CN101659965B - 一种培育叶夹角改变的转基因水稻的方法及其专用重组载体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种培育叶夹角改变的转基因水稻的方法及其专用重组载体。本发明提供的重组载体，是含有OsBAK1-1基因片段的重组载体，所述OsBAK1-1基因片段是将序列表中序列1所示的基因用KpnI和SacI双酶切得到的基因片段。将该重组载体导入水稻，得到转基因水稻，该转基因的水稻叶直立，可以提高单产。

Description

一种培育叶夹角改变的转基因水稻的方法及其专用重组载体

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种培育叶夹角改变的转基因水稻的方法及其专用重组载体。

背景技术

理想的株型是水稻提高产量的决定因素。在水稻的理想株型中，半矮化和叶片直立是两个对增产非常有利的性状(Wang Y and Li J，.2008，Annu.Rev.PlantBiol.，59：253-279)。绿色革命就是通过改良水稻株型提高水稻产量的成功例证。近年的一些研究表明叶片直立也是成就水稻高产株型的目标之一。叶片直立可提高冠层光合速率，改善群体下部光照，增加物质生产量；同时增加冠层基部光量，增强根系活力，提高抗倒性；且利于密植，提高单位土地面积上的净光合速率。研究表明油菜素内酯(BRs)影响着水稻的许多重要农艺性状，如株高、叶片角度、分蘖角度、种子形态等(Yamamuro C et al.，2000 Plant Cell 12：1591-1605；HongZ et al.，2005，Plant Cell 17：2243-2254；Tanabe S et al.，2005，Plant Cell17：776-790；Wang et al.，2008，PLoS ONE 3：e3521)。尤其是最近对BRs突变体的研究表明通过密植具有直立叶片的水稻品种可以达到增产的目的(Morinaka Yet al.，2006，Plant Physiol 141：924-931；Sakamoto T et al.，2006，NatBiotechnol 24：105-109)，所以人们推测水稻BRs信号途径的关键基因或BRs合成途径的关键酶是改良水稻株型的潜在分子工具。

一个成功的例子是通过突变OsDWARF4基因，它编码水稻BRs合成途径的关键酶，获得了叶片直立而育性正常的水稻品种，密植这种水稻品种可以提高水稻产量(Sakamoto et al.，2006)。这使人们对通过调控BRs途径关键基因，改良水稻株型、提高水稻产量的策略信心倍增。迄今为止，人们分离到的水稻BRs信号途径的关键基因有OsBRI1，OsBZR1和OsBIN2，其中人们对OsBRI1的突变体在水稻增产方面的应用进行了详细的研究。研究表明由于OsBRI1是水稻的BRs受体，它在水稻BRs信号途径的核心作用使得它突变后很难找到弱突变体。人们在筛选了100多个突变体后，找到了OsBRI1的弱突变体d61-7，虽然该突变体密植可以增加水稻的生物量，但因为d61-7结小种子所以并没有带来产量的增加。

反义RNA技术是一个已经发展比较成熟的研究基因功能的技术。它是将基因以反向的方式插入到特定的启动子下游，使其表达产物与内源的mRNA反向互补，从而可以与内源mRNA相结合，抑制内源基因的翻译成蛋白质。采用反义RNA技术可以使我们了解在该基因的表达被抑制的情况下，水稻的生长、发育和株型建成以及产量等性状。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组载体。

本发明提供的重组载体是含有反向的OsBAK1-1基因片段的重组载体，所述OsBAK1-1基因片段是将序列表中序列1所示的基因用KpnI和SacI双酶切得到的基因片段。

上述重组载体是将DNA片段A导入骨架质粒中得到的重组载体；所述骨架质粒是pCAMBIA1301；所述DNA片段A是含有反向的OsBAK1-1基因的DNA片段。

上述DNA片段A自上游至下游依次包括UbiPro、反向的OsBAK1-1基因片段和Noster。

上述重组载体是将OsBAK1-1基因片段反向插入质粒pUN1301的多克隆位点中，得到的重组载体；所述OsBAK1-1基因片段是将序列表中序列1所示的基因用KpnI和SacI双酶切得到的基因片段；

所述质粒pUN1301是用包含UbiPro和Noster的片段插入质粒pCAMBIA1301中，得到的重组质粒；

所述包含UbiPro和Noster的片段是用EcoR I和HindIII载体pUN19，得到的2.3kb的片段；

所述pUN19是将UbiPro插入质粒pUC19-Noster中，得到的载体；

所述质粒pUC19-Noster是将Noster poly A终止序列插入pUC19，得到的重组质粒；

所述Noster poly A终止序列是用Sac I和EcoR I双酶切pBI221得到的序列。

含有上述的重组载体的重组菌也属于本发明的保护范围之内。

本发明的另一目的在于提供一种培育叶夹角改变的转基因水稻的方法，是将OsBAK1基因或反向的OsBAK1-1基因片段导入目的水稻中，得到叶夹角改变的转基因水稻，所述OsBAK1基因是序列1的自5’端第1-2180位所示的DNA分子；所述OsBAK1-1基因片段是将序列表中序列1所示的基因用KpnI和SacI双酶切得到的基因片段。

上述反向的OsBAK1-1基因片段是通过上述的重组载体导入水稻中的；所述叶夹角改变的转基因水稻是与所述目的水稻相比，叶夹角变小的转基因水稻。

本发明的又一目的在于提供上述的方法在培育水稻新品种的应用。

上述水稻新品种是水稻单产提高的品种。

本发明通过将水稻中BRs途径的关键基因OsBAK1构建反义表达载体，得到转OsBAK1-AS(OsBAK1-antisense)的转基因水稻，植株不仅具有直立的叶片，而且育性和种子的百粒重与野生型无异。因此OsBAK1可以作为一种潜在的分子育种工具，通过调控水稻BRs信号传递改良水稻株型提高水稻产量。

附图说明

图1：反义表达载体物理图谱示意图。

图2：OsBAK1-AS转基因水稻的表型观察，其中A是成熟期的水稻成体植株和种子大小表型；B是转基因水稻的株高统计；C是抽穗期转基因水稻叶夹角相对角度的统计。

图3实时定量PCR结果，表示该基因在转基因材料中的表达水平，其中A是实时定量PCR检测OsBAK1-AS转基因水稻中内源OsBAK1的表达；B是实时定量PCR检测OsBAK1-AS转基因水稻中OsBAK1及其同源基因的表达。

图4：OsBAK1-AS转基因水稻根对BL处理的敏感性检测，其中A是1μM24-epiBL处理导致水稻主根抑制图片；B是柱形图显示1μM 24-epiBL处理后主根的相对长度；C是水稻主根对24-epiBL处理响应的生长曲线。

图5：OsBAK1-AS转基因水稻的叶夹角对BL处理的敏感性检测，其中A是1000ng/μl的24-epiBL处理导致水稻叶夹角增大图片；B是柱形图显示1000ng/μl的24-epiBL处理导致水稻叶夹角增大的数值；C是水稻叶夹角对24-epiBL处理响应的增长曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

本发明涉及的水稻叶夹角是指水稻叶片与水稻直立的茎秆的夹角。

实施例1、水稻叶夹角变小的转基因水稻的获得及其检测

一、水稻叶夹角变小的转基因水稻的获得

1、OsBAK1的cDNA的获得

1)水稻总RNA的提取

由于RNA易降解，有机溶剂必须是新购的，用DEPC处理的ddH₂O配制所需试剂。所用玻璃器皿全部在180℃烘箱中烘烤8h以上，操作时勤换一次性手套。

在液氮中研磨100mg材料，研碎后转入到含1ml Trizol试剂的1.5ml离心管中，充分混匀，室温放置5min；每管中加入0.2ml新鲜氯仿，剧烈振摇15sec，室温静置2-3min，≤12,000rpm(不低于10,000rpm)，4℃，离心15min；把上层无色水相转移到一个新的1.5ml离心管中，用0.6ml异丙醇沉淀RNA，室温放置10min，≤12,000rpm，4℃，离心10min；去上清，将RNA沉淀用1ml 75％乙醇清洗2次，超净台吹干(5min左右，注意不要完全干)；将沉淀溶于适量DEPC处理过的ddH₂O中，60℃温育10min，-70℃保存；将提取好的RNA样品(0.5-1μg)，用1/4倍的TAE buffer配置的琼脂糖胶，在200V电压下电泳5min，观察照相。测OD₂₆₀/₂₈₀值，以OD₂₆₀/₂₈₀大于1.9为宜，并确定RNA浓度。

2)RT-PCR获得OsBAK1的cDNA

A、反转录第一链cDNA的合成

参照SSII反转录酶(Invitrogen)说明书进行。

Total RNA(1μg/μl)         2μl

Oligo dT(0.5μg/μl)        1μl

dNTP Mixture(2.5mM)         4μl

RNase free Water            4μl

65℃变性5min，迅速冰浴待用。

加入各种反转录试剂混合：

5×reverse transcript buffer    4μl；

RNase Inhibitor                 0.5μl；

0.1M DTT                        2μl；

混匀，42℃温浴2min。

最后加入SSII反转录酶0.5μl，RNase free Water 2μl，补足反应体积到20μl；混匀后水浴，42℃50min；70℃15min。

B、PCR合成第二链：

人工合成一对引物如下：

正向引物：5’-TCCCCCGGGAGGGTGGTGCTGATTTGGTGT-3’；

反向引物：5’-GGGGTACCGTTCCTTGGGCTCCTGCTGTT-3’。

取第一链稀释10倍的产物1μl为模板，以上述的正向引物和反向引物为引物，按常规PCR程序进行PCR扩增。PCR扩增体系    (50μl)：

Pyrobest/PrimerStar enzyme(Takara)   0.5μl

2×Pyrobest/PrimerStar GCbuffer      25μl

dNTP Mixture(2.5mM)                  4μl

正向引物(20μM)                      1μl

反向引物(20μM)                      1μl

Template                             2μl

H₂O                                  16.5μl

PCR扩增程序：98℃2min；98℃10sec；58℃30sec；72℃1kb/min(通常一分钟该酶可合成1kb的DNA，根据扩增片断长度设定扩增时间)；36个循环后，72℃10min。

PCR扩增得到2180bp的片段，命名为OsBAK1，回收该片段连入载体pGEM-TEasy，得到重组质粒，命名为pTOsBAK1，将该重组质粒转化大肠杆菌DH5a(宝生物工程有限公司，大连)，以上述的正向引物和反向引物为引物PCR鉴定阳性克隆，扩增出2180bp左右片段的克隆为阳性克隆。提取阳性克隆的质粒，以该质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明OsBAK1的核苷酸序列如序列表中序列1的自5’端第1-2180位所示。

2、重组载体的构建

1)玉米泛素启动子(UbiPro)的获得

a、玉米基因组DNA的提取

剪取约0.2g 玉米幼苗，置于液氮中研磨；然后加入800μL新配制的提取缓冲液(含0.1M Tris-HCl pH8.0，50mM EDTA，0.5M NaCl，1％SDS和1％β-巯基乙醇)，剧烈振荡使其全部悬浮；65℃水浴30分钟，每5分钟颠倒混匀一次；然后加入250μL预冷的5M  酸钾，立即颠倒混匀，冰浴5分钟；加入等量酚/氯仿，抽提一次，12000rpm离心5分钟；收集上清，加入0.6倍体积的异丙醇沉淀DNA，室温放置40分钟；4℃12000rpm离心15分钟，弃上清；沉淀用70％、100％乙醇各洗一次；干燥后，溶于20μL含100μg/mL RNase的ddH₂O中，得到玉米基因组DNA。

b、PCR扩增玉米泛素启动子(UbiPro)

取2μL步骤1)获得的玉米基因组DNA溶液作为模板，在带有Hind III识别位点的5′引物(GGAAGCTTCTGCAGTGCAGCGTGACCCGG)和带有BamHI识别位点的3′引物(CGGGATCCAAGTAACACCAAACAACAGGG)的引导下进行PCR扩增，PCR反应条件为：先94℃3分钟；再94℃45秒，62℃45秒，72℃2分钟，共35个循环，最后72℃10分钟。反应结束后，对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，表明得到长度约为2kb的扩增片段，与预期结果相符，回收该目的片段，用限制性内切酶Hind III和BamH I双酶切后回收，得到带有粘性末端的玉米泛素启动子(UbiPro)，备用。

2)pUN1301载体的构建

用限制性内切酶Sac I和EcoR I将Noster poly A终止序列从质粒载体pBI 221(Clontech公司)上切下，连接到载体pUC19(TaKaRa公司)的相应位点中，得到重组载体，命名为pUC19-Noster。再用限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切pUC19-Noster，琼脂糖凝胶电泳检测后，回收线性化的载体大片段，并将该回收片段与步骤1获得的带有粘性末端的玉米泛素启动子(UbiPro)相连，得到重组载体，命名为pUN19。

用限制性内切酶EcoR I部分酶切和HindIII完全酶切从步骤2购建的重组载体pUN19切下包含UbiPro和Noster的长度约为2.3kb的片段，将该片段克隆入质粒载体pCAMBIA1301(Center for the Application of Molecular Biology toInternational Agriclture，www.cambia.org)多克隆位点的EcoR I和HindIII位点处，得到重组载体，命名为pUN1301。

3)反向表达载体pUNBAK1-AS的构建

对RT-PCR获得的OsBAK1片段用限制性内切酶KpnI和SacI进行双酶切，得到1800bp左右片段，命名为OsBAK1-1。电泳回收得到的片段。将pUN1301质粒同样用限制性内切酶KpnI和SacI进行双酶切，将上述1800bp的片段反向克隆到酶切过的pUN1301中，得到反向表达载体，命名为pUNBAK1-AS。其物理图谱如图1所示。

将pUNBAK1-AS转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有10μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养基筛选出所需重组子并进行测序分析，经过测序鉴定，证明含有反向的OsBAK1-1基因的pUNBAK1-AS的序列及结构正确，该重组质粒受UbiPro启动子控制。其中，pUNBAK1-AS与pCAMBIA1301的区别在于多了一个DNA片段，命名为DNA片段A。

3、水稻叶夹角变小的转基因水稻的获得

1)重组农杆菌的获得

参照电激仪(EasyJecT Plus电激仪，英国EquiBio有限公司)操作指南，将质粒pUNBAK1-AS通过电激法转入农杆菌EHA105(宝生物工程有限公司，大连)中，获得阳性克隆，备用转化水稻。

2)转基因水稻的获得

参照陈惠等的方法(植物学通报，2008，25：322-331)转化水稻。将携带质粒pUNBAK1-AS的农杆菌EHA105扩接种到20ml含Km 50mg/l的YEB液体培养基中28℃摇菌培养至对数生长晚期；再从中取0.5ml转接至50ml同样的YEB培养基中，同样条件下培养至OD600为0.5左右。将培养好的根癌农杆菌4000g离心10分钟后，沉淀用等体积的培养基重悬。侵染水稻中花10号(浙江国稻高科技种业有限公司，浙江省杭州市体育场路359号，邮编：310006)的愈伤组织，经共培养感染、抗性培养基筛选及分化培养基上分化得到潮霉素抗性的阳性苗。

待小苗长至10厘米左右时，打开容器封口膜，炼苗2-3天，然后将小苗移入人工气候室栽培。

炼苗同时，取潮霉素抗性的阳性苗的幼根切段2-3毫米进行GUS染色鉴定。GUS染色液组成为100mmol/L NaPO4 pH7.0，0.1％Triton X-100，10mmol/LEDTA，0.5mmol/L铁氰化钾，X-Gluc 1mg/mL)。37℃温育2小时，观察蓝色反应，进一步确定阳性转化体。能够出现蓝色反应的植株为外源基因已经可以表达的抗性苗。得到转pUNBAK1-AS的转基因水稻株系7个，我们随机挑选其中的两个株系AS-2和AS-3做进一步生理实验的检测。

二、检测分析

1、转基因水稻表型分析

以野生型水稻中花10号为正对照；以水稻BRs非敏感突变体d61-1(由Makoto Matsuoka教授(Nagoya University，BioScience Center，Chikusa，Nagoya 464-8601，Japan，email：j45751anucc.cc.nagoya-u.ac.jp，fax：81-52-789-5226)提供)为负对照。

将上述的两个转基因株系AS-2和AS-3、正对照和负对照在水稻生长季进行田间培养，进入成熟期后拍照并统计株型、叶片夹角和种子形态。

实验重复3次，结果如图2所示，其中A是成熟期的水稻成体植株和种子大小表型；B是转基因水稻的株高统计。P，穗长；I、II、III、IV分别表示穗下第1、2、3、4节间的长度；C是抽穗期转基因水稻叶夹角相对角度的统计。Flag leaf：剑叶；2nd leaf：剑叶下第二叶；3rd leaf：剑叶下第三叶。WT，中花10号，正对照；d61-1，水稻BRs非敏感突变体，负对照。统计数据为20株水稻的平均值。

转基因株系株型紧凑(图2A)，株高没有变化说明植株发育正常(图2B)，叶夹角变小(图2C)。种子形态指标统计结果如表1所示，转基因水稻的种子虽然长度变小但宽度增加，百粒重与野生型相比没有明显改变。

表1.转基因植株的种子形态指标

2、转基因水稻中OsBAK1基因的表达分析

1)水稻模板RNA的制备

参照实施例1中方法，提取GUS阳性苗和对照材料的总RNA，依以下体系去除RNA中可能混杂的基因组DNA：

1μl RNaSIN(40U/μl)

4μl DNase I(40U/μl)

2μl 10 X DNase I buffer

Xμl RNA(20μg)

Yμl H₂O到总反应体积为50μl。

(依据RNA浓度决定X，Y＝50-1-4-2-X)

将混合物置于37℃，20min后，用等体积的酚、氯仿抽提以去除RNA中的蛋白污染。乙醇过夜沉淀(2倍体积的无水乙醇，0.3M NaAc，pH 5.2)，12,000g，4℃，10min。70％乙醇洗涤3次，吹干沉淀后溶于RNase free水。用水稻一个带有内含子的内参基因ACTIN引物进行RT-PCR，确保模板RNA中没有基因组DNA污染。参照实施例1中方法，反转录合成第一链cDNA。

2)PCR体系

利用SYBR GREEN PCR试剂盒(TOYOBO)进行荧光PCR。首先将反转录产物稀释50倍，然后各取5μl样品进行检测(每个样品设置3次重复)。

以基因ACTIN为内参，引物如下：

上游引物：5’-CGT ATG AGC AAG GAG ATC AC-3’；

下游引物：5’-CAC ATC TGT TGG AAG GTG CT-3’。

检测OsBAK1表达所用引物如下：

上游引物：5’-GAG TTG ATC TTG GGA ATG CTG C-3’；

下游引物：5’-CAC TAG GTA TCG TTC CGC TTA TGT T-3’。

检测OsBAK1同源基因表达所用引物如下：

OsSERK2

上游引物：5’-CGG AGG GTG ATG CCC TAT-3’；

下游引物：5’-CAC GCT GTT GTC AGG GTT AC-3’。

OsSERK3

上游引物：5’-AAA TCT TGA AGT GCT GGA CTT G-3’；

下游引物：5’-GGT TAT TGG AGA AAC TGA TTG G-3’。

OsSERK4

上游引物：5’-TGT CCT GTC CTT GGC TGG T-3’；

下游引物：5’-GGC CAA GAG AAG CTG GTA TTT C-3’。

PCR混合物成分如下：

10μl 2X

GREEN Realtime PCR Master Mix

5μl cDNA template

0.3μl 上游引物(20μM)

0.3μl 下游引物(20μM)

4.4μl H₂O

反应终体积为20μl/个反应，先配置反应混合物，混匀分装后加入模板。操作要在冰上进行，使用进口PCR管，为防止触摸影响管壁的透光度，操作过程中需戴手套。

3)PCR程序及实验结果分析

按照

GREEN Realtime PCR Master Mix(TOYOBO)推荐程序进行PCR：①95℃，30sec；②95℃，5sec；55℃，10sec；72℃，15sec；45个循环。PCR反应及其检测分别使用SYBR Green Realtime Master mix和STAR TAGENE MX3000PTm system。

实时定量PCR结果如图3所示，在AS-2和AS-3两个转基因水稻株系中，内源OsBAK1的表达被抑制了50％以上(图3a)，并且OsBAK1的同源基因的表达也不同程度地受到抑制(图3b)。

3、转基因水稻对水稻油菜素内酯(BR)的敏感性检测

1)转基因水稻的根的生长受BR的抑制实验

将AS-2和AS-3两个转基因水稻株系和正对照中花10号、负对照d61-1水稻种子灭菌后在添加有25mg/L潮霉素的无菌水中30℃浸泡48h(筛选得到阳性转基因水稻苗)。挑选萌发一致的水稻种子接种在含有不同浓度24-epiBL(上海生工生物工程技术服务有限公司)(油菜素内酯的一种)的1/2MS培养基上。28℃无菌培养8天，测量幼苗主根长并拍照，所得数据用Excel软件进行统计分析。每组生理实验都被重复三次以上。

结果如图4所示。A是1μM 24-epiBL处理导致水稻主根抑制，每幅图左侧为未处理时的主根长，右侧为1μM 24-epiBL处理后的主根长；B是柱形图显示1μM24-epiBL处理后主根的相对长度，其中，主根的相对长度是指经24-epiBL处理后的主根长与未经24-epiBL处理(Control)的主根长的比例，而主根伸长抑制率＝100％-主根的相对长度；C是水稻主根对24-epiB处理响应的生长曲线。AS-2和AS-3是两个转基因水稻株系；WT是正对照中花10号；d61-1是负对照，即水稻BRs非敏感突变体；control是未经24-epiBL处理的对照。

在24-epiBL存在下，AS-2和AS-3两个转基因水稻株系和正对照中花10号、负对照d61-1水稻幼苗的主根生长受抑(图4A)。具体抑制结果如图4B所示，正对照中花10号的主根伸长被1μM 24-epiBL处理抑制了54％；负对照BRs非敏感突变体d61-1的主根伸长仅被抑制了20％；而AS-2和AS-3两个转基因水稻株系居于两者之间，主根伸长分别被抑制了44％和34％。这表明OsBAK1-AS转基因水稻的主根对BL处理的敏感性低于野生型。

本发明还统计OsBAK1-AS转基因水稻代表株系AS-2和正负对照水稻幼苗在不同浓度24-epiBL(0、0.01、0.0和1μM)处理条件下的主根长度，描绘生长曲线。实验结果显示中花10号的主根曲线变化明显，随BL浓度升高，主根变短。BRs非敏感突变体d61-1在不同浓度BL处理条件下主根的变化不明显，生长曲线平直。而AS-2转基因水稻株系主根生长曲线趋于平缓，接近于突变体d61-1，进一步表明0sBAK1-AS转基因水稻的主根对BL处理的敏感性降低。

2)叶夹角对BR的敏感性实验

将AS-2和AS-3两个转基因水稻株系和正对照中花10号、负对照d61-1水稻种子浸种萌发后，挑选萌发一致的水稻种子播种到花卉土中，在培养箱中28℃培养3天。用无水乙醇溶解24-epiBL，使其终浓度为10ng/μl、100ng/μl、500ng/μl和1000ng/μl，每种浓度的24-epiBL溶液中加入TritonX100，使其终浓度为0.1％。取1μl上述各浓度的24-epiBL溶液滴加在第二叶的叶枕处，继续培养3天，取处理的叶夹角照相，用Image J软件测量。用Excel软件进行统计分析。每个数据代表20株以上幼苗第二叶叶夹角的平均值，误差为SE。每组生理实验都被重复三次以上。

结果如图5所示，其中A是1000ng/μl的24-epiBL处理导致水稻叶夹角增大；B是柱形图显示1000ng/μl的24-epiBL处理导致水稻叶夹角增大的数值；C是水稻叶夹角对24-epiBL处理响应的增长曲线。AS-2和AS-3是两个转基因水稻株系；WT是正对照中花10号；d61-1是负对照，即水稻BRs非敏感突变体；control是未经24-epiBL处理的对照。

没有24-epiBL处理的水稻幼苗长到三叶期，第二叶包裹在叶鞘上并不展开，而24-epiBL处理后的同期水稻幼苗的第二叶被24-epiBL促进产生弯曲，叶夹角增大。用1000ng/μl的24-epiBL处理AS-2和AS-3两个转基因水稻株系和正对照中花10号、负对照d61-1水稻幼苗，对水稻幼苗第二叶叶夹角进行拍照，图片如图5a所示，野生型对照的叶夹角最大，负对照的叶夹角最小，AS-2和AS-3介于之间。具体结果如图5b所示，野生型中花10号的第二叶叶夹角达到了约93°；而BRs非敏感突变体d61-1的第二叶叶夹角仅为30°；AS-2和AS-3两个转基因水稻株系居于两者之间，第二叶叶夹角分别为55°和48°。实验结果说明转基因水稻的叶夹角对BL处理的敏感性低于野生型，接近于BRs非敏感突变体d61-1。AS-2转基因水稻和中花10号、d61-1水稻第二叶叶夹角在不同浓度BL处理后的结果如图5c所示，野生型中花10号的第二叶叶夹角随BL浓度的升高，增大明显；而BRs非敏感突变体d61-1的第二叶叶夹角变化很小，曲线平直；AS-2转基因水稻第二叶叶夹角变化曲线居于两者之间，更接近于突变体d61-1。与根的敏感性检测相似，叶夹角敏感性实验也表明OsBAK1-AS转基因水稻叶片夹角对BL处理是不敏感的。

序列表

<110>中国科学院植物研究所

<120>一种培育叶夹角改变的转基因水稻的方法及其专用重组载体

<130>CGGNARL92502

<160>1

<210>1

<211>2180

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>1

tcccccggga gggtggtgct gatttggtgt ggaggcgggg aaatgcgtga tgtgtgagat    60

ctagggcgtg gggaggcgga tcgcggcaat ggcggcgcat cggtgggcgg tgtgggcggt    120

gctgctgctg cggctgctcg tgccggcggc gcgggtgctc gccaacatgg aaggtgatgc    180

attgcatagc ttgaggacta atttagttga tcctaataat gttctacaaa gttgggaccc    240

aactctggtc aatccgtgca cttggtttca tgttacttgc aataacgaca acagtgttat    300

cagagttgat cttgggaatg ctgcactatc aggcactttg gtcccacaac ttgggcaact    360

aaaaaacttg caatacctgg agctctacag taataacata agcggaacga tacctagtga    420

acttggaaac ctcacaaact tggtcagttt ggatttgtac ttgaacaact tcactggtcc    480

aataccagat tcacttggaa acctattgaa gctacgattc ctgcgtctta acaataacag    540

cctttcgggt tcaattccta aatcactaac tgctatcact gccctacaag ttctagatct    600

ttcaaacaac aatttgtctg gagaagttcc atcaactggt tccttttcat tattcacccc    660

tatcagtttt gccaacaacc cttccttgtg tggtcctggg accacaaaac cttgccctgg    720

tgctcccccc ttttccccac ctcctccata taatcctcca actcctgtgc agtcaccagg    780

gagttcatct agtactggag caattgctgg tggagtggct gctggagcag ccttgctatt    840

tgctattcct gctattggtt ttgcatggta tcggcgcagg aaaccccaag agcatttctt    900

tgatgtgcct gctgaggagg atccagaggt ccatcttggc cagcttaaaa gattttcact    960

acgagaacta caagttgcaa cagatacctt cagcaataaa aacattctcg gaagaggtgg    1020

gtttggcaag gtctataaag gaagattagc agatggttct ttagtagctg ttaagagact    1080

aaaggaggag agaacacctg gtggggaact acagtttcaa acagaagttg agatgattag    1140

catggctgta catagaaatc tgctgcgttt acgagggttc tgtatgacac ccacagaaag    1200

gttgcttgtg tatccataca tggctaatgg aagcgttgcg tcacgtctta gagaacggcc    1260

accatcggaa cctccacttg attggcgaac aagaagaagg attgcgttgg gttccgccag    1320

ggggctgtcc tatttacatg atcattgtga cccaaagatt atccatcgtg atgtcaaagc    1380

tgcaaatatt ttattagatg aagactttga agctgtagta ggggactttg gtttggccaa    1440

actaatggat tacaaggata cccatgtaac aactgcagtt cgtggaacaa ttgggcatat    1500

tgcaccagaa tatctttcaa caggaaaatc atctgagaaa actgatgtat ttggttatgg    1560

gattatgctt ttggagctta taacaggaca acgtgccttt gaccttgctc gtctagccaa    1620

tgatgatgat gtcatgctac tggactgggt aaaaggatta ctcaaggaga aaaggctgga    1680

gatgttggtt gatccagatt tacagagcaa ctacattgat gttgaggtag aatcactaat    1740

ccaggttgct cttctttgca cacaaggctc ccccacagaa cgccccaaga tggcggaggt    1800

tgtgaggatg cttgaaggtg atggccttgc cgagagatgg gaggagtggc agaagataga    1860

agtagtacgg caggaggtag agcttggccc tcatcggaac tcagagtgga ttgtcgactc    1920

gacggacaac cttcatgcgg ttgagctatc agggccgagg tgatgacagc gcactggtag    1980

tttgctgcta attcttgtcc gtcggaagag tgatttttat cagccatcct agtcgaatcg    2040

ccatttgttc ataccaacca attggcccaa tgtagccagc tacaactatg ttttgatgta    2100

tattgcttga tttgctcctt gatgtgccgc cttggatatc ggtgacccga aaacagcagg    2160

agcccaagga acggtacccc                                                2180

Claims (9)

1.含有反向的OsBAK1-1基因片段的重组载体，所述OsBAK1-1基因片段是将序列表中序列1所示的基因用KpnI和SacI双酶切得到的基因片段。

2.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体是将DNA片段A导入骨架质粒中得到的重组载体；所述骨架质粒是pCAMBIA1301；所述DNA片段A是含有反向的OsBAK1-1基因的DNA片段。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述DNA片段A自上游至下游依次包括UbiPro、反向的OsBAK1-1基因片段和Noster。

4.根据权利要求1-3任一所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体是将OsBAK1-1基因片段反向插入质粒pUN1301的多克隆位点中，得到的重组载体；所述OsBAK1-1基因片段是将序列表中序列1所示的基因用KpnI和SacI双酶切得到的基因片段；

所述质粒pUN1301是用包含UbiPro和Noster的片段插入质粒pCAMBIA1301中，得到的重组质粒；

所述包含UbiPro和Noster的片段是用EcoR I和HindIII双酶切载体pUN19，得到的2.3kb的片段；

所述pUN19是将UbiPro插入质粒pUC19-Noster中，得到的载体；

所述质粒pUC19-Noster是将Noster poly A终止序列插入pUC19，得到的重组质粒；

所述Noster poly A终止序列是用Sac I和EcoR I双酶切pBI221得到的序列。

5.含有权利要求1-4任一所述的重组载体的重组菌。

6.一种培育叶夹角改变的转基因水稻的方法，是将OsBAK1基因或反向的OsBAK1-1基因片段导入目的水稻中，得到叶夹角改变的转基因水稻，所述OsBAK1基因是序列1的自5’端第1-2180位所示的DNA分子；所述OsBAK1-1基因片段是将序列表中序列1所示的基因用KpnI和SacI双酶切得到的基因片段。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述反向的OsBAK1-1基因片段是通过权利要求1-4任一所述的重组载体导入水稻中的；所述叶夹角改变的转基因水稻是与目的水稻相比，叶夹角变小的转基因水稻。

8.权利要求6或7所述的方法在培育水稻新品种中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述水稻新品种是水稻单产提高的品种。

Images