CN105586385A - 一种磷脂酰乙醇胺n-甲基转移酶酶活力检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶酶活力检测方法，该方法包括将含磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶的样本与S-腺苷-L-甲硫氨酸和甲基受体接触以形成S-腺苷-L-同型半胱氨酸和甲基受体的甲基化产物；通过将所述S-腺苷-L-同型半胱氨酸与S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶相接触以生成高半胱氨酸和腺苷，采用光度计评估所述腺苷的产生速率以检测所述样本中所述磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶的酶活力。该方法具有方便、快捷和高灵敏度的特点，便于推广应用。

Description

一种磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶酶活力检测方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，同时又属于临床诊断和检测领域。具体而言，本发明提供了一种测定磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶(PEMT，PhosphatidylethanolamineN-methyltransferase，EC2.1.1.17)酶活力的方法。
背景技术
胆碱是一种强有机碱，是卵磷脂的组成成分，也存在于神经鞘磷脂之中，是生命体所需要的一种营养物质，胆碱对肝脏和脑的结构和功能、脂肪代谢及胎儿发育具有重要作用。胆碱对脂肪有亲和力，可使脂肪以磷脂形式由肝脏通过血液输送出去，从而防止脂肪肝的形成，有效保护和治疗酒精引起的肝纤维化，具有抗肝脂肪过氧化的作用，从而减少酒精引起的肝细胞凋亡，调节肝细胞活性，降低肿瘤坏死因子的细胞毒性和增强白介素22保护肝细胞的作用，同时胆碱还具有保护肌肉组织避免损伤的作用。胆碱对胎儿的发育至关重要，它影响干细胞的增值和凋亡而改变脑的结构和功能，同样胆碱缺乏会增加患神经管缺陷的风险。
人类体内胆碱可以部分来自于磷脂酰胆碱，磷脂酰胆碱是所有真核细胞的细胞膜的基本组成成分。磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶(PEMT)是催化磷脂代谢途径中磷脂酰乙醇胺N-甲基化反应的一种催化酶，在哺乳动物中该酶能够将S-腺苷酰-L-甲硫氨酸的甲基基团转移给磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)的N端，通过两个磷脂酰乙醇胺的中间态物质磷脂酰N-单甲基乙醇胺(PME)和磷脂酰N,N-二甲基乙醇胺(PDE)，最终合成磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)。
PMET在肝外组织的活性极低，主要在正常的肝组织中表达，哺乳动物体内肝脏是唯一的具有显著PEMT酶活力的器官。PEMT具有两种类型，分别是PEMT1和PEMT2，其中PEMT1位于内质网的胞质一侧的表面，具有非常高的总PEMT活力，是肝脏中主要合成磷脂酰胆碱的酶。PEMT2分布于线粒体相关的膜部分，据研究发现，PEMT2负责肝细胞20％-40％磷脂酰胆碱的合成，已有的研究证明其基因表达与肝细胞的增值分裂呈负相关，增值快的细胞如肝癌细胞、再生肝组织中PEMT2的表达量很低，正常肝细胞中PEMT的表达和活性都较高，研究表明，PEMT基因敲除的小鼠患有脂肪肝，并且更易患化学诱导的肝癌。还有研究发现PEMT2的过表达可以抑制重组质粒转染大鼠肝癌CBRH-7919细胞的增值并诱导细胞的凋亡。
PEMT基因具有很高的多态性，目前已经鉴定出一百余个SNP，其中5465G→A和744G→C是已知的具有功能的SNP，能够影响蛋白的活性剂胆碱的需求及肌体的健康。非酒精性脂肪肝(nonalcoholicfattyliverdisease，NAFLD)是常见的慢性病之一，人群的发病率高达25％，NAFLD可能会发展为肝细胞坏死、纤维化甚至肝硬化。PEMT基因中5465G→A的结果是导致175位氨基酸由置换，从而引起部分编码PEMT活性缺失，这种基因多态性在NAFLD患者发生率相当于正常人的1.7倍，可以推断PEMT活性缺失与非酒精性脂肪肝的发病有直接的关系，因此推测人类非酒精性脂肪肝与PEMT基因多态性有关。744G→C位于该基因的启动子区，约有50个碱基位于雌激素反应元件区域内，744G→C可影响该基因的表达，通过雌激素介导的PEMT基因的感应从而增加女性对胆碱缺乏的敏感性，有研究显示744CC与GG相比增加了患乳腺癌的风险。
有研究显示帕金森病患者脑部额皮质的PEMT活力低于正常人，外源性增加PME和PDE后会显著增加脑部的甲基化水平，但在额皮质却没有得到任何修正，说明帕金森病与PEMT的功能有关，有文献报道PEMTV175M与中国人群的散发型阿尔茨海默病(Alzheimer'sDisease)相关。
还有研究显示，在小鼠体内缺少PEMT表达会导致高密度脂蛋白(highdensitylipoproteins，HDL)量的降低以及极低密度脂蛋白(verylowdensitylipoproteins，VLDL)和低密度脂蛋白(lowdensitylipoproteins，LDL)量的升高，VLDL以及LDL含量的升高是动脉粥样硬化发生的危险因素。由此可见PEMT表达和活性的降低有可能是人类动脉粥样硬化的诱导因素之一。
目前PEMT酶活力的检测方法是放射化学法，即通过检测以S-腺苷-L-(甲基-3H)-蛋氨酸为底物生成磷脂(phospholipids)所结合的[甲基-3H]的量，来测定PEMT的活性，这种放射法的前期处理较复杂，对技术要求较高且易造成污染，不利于推广使用。
发明内容
因此，基于上述已有技术的缺陷，为了解决现有磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶(PEMT，PhosphatidylethanolamineN-methyltransferase，EC2.1.1.17)的酶活力检测方法不易推广的问题，本发明的目的是提供一种快速、特异、准确可靠的PEMT酶活力检测方法。采用该方法可以在半自动或全自动的分析检测设备上使用，而且检测灵敏度高，特异性高，操作简便，因而可以得到切实的推广使用。
针对上述发明目的，本发明是通过下述技术方案实现的：
本发明提供一种磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶(PEMT)酶活力检测方法，所述方法包括：
(1)将含PEMT的样本与S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)和甲基受体接触以形成S-腺苷-L-同型半胱氨酸(SAH)和甲基受体的甲基化产物，
(2)通过将所述SAH与S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶(SAHase)相接触以生成高半胱氨酸(Hcy)和腺苷(Ado)，采用光度计评估所述Ado的产生速率以检测所述样本中PEMT的酶活力。
优选地，根据前述的PEMT酶活力检测方法，其中，所述甲基受体为磷脂酰乙醇胺类化合物。优选地，所述磷脂酰乙醇胺类化合物为磷脂酰乙醇胺(PE)或磷脂酰N-单甲基乙醇胺(PME)。最优选为磷脂酰乙醇胺。
更优选地，根据前述的PEMT酶活力检测方法，其中，所述方法包括：
(1)将所述含PEMT的样本、所述SAM和所述甲基受体混合并反应获得反应液1；
(2)向步骤(1)中的所述反应液1中加入所述SAHase并反应，获得反应液2；
(3)将步骤(2)中所述的反应液2离心获得上清液；
(4)采用光度计检测步骤(3)中所述的上清液的光吸收值，间接或直接地评估所述Ado的产生速率以检测所述样本中所述磷脂酰PEMT的酶活力。
再优选地，根据前述的PEMT酶活力检测方法，其中，所述方法包括：在步骤(1)过程和步骤(2)过程中加入缓冲液。优选地，所述缓冲液选自甘氨酸/氢氧化钠、柠檬酸/柠檬酸钠、磷酸氢盐/柠檬酸(盐)、磷酸盐、2-吗啉代乙磺酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、Tris-盐酸、硼酸-硼砂、巴比妥钠-盐酸缓冲液中的一种或多种。最优选为Tris-盐酸。
还优选地，根据前述的PEMT酶活力检测方法，其中，所述缓冲液为10～1000mmol/L，优选为25～100mmol/L，最优选为30mmol/L。所述甲基受体为0.002～10mmol/L，优选为0.05～0.5mmol/L，最优选为0.2mmol/L。所述S-腺苷-L-甲硫氨酸为0.02～2mmol/L，优选为0.05～0.5mmol/L，最优选为0.1mmol/L。及所述S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶为0.01～100KU/L，优选为0.1～50KU/L，最优选为10KU/L。
或还优选地，根据前述的PEMT酶活力检测方法，其中，步骤(1)中所述反应的条件为置于35℃环境中温浴60min。优选地，步骤(2)中所述反应的条件为置于30℃环境中温浴10min。更优选地，步骤(3)中所述离心为10,000g离心10分钟。
或还优选地，根据前述的PEMT酶活力检测方法，其中，所述方法还包括在步骤(1)前将所述含PEMT的样本进行前期处理，所述前期处理为所述含PEMT的样本与试剂混合，所述试剂为油酸、胆酸盐、Tween20、Brij35或牛磺胆酸钠。优选地，所述试剂在上述混合后，达到的体积百分浓度为0.05-1％。最优选为0.5％。
进一步优选地，根据前述的PEMT酶活力检测方法，其中，所述方法还包括，在所述前期处理后，将所述含PEMT的样本在冰上放置30min。
优选地，根据前述的PEMT酶活力检测方法，其中，所述SAM由三磷酸腺苷，甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸合成酶(EC2.5.1.6)组成的酶反应系统所生成。
优选地，根据前述的PEMT酶活力检测方法，其中，所述样本选自生物组织、体液和细胞中的一种或多种。优选地，所述生物组织选自肺、结肠、卵巢、胎盘、胰腺、胸腺、小肠、肾、脑和肝脏中的一种或多种，所述体液为血液。
()
具体地，本发明提供一种PEMT酶活力检测方法，其基本实施过程如下：
PEMT能够利用S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)作为甲基供体，将SAM的甲基转移到甲基受体上，生成甲基受体的甲基化产物，同时SAM转化为S-腺苷-L-同型半胱氨酸(SAH)，SAH在S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶(SAHase，EC3.3.1.1)的作用下产生腺苷(Ado)，产生的Ado的速率与SAM的减少速率成正比，评估所述Ado的产生速率可以检测PEMT的酶活力。所述甲基受体为磷脂酰乙醇胺类化合物，如磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰N-甲基乙醇胺(PME)，优选为磷脂酰乙醇胺。
可以直接评估所述Ado的产生速率。如Ado在紫外特定波长条件下具有特异性光吸收，评估所述Ado的生成速率可以间接评估SAM的减少速率，进而计算出待测样本中PEMT的酶活力。
本发明所述的PEMT酶活力检测方法，对样本进行前期处理可以显著增强样本的PEMT酶活性。进一步地，本发明所述的PEMT酶活力检测方法，对样本进行前期处理的试剂可以为油酸、胆酸盐、Tween20、Brij35、牛磺胆酸钠等。更进一步地，本发明所述的PEMT酶活力检测方法，对样本进行前期处理试剂的浓度最适范围0.05-1％。
本发明所述的PEMT酶活力检测方法的原理可以简化如图1。
适合用于本发明测定磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶酶活力方法的组合产品，其中，所述组合产品含有：S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)或生成S-腺苷-L-甲硫氨酸的酶反应系统，所述生成S-腺苷-L-甲硫氨酸的酶反应系统包括三磷酸腺苷，甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸合成酶；甲基受体；S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶(SAHase)。优选地，所述组合产品为试剂盒形式，其中各包含成分为各自存在的试剂状态。
优选地，根据前述的检测PEMT酶活力的组合产品，其中，所述甲基受体为磷脂酰乙醇胺类化合物。优选地，所述磷脂酰乙醇胺类化合物为磷脂酰乙醇胺(PE)或磷脂酰N-单甲基乙醇胺(PME)。最优选为磷脂酰乙醇胺。
更优选地，根据前述的检测PEMT酶活力的组合产品，其中，所述组合产品还包括缓冲液。所述缓冲液是被物理、化学和酶学上普遍接受的能将体系的pH值缓冲或稳定6.5～10.0的范围中的试剂，它的存在可以有效的稳定磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶的催化反应的pH值，并可以稳定磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶的物化性质，从而利于磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶的酶活力的分析和检测。它包括以下实例但不限于这些实例：
甘氨酸-氢氧化钠：pH8.6～10.6
柠檬酸/柠檬酸钠：pH3.0～6.6
磷酸氢盐/柠檬酸(盐)：pH2.2～8.0
磷酸盐：pH4.9～8.2
2-吗啉代乙磺酸缓冲液(MES)：pH5.5～6.7
3-吗啉丙磺酸缓冲液(MOPS)：pH6.5～7.9
4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)：pH6.8～8.2
Tris-盐酸：pH7.1～8.9
硼酸-硼砂缓冲液：pH7.4～9.0
巴比妥钠-盐酸缓冲液：pH6.8～9.6
最优选地，所述缓冲液为Tris-盐酸。
再优选地，根据前述的检测PEMT酶活力的组合产品，其中，所述组合产品包括：所述组合产品pH范围为6.5～10.0，优选为7.5～8.9，最优选为8.5；所述组合产品含有所述缓冲液为10～1000mmol/L，优选为25～100mmol/L，最优选为30mmol/L；所述甲基受体为0.002～10mmol/L，优选为0.05～0.5mmol/L，最优选为0.2mmol/L；所述S-腺苷-L-甲硫氨酸为0.02～2mmol/L，优选为0.05～0.5mmol/L，最优选为0.1mmol/L；及所述S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶为0.01～100KU/L，优选为0.1～50KU/L，最优选为10KU/L。
优选地，根据根据前述的检测PEMT酶活力的组合产品，其中，所述组合产品还含有试剂，所述试剂为油酸、胆酸盐、Tween20、Brij35或牛磺胆酸钠。优选地，所述试剂的体积百分浓度为0.05-1％。最优选为0.5％。
更优选地，根据根据前述的检测PEMT酶活力的组合产品，其中，所述组合产品为干粉或液体。
再优选地，根据根据前述的检测PEMT酶活力的组合产品，其中，所述组合产品为双剂试剂或三剂试剂。
具体地，根据前述的检测PEMT酶活力的组合产品，其中，所述组合产品包括：
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是双剂还是三剂，如下成分关系较为理想。
因此，优选地，根据前述的检测PEMT酶活力的组合产品，其中，所述组合产品包括：
最优选地，根据前述的检测PEMT酶活力的组合产品，其中，所述组合产品pH为8.5，所述组合产品含有所述缓冲液30mmol/L，所述甲基受体0.2mmol/L，所述SAM0.1mmol/L，所述S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶10KU/L。优选地，所述缓冲液为Tris-盐酸缓冲液，所述甲基受体为磷脂酰乙醇胺。
优选地，根据前述的检测PEMT酶活力的组合产品，其中，所述组合产品可以配成如下双剂试剂：
试剂1
缓冲液、SAM
试剂2
缓冲液、甲基受体、S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶
试剂可以是制成干粉，溶解后使用；或是配成液体试剂，可以直接使用。
也可以将上述双剂试剂配成如下三剂试剂：
试剂1
缓冲液、SAM
试剂2
缓冲液、甲基受体
试剂3
缓冲液、S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶
试剂可以是制成干粉，溶解后使用；或是配成液体试剂，可以直接使用。
本发明还提供了前述检测磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶酶活力的组合产品在制备用于分析样本中磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶的酶活力的产品或器械中的应用。优选地，所述样本选自生物组织、体液和细胞中的一种或多种。更优选地，所述生物组织选自肺、结肠、卵巢、胎盘、胰腺、胸腺、小肠、肾、脑和肝脏中的一种或多种，所述体液为血液。
本发明还提供了前述检测磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶酶活力的组合产品在制备用于分析、检测或诊断待测样本中的磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶的酶活力异常导致的疾病的产品中的应用，所述疾病优选为由磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶的酶活力异常导致的遗传和代谢疾病。或在制备用于临床检测或诊断与磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶的酶活力相关疾病的产品中的应用。
本发明还提供了前述检测磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶酶活力的组合产品制备用于指导与磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶的酶活力相关药物使用的产品中的应用。
本发明所述的PEMT酶活力检测方法可以用于分析、检测和诊断待测样本中的磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶的酶活力异常导致的各种疾病，特别是由磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶的酶活力异常导致的各种遗传和代谢疾病。从而可以广泛应用到临床检测或诊断与磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶的酶活力相关的疾病；而且这种磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶酶活力检测方法和试剂还可用于指导与磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶的酶活力相关的药物使用。本发明所述的PEMT酶活力检测方法中，所述底物S-腺苷-L-甲硫氨酸可以是已经合成好的化合物；此外，还可以由三磷酸腺苷，甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸合成酶(EC2.5.1.6)组成的酶反应系统所生成。
本发明所述的PEMT酶活力检测方法中，所述的S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶(EC3.3.1.1)可以是各种物种来源的，它包括但不限于是天然提取的，或者是重组表达的，或是经过改造或修饰的酶，只要它具有催化S-腺苷-L-同型半胱氨酸(SAH)水解产生腺苷的功能，均是本发明所涵盖的范畴。
本发明所述的PEMT酶活力检测方法中，所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶(EC2.5.1.6)可以是各种物种来源，它包括但不限于是天然提取的，或者是重组表达的，或是经过改造或修饰的酶，只要它具有催化三磷酸腺苷和甲硫氨酸反应生成S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)的功能，均是本发明所涵盖的范畴。
本发明所述的PEMT酶活力检测方法具有但不限于以下有益效果：
(1)与现有技术放射化学法相比，本发明的PEMT酶活力检测方法前期处理简单，对技术要求不高且不易造成污染。
(2)基于实施例中的酶活力测定可知，本发明的PEMT酶活力检测方法是一种准确稳定的检测方法，可以通过一般的光谱检测设备检测得出所需的测定结果，并且灵敏度高，精确度好，特异性高，不受内外源物质的污染和干扰，便于推广应用于磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶酶活力的分析和检测。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1示出了本发明所述的PEMT酶活力检测方法的原理。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
以下实施例中，除具体指明的试验材料、条件以及操作方法外，实例中所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的。因此，本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
以下PE、SAM、S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶均购自SIGMA-ALDRICH，使用检测设备为752型紫外可见分光光度计。
实施例1：鼠肝组织内质网的粗提取
称取已剪除脂肪组织的鼠肝组织20g，加入200mL的0.25M(内含0.01M，pH8磷酸缓冲液)的蔗糖溶液，用玻璃匀浆器匀浆20次，Sigma3-30K离心机以2600-2800rpm离心10分钟，用四层纱布过滤后，弃沉淀。上清以15000rpm离心30分钟，所得沉淀即为含内质网的部分，悬浮于0.25M(内含0.01M，pH8.0磷酸缓冲液)的蔗糖溶液中，内质网可在-80℃条件下保存。
实施例2：鼠肝内质网磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶酶活力测定(进行前期处理)
本实施例的PEMT检测试剂为三剂试剂，包括
试剂1
Tris-盐酸缓冲液(pH8.5)30mmol/L
SAM0.1mmol/L
试剂2
Tris-盐酸缓冲液(pH8.5)30mmol/L
PE0.2mmol/L
试剂3
磷酸钾缓冲液(pH8.0)30mmol/L
S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶10KU/L
被测PEMT的样品为提取的鼠肝组织内质网，经破碎处理后，向样本中加入胆酸钠溶液，使终体积百分浓度达到0.5％，轻轻混匀后，冰上放置30min待用。反应体系中总蛋白用量为10ug，反应体系为250ul。共制作5份平行样本，本检测方法采用终点法检测PEMT酶活力。
检测方法：
对照：将试剂1与2与经过灭活处理的样本混合后置于35℃环境中温浴60分钟，然后加入试剂3置于30℃环境中温浴10分钟，之后终止反应，终止后的混合液经10,000g离心10分钟后取上清加入到分光光度计中，在260nm条件下检测产物的光吸收值，记为A0。
样品：将试剂1与2与样本混合后置于35℃环境中温浴60分钟，然后加入试剂3置于30℃环境中温浴10分钟，之后终止反应，终止后的混合液经10,000g离心10分钟后取上清加入到分光光度计中，在260nm条件下检测产物的光吸收值，记为A1。
PEMT的活力吸光值ΔA＝A1－A0。
酶活力单位为：每小时每毫克蛋白转化底物的纳摩尔数，用nmol/h/mg蛋白表示。
实验结果A0值为0.476±0.006，A1值为1.109±0.032，ΔA均值为0.632，转化成酶活力均值为369.70nmol/h/mg蛋白，由此可见本发明的检测磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶酶活力的方法和试剂可以有效检测出样本中的磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶酶活力且测定稳定。
实施例3：鼠肝内质网磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶酶活力测定(对样本进行前期处 理比较)
本实施例的磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶检测试剂为三剂试剂，包括
试剂1
Tris-盐酸缓冲液(pH8.5)30mmol/L
SAM0.1mmol/L
试剂2
Tris-盐酸缓冲液(pH8.5)30mmol/L
PE0.2mmol/L
试剂3
磷酸钾缓冲液(pH8.0)30mmol/L
S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶10KU/L
被测磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶的样品为提取的鼠肝组织内质网，经破碎处理后，均分成两份，其中一份向样本中加入胆酸钠溶液，使终浓度达到0.5％，轻轻混匀后，冰上放置30min；另一份加入等量的样本悬浮液，轻轻混匀后冰上放置30min，反应体系中总蛋白用量为10ug，反应体系为250ul。本检测方法采用终点法检测磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶酶活力。
检测方法：与实施例2中检测方法相同。
实验结果比较：
前期处理后的磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶酶活力为341.65nmol/h/mg蛋白，未经前期处理的磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶酶活力为215.07nmol/h/mg蛋白，由此可见使用本发明中的试剂对样本进行前期处理能够明显提高样本中磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶酶活力，进而提高所述检测磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶酶活力的方法的灵敏度。本发明的检测磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶酶活力的方法和试剂可以有效检测出样本中的磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶酶活力且测定稳定。
尽管在此，已对本发明进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明精神和范围的条件下，所属领域技术人员可进行各个条件的适当变化。可以理解的是，本发明不限于所述实施方案概括和具体实例，其权利归于权利要求的范围，并包括所述每个因素的等同替换。

Claims (10)

1.一种磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶酶活力检测方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)将含磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶的样本与S-腺苷-L-甲硫氨酸和甲基受体接触以形成S-腺苷-L-同型半胱氨酸和甲基受体的甲基化产物，
(2)通过将所述S-腺苷-L-同型半胱氨酸与S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶相接触以生成高半胱氨酸和腺苷，采用光度计评估所述腺苷的产生速率以检测所述样本中磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶的酶活力。
2.根据权利要求1所述的磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶酶活力检测方法，其特征在于，所述甲基受体为磷脂酰乙醇胺类化合物；优选地，所述磷脂酰乙醇胺类化合物为磷脂酰乙醇胺或磷脂酰N-单甲基乙醇胺；最优选为磷脂酰乙醇胺。
3.根据权利要求2所述的磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶酶活力检测方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)将所述样本、所述S-腺苷-L-甲硫氨酸和所述甲基受体混合并反应获得反应液1；
(2)向步骤(1)中的所述反应液1中加入所述S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶并反应，获得反应液2；
(3)将步骤(2)中所述的反应液2离心获得上清液；
(4)采用光度计检测步骤(3)中所述的上清液的光吸收值，间接或直接地评估所述腺苷的产生速率以检测所述样本中所述磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶的酶活力。
4.根据权利要求3所述的磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶酶活力检测方法，其特征在于，所述方法包括：在步骤(1)过程和步骤(2)过程中加入缓冲液；优选地，所述缓冲液选自甘氨酸/氢氧化钠、柠檬酸/柠檬酸钠、磷酸氢盐/柠檬酸(盐)、磷酸盐、2-吗啉代乙磺酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、Tris-盐酸、硼酸-硼砂、巴比妥钠-盐酸缓冲液中的一种或多种；最优选为Tris-盐酸。
5.根据权利要求4所述的磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶酶活力检测方法，其特征在于：
所述缓冲液为10～1000mmol/L，优选为25～100mmol/L，最优选为30mmol/L；
所述甲基受体为0.002～10mmol/L，优选为0.05～0.5mmol/L，最优选为0.2mmol/L；
所述S-腺苷-L-甲硫氨酸为0.02～2mmol/L，优选为0.05～0.5mmol/L，最优选为0.1mmol/L；及
所述S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶为0.01～100KU/L，优选为0.1～50KU/L，最优选为10KU/L。
6.根据权利要求4所述的磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶酶活力检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述反应的条件为置于35℃环境中温浴60min；优选地，步骤(2)中所述反应的条件为置于30℃环境中温浴10min；更优选地，步骤(3)中所述离心为10,000g离心10分钟。
7.根据权利要求4所述的磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶酶活力检测方法，其特征在于，所述方法还包括在步骤(1)前将所述样本进行前期处理，所述前期处理为所述样本与试剂混合，所述试剂为油酸、胆酸盐、Tween20、Brij35或牛磺胆酸钠；优选地，所述试剂在上述混合后，达到的体积百分浓度为0.05-1％；最优选为0.5％。
8.根据权利要求7所述的磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶酶活力检测方法，其特征在于，在所述前期处理后，将所述样本在冰上放置30min。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶酶活力检测方法，其特征在于，所述S-腺苷-L-甲硫氨酸由三磷酸腺苷，甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸合成酶组成的酶反应系统所生成。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶酶活力检测方法，其特征在于，所述样本选自生物组织、体液和细胞中的一种或多种；优选地，所述生物组织选自肺、结肠、卵巢、胎盘、胰腺、胸腺、小肠、肾、脑和肝脏中的一种或多种，所述体液为血液。
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