ES2338774T3 - Expresion de psoriasina por las celulas epiteliales mamarias. - Google Patents
Expresion de psoriasina por las celulas epiteliales mamarias. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2338774T3 ES2338774T3 ES02806283T ES02806283T ES2338774T3 ES 2338774 T3 ES2338774 T3 ES 2338774T3 ES 02806283 T ES02806283 T ES 02806283T ES 02806283 T ES02806283 T ES 02806283T ES 2338774 T3 ES2338774 T3 ES 2338774T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- psoriasin
- hid
- dcis
- grade
- expression
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57488—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds identifable in body fluids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
Un método para evaluar si un individuo padece o no carcinoma ductal in situ (DCIS) de grado alto, comprendiendo dicho método: (a) identificar un individuo que se sospecha corre riesgo de padecer DCIS de grado alto; y (b) medir el nivel de expresión de psoriasina o del gen de psoriasina en una muestra de un fluido corporal, un lavado, un aspirado, un sobrenadante de cultivo de células, o una muestra de tejido de mama del individuo; en donde dicho método incluye determinar si dicho nivel es superior o no al nivel de expresión de psoriasina o del gen de psoriasina que estaría presente en una muestra de este tipo con respecto a un individuo con DCIS de grado intermedio o DCIS de grado bajo.
Description
Expresión de psoriasina por las células
epiteliales mamarias.
La investigación descrita en esta solicitud fue
soportada en parte por una subvención (No. P50
CA89393-01) del Instituto Nacional del Cáncer de
los Estados Unidos, perteneciente a los Institutos Nacionales de la
Salud de los Estados Unidos. Por consiguiente, el gobierno de los
Estados Unidos tiene ciertos derechos en la invención.
Esta invención se refiere al diagnóstico del
cáncer, y más particularmente al diagnóstico del cáncer de mama.
El carcinoma de mama es la segunda causa
principal de fallecimientos relacionados con el cáncer en las
mujeres del mundo occidental. Sólo en los Estados Unidos, se
diagnostican anualmente más de 175.000 nuevos casos. La historia
natural del cáncer de mama implica una progresión secuencial a lo
largo de etapas clínicas y patológicas definidas que comienzan con
carácter inicialmente benigno seguido por hiperproliferación
atípica, progresando hacia carcinomas in situ y
posteriormente invasivos, y culminando en enfermedad metastásica. El
carcinoma ductal in situ (DCIS) es el precursor del
carcinoma ductal invasivo. Por consiguiente, es importante que se
disponga de un test fiable para el DCIS.
En Cancer Research, 56,
4606-4609 [1996], Leygue et al exponen la
expresión diferencial del mRNA de psoriasina entre el carcinoma de
mama in situ y el invasivo. Se comparan casos de DCIS de tipo
comedo y no-comedo. Se llega a la conclusión de que
el papel fundamental de la proteína psoriasina en las células
tumorales de mama sigue sin determinar.
WO 00/26668 es una solicitud de patente
internacional que lleva por título "S100 proteins and
auto-antibodies as serum markers for cancer". Se
discuten las proteínas S100-Ag,
S100-A7, S100-A8 y
S100-A9. No se menciona el DCIS.
La invención está basada en la observación de
que las células DCIS humanas de grado alto expresan niveles
elevados de una proteína designada por los inventores
HID-5 (del inglés high in
DCIS-5, es decir rica en
DCIS-5). Esta proteína se conoce también como
psoriasina. Los DCIS bajos e intermedios expresan, si acaso, el gen
HID-5 a un nivel muy bajo. Adicionalmente, los
inventores descubrieron que HID-5 es secretado por
las células del cáncer de mama. Por tanto, la invención se refiere
a métodos útiles en el diagnóstico del DCIS de grado alto.
De acuerdo con la presente invención, se
proporciona un método para evaluar si un individuo padece carcinoma
ductal in situ (DCIS) de grado alto, comprendiendo dicho
método:
- (a)
- identificar un individuo que se sospecha corre riesgo de padecer DCIS de grado alto; y
- (b)
- medir el nivel de expresión de psoriasina o del gen de psoriasina en una muestra de un fluido corporal, un lavado, un aspirado, un sobrenadante de cultivo de células, o una muestra de tejido de mama del individuo;
en donde dicho método incluye determinar si
dicho nivel es superior o no al nivel de expresión de psoriasina o
del gen de psoriasina que estaría presente en una muestra de este
tipo con respecto a un individuo con DCIS de grado intermedio o
DCIS de grado bajo.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención proporciona también un método de
discriminación del DCIS de grado alto con respecto a DCIS de grado
intermedio o DCIS de grado bajo, comprendiendo el método medir el
nivel de expresión de psoriasina o gen de psoriasina en una muestra
de un fluido corporal, un lavado, un aspirado, un sobrenadante de
cultivo de células, o una muestra de tejido mamario de un individuo
identificado como paciente de DCIS, en donde dicho método incluye
determinar si dicho nivel es o no superior al nivel que estaría
presente en una muestra de este tipo con respecto a un individuo
con DCIS de grado intermedio o DCIS de grado bajo.
Diversas características opcionales se exponen
en las reivindicaciones 3 a 10.
A no ser que se defina de otro modo, todos los
términos técnicos y científicos utilizados en esta memoria tienen
el mismo significado que se entiende comúnmente por una persona con
experiencia ordinaria en la técnica a la que pertenece esta
invención. En caso de conflicto, el presente documento, con
inclusión de las definiciones, ejercerá papel de control. Métodos y
materiales preferidos se describen a continuación. Los materiales,
métodos, y ejemplos descritos en esta memoria son únicamente
ilustrativos y no deben considerarse como limitantes.
Fig. 1A es un gráfico de barras que muestra los
resultados de un análisis PCR en tiempo real de la expresión de
mRNA de HID-5/psoriasina en carcinomas primarios de
mama purificados por microdisección con captura de láser (LCM) y
epitelio mamario normal correspondiente. Los datos se expresan como
la relación del nivel de mRNA de HID-5/psoriasina
en epitelio canceroso al nivel de mRNA de
HID-5/psoriasina en el epitelio normal
correspondiente ("relación T/N"). Cada barra está marcada con
el número de caso y un acrónimo que indica si el carcinoma estaba
localizado in situ ("is") o era invasivo ("inv").
Se muestra si el carcinoma era de grado alto ("H"), intermedio
("I"), o bajo ("L") y con expresión ("+") y ausencia
de expresión ("-") del receptor de estrógenos \alpha
("ER\alpha"), receptor de progesterona ("PR"), y
erbB2.
Fig. 1B muestra una serie de fotomicrografías de
secciones histológicas de dos tumores DCIS con comedo de grado alto
("DCIS-1" y "DCIS-2") que
se tiñeron con hematoxilina y eosina ("H&E") o se
sometieron a análisis de hibridación in situ con ribosondas
HID-5/psoriasina antisentido o sentido marcadas con
^{33}P. Las muestras analizadas con la ribosonda antisentido se
fotografiaron en condiciones de "campo brillante" y "campo
oscuro" utilizando aumentos de la lente objetivo de 4x y 20x. Las
muestras analizadas con la ribosonda sentido se fotografiaron en
condiciones de "campo oscuro" únicamente, utilizando un aumento
de la lente objetivo de 20x. Análisis de hibridación in situ
similares de dos tumores DCIS de grado bajo y dos de grado
intermedio lograron detectar mRNA de
HID-5/psoriasina en ninguna de las muestras.
Fig. 2A muestra un par de fotografías de
inmunotransferencias que demuestran la especificidad de un
anticuerpo policlonal
anti-HID-5/psoriasina (panel
izquierdo) y cuatro anticuerpos monoclonales
anti-HID-5/psoriasina individuales
(panel derecho). Lisados de células que expresaban
HID-5/psoriasina ("H") y células de control
que no expresaban HID-5/psoriasina ("C") se
resolvieron por electroforesis en gel de dodecilsulfato de
sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) y
los geles resultantes se transfirieron a membranas que se tiñeron
con suero de control pre-inmune ("P.I."),
anticuerpo policlonal
anti-HID-5/psoriasina
("\alphaHID5") o los cuatro anticuerpos monoclonales
anti-HID-5/psoriasina ("C1 1",
"C1 2", "C1-3", y "C1 4"). La pista
marcada "M" muestra las posiciones de marcadores de peso
molecular de 17 kDa y 7 kDa. Las posiciones de
HID-5/psoriasina en ambos paneles se indican por
("HID-5/psoriasina").
Fig. 2B es una serie de 3 fotografías de
inmunotransferencias que muestran los niveles relativos de expresión
HID-5/psoriasina por células MCF10A que crecían en
medio de cultivo que contenía una concentración baja ("medio de
suero al 0,2%") o alta ("medio de suero al 5%") de suero y
en condiciones de cultivo confluyentes ("Células
confluyentes") o dispersa ("Células dispersas"). Las células
se testaron respecto a la expresión de la proteína
HID-5/psoriasina al cabo de 0, 2, 4, 8, 12, y 16
días de cultivo. Las transferencias se generaron como se describe
para Fig. 2A y se tiñeron con un anticuerpo policlonal específico
para HID-5/psoriasina. Se indican las posiciones de
HID-5 ("HID-5/psoriasina") y
una proteína de control ("\beta-tubulina") en
las inmunotransferencias.
Fig. 2C es una fotografía de una
inmunotransferencia que muestra los niveles relativos de proteína
HID-5/psoriasina expresadas por células MCF10A que
crecían en cultivo de suspensión durante 0, 1, 2, y 3 días. Las
trasferencias se generaron como se describe para Fig. 2A y se
tiñeron con un anticuerpo policlonal específico para
HID-5/psoriasina. Las proteínas de
HID-5 ("HID-5/psoriasina") y
una proteína de control ("\beta-tubulina") en
la inmunotransferencia se indican.
Fig. 2D es una fotografía de un autorradiograma
de una transferencia Northern que muestra los niveles relativos de
mRNA de HID-5/psoriasina expresados por células
MCF10A que crecían en cultivo de suspensión ("Suspensión")
para 1, 2, y 3 días de condiciones de cultivo confluyente
("Confluencia") durante 4, 8, y 12 días. Se aisló RNA de las
células en los momentos indicados y se sometió el RNA a análisis de
transferencia Northern como se ha descrito previamente ["Krop
et al (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
98:9796-9801"]. Las transferencias se analizaron
secuencialmente con sondas de cDNA de
HID-5/psoriasina y \beta-actina
marcadas con ^{32}P y se muestran las posiciones de
HID-5 ("HID-5/psoriasina") y
\beta-actina en las transferencias.
Fig. 3A es una serie de fotomicrografías de
cultivos de células de cáncer de mama
MDA-MB-468 (panel izquierdo) y
células epiteliales normales de mama MCF10A que crecían
exponencialmente ("Crecimiento exp.") o en ausencia de suero
("Privadas de suero") (panel derecho). Las células
MDA-MB-468 se teñían con un
anticuerpo monoclonal
anti-HID-5/psoriasina (panel
izquierdo, fotomicrografías inferiores) o suero de ratón normal de
control (panel izquierdo, fotomicrografías superiores). Las células
MCF10A se teñían con un anticuerpo monoclonal
anti-HID-5/psoriasina. No se
observó tinción alguna en las células MCF10A teñidas con suero de
ratón normal de control. Las fotomicrografías de la izquierda se
tomaron con un aumento de la lente objetivo de 2x y las
fotomicrografías de la derecha con un aumento de la lente objetivo
de 10x.
Fig. 3B es una fotografía de una
inmunotransferencia que muestra la localización y secreción
intracelular de HID-5/psoriasina por las células
MDA-MB-468 en cultivo. El lisado
total de las células MDA-MB-468
("Total") y las proteínas inmunoprecipitadas de los lisados
("Células") o del sobrenadante de cultivo ("Medio") de las
células MDA-MB-468 por un
anticuerpo policlonal
anti-HID-5/psoriasina
("HID-5") o suero de control
pre-inmune ("P.I.") se resolvieron por
SDS-PAGE y se sometieron a análisis de
inmunotransferencia. Se muestra la posición de
HID-5 ("HID-5/psoriasina") en
la inmunotransferencia.
\newpage
Fig. 3C es una serie de 3 fotomicrografías de
secciones de una lesión de CDIS de grado alto con comedo que se
tiñeron con hematoxilina y eosina ("H&E") (fotografía de la
izquierda), anticuerpo monoclonal
anti-HID-5/psoriasina
("HID-5") (fotografía de la derecha), y suero
de ratón normal de control ("Control") (fotografía
central).
Fig. 3D es una serie de 6 fotomicrografías de
muestras de un tumor de mama representativo en una red de tejido
teñida con hematoxilina y eosina ("H&E"), anticuerpos
monoclonales específicos para HID-5/psoriasina,
ER\alpha, erbB2, o CD45, o suero de ratón normal de control
("Control").
Fig. 3E es una representación esquemática que
resume los resultados de los análisis inmunoquímicos de dos redes
de tejido. La red 1 estaba compuesta de 5 muestras individuales de
tejido de mama normal y 30 muestras individuales de carcinomas de
mama primarios invasivos (10 cada uno de grado bajo, intermedio y
alto) y la red 2 estaba compuesta de 6 muestras individuales de
tejido de mama normal, 3 muestras de lesiones hiperproliferativas
benignas y 49 muestras de carcinomas ductales primarios invasivos.
En la red 1, se fijaron 3 troqueles (en filas horizontales) de cada
muestra de tumor a la diapositiva y se agruparon los tumores de
acuerdo con su grado histológico, tumores de grado bajo,
intermedio, y alto). Las muestras del tumor de la red 1 se
analizaron en cuanto a expresión de
HID-5/psoriasina, ER \alpha (ER\alpha), y erbB2
y respecto a la presencia de leucocitos utilizando un anticuerpo
específico para CD45, un antígeno panleucocítico. En la red 2, la
primera fila vertical contenía las 6 muestras de tejido de mama
normal, 3 muestras de lesiones hiperproliferativas benignas, y un
punto vacío (indicado por el cuadrado rayado). Las muestras de la
red 2 se analizaron respecto a la expresión de ER\alpha, receptor
de progesterona (PR) y p53; se muestran los datos del análisis de la
expresión de HID-5/psoriasina y ER\alpha. La
intensidad de tinción se indica por la intensidad de sombreado,
representando el color blanco la ausencia de tinción detectable y
siendo el negro una tinción muy fuerte. Los rectángulos rayados
representan puntos vacíos en las redes o muestras perdidas durante
el procedimiento de tinción.
Fig. 4A es una representación gráfica de la
secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) de
HID-5/psoriasina.
Fig. 4B es una representación gráfica de la
secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 2) de
HID-5/psoriasina.
Los autores de la invención han descubierto por
Análisis Seriado de la Expresión Génica (SAGE) que
HID-5/psoriasina se expresa diferencial y
fuertemente en las células DCIS de grado alto con relación al
epitelio normal de mama y el DCIS de grado intermedio. La extensión
de cromosomas y el análisis FISH en la interfase nuclear indicaron
que la expresión incrementada de HID-5/psoriasina en
las células DCIS de grado alto no era debida a amplificación
génica. Un análisis PCR en tiempo real de un panel de cánceres de
mama primarios indicó la presencia de niveles más elevados de mRNA
de HID-5/psoriasina en los tumores de grado alto a
intermedio que en el epitelio mamario normal del mismo paciente.
Por hibridación de mRNA in situ, se detectó mRNA de
HID-5/psoriasina en las células de grado alto pero
no en las células DCIS de grado bajo o intermedio o en el epitelio
mamario normal.
Los experimentos in vitro con células
MCF10A normales de epitelio mamario indicaron que:
- (a)
- la expresión de la proteína HID-5/psoriasina se regulaba fuertemente en sentido creciente por cultivo de las células en medio que contenía una baja concentración de suero, en condiciones confluyentes y en suspensión; y
- (b)
- la expresión de mRNA de HID-5/psoriasina se regulaba fuertemente en sentido creciente por cultivo de las células en condiciones confluyentes y en suspensión. Dado que la privación de suero, la confluencia y la falta de anclaje celular daban también como resultado detención en G1 y apoptosis, las células que sobreviven a estas condiciones es probable que sean relativamente resistentes a la apoptosis. Así pues, la HID-5/psoriasina está probablemente implicada en la regulación de la detención en G1 y la resistencia relativa a la apoptosis.
\vskip1.000000\baselineskip
Se observó tinción nuclear y citoplásmica por un
anticuerpo específico para HID-5/psoriasina en
células de cáncer de mama
MDA-MB-468 y células MCF10A privadas
de suero. Además, el testado de los lisados de células y medio de
cultivo de células MDA-MB-468
indicaron que la HID-5/psoriasina se expresa
intracelularmente y se secreta.
Los análisis inmunoquímicos indicaron la
expresión incrementada de HID-5/psoriasina en un
número significativo de cánceres de mama de grado alto frente a los
cánceres de mama de grado bajo e intermedio y el epitelio mamario
normal.
Estos datos proporcionan las bases para los
métodos de la invención.
La invención presenta adicionalmente ensayos de
diagnóstico. Tales ensayos se basan en los descubrimientos de
que:
(1) las células DCIS de grado alto expresan
niveles elevados de proteína HID-5/psoriasina y mRNA
de HID-5/psoriasina, mientras que las células de
mama normales y bajas y las células de cáncer de mama de grado bajo
e intermedio expresan niveles significativamente menores o
indetectables de proteína HID-5/psoriasina y mRNA de
HID-5/psoriasina; y (2) la proteína
HID-5/psoriasina es secretada por las células del
cáncer de mama. Estos descubrimientos proporcionan las bases para
ensayos de diagnóstico de DCIS de grado alto. Tales ensayos pueden
utilizarse por sí solos o, preferiblemente, en asociación con otros
procedimientos para testar el DCIS de grado alto.
En los ensayos de la invención: (1) se testa la
presencia de la proteína HID-5/psoriasina o mRNA de
HID-5/psoriasina o se miden sus niveles; o (2) se
mide el nivel de la proteína HID-5/psoriasina en una
muestra líquida tal como un fluido corporal (v.g., orina, saliva,
semen, sangre, o suero o plasma derivados de la sangre); un lavado
tal como un lavado del conducto mamario, lavado de pulmón, lavado
gástrico, lavado rectal o de colon, o lavado vaginal; un aspirado
tal como un aspirado de pezón; o un fluido tal como un sobrenadante
de un cultivo de células. Con objeto de testar la presencia, o
medir el nivel, de mRNA de HID-5/psoriasina en las
células, las células pueden lisarse y puede purificarse o
semipurificarse el RNA total de los lisados por cualquiera de una
diversidad de métodos conocidos en la técnica. Métodos para
detección o medición de los niveles de transcritos particulares de
mRNA son también familiares para los expertos. Dichos ensayos
incluyen, sin limitación, ensayos de hibridación que utilizan
sondas de DNA o RNA específicas de HID-5/psoriasina
marcadas detectablemente y metodologías cuantitativas o
semicuantitativas RT-PCR que emplean iniciadores
oligonucleotídicos apropiados específicos de
HID-5/psoriasina. Métodos adicionales para
cuantificación de mRNA en lisados de células incluyen ensayos de
protección del RNA y el análisis seriado de la expresión génica
(SAGE). Alternativamente, pueden realizarse ensayos cualitativos,
cuantitativos, o semicuantitativos de hibridación in situ
utilizando, por ejemplo, secciones de tejidos o suspensiones de
células no lisadas, y sondas de DNA o RNA marcadas detectablemente
(v.g., por fluorescencia o enzimáticamente).
Métodos de detección o medición de los niveles
de una proteína de interés (v.g., HID-5/psoriasina)
en las células se conocen en la técnica. Muchos métodos de esta
clase emplean anticuerpos (v.g. anticuerpos policlonales o mAbs)
que se fijan específicamente a la proteína. En tales ensayos, NaBS
el anticuerpo propiamente dicho o un anticuerpo secundario que se
fija al mismo c Alternativamente, el anticuerpo puede conjugarse con
biotina, y puede utilizarse avidina (una proteína que se fija a la
biotina) marcada de manera detectable para detectar la presencia
del anticuerpo biotinilado. Combinaciones de estos métodos (con
inclusión de los ensayos "multicapa") familiares para los
expertos en la técnica pueden utilizarse para mejorar la
sensibilidad de los ensayos. Algunos de estos ensayos (v.g.,
métodos inmunohistológicos o citometría de flujo con fluorescencia)
pueden aplicarse a secciones histológicas o suspensiones de células
no lisadas. Los métodos descritos a continuación para detectar
HID-5/psoriasina en una muestra líquida pueden
utilizarse también para detectar HID-5/psoriasina
en lisados de células.
Los métodos para detección de
HID-5/psoriasina en una muestra líquida (véase
arriba) implican básicamente poner en contacto una muestra de
interés con un anticuerpo que se fija a
HID-5/psoriasina y testar respecto a la fijación
del anticuerpo a un componente de la muestra. En tales ensayos, el
anticuerpo no precisa estar marcado detectablemente y puede
utilizarse sin un segundo anticuerpo que se fije a
HID-5/psoriasina. Por ejemplo, por aprovechamiento
del fenómeno de resonancia de plasmones de superficie, se expone a
la muestra un anticuerpo específico para
HID-5/psoriasina fijado a un sustrato sólido
apropiado. La fijación de HID-5/psoriasina al
anticuerpo sobre el sustrato sólido da como resultado un cambio en
la intensidad de la resonancia de los plasmones de superficie que
puede ser detectado cualitativa o cuantitativamente por un
instrumento apropiado, v.g., un aparato Biacore (Biacore
International AB, Rapsgatan, Suecia).
Además, ensayos para la detección de
HID-5/psoriasina en una muestra líquida pueden
implicar el uso, por ejemplo, de: (a) un anticuerpo simple
específico de HID-5/psoriasina que está marcado
detectablemente; y (b) un anticuerpo
HID-5/psoriasina específico sin marcar y un
anticuerpo secundario marcado detectablemente; o (c) un anticuerpo
HID-5/psoriasina específico biotinilado y avidina
marcada detectablemente. Adicionalmente, como se ha descrito arriba
para la detección de proteínas en las células, pueden utilizarse
combinaciones de estos enfoques (con inclusión de ensayos
"multicapa") familiares para los expertos en la técnica a fin
de mejorar la sensibilidad de los ensayos. En estos ensayos, la
muestra (o una parte alícuota de la muestra) que se sospecha
contiene HID-5/psoriasina puede inmovilizarse sobre
un sustrato sólido tal como una membrana de nailon o nitrocelulosa
mediante, por ejemplo, "punteado" de una parte alícuota de la
muestra líquida o por transferencia de un gel electroforético en el
cual se ha sometido la muestra o una parte alícuota de la muestra a
separación electroforética. La presencia o cantidad de
HID-5/psoriasina en el sustrato sólido se ensaya
luego utilizando cualquiera de las formas arriba descritas del
anticuerpo específico de HID-5/psoriasina y, en caso
requerido, anticuerpos secundarios apropiados marcados
detectablemente o avidina.
La invención presenta también ensayos
"sándwich". En estos ensayos sándwich, en lugar de inmovilizar
las muestras sobre sustratos sólidos por los métodos arriba
descritos, cualquier cantidad de HID-5/psoriasina
que pueda estar presente en una muestra puede inmovilizarse sobre
el sustrato sólido, antes de la exposición del sustrato sólido a la
muestra, por conjugación de un segundo anticuerpo ("de
captura") (policlonal o mAb) específico de
HID-5/psoriasina al sustrato sólido por cualquiera
de una diversidad de métodos conocidos en la técnica. En la
exposición de la muestra al sustrato sólido con el segundo
anticuerpo específico de HID-5/psoriasina fijado al
mismo, cualquier cantidad de HID-5/psoriasina
existente en la muestra (o parte alícuota de la muestra) se fijará
al segundo anticuerpo específico de HID-5/psoriasina
sobre el sustrato sólido. La presencia o cantidad de
HID-5/psoriasina fijada al segundo anticuerpo
específico de HID-5/psoriasina conjugado se ensaya
luego utilizando un anticuerpo específico de "detección" de
HID-5/psoriasina por métodos que son esencialmente
los mismos que se han descrito arriba utilizando un anticuerpo
simple específico de HID-5/psoriasina. Debe
entenderse que en estos ensayos sándwich, el anticuerpo de captura
no debe fijarse al mismo epítope (o gama de epítopes en el caso de
un anticuerpo policlonal) que el anticuerpo de detección. Así, si se
utiliza un mAb como anticuerpo de captura, el anticuerpo de
detección puede ser, o bien: (a) otro mAb que se fija a un epítope
que está separado físicamente por completo del epítope al que se
fija el mAb de captura o que se solapa sólo parcialmente con el
mismo; o (b) un anticuerpo policlonal que se fija a epítopes
distintos de o adicionales a aquél al que se fija el mAb de
captura. Por otra parte, si se utiliza un anticuerpo policlonal como
anticuerpo de captura, el anticuerpo de detección puede ser (a) un
mAb que se fija a un epítope del cual está separado físicamente por
completo o que se solapa parcialmente con cualquiera de los epítopes
a los que se fija el anticuerpo policlonal de captura; o (b) un
anticuerpo policlonal que se fija a epítopes distintos de o
adicionales a aquél al que se fija el anticuerpo policlonal de
captura. Ensayos que implican el uso de un anticuerpo de captura y
un anticuerpo de detección incluyen ensayos sándwich ELISA ensayos
sándwich de transferencia Western, y ensayos sándwich de detección
inmunomagnética.
Sustratos sólidos adecuados a los cuales puede
fijarse el anticuerpo de captura incluyen, sin limitación, los
fondos y paredes de plástico de pocillos de placas de
microtitulación, membranas tales como membranas de nailon o de
nitrocelulosa, cuentas de polímero (v.g., sin limitación, agarosa,
celulosa, o poliacrilamida), o partículas. Debe indicarse que los
anticuerpos específicos de HID-5/psoriasina fijados
a tales cuentas o partículas pueden utilizarse también para la
purificación por inmunoafinidad de
HID-5/psoriasina.
Los métodos de detección o para cuantificación
de un marcador detectable dependen de la naturaleza del marcador y
son conocidos en la técnica. Marcadores apropiados incluyen, sin
limitación, radionucleidos (v.g., ^{125}I, ^{131}I, ^{35}S,
^{3}H, ^{32}P, ^{33}P, o ^{14}C), restos fluorescentes (v.g.
fluoresceína, rodamina, o ficoeritrina), restos luminiscentes
(v.g., nanopartículas Qdot^{TM} suministradas por Quantum Dot
Corporation, Palo Alto, CA), compuestos que absorben luz de una
longitud de onda definida, o enzimas (v.g., fosfatasa alcalina o
peroxidasa de rábano picante). Los productos de las reacciones
catalizadas por enzimas apropiadas pueden ser, sin limitación,
fluorescentes, luminiscentes, o radiactivos, o bien pueden absorber
luz visible o ultravioleta. Ejemplos de detectores incluyen, sin
limitación, película de rayos X, contadores de radiactividad,
contadores de centelleo, espectrofotómetros, colorímetros,
fluorómetros, luminómetros, y densitómetros.
En los ensayos para diagnosticar DCIS de grado
alto, la concentración de HID-5/psoriasina en, por
ejemplo, suero procedente de un paciente que se sospecha padece, o
se halla en riesgo de padecer DCIS de grado alto se compara con el
valor medio de las concentraciones de
HID-5/psoriasina en sueros procedentes de un grupo
de individuos de control, v.g., individuos que no padecen cáncer de
mama, individuos que padecen un cáncer de mama de grado bajo,
individuos que padecen un cáncer de mama de grado intermedio, o
cualquier combinación de tales individuos. Una concentración
significativamente mayor de HID-5/psoriasina en el
suero del paciente con relación a la concentración media en los
sueros del grupo de control indicaría que el paciente padece DCIS
de grado alto. Alternativamente, si se dispone de una muestra del
suero del individuo que se obtuvo en una fecha anterior en la cual
el paciente, evidentemente, no padecía cáncer de mama, la
concentración de HID-5/psoriasina en la muestra de
suero de test puede compararse con la concentración en la muestra
obtenida previamente. Un nivel mayor en la muestra de suero de test
sería una indicación de que el paciente padecería un DCIS de grado
alto.
Debe entenderse que, si bien las descripciones
que anteceden de los ensayos de diagnóstico se refieren a ensayos
sobre suero, los ensayos pueden realizarse también sobre cualquiera
de las otras muestras de fluido enumeradas en esta memoria.
Adicionalmente, debe indicarse que los pacientes e individuos de
control a que se hace referencia arriba no precisan ser pacientes
humanos. Los mismos pueden ser por ejemplo, primates no humanos
(v.g., monos), caballos, ovejas, vacas, cabras, cerdos, perros,
cobayos, hámsters, ratas, conejos o ratones).
Debe entenderse que, dado que el análisis SAGE
descrito en el Ejemplo 2 demostró que la expresión de calgranulina
B/S100A9 y conexina 43 estaba regulada en sitio creciente en las
células DCIS de grado alto con relación a las células epiteliales
normales de mama y las células DCIS de grado intermedio, la
detección y/o medición de la expresión de calgranulina B/S100A9 o
conexina 43 por las células de mama de test, por adaptación de
cualquiera de los métodos arriba descritos, puede realizarse para
diagnosticar DCIS de grado alto.
Los datos presentados a continuación demuestran
que la expresión de HID-5/psoriasina está regulada
en sentido creciente en ciertos pacientes de cáncer de mama. Así,
en los pacientes que tienen la capacidad de montar una respuesta
autoinmune a HID-5/psoriasina, la inmunización con
HID-5/psoriasina o uno o más fragmentos de
HID-5/psoriasina podría ser un régimen
inmunoterapéutico eficaz. Sin quedar limitados a cualquier mecanismo
particular de acción, el efecto terapéutico en un régimen de este
tipo podría ser debido a la acción de los linfocitos citotóxicos T
(CTL) específicos para los fragmentos peptídicos de
HID-5/psoriasina o de anticuerpos neutralizantes
específicos para HID-5/psoriasina.
Los anticuerpos pueden ser anticuerpos
policlonales o monoclonales; métodos para producción de ambos tipos
de anticuerpos se conocen en la técnica. Los anticuerpos pueden ser
de cualquier clase (v.g., IgM, IgG, IgA, IgD o IgE) y pueden
generarse en cualquiera de las especies citadas en esta memoria. Los
mismos son preferiblemente anticuerpos IgG. Anticuerpos
recombinantes específicos para HID-5/psoriasina,
tales como anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados que
comprenden a la vez porciones humanas y no humanas, pueden
utilizarse también en los métodos de la invención. Tales
anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados pueden producirse
por métodos de DNA recombinante conocidos en la técnica, por
ejemplo, utilizando métodos descritos en Robinson et al.,
Publicación de Patente Internacional PCT/US86/02269; Akira et
al., Solicitud de Patente Europea 184,187; Taniguchi, Solicitud
de Patente Europea 171,496; Morrison et al., Solicitud de
Patente Europea 173,494; Neuberger et al., PCT Application
WO 86/01533; Cabilly et al., Patente U.S. No. 4.816.567;
Cabilly et al., Solicitud de Patente Europea 125,023; Better
et al. (1988) Science 240, 1041-43; Liu et
al. (1987) J. Immunol. 139, 3521-26; Sun et
al. (1987) PNAS 84, 214-18; Nishimura et
al. (1987) Canc. Res. 47, 999-1005; Wood et
al. (1985) Nature 314, 446-49; Shaw et
al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80, 1553-59;
Morrison, (1985) Science 229, 1202-07; Oi et
al. (1986) BioTechniques 4, 214; Winter, Patente U.S. No.
5.225.539; Jones et al. (1986) Nature 321,
552-25; Veroeyan et al. (1988) Science 239,
1534; y Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141,
4053-60.
Son también útiles para la invención fragmentos
de anticuerpos y derivados que contienen al menos la porción
funcional del dominio de fijación de antígeno de un anticuerpo que
se fija a HID-5/psoriasina. Fragmentos de
anticuerpos que contienen el dominio de fijación de la molécula
pueden generarse por técnicas conocidas. Dichos fragmentos
incluyen, pero sin carácter limitante: fragmentos
F(ab')_{2} que pueden producirse por digestión con pepsina
de moléculas de anticuerpo; fragmentos Fab que pueden generarse por
reducción de los puentes disulfuro de los fragmentos
F(ab')_{2}; y fragmentos Fab que pueden generarse por
tratamiento de moléculas de anticuerpo con papaína y un agente
reductor. Véase, v.g. National Institutes of Health, 1
Current Protocols in Immunology, Coligan et al., ed
2.8, 2.10 (Wiley Insterscience, 1991). Los fragmentos de anticuerpo
incluyen también fragmentos Fv, es decir, productos de anticuerpo en
los cuales existen pocos o ningún residuo de aminoácido de la
región constante. Un fragmento Fv monocatenario (scFv) es una cadena
de polipéptido simple que incluye a la vez las regiones variables
de cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo del que se deriva
el scFv. Fragmentos de esta clase pueden producirse, por ejemplo,
como se describe en la patente U.S. No. 4.642.334, que se incorpora
en esta memoria por referencia en su totalidad. Para un individuo
humano, el anticuerpo puede ser una versión "humanizada" de un
anticuerpo monoclonal generado originalmente en una especie
diferente.
La invención se ilustra, sin carácter limitante,
por los ejemplos siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Las líneas de células MDA-MB468
y MCF10A se obtuvieron de American Type Culture Collection (ATCC;
Manassas, VA) y se mantuvieron en medio de McCoy (Life
Technologies, Gaithersburg, MD) que contenía 10% de suero bovino
fetal (FBS) y en medio DMEM/F12 (Life Technologies) que contenía 5%
de suero de caballo y estaba complementado con 20 ng/ml de factor
de crecimiento epidérmico, 100 ng/ml de toxina del cólera, 0,01
mg/ml de insulina, y 500 ng/ml de hidrocortisona, respectivamente.
Para determinar el efecto de la privación de suero sobre la
expresión de HID-5/psoriasina en cultivos
subconfluyentes o confluyentes, las células MCF10A se cambiaron a
suero al 0,2% que contenía medio DMEM/F12 y se incubaron durante el
tiempo indicado. El efecto de la confluencia se analizó por
mantenimiento de las células MCF10A en condiciones confluyentes
durante el tiempo indicado con cambios frecuentes (en días
alternos) de medio. Para los cultivos en suspensión, las células
MCF10A se tripsinizaron, se suspendieron de nuevo en medio reciente
(1,75 x 10^{5} células/ml de medio), se extendieron en cápsulas
petri recubiertas con
poli-2-hidroxi-etilmetacrilato
(Aldrich, St. Louis, MO) (1 mg/cm^{2} en etanol 100%), y se
incubaron durante el tiempo indicado.
Se generó un anticuerpo de conejo
anti-HID-5/psoriasina policlonal de
conejo por inmunización con un péptido sintético correspondiente a
los aminoácidos 83-100 de
HID-5/psoriasina humana (TDYHKQSHGAAPCSGGSQ) (SEQ ID
NO: 3). En Fig. 4A se muestra la secuencia de amino-ácidos (SEQ ID
NO: 1) de HID-5/psoriasina humana de longitud
total, y en Fig. 4B se muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID
NO: 2) de cDNA codificante de HID-5/psoriasina
humana madura de longitud total. Para la generación de anticuerpos
monoclonales de ratón, un fragmento de cDNA
BamHI-HindIII generado por PCR codificante de
HID-5/psoriasina humana de longitud total, se
subclonó en los sitios BamHI-HindIII de
pQE-30 (Qiagen Sciences, Germantown, MD) produciendo
un constructo que codifica HID-5/psoriasina con una
secuencia N-terminal de hexahistidina. La proteína
se expresó en bacterias M15 [pREP4], purificadas hasta homogeneidad
utilizando tampón desnaturalizante de urea y cuentas NiNTA (Qiagen
Sciences). La proteína fijada se eluyó en Tris 50 mM de pH 7,5,
imidazol 500 mM, EDTA 100 mM, NaCl 1 M, glicerol al 10%, y DTT 1
mM. En colaboración con Imgenex, San Diego, CA, se utilizó la
proteína para hiperinmunizar ratones BALB/c, lo que proporcionó una
fuente de células productoras de anticuerpo para la generación de
anticuerpos monoclonales específicos de
HID-5/psoriasina. Los anticuerpos monoclonales
anti-HID-5/psoriasina están
disponibles comercialmente de Imgenex.
Se realizaron análisis por transferencia Western
de lisados de células e inmunohistoquímica utilizando anticuerpos
panleucocítico anti-CD45 (Dako, Glostrup,
Dinamarca), receptor \alpha antiestrogénico (ER\alpha),
anti-erbB2, y
anti-HID-5/psoriasina (clon
1068-1; designado "C1 1" en el panel de la
derecha de Fig. 2A) como se ha descrito previamente [Krop et
al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
98:9796-9801; Leach et al. (1998) Cancer Res.
56:235-240]. Se adquirieron microrredes de tejidos
de Imgenex o se generaron como se ha descrito previamente [Kononen
et al. (1998) Nat. Med. 4:844-847].
El análisis FISH de preparaciones de cromosomas
en metafase de linfocitos de sangre periférica obtenidos de varones
humanos normales se realizó de acuerdo con un método descrito
previamente [Ney et al. (1993) Mol. Cell. Biol.
13:5604-5612]. Se prepararon núcleos en interfase de
tejido tumoral disgregado, fijado en formalina y embebido en
parafina y se realizó la FISH de acuerdo con métodos descritos
previamente [Kuchinka et al. (19950 Mod. Pathol.
8:183-186]. Los cromosomas en metafase y los núcleos
en interfase se sometieron a contratinción con
4,6-diamidino-2-fenilindol-dihidrocloruro
(DAPI). La microdisección con captura de láser, el análisis PCR en
tiempo real, el aislamiento de RNA, y el análisis de transferencias
Northern se llevaron a cabo como se ha descrito previamente [Krop
et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
98:9796-9801]. Las hibridaciones de mRNA in
situ utilizando ribosondas de sentido (de control) o antisentido
HID-5 marcadas con ^{33}P se realizaron como se
ha descrito previamente [Rosen et al. (1999) Mol. Cell.
4:611-617].
\vskip1.000000\baselineskip
La generación de bibliotecas SAGE ha sido
descrita previamente [v.g., Porter et al (2001) Cancer Res.
61:5697-5702]. La comparación de las bibliotecas
SAGE generadas a partir de dos muestras epiteliales normales de mama
("Normal 1" y "Normal 2"), células DCIS de grado
intermedio que expresaban receptor de estrógenos (ER) ("IM DCIS
(ER+)") y DCIS de grado alto que no expresaba ER ("HG DCIS
(ER)") reveló que HID-5/psoriasina se encuentra
entre los transcritos expresados diferencialmente con mayor fuerza
y es uno de los mRNAs más abundantes en el DCIS de grado alto
(Tabla 1). Además del mRNA transcrito a partir del gen de mRNA
codificante de psoriasina, S100A9, otra proteína S100, se expresaba
también fuertemente en el DCIS de grado alto (Tabla 1). Ambos genes
están localizados en la rama larga (q) del cromosoma 1 y la
expresión de ambos está regulada en sentido creciente en los
queratinocitos psoriásicos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Se examinó la localización cromosómica de otros
genes muy expresados diferencialmente y el nivel de expresión de
los genes implicados en lesiones psoriásicas (Tabla 1).
Sorprendentemente, una fracción importante (13 de 46 genes mapeados
fiablemente) de genes sobreexpresados específicamente en DCIS de
grado alto está localizada en la rama larga del cromosoma 1 (Tabla
1). Las anormalidades estructurales del cromosoma 1 se encuentran
entre las anormalidades citogenéticas más frecuentes en los
carcinomas de mama y varios genes implicados en el mapa de
diferenciación epidérmica para el cromosoma 1q [Volz et al.
(1993) Genomics 18:92-99; Tirkkonen et al.
(1998) Genes Chrom. Cancer 21:177-184].
Para determinar si la sobreexpresión de estos 13
genes en el DCIS de grado alto es debida a aneuploidía/aneusomía
del cromosoma 1q, se llevó a cabo análisis FISH utilizando como
sondas dos BACs (cromosomas bacterianos artificiales) no solapantes
que contenían los genes A4 de psoriasina y efrina, respectivamente.
El análisis se realizó sobre extensiones en metafase de un
individuo normal y núcleos en interfase del CDIS utilizado para SAGE
(datos no presentados). Después de la confirmación de la asignación
cromosómica del gen de HID-5/psoriasina a la rama
larga del cromosoma 1 en la banda q21 por análisis de extensiones en
metafase, los núcleos en interfase del tejido tumoral DCIS se
hibridaron con el BAC que contenía el gen (datos no presentados). Se
observaron dos señales de hibridación en 31/33 (94%) de los núcleos
examinados, coherente con un número normal de copias para la región
genómica testada. Este resultado indicaba que la expresión aberrante
de psoriasina/HID-5 en la lesión DCIS de grado alto
no está causada por amplificación del locus
psoriasina/HID-5.
Además de psoriasina, varios otros genes que se
sabe están regulados en sentido creciente en los queratinocitos
psoriásicos se expresaban aberrantemente en el DCIS de grado alto
(Tabla 1) [Celis et al. (1990) Electrophoresis
11:242-254; Labarthe et al. (1998) J. Invest.
Dermatol. 111:72-76; Rivas et al. (1997) J.
Invest. Dermatol. 108:188-194). Estos genes
incluían los codificantes de S100A9, conexina 43, interleuquinas 6 y
8, receptor de interleuquina 6, anfirregulina, y queratina 6. La
expresión de mRNA de SCCA1 (antígeno 1 del carcinoma de células
escamosas) estaba también ligeramente regulada en sentido creciente
en el DCIS de grado alto aunque, debido a la escasa abundancia de
este mRNA, la diferencia detectada no alcanzaba significación
estadística. La expresión aberrante de estos genes en DCIS de grado
alto y queratinocitos psoriásicos podría ser debida a
hiperproliferación, diferenciación anormal, o a la infiltración de
linfocitos característica de ambos tipos de lesiones [Bos et
al. (1999) Immunol. Today 20:40-46; Page et
al. (2000) Curr. Opin. Oncol. 12:526-531].
\vskip1.000000\baselineskip
Para evaluar la expresión de
HID-5/psoriasina en los carcinomas de mama
primarios, análisis PCR de 11 tumores primarios purificados LCM
(Microdisección con Captura por Láser) y muestras de epitelio
mamario normal correspondientes (Fig. 1A) (sic). Así, cada muestra
de tumor de un paciente se comparó con epitelio mamario normal del
mismo paciente. En todos los casos, excepto para una lesión de
grado bajo que expresaba receptor de progesterona y que expresaba
ER in situ (muestra 57) y una lesión invasiva de grado
intermedio, que expresaba ER y expresaba receptor de progesterona
(muestra 65), los niveles de mRNA de
HID-5/psoriasina estaban significativamente (\geq
10 veces) incrementados con relación al epitelio mamario normal
correspondiente (Fig. 1A).
Para confirmar la expresión de
HID-5/psoriasina en células epiteliales de DCIS de
grado alto al nivel celular, se realizó un análisis de mRNA por
hibridación in situ de dos tumores DCIS de grado bajo, dos
intermedios y dos de grado alto, y del epitelio normal
correspondiente (Fig. 1B y datos no presentados). La
HID-5/psoriasina es expresada fuerte y
específicamente por las células tumorales de los dos DCIS de comedo
de grado alto (Fig. 1B). En contraste, no se detectó señal de
hibridación alguna en los DCIS de grado bajo e intermedio, y en las
células epiteliales mamarias normales (Fig. 1B y datos no
presentados).
Para analizar la expresión de la proteína
HID-5/psoriasina, se generaron y caracterizaron
anticuerpos policlonales y monoclonales específicos para
HID-5/psoriasina humana. Tanto el anticuerpo
policlonal como los anticuerpos monoclonales se fijaban a la
proteína HID-5/psoriasina recombinante y las
endógenas que migraban como una banda simple de \sim 11 kDa en la
electroforesis en gel de dodecilsulfato de
sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE)
(Fig. 2A). Se realizaron una serie de experimentos para testar si la
expresión de HID-5/psoriasina puede ser detectada
en diversas condiciones de crecimiento en las células MCF10A. Las
células MCF10A son células epiteliales mamarias humanas
inmortalizadas normales que demuestran una expresión nula (o un
nivel muy bajo de expresión) de HID-5/psoriasina en
cultivos dispersos de crecimiento exponencial. Para mimetizar las
condiciones que existen probablemente in vivo en el DCIS de
grado alto y en las lesiones psoriásicas de piel, las células MCF10A
se cultivaron en medio de suero que contenía una concentración baja
de suero (0,2% frente a (5%)) y en condiciones confluyentes (frente
a las dispersas). El cultivo de las células en una concentración
baja de suero y en condiciones confluyentes (con indiferencia de la
concentración de suero) conducía a una regulación espectacular en
sentido creciente de los niveles de proteína
HID-5/psoriasina (Fig. 2B). Los niveles de proteína
HID-5/psoriasina máximos se observaron en células
confluyentes privadas de suero (Fig. 2B).
El efecto del desprendimiento de células de la
matriz extracelular se testó por cultivo de células MCF10A en
suspensión durante varios días. La falta de anclaje de las células
aumentaba también espectacularmente los niveles de proteína
HID-5/psoriasina (Fig. 2C). El análisis por
transferencia Northern indicó que la regulación creciente de la
expresión de HID-5/psoriasina por la suspensión de
células y la confluencia ocurría al nivel del mRNA (Fig. 2D). El
análisis del ciclo celular de las células MCF10A reveló que la
privación de suero, la confluencia y la falta de anclaje de las
células da finalmente como resultado la detención en G1 seguida por
apoptosis (datos no presentados). La regulación espectacular
creciente de la expresión de HID-5/psoriasina por
estas señales extracelulares indica que la
HID-5/psoriasina puede jugar un papel en la
regulación de estos procesos celulares. Es interesante que los
queratinocitos derivados de lesiones psoriásicas han demostrado ser
resistentes a la apoptosis en comparación con los derivados de piel
normal [Wrone-Smith et al. (1997) Am. J.
Pathol. 151:1321-1329]. Los tumores DCIS de grado
alto demuestran tasas apoptóticas elevadas [Page et al.
(2000) Curr. Opin. Oncol. 12:526-531] y las células
tumorales supervivientes son probablemente relativamente
resistentes a la apoptosis.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar la localización subcelular de la
proteína HID-5/psoriasina, se realizó la
inmunohistoquímica de células de cáncer de mama
MDA-MB468 y células MCF10A en crecimiento
exponencial y privadas de suero utilizando el anticuerpo monoclonal
anti-HID-5/psoriasina designado
"C1 1" en Fig. 2A (Fig. 3A). Se detectaron la tinción tanto
nuclear como citoplásmica en células MDA-MB468 y en
células MCF10A privadas de suero, en tanto que no se observó
tinción alguna utilizando un antisuero negativo de control o en las
células MCF10A que se encontraban en crecimiento exponencial (Fig.
3A). Los resultados previos demostraron que la psoriasina puede ser
detectada en la orina de los pacientes con cáncer de vejiga y es
parcialmente secretada por los queratinocitos psoriásicos aun
cuando la misma no contiene péptido de señal alguno [Madsen et
al. (1991) J. Invest. Dermatol. 97:701-712;
Ostergaard et al. (1999) Electrophoresis
20:349-354]. Para determinar si la
HID-5/psoriasina es secretada también por las
células de cáncer de mama, se realizaron inmunoprecipitaciones en
lisados de células y en medio de cultivo de las células
MDA-MB468 utilizando un anticuerpo policlonal
anti-HID-5/psoriasina. Los
inmunoprecipitados se resolvieron por SDS-PAGE y se
analizaron por transferencia Western con un anticuerpo policlonal
anti-HID-5. La proteína
HID-5/psoriasina se precipitaba tanto del lisado de
células como del medio de cultivo con el anticuerpo
anti-HID-5/psoriasina
("HID-5"), mientras que no era precipitada
proteína alguna por el suero de control pre-inmune
("P.I.") (Fig. 3B). Así pues, la proteína
HID-5/psoriasina es secretada o liberada
parcialmente por las células de cáncer de mama. Por tanto, es
probable que la misma sea detectable en los fluidos corporales
(v.g., sangre y orina) de los pacientes con cáncer de mama. La
detección de HID-5/psoriasina en tales fluidos
corporales puede ser por tanto un test para el cáncer de mama de
grado alto, v.g. DCIS de grado alto.
\vskip1.000000\baselineskip
Para analizar la expresión in vivo de la
proteína HID-5/psoriasina, se realizó un análisis
inmunohistoquímico de carcinomas de mama fijados con formalina y
embebidos en parafina, utilizando anticuerpos monoclonales
anti-HID-5/psoriasina. Para evaluar
la fiabilidad de la tinción, se analizó un tumor DCIS de comedo de
grado alto que se había demostrado previamente por hibridación de
mRNA in situ que expresaba HID-5/psoriasina.
Se detectó una tinción inmunohistoquímica intensa en las células
tumorales utilizando el anticuerpo
anti-HID-5/psoriasina
("HID-5"), en tanto que no se observó tinción
alguna utilizando suero isotipo de control ("Control") (Fig.
3C).
Se examinaron dos microrredes de tejido. La red
1 estaba compuesta de 5 muestras individuales de tejido de mama
normal y 30 muestras individuales de carcinomas de mama primarios
invasivos (10 de cada uno de grado bajo, intermedio y alto), y la
red 2 estaba compuesta de 6 muestras individuales de tejido de mama
normal, 3 muestras de lesiones hiperproliferativas benignas y 49
muestras de carcinomas ductales primarios invasivos. Las
representaciones diagramáticas de las dos redes se muestran en Fig.
3E. En la red 1, se fijaron 3 troqueles (en filas horizontales) de
cada muestra de tumor a la diapositiva y se agruparon los tumores de
acuerdo con su grado histológico (tumores de grado bajo, intermedio
y alto). Las muestras de tumor de la red 1 se analizaron también
respecto a la expresión de ER\alpha (ER\alpha) y erbB2 y
respecto a la presencia de leucocitos utilizando un anticuerpo
específico para CD45, un antígeno panleucocítico. En la red 2, la
primera fila vertical contenía las 6 muestras de tejido mamario
normal, las 3 muestras de lesiones hiperproliferativas benignas, y
un punto vacío (indicado por el cuadrado rayado). Las muestras de la
red 2 se analizaron respecto a la expresión de ER\alpha, el
receptor de progesterona (PR), y p53. La tinción de un tumor
representativo se muestra en Fig. 3D y los resultados se resumen en
Fig. 3E.
Como era de esperar, los tumores de grado bajo
eran en su mayoría ER\alpha-positivos,
erbB2-negativos y pobres en CD45, mientras que los
de grado alto eran en su mayoría ER\alpha negativos, erB2
positivos y ricos en CD45. No se detectó expresión significativa
alguna de HID-5/psoriasina en ninguna de las
muestras de tejido mamario normal ni en las lesiones
hiperproliferativas benignas (Fig. 3E). Los tumores invasivos
positivos a HID-5/psoriasina eran en su mayoría
ER\alpha negativos. Entre los 78 tumores examinados, 38 eran
positivos para HID-5/psoriasina (15 ER\alpha+ y
23 ER\alpha-) y 40 eran negativos para
HID-5/psoriasina (26 ER\alpha+ y 14 ER\alpha-).
Basándose en estos resultados, los tumores positivos para
HID-5/psoriasina tienen más probabilidad de ser
ER\alpha negativos (P = 0,04, test exacto de Fisher). En uno de 3
troqueles procedentes de un tumor de grado bajo, se observó un alto
nivel de HID-5/psoriasina (Fig. 3E, red 1); sin
embargo, se encontró más tarde que este tumor era una lesión DCIS
de grado alto.
La HID-5/psoriasina es un
quimioatrayente supuesto para los linfocitos, y tanto las lesiones
psoriásicas de piel como las lesiones DCIS de grado alto están
frecuentemente infiltradas por linfocitos [Bos et al. (1999)
Immunol. Today 20:40-46; Page et al. (2000)
Curr. Opin. Oncol. 12:526-531]. Aunque la
infiltración linfocítica, como se indicaba por la tinción con CD45,
era frecuente en los tumores de grado alto, no se apreció una
asociación clara entre CD45 y la positividad de
HID-5/psoriasina (Fig. 3E). Esto podría ser debido
al tamaño relativamente pequeño de las muestras o al hecho de que
los carcinomas eran invasivos y no estaban localizados in
situ.
Para determinar si la expresión de
HID-5/psoriasina está correlacionada con
características histopatológicas o clínicas de los tumores de mama,
se llevó a cabo un análisis inmunohistoquímico separado de 722
tumores de mama. En suma, aproximadamente 30% de los tumores eran
positivos a HID-5/psoriasina. El análisis
estadístico de los datos inmunohistoquímicos demostró que la
expresión de HID-5/psoriasina era diferente de modo
estadísticamente significativo en los tumores in situ y los
tumores primarios invasivos, y las metástasis distantes.
Específicamente, los tumores in situ primarios invasivos
tenían mayor probabilidad de ser
HID-5/psoriasina-positivos que las
metástasis distantes (p = 0,008). El análisis por el modelo de
regresión logística de la expresión de
HID-5/psoriasina en los tumores de mama primarios
invasivos demostró una correlación positiva estadísticamente
significativa entre la positividad de
HID-5/psoriasina y la ausencia de receptor de
estrógenos (razón de puntos [OR] = 6,25 y relación de probabilidad
[LR] p = 0,001), grado histológico alto (OR = 20,85 LR p = 0,0007),
y \geq 4 ganglios linfáticos positivos (OR = 10,025 LR p = 0,01).
Dicho de otro modo, los tumores de mama primarios invasivos
positivos a HID-5/psoriasina es más probable que
sean negativos al receptor de estrógenos (ER) y de grado
histológico alto con \geq 4 ganglios linfáticos positivos. En un
subconjunto de muestras de tumores (156 pacientes coreanos) la
expresión de HID-5/psoriasina estaba correlacionada
positivamente con la expresión de erbB2 (OR = 5,29 LR p <
0,0001), pero esto no sucedía en la serie de datos combinados, lo
que indicaba posiblemente diferencias relacionadas con la etnia.
Este estudio, utilizando el test exacto de Fisher, demostró también
que, en las células del cáncer de mama, la expresión de S100A7
estaba asociada con una mayor probabilidad de expresión de FASN
(sintasa de ácidos grasos) (p = 9,95 x 10^{-6}) y el factor
trébol 3 (TFF3) (p = 0,002), y una menor probabilidad de expresión
del factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF) (p = 0,005).
Adicionalmente, la expresión de FASN en las células de cáncer de
mama estaba asociada con la de TFF3 (p = 3,5 x 10^{-6}) y SPARC
(p = 4 x 10^{-5}).
Dado que los tumores de grado alto
ER-negativos, con ganglios linfáticos positivos
múltiples suelen tener por regla general un desenlace clínico peor,
se analizó la expresión de HID-5/psoriasina en
relación con la supervivencia global y exenta de metástasis
distantes. Los datos de seguimiento clínico estaban disponibles
únicamente para un subconjunto de pacientes (156 pacientes coreanos)
y esto ocurrió sólo durante hasta 7 años. Sobre la base de este
análisis, los pacientes con tumores positivos a
HID-5/psoriasina tenían una supervivencia global
reducida en > 5 años; sin embargo, esta disminución no era
estadísticamente significativa.
En resumen, el análisis SAGE de los perfiles de
expresión génica de las células epiteliales mamarias normales y los
tumores DCIS reveló que varios genes implicados en la psoriasis se
expresan aberrantemente en el DCIS de grado alto, siendo la
HID-5/psoriasina uno de los transcritos más
abundantes en estos tumores. La regulación espectacularmente
creciente de HID-5/psoriasina en las células
epiteliales mamarias in vitro es inducida por la privación
del factor de crecimiento, la confluencia celular, y la falta de
fijación a la matriz extracelular. Dado que todas estas condiciones
ocurren probablemente en las lesiones psoriásicas de piel y el DCIS
de grado alto caracterizado por tasas de proliferación altas, la
expresión elevada de HID-5/psoriasina en estas
células podría ser debida a las mismas señales y la
HID-5/psoriasina puede jugar un papel en la
adquisición de resistencia a la apoptosis de estas células.
Claims (10)
1. Un método para evaluar si un individuo padece
o no carcinoma ductal in situ (DCIS) de grado alto,
comprendiendo dicho método:
- (a)
- identificar un individuo que se sospecha corre riesgo de padecer DCIS de grado alto; y
- (b)
- medir el nivel de expresión de psoriasina o del gen de psoriasina en una muestra de un fluido corporal, un lavado, un aspirado, un sobrenadante de cultivo de células, o una muestra de tejido de mama del individuo;
en donde dicho método incluye determinar si
dicho nivel es superior o no al nivel de expresión de psoriasina o
del gen de psoriasina que estaría presente en una muestra de este
tipo con respecto a un individuo con DCIS de grado intermedio o
DCIS de grado bajo.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un método de discriminación del DCIS de grado
alto con respecto a DCIS de grado intermedio o DCIS de grado bajo,
comprendiendo el método medir el nivel de expresión de psoriasina o
gen de psoriasina en una muestra de un fluido corporal, un lavado,
un aspirado, un sobrenadante de cultivo de células, o una muestra de
tejido mamario de un individuo identificado como paciente de DCIS,
en donde dicho método incluye determinar si dicho nivel es o no
superior al nivel que estaría presente en una muestra de este tipo
con respecto a un individuo con DCIS de grado intermedio o DCIS de
grado bajo.
3. El método de la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el cual el fluido corporal es sangre u orina,
el lavado es un lavado del conducto mamario, o el aspirado es un
aspirado de pezón.
4. Un método de la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el cual dicha muestra es una muestra de tejido
mamario del individuo.
5. El método de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el cual se mide la proteína
psoriasina.
6. El método de la reivindicación 5, en el cual
la proteína psoriasina se mide utilizando un anticuerpo que se fija
a la psoriasina.
7. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el cual se mide mRNA de psoriasina.
8. El método de la reivindicación 7, en el cual
el mRNA de psoriasina se mide utilizando RT-PCR.
9. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el cual el individuo es un
mamífero.
10. El método de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el cual el individuo es un
humano.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US34574001P | 2001-12-31 | 2001-12-31 | |
| US345740P | 2001-12-31 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2338774T3 true ES2338774T3 (es) | 2010-05-12 |
Family
ID=23356293
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES02806283T Expired - Lifetime ES2338774T3 (es) | 2001-12-31 | 2002-12-30 | Expresion de psoriasina por las celulas epiteliales mamarias. |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7465553B2 (es) |
| EP (1) | EP1470239B1 (es) |
| JP (1) | JP2005526233A (es) |
| AT (1) | ATE453723T1 (es) |
| AU (1) | AU2002367317A1 (es) |
| CA (1) | CA2472163C (es) |
| DE (1) | DE60234958D1 (es) |
| ES (1) | ES2338774T3 (es) |
| WO (1) | WO2003057159A2 (es) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030198972A1 (en) | 2001-12-21 | 2003-10-23 | Erlander Mark G. | Grading of breast cancer |
| US9856533B2 (en) * | 2003-09-19 | 2018-01-02 | Biotheranostics, Inc. | Predicting breast cancer treatment outcome |
| GB0412620D0 (en) * | 2004-06-05 | 2004-07-07 | Univ Belfast | BRCA1 markers |
| US8379960B2 (en) * | 2009-03-30 | 2013-02-19 | Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. | System and method for distinguishing between biological materials |
| WO2010118324A2 (en) | 2009-04-09 | 2010-10-14 | Nuclea Biotechnologies, LLC | Antibodies against fatty acid synthase |
| WO2011031517A1 (en) | 2009-08-27 | 2011-03-17 | Nuclea Biotechnologies, LLC | Method and assay for determining fas expression |
| CN103998064A (zh) | 2010-12-09 | 2014-08-20 | 生物诊断治疗公司 | 治疗后的乳腺癌预后 |
| ES2639227T3 (es) | 2013-04-09 | 2017-10-25 | Lykera Biomed S.A. | Anticuerpos anti S100A7 para el tratamiento y diagnóstico de cáncer |
| WO2017083675A1 (en) | 2015-11-13 | 2017-05-18 | Biotheranostics, Inc. | Integration of tumor characteristics with breast cancer index |
| US11360092B2 (en) | 2016-08-05 | 2022-06-14 | The Research Foundation For The State University Of New York | Keratin 17 as a biomarker for bladder cancer |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3382317D1 (de) | 1982-03-15 | 1991-07-25 | Schering Corp | Hybride dns, damit hergestellte bindungszusammensetzung und verfahren dafuer. |
| US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
| JPS6147500A (ja) | 1984-08-15 | 1986-03-07 | Res Dev Corp Of Japan | キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法 |
| EP0173494A3 (en) | 1984-08-27 | 1987-11-25 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Chimeric receptors by dna splicing and expression |
| GB8422238D0 (en) | 1984-09-03 | 1984-10-10 | Neuberger M S | Chimeric proteins |
| JPS61134325A (ja) | 1984-12-04 | 1986-06-21 | Teijin Ltd | ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法 |
| US5225539A (en) | 1986-03-27 | 1993-07-06 | Medical Research Council | Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies |
| CA2349593A1 (en) * | 1998-11-05 | 2000-05-11 | The Regents Of The University Of Michigan | S100 proteins and autoantibodies as serum markers for cancer |
| AU3752700A (en) | 1999-03-15 | 2000-10-04 | Eos Biotechnology, Inc. | Novel methods of diagnosing and treating breast cancer, compositions, and methods of screening for breast cancer modulators |
| US7585497B2 (en) | 2000-05-17 | 2009-09-08 | Oregon Health & Science University | Induction of apoptosis and cell growth inhibition by protein 4.33 |
| IT1395574B1 (it) | 2009-09-14 | 2012-10-16 | Guala Dispensing Spa | Dispositivo di erogazione |
-
2002
- 2002-12-30 US US10/331,200 patent/US7465553B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-12-30 AT AT02806283T patent/ATE453723T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-12-30 CA CA2472163A patent/CA2472163C/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-12-30 JP JP2003557518A patent/JP2005526233A/ja active Pending
- 2002-12-30 DE DE60234958T patent/DE60234958D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-30 ES ES02806283T patent/ES2338774T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-30 EP EP02806283A patent/EP1470239B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-30 AU AU2002367317A patent/AU2002367317A1/en not_active Abandoned
- 2002-12-30 WO PCT/US2002/041795 patent/WO2003057159A2/en active Application Filing
-
2008
- 2008-12-08 US US12/330,342 patent/US7776541B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2002367317A8 (en) | 2003-07-24 |
| US7776541B2 (en) | 2010-08-17 |
| EP1470239B1 (en) | 2009-12-30 |
| WO2003057159A2 (en) | 2003-07-17 |
| ATE453723T1 (de) | 2010-01-15 |
| DE60234958D1 (de) | 2010-02-11 |
| EP1470239A2 (en) | 2004-10-27 |
| US20090104618A1 (en) | 2009-04-23 |
| AU2002367317A1 (en) | 2003-07-24 |
| US7465553B2 (en) | 2008-12-16 |
| US20030138833A1 (en) | 2003-07-24 |
| JP2005526233A (ja) | 2005-09-02 |
| CA2472163A1 (en) | 2003-07-17 |
| CA2472163C (en) | 2012-12-18 |
| WO2003057159A3 (en) | 2003-12-18 |
| WO2003057159A9 (en) | 2004-06-03 |
| EP1470239A4 (en) | 2006-08-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Khan et al. | Early diagnostic value of survivin and its alternative splice variants in breast cancer | |
| US7776541B2 (en) | Psoriasin expression by breast epithelial cells | |
| RU2436098C2 (ru) | Детектирование рака яичника по повышенным уровням bcl-2 в моче | |
| Hirata et al. | Expression of CD44 variant exon 6 in stage I non-small cell lung carcinoma as a prognostic factor | |
| Slattery et al. | Estrogen and progesterone receptors in colon tumors | |
| US20090081710A1 (en) | Method for Cancer Prognosis Using Cellular Folate Vitamin Receptor Quantification | |
| Berchuck et al. | Immunohistochemical expression of CA 125 in endometrial adenocarcinoma: correlation of antigen expression with metastatic potential | |
| Mito et al. | Clinicopathological and prognostic significance of MUC13 and AGR2 expression in intraductal papillary mucinous neoplasms of the pancreas | |
| EP3109638A1 (en) | Urinary biomarkers for cancer diagnosis | |
| Cierpikowski et al. | PDGFRα/HER2 and PDGFRα/p53 co-expression in oral squamous cell carcinoma | |
| Florea et al. | MUC1 marker for the detection of ovarian cancer. A review | |
| US20090155767A1 (en) | Methods for a predictive diagnostic test for tamoxifen | |
| CN110763845B (zh) | 一种检测蛋白标志物的配体在制备用于诊断结肠癌的产品中的用途和试剂盒 | |
| WO2021084242A1 (en) | Methods for determining the invasive and/or metastatic potential of a tumour | |
| JP7012363B2 (ja) | がん患者におけるｆｓｔｌ１阻害剤による治療効果を予測するためのバイオマーカー | |
| Camacho et al. | CD44v6 expression in inflammatory bowel disease is associated with activity detected by endoscopy and pathological features | |
| Kammori et al. | Prognostic utility of fluorescence in situ hybridization for determining HER2 gene amplification in breast cancer | |
| US20180299447A1 (en) | Cervical cancer testing method and test reagent used therefor | |
| WO2012004565A1 (en) | Cancer biomarker brf1 | |
| Koo et al. | HER-2 protein overexpressing breast cancer without gene amplification shows higher hormone receptor expression than HER-2 protein overexpressing breast cancer with gene amplification | |
| Stasikowska-Kanicka et al. | Close relationship between TAZhigh/SOX2high co-localization and metastasis in oral squamous cell carcinoma | |
| WO2019049829A1 (ja) | 大腸がんの予後バイオマーカー | |
| EP3775910A1 (en) | In vitro screening method and kit for early diagnosis of oral cavity tumours |