KR960705036A - Dna 바이러스 리보자임 - Google Patents

Dna 바이러스 리보자임

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KR960705036A
KR960705036A KR1019960701748A KR19960701748A KR960705036A KR 960705036 A KR960705036 A KR 960705036A KR 1019960701748 A KR1019960701748 A KR 1019960701748A KR 19960701748 A KR19960701748 A KR 19960701748A KR 960705036 A KR960705036 A KR 960705036A
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베로니크 그루베
실버 보디노
존 매슨
모 다비드 조
모하마드 알리 레자이안
이안 베리 드라이
저스틴 엘리스 리젠
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리 비. 패어렐
진 쉬어즈 피티와이 엘티디.
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Abstract

본 발명은, 하이브리드 형성 영역과 촉매 영역을 포함하는 리보자임에 있어서, 하이브리드 형성 영역은 식물세포를 감염시킬 수 있는 DNA 바이러스에 관련된 DNA 분자로부터 전사된 목표 RNA의 최소한 일부와 하이브리드를 형성할 수 있으며, 촉매 영역은 상기 목표 mRNA 서열을 절단함으로써 상기 DNA 바이러스의 복제, 감염 및/또는 조립을 실질적을 감소시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 리보자임에 관한 것이다.

Description

DNA 바이러스 리보자임
본 내용은 요부공개 건이므로 전문내용을 수록하지 않았음
제1도는 TLCV의 세가지 서로 다른 분리균으로부터 상보적-감지 DNA 가닥의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다 : 맨 윗줄은 TLCV(오스트레일리아) ; 가운데줄은 TLCV(이스라엘) ; 맨 아래 줄은 TLCV(사르디니아). 서열은 5′→3′ 방향으로 나타낸다.
제2도는 GaMV35S-1568bp TLCV 단편(Rz1, Rz2 및 Rz3을 함유)-BamHI절단 Bin19로 클로닝된 CaMVpolyA 발현 카세트를 함유하는 pRIBO5BIN을 도시항 나타낸 것이다. 세 리보자임 Rz1, Rz2 및 Rz3의 삽입 부위는 1111,2056 및 2355 위치로 나타나 있다. 상기 번호매김은 비리온-감지 번호매김이고, 이는 제8도 및 제10도에 도시된 바와 같은 (-)감지 번호매김을 사용하면 각각 1654, 711 및 412의 위치에 해당한다.
제6도는 전이유전 담배에서 리보자임 구조 발현의 RT-PCR 분석을 위해 사용되는 시발체의 위치를 도시하여 나타낸 것이다.
제8도는 TYLCV-S의 상보적-감지 가닥의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 소문자는 리보자임 절단부위를 나타낸다. 이와 같은 TYLCV-S의 서열은 문헌〔Kher-Pour et al, Nucl. Acid Res. (1991) 19 : 6763〕에 공고되었다.
제12도는 리보자임 구도를 도시하여 나타낸 것이다. 사선은 TYLCV-S 상보적-감지 가닥을 나타내고, 굵은 선은 TLCV 상보적 감지 가닥을 나타낸다. R=리보자임.

Claims (38)

  1. 하이브리드 형성 영역과 촉매 영역을 포함하는 리보자임에 있어서, 하이브리드 형성 영역은 식물 세포를 감염시킬 수 있는 DNA 바이러스에 관련된 DNA 분자로부터 전사된 목표 RNA의 최소한 일부와 하이브리드를 형성할 수 있으며, 촉매 영역은 상기 목표 mRNA 서열을 절단함으로써 상기 DNA 바이러스의 복제, 감염 및/또는 조립을 실질적으로 감소시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 리보자임.
  2. 제1항에 있어서, 식물 DNA 바이러스가 단일 가닥 DNA 바이러스인 것을 특징으로 하는 리보자임.
  3. 제2항에 있어서, 단일 가닥 DNA 바이러스가 게미니바이러스인 것을 특징으로 하는 리보자임.
  4. 제3항에 있어서, 게미니바이러스가 마이제 스트레아크 바이러스(Maize Streak Virus, MSV), 콩 골든 모자이크 바이러스(Bean Golden Mosaic Virus, BGMV), 아프리칸 카싸바 모자이크 바이러스(African Cassava Mosaic Virus, ACMV), 클로리스 스트리아테 모자이크 바이러스(Chloris Striate Mosaic Virus,CSMV), 토마토 황색 리프 컬 바이러스(Tomato Yellow Leaf Curl Virus, TYLCV), 토마토 골든 모자이크 바이러스(Tomato Colden Mosaic Virus, TGMV), 토마토 리프 컬 바이러스(Tomata Leaf Curl Virus, TLCV) 및 비트 컬리 톱 바이러스(Beet Curly Top Virus, BCTV)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 리보자임.
  5. 제4항에 있어서, 게미니바이러스가 토마토 리프 컬 바이러스(TLCV), 토마토 황색 리프 컬 바이러스(TYLCV), 또는 그의 돌연변이체, 유도체 또는 변이체인 것을 특징으로 하는 리보자임.
  6. 하이브리드 형성 영역과 촉매 영역을 포함하는 리보자임에 있어서, 하이브리드 형성 영역은 게미니바이러스의 비리온-감지 DNA 분자 또는 상기 비리온-감지 DNA 분자에 상보적인 DNA 분자로부터 전사된 목표 mRNA 서열의 최소한 일부와 하이브리드를 형성할 수 있으며, 촉매 영역은 상기 목표 mRNA 서열을 절단함으로써 상기 게미니바이러스의 복제를 실질적으로 감소시킬 수 있음을 특징으로 하는 리보자임.
  7. 제6항에 있어서, mRNA 전사체는 바이러스에 의해 지향된 다른 mRNA 전사체에 비하여 빈도수가 낮은 것을 특징으로 하는 리보자임.
  8. 제7항에 있어서, mRNA 전사체는 C1, L1, AL1, AC1, 또는 게미니바이러스 유전자의 본제에 수반되는 다른 유전자로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 리보자임.
  9. 제8항에 있어서, C1 유전자가 상기 게미니바이러스의 상보적-감지 DNA 가닥에 의해 특정되는 것을 특징으로 하는 리보자임.
  10. 제9항에 있어서, 게미니바이러스가 마이제 스트레아크 바이러스(Maize Streak Virus, MSV), 콩 골드 모자이크 바이러스(Bean Golden Mosic Virus, BGMV), 아프리칸 카싸바 모자이크 바이러스(African Cassava Mosaic Virus, ACMV), 클로리스 스트리아테 모자이크 바이러스(Chloris Striate Mosaic Virus,CSMV), 토마토 황색 리프 컬 바이러스(Tomato Yellow Leaf Curl Virus, TYLCV), 토마토 골든 모자이크 바이러스(Tomato Colden Mosaic Virus, TGMV), 토마토 리프 컬 바이러스(Tomata Leaf Curl Virus, TLCV) 및 비트 컬리 톱 바이러스(Beet Curly Top Virus, BCTV)로 구성된 군에서 바람직하게는 TLCV, TYLCV 또는 그의 돌연변이체, 유도체 또는 변이체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 리보자임.
  11. 제10항에 있어서, 상기 리보자임의 하이브리드 형성 영역은 서열 X UY(식중, X는 임의의 리보뉴클레오티드, U는 우라실 및 Y는 아데닌, 시토신 또는 우라실이다)의 옆에 위치한 리보뉴클레오티드 서열에 하이브리드 형성될 수 있고, 상기 하이브리드 형성 영역은 제1도에 도시된 바와 같은 서열 또는 그 일부와 실질적으로 일치되는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 리보자임.
  12. 제11항에 있어서,
    으로 구성된 군에서 선택된 리보자임.
  13. 내부리보핵산 가스분해효소 활성을 갖으며 DNA 바이러스의 복제, 감염 또는 조립을 저해할 수 있는 핵산 화합물에 있어서, 하기 식의 "R"을 최소한 한 단위 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 화합물.
    5′ 〔X-Y-X′〕 3'
    (식중, -X와 X′은 각각 독립적으로 적어도 네 개의 염기를 갖으며, 바이러스 게놈 또는 DNA 바이러스의 (-) 감지 RNA 전사체의 최소한 일부와 상보적인 뉴클레오티드 서열을 나타내고; -Y는 리보자임의 촉매 영역을 나타낸다.)
  14. 제13항에 있어서, 하나의 "R"단위만을 함유하고 하기 일반식을 갖는 핵산 화합물.
    〔X-Y-X′〕
    (식중, X, X′ 및 Y는 상기 정의한 바와 같다.)
  15. 제13항에 있어서, 복수의 "R"단위를 함유하며, 하기 일반식으로 표시되는 핵산 화합물.
    R₁-R₂------R
    (식중, R은 상기 정의와 같고 n>1이다.)
  16. 제14 또는 15항에 있어서, 임의의 하나의 "R"단위 내의 X 및 X′ 서열이 DNA 바이러스 게놈 또는 (-)감지 RNA 전사체의 인접한 부위에 상보적인 것을 특징으로 하는 핵산 화합물.
  17. 제15또는 16항에 있어서, 주어진 "R"단위의 3′X′ 서열 및 "R" 단위에 인접한 5′X 서열을 DNA 게놈 또는 (-)감지 RNA 전사체에 인접한 서열에 상보적인 것을 특징으로 하는 핵산 화합물.
  18. 제14 또는 15항에 있어서, 임의의 하나의 "R"단위 내의 X및 X′ 서열이 게놈 또는 (-) 감지 RNA 전사체의 비인접 부분에 상보적인 것을 특징으로 하는 핵산 화합물.
  19. 제15항에 있어서, 주어진 "R"단위의 3′X′ 서열 및 인접한 "R"단위의 5′X 서열이 게놈 또는 (-)감지 RNA 전사체의 비인접 부분에 상보적인 것을 특징으로 하는 핵산 화합물.
  20. 제13 내지 19항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 4개의 염기를 가지고 바이러스 게놈 또는 (-) 감지 RNA 전사체에 비상보적인 서열 "A"가 2개의 연속되는 "R"단위 사이에 포함되는 것을 특징으로 하는 핵산 화합물.
  21. 제20항에 있어서, 비상보적 서열 "A"가 폴리링커 또는 스페이서(spacer)인 것을 특징으로 하는 핵산 화합물.
  22. 제15내지 21항 중 어느 한 항에 있어서, 게놈 또는 적어도 2개의 상이한 유형의 (-) 감지 전사체 또는 DNA 바이러스 분리균에 대하여 상보적인 X및 X′ 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 화합물.
  23. 제15 내지 21하 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 "R"단위는, DNA 바이러스 사이, 예를 들면 동일 유형의 DNA 바이러스 사이에 있는 고도로 보존된 영역에 상보적인 X 및 X′ 서열을 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 핵산 화합물.
  24. 앞선 항 중 어느 한 항에 있어서, 리보자임 촉매 영역 "Y"가 헤머헤드 촉매 영역인 것을 특징으로 하는 핵산 화합물.
  25. 하기 식(Ⅰ)으로 표시되는 리보자임 :
    식중, (X) 및 (X)n'은 DNA 바이러스의 mRNA 서열에 실질적으로 상보적인 리보뉴클레오티드를 나타내고; n과 n′의 합은 동일 또는 상이할 수 있으며; (*)는 상보적인 리보뉴클레오티드 사이의 염기쌍을 나타내고; Y는 도일 또는 상이한 임의의 리보뉴클레오티드이며; Y′ 및 Y″는 올리고리보뉴클레오티드 사이에 염기 짝지움이 가능하도록 그 길이의 적어도 일부를 따라 존재하는 상보적 서열의 리보뉴클레오티드를 나타내거나, Y′ 및 Y″은 함께, 적어도 일부의 서열이 상보적 뉴클레오티드 사이의 염기 짝지움에 의해 형성된 자루(stem)를 포함하는 단일 RNA 서열을 형성하고; 임의로 A, G, C 또는 U의 어느 하나에서 선택된 추가의 뉴클레오티드가 A 뒤에 삽입된다.
  26. 제25항에 있어서, 하기 식(Ⅱ)으로 표시되는 리보자임.
    식중, (X)n및 (X)n'은 DNA 바이러스, 특히 TLCV 또는 TYLCV 같은 게미니바이러스의 mRNA에 실질적으로 상보적인 리보뉴클레오티드 서열을 나타내고; Y는 동일 또는 상이한 임의의 리보뉴클레오티드이며; (*)는 상보적 리보뉴클레오티드 사이의 염기쌍을 나타내고; n 및 n′은 상기 정의한 바와 같으며, B는 결합, 염기상, 리보뉴클레오티드, 또는 적어도 2개의 리보뉴클레오티드를 함유하는 올리고리보뉴클레오티드를 나타내고; m과 m′는 1 이상이고 동일 또는 상이할 수 있으며, 임의로 A, G, C 또는 U에 어느 하나에서 선택된 추가의 뉴클레오티드가 A 뒤에 삽입된다
  27. 제26항에 있어서, 하기 식(Ⅲ)으로 표시되는 리보자임.
    식중, (X) 및 (X) 은 DNA 바이러스, 특히 TLCV 또는 TLCV 같은 게미니바이러스의 mRNA에 실질적으로 상보적인 리보뉴클레오티드 서열을 나타내고; Y는 동일 또는 상이한 임의의 리보뉴클레오티드를 나타내며; (*)는 상보적 리보뉴클레오티드 사이의 염기쌍을 나타내고; n 및 n′은 상기 정의한 바와 같다.
  28. 제27항에 있어서,
    로 구성된 군에서 선택되는 리보자임.
  29. 제 1, 6, 13, 25 및 28항 중 어느 한 항에 따른 리보자임의 상보적 서열과 벡터 서열을 함유하는 유전자 구조.
  30. 제29항에 있어서, 상기 상보적 리보자임 서열에 작동가능하게 결합되어 있는 프로모터를 더 함유하는 것을 특징으로 하는 유전자 구조.
  31. pRIBO5BIN, pRIB05BINDel, pRIBO7BIN, pRIBO2BIN, pGAZE-RzA, pGAZE-polyRzC, pGAZE-polyRzD, pGAZE-polyRzE, pGAZE-polyRzF, pGA492-RzA 및 pGA492polyRzC로 구성된 군에서 선택된 유전자 서열.
  32. 제 1, 6, 13, 25 및 28항 중 어느 한 항에 따르는 리보자임을 발현하는, 식물 DNA 바이러스의 복제, 감염 및/또는 조립을 감소시킬 수 있는 세포를 포함하는 전이유전 식물.
  33. 제32항에 있어서, 상기 식물 DNA 바이러스가 단일 가닥 DNA 바이러스인 것을 특징으로 하는 전이유전 식물.
  34. 제33항에 있어서, 상기 단일 가닥 DNA 바이러스가 게미니바이러스인 것을 특징으로 하는 전이유전 식물.
  35. 제34항에 있어서, 상기 게미니바이러스가 TLCV 도는 TYLCV인 것을 특징으로 하는 전이유전 식물.
  36. 제35항에 있어서, 발현된 리보자임이 RIBO5, RIBO5Del, RIBO7, RIBO2, RzA, polyRzC, polyRzD, polyRzE, polyRzF로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 전이유전 식물.
  37. 제3 내지 36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물이 토마토 식물인 것을 특징으로 하는 전이유전 식물.
  38. 제 1, 6, 13, 25 및 28항 중 어느 한 항에 따른 리보자임을, 예를 들면 리보자임을 인코딩하는 DNA 서열에 의해 식물의 일부를 안정하 유전자 형질변환시킨 후 전이유전 식물을 번식시킴으로써 식물에 도입하여, 식물에 DNA 바이러스 저항성을 부여하는 방법.
    ※ 참고사항 : 최초출원 내용에 의하여 공개하는 것임.
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