은 ER 상태와 무관하게 세포 생존력을 감소시켰다. 종합적으로 이러한 관찰은 일부 상황에서 SASH1 억제가 암세포 생존력과 공격적인 임상 행동에 필요한 과정을 반영할 수 있음을 시사했으며, 발현을 증가시키는 것이 새로운 치료 전략이 될 수 있다고 가정하였다. 이 기능을 가진 약물 후보를 식별하기 위해 cmap 데이터베이스 (Broad Insitute [16])를 사용하여 인 실리코 연결성 매핑을 수행하고 항히스타민 클로로피라민을 후보 SASH1 유도제로 식별하였다. 다른 사람들은 클로로피라민이 흑색종, 신경모세포종, 유방암 및 췌장암으로부터 세포주의 생존을 감소시키며, 경우에 따라서는 FAK 및 VEGFR3 신호 전달의 억제를 포함한다는 것도 보여주었다 [17, 18, 24-26]. 연결성 스크린과 일치하게, 클로로피라민은 시험된 8 개의 유방암 세포주 중 7 개에서 SASH1 발현을 유도하고 8 개 중 6 개의 생존력을 감소시켰다. 치료 전에 SASH1 siRNA로 가장 민감한 세 세포주를 형질도입하였더니 세포독성 반응이 부분적으로 구제되었으며, 이는 클로로피라민에 의한 암세포주 사멸은 SASH1에 의해 적어도 부분적으로 매개됨을 시사하는 것이다. 클로로피라민이 생체 내에서 유방암 이종 이식 성장을 감소시킬 수 있음을 시사하는 적어도 하나의 기존 보고서가 있지만 [18], 약제의 항종양 활성을 보다 포괄적으로 특성화하기 위해 추가 전임상 연구가 필요하다.
유방암 관리는 지난 수십 년 동안 상당히 개선되었지만 호주, 미국 및 영국에서는 환자의 15-20%가 진단 후 10 년을 살지 못했다 [27, 28]. 이것은 암과 관련된 이환율 및 사망률과 공중 보건 부문의 비용에 상당 부분을 차지한다. 현재의 일차 요법에 반응하지 않는 종양은 더 복잡하고 이질적일 수 있다. 미래의 질병 통제는 질병의 분자 생물학에 대한 이해 증가에 달려 있으며, 동반 진단과 관련된 새로운 개인 맞춤 의학 요법의 식별로 이어질 것이다. 인 실리코 연결성 스크리닝은 유전자-약물 연관성 및 약물 용도 변경 기회의 식별을 신속하게 추적할 수 있는 수단을 제공한다. SASH1 유도와 '시판' 약물 간의 연관성에 대한 인 실리코 매핑은 시험관 내에서 항종양 활성을 갖는 새로운 후보인 클로로피라민을 확인하였다. 클로로피라민 및 기타 1 세대 H1 길항제는 혈액-뇌 장벽을 통과하기 때문에 가라앉고 있으며, 따라서 알레르기 치료를 위한 말초 작용제로 대체되었다. 뇌 흡수가 분자 종양학에서 바람직할 수 있고 다르게는 클로로피라민이 내용성이 우수한 점을 감안할 때, 유방암 및 기타 암의 저독성 치료를 위한 이 약제 또는 구조적으로 관련된 약제의 잠재적인 적용은 추가의 기계론적 및 전임상 조사가 필요하다. 또한 유방암 환자에서 임상 시험으로 유도된 0 상 및 용량 발견 1 상, 신보조제, 바이오마커로 향후 약물의 추가 용도 변경 연구를 뒷받침할 클로로피라민에 의한 SASH1의 약력학적 유도를 확인할 수 있다. 이것은 특히 치료 옵션이 현재 제한되어 있는 삼중 음성 유방암뿐만 아니라 현재의 치료 접근법에 저항성이 있는 ER 및 HER2 질환과 관련된다.
참고 문헌
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
실시예 3
본 연구에서는 난소암 환자로부터의 PDX 종양 샘플을 사용하여 SASH1 단백질 수준과 난소암 종양 샘플의 PARP 억제제에 대한 민감도 간의 관계를 조사하였다.
재료 및 방법
12 명의 고등급 난소암 환자로부터의 PDX 조직과 루카파립에 대한 알려진 반응을 Walter and Eliza Hall Institute에서 받았다. 이들 샘플은 Kondrashova et al., [1]에 자세히 설명되어 있다. 각 샘플에서 15 mg의 조직을 프로테아제 및 포스파타제 억제제 (Invitrogen)와 함께 400 μL의 RIPA 완충액에 용해하였다. 샘플을 균질화한 다음 원심분리를 통해 제거된 세포 파편과 함께 초음파 처리하였다. 겔에서 실행된 40 ㎍과 이전에 설명한 대로 수행한 웨스턴 블롯과 함께 BCA 분석을 수행하여 단백질 농도를 계산하였다. SASH1 단백질 수준을 ImageJ로 정량화하고 γ-튜불린에 대해 정규화하였다.
결과
SASH1 단백질 수준은 일반적으로 BRCA 결핍시 더 낮았고 BRCA 풍부 종양에서 더 높았지만, 이들 두 그룹 사이에 SASH1 수준에는 여전히 현저한 중복이 있다 (도 14A). 대조적으로 SASH1 수준은 루카파립 치료에 대한 반응성에 대해 훨씬 더 강력하고 매우 중요한 예측을 제공하여 민감하거나 혼합된 반응을 가진 환자에서 더 낮은 SASH1 수준이 발견되는 반면 불응성 환자에서 더 높은 수준이 발견되었다 (도 14B).
검토
이들 결과는 PARP 억제제에 대한 환자 및 종양 민감성을 예측하는 SASH1 수준의 능력을 보여주며 이러한 정보는 환자를 치료 그룹으로 분류하고 병원에서 결과를 개선하는 데 도움이 될 것이다. 이들 결과는 또한 임상의가 PARP 억제에 반응할 가능성이 더 큰 환자를 식별할 수 있도록 함으로써 환자에서 SASH1 수준을 측정하여 효율성을 크게 향상시키고 새로운 PARP 억제제 개발을 위한 임상 시험 수행 비용을 낮출 수 있음을 보여준다.
참고 문헌
1. Olga Kondrashova, Monique Topp, et al,. Methylation of all BRCA1 copies predicts response to the PARP inhibitor rucaparib in ovarian carcinoma. Nature Communications volume 9, Article number: 3970 (2018).
명세서 전체에 걸쳐 목적은 본 발명을 어느 한 실시양태 또는 특정 특징들의 집합으로 제한하지 않고 본 발명의 바람직한 실시양태를 설명하는 것이었다. 따라서, 본 개시 내용에 비추어 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 예시된 특정 실시양태에서 다양한 조정 및 변경이 이루어질 수 있음을 당업자는 이해할 것이다.
본 명세서에 언급된 모든 컴퓨터 프로그램, 알고리즘, 특허 및 과학 문헌은 본 명세서에 참조로 포함된다.

Claims (31)

  1. 대상체에서 파손된 DNA 가닥의 복구를 매개하는 효소의 활성을 억제하는 항암제에 대한 암의 반응성을 예측하는 방법으로서, 대상체의 하나 또는 다수의 암 세포, 조직 또는 기관에서 SASH1 핵산 또는 단백질의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 SASH1 핵산 또는 단백질의 발현 수준은 항암제에 대한 암의 상대적으로 증가 또는 감소된 반응성을 나타내거나 이와 관련된 것인, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 효소가 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제 (PARP)인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항암제가 PARP 억제제이거나 이를 포함하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, PARP 억제제가 올라파립, 벨리파립, 루카파립, 이니파립, 탈라조파립, 니라파립, 3-아미노벤즈아미드, ME0328, PJ34, AG-14361, INO-1001, UPF-1069, AZD-2461, CEP 9722, A-966492 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택되는, 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, SASH1 핵산 또는 단백질의 감소된 수준은 PARP 억제제에 대한 암의 상대적으로 증가된 반응성을 나타내거나 이와 관련되고/되거나, SASH1 핵산 또는 단백질의 증가된 수준은 PARP 억제제에 대한 암의 상대적으로 감소된 반응성을 나타내거나 이와 관련된 것인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 암을 치료하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  7. 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 상기 대상체의 하나 또는 다수의 암 세포, 조직 또는 기관에서 SASH1 핵산 또는 단백질의 발현 수준을 결정하는 단계, 및 상기 이루어진 결정에 기초해 암 치료를 개시, 계속, 수정 또는 중단하는 단계를 포함하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 암 치료가 파손된 DNA 가닥의 복구를 매개하는 효소의 활성을 억제하는 치료적 유효량의 항암제의 투여를 포함하는, 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 암 치료가 SASH1의 발현 및/또는 활성을 억제 또는 예방하는 치료적 유효량의 약제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  10. 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, SASH1의 발현 및/또는 활성을 억제 또는 예방하는 치료적 유효량의 약제를 파손된 DNA 가닥의 복구를 매개하는 효소의 활성을 억제하는 항암제와 조합하여 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 효소가 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제 (PARP)인, 방법.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항암제가 PARP 억제제이거나 이를 포함하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, PARP 억제제가 올라파립, 벨리파립, 루카파립, 이니파립, 탈라조파립, 니라파립, 3-아미노벤즈아미드, ME0328, PJ34, AG-14361, INO-1001, UPF-1069, AZD-2461, CEP 9722, A-966492 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  14. SASH1의 발현 및/또는 활성을 증가시키는 약제의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 약제가 작은 유기 분자인, 방법.
  16. (a) SASH1 단백질 또는 핵산을 발현하는 세포를 후보 약제와 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 후보 약제가 SASH1의 발현 및/또는 활성을 조절하는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는,
    대상체에서 암 치료에 사용하기 위한 약제를 확인 및/또는 생성하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 후보 약제가 SASH1의 발현 및/또는 활성을 적어도 부분적으로 감소, 제거, 억압 또는 억제하는, 방법.
  18. 제16항에 있어서, 후보 약제가 SASH1의 발현 및/또는 활성을 적어도 부분적으로 증가시키는, 방법.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 후보 약제가 항체 또는 작은 유기 분자인, 방법.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 후보 약제가 암 치료에 사용하기에 적합한, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 생식계 암인, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 생식계 암이 유방암, 난소암, 자궁경부암, 자궁암, 전립선암 또는 고환암을 포함하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 생식계 암이 유방암인, 방법.
  24. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 폐암이거나 이를 포함하는, 방법.
  25. 제15항 내지 제24항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성되거나 확인된, 암 치료용 약제.
  26. 제25항에 있어서, 제6항 내지 제15항 또는 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항의 방법에 따라 사용하기 위한 약제.
  27. 대상체에서 파손된 DNA 가닥의 복구를 매개하는 효소의 활성을 억제하는 항암제에 대한 암의 반응성을 예측하기 위한 키트로서, 대상체의 하나 또는 다수의 암 세포, 조직 또는 기관에서 SASH1 단백질 또는 코딩 핵산의 발현 수준을 결정할 수 있는 적어도 하나의 시약을 포함하고, 여기서 SASH1 단백질 또는 코딩 핵산의 발현 수준은 항암제에 대한 암의 상대적으로 증가 또는 감소된 반응성을 나타내거나 이와 관련된 것인, 키트.
  28. 제27항에 있어서, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 방법에 사용하기 위한 키트.
  29. 대상체에서 유방암에 대한 예후를 결정하는 방법으로서, 대상체의 하나 또는 다수의 암 세포, 조직 또는 기관에서 SASH1 핵산 또는 단백질의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 SASH1의 변조된 발현 수준은 상기 유방암에 대해 덜 유리하거나 더 유리한 암 예후를 나타내거나 이와 관련된 것인, 방법,
  30. 제29항에 있어서, 유방암이 ER 양성 (ER+) 유방암 또는 ER 음성 (ER-) 유방암인, 방법.
  31. 제1항 내지 제24항, 제29항 및 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인, 방법.
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