CN102952809B

CN102952809B - Mapkkk家族ila1基因在控制水稻叶夹角中的应用

Info

Publication number: CN102952809B
Application number: CN201110415914.0A
Authority: CN
Inventors: 熊立仲; 宁婧; 周奕华; 张保才
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2011-12-13
Filing date: 2011-12-13
Publication date: 2014-10-08
Anticipated expiration: 2031-12-13
Also published as: CN102952809A

Abstract

本发明属于水稻基因工程技术领域。具体涉及分离、克隆和通过功能验证得到一种能够控制水稻叶夹角基因ILA1。本发明采用筛选T-DNA插入水稻突变体库的方法，克隆到控制水稻叶夹角基因ILA1，通过共分离分析、细胞学观察、基因表达部位分析表明ILA1是控制水稻叶夹角表型的关键基因。所述的ILA1基因具有如序列表SEQ NO：1中第50-1744位所示的核苷酸序列。

Description

MAPKKK家族ILA1基因在控制水稻叶夹角中的应用

技术领域

本发明涉及水稻基因工程领域。具体涉及分离、克隆和通过功能验证得到一种能够控制水稻叶夹角基因ILA1。本发明采用筛选T-DNA插入水稻突变体库的方法，克隆到控制水稻叶夹角基因ILA1，通过共分离分析、细胞学观察、基因表达部位分析表明ILA1是控制水稻叶夹角表型的关键基因。

背景技术

水稻是亚洲最重要的粮食作物同时也是一种模式植物。而在未来的40年，水稻的产量必须增长50％才能满足人口增长的需要。在众多影响产量的因素中，叶片的光合作用被认为对增加产量起到很重要的作用。对于水稻而言，叶片夹角、叶片温度和叶片衰老是影响叶片光合作用的三个主要因素。叶片夹角是指叶片偏离垂直面的角度。拥有小的叶夹角、直立的叶片是新水稻品种的一个重要指标，被命名为NPT(newplant type)。总之，合适的叶夹角能减少植株阴影、增加群体透光性、充分发挥中下层叶的光合潜力、在密植的情况下减少占地面积。

近年来的研究表明叶夹角与植物激素和环境有密切的关系。油菜素内酯(BR)是一种多羟基化的固醇类激素，广泛参与植物生长发育等多种生理过程。水稻对BR的一个最显著的反应就是叶夹角变大(Wada等.Brassinolide and Homobrassinolide Promotion of Lamina Inclination of Rice Seedlings.Plant Cell Physiol，1981，22：323-325.)。BR会引起近轴面细胞的快速分裂和生长，从而导致水稻叶夹角的增大(Cao H，Chen S.Brassinosteroid-induced rice lamina joint inclination and its relation to indole-3-acetic acid and ethylene.PlantGrowth Regul，1995，16：189-196.)，也会促进胚芽鞘的生长和根变短(Yamamuro等.Loss of function of a ricebrassinosteroid insensitivel homolog prevents internode elongation and bending of the lamina joint.Plant Cell，2000，12：1591-1606.)。生长素是植物中第一个发现的激素，研究发现生长素与BR有相互促进的作用。生长素引起的叶夹角的变化与与BR类似。Song等报道过在水稻中超表达OsIAA1使叶夹角变大、植株株高变矮，呈现典型的BR相关的表型。TLD1编码IAA氨基合成酶，TLD1功能获得突变体的表型为分蘖增多、叶夹角变大和矮化。水稻的叶是由叶片和叶鞘组成，中间由叶枕连接，维管束在这三个组织中平行排布，厚壁细胞分布在维管束周围，被认为是支撑叶的最主要的细胞。叶片或叶鞘中厚壁细胞的减少或者变薄会直接导致植株变脆或柔韧。叶夹角的改变也与光照强度和光性质有关，光依赖的叶夹角变化是通过光敏色素和ABA合成介导的。叶夹角与纬度的关系也被研究过，例如，拟南芥不同生态型的叶片在低纬度上表现得更加直立。

发明内容

本发明的目的涉及一个MAPKKK家族基因ILA1基因在控制水稻叶夹角改良中的应用。

从水稻T-DNA突变体库中分离得到一个叶夹角变小的水稻T-DNA突变体，其插入基因是一个MAPKKK基因，基于这个突变体的表型，申请人将该基因命名为ILA1(increased leaf anglel)。本发明分离和应用一种包含ILA1基因的DNA片段。其中，所述的ILA1基因是下列核苷酸序列之一：

1)序列表SEQ NO：1中第50-1744位所示的DNA序列；或

2)编码与1)编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列；或

3)1)和2)所包含的亚片断。

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1显示的是本发明分离克隆的包含有ILA1基因编码区的核苷酸序列。

图1.根据插入位点设计引物验证共分离示意图。A表示在插入位点上游设计的引物，B表示在插入位点下游设计的引物，C表示根据T-DNA内部序列设计的引物。在T1代植株中，纯合突变体只有A和C配对可以扩增的出，因为有T-DNA插入A与B配对的产物太大无法得到扩增片段，野生型的植株由于没有T-DNA的插入，只有A和B配对可以得到产物，杂合植株则A和C配对以及A和B配对时都可以扩增得到产物。

图2.根据插入位点设计引物验证共分离的PCR结果。上一行引物：A+B，下一行引物：C+B，其中泳道3，4，8，10，14，16，18，20，21为T-DNA纯合；1，9，19为T-DNA杂合；2，5，6，7，11，12，13，15，17，为T-DNA阴性。

图3.ila1突变体表型。A图为野生型水稻植株中花11(ZH11)与突变体(ila1)在抽穗时的表型；B图为野生型植株与突变体的叶片夹角的比较

图4.水稻中花11(ZH11)与ila1叶枕的横切面的比较。箭头显示厚壁细胞。

图5.ila1叶枕细胞壁组分测定。X-轴是测定组分，分别为鼠李糖(Rhamnose)，岩藻糖(Fucose)，阿拉伯糖(Arabinose)，木糖(Xylose)，甘露糖(Mannose)，半乳入糖(Galactose)，葡萄糖(Glucose)、纤维(Cellulose).

图6.pDX2181-ILA1P载体图谱。

图7.ILA1基因的启动子表达模式。图中显示叶枕部位GUS特异表达。

具体实施方式

以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在分离ILA1T-DNA突变体，鉴定表型的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。

实施例1：分离ILA1 T-DNA突变体

基于已报道的植物MAPK/MAPKK/MAPKKK蛋白质序列建立隐马尔可夫模型(HMMs：HiddenMarkov model profiles，一种软件，参见：http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/0471219282.eot114/full)然后用HMMER扫描水稻全基因组，得到水稻基因组里所有可能的MAPKKK基因。然后从水稻突变体库(http://rmd.ncpgr.cn/)中挑取相应的T-DNA突变体。本发明所涉及的序列来源于NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，TIGR(http://www.tigr.org)，KOME(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)，定位的基因的位置信息以“TIGR Rice Annotation Release 4”为准。

其中ILA1 T-DNA突变体的侧翼序列为：

AACGTCCGCAATGTGTTATTAAGTTGTCCTGCACCTATTTTTGGCTCTACCACAGCCCTTAAGGCTCTTGTTCGTCAAGCAAGCAGCAAGAACCTCCTGGATGACAACCAAGACATAGATGCTATTCTCAGGTTTGCATATTTATAGTTACTAGGTCCTGAAATTTTCTCATTTACCTATGCACTTTTTTCTCTTTGCACTTTCGGATTTTTCTGTTTTAGACATTCATTTTTAATTCAAATATCACTAATTAGCTCATTTTGCTGTTACTTGATGTTGTGTTTATTCCTTTTTTTCAGTCAGAGTGTGGTTATTTCTTTAAAACACTAATCAGTGAGACTATGATATTTAGAACCATTTCTTCTGTTTCATCTCAGTCGTCAAATCTGGCATGCGGGTTTGTGAAATACAGTTTTTATTGATAGAAGGATTTTTACACATACAAATAAATCGTAAAGGGGTGCGTGTGTGCCCCACACACGCGGCGAAACCCTATAGGAAACCCCAATTCCCCCTATCTGGGGACTACACCACACCTTTTTTATGGGAGAAAACCCGCGCACACAGACAA

根据侧翼序列与水稻基因组的匹配情况，可以确定插入位点，在插入位点的两边设计一对引物A和B，及T-DNA上设计一条引物C，如图1，A表示在插入位点上游设计的引物，B表示在插入位点下游设计的引物，C表示根据T-DNA内部序列设计的引物。在T1代植株中，T-DNA纯合植株只有A和C配对可以扩增的出，因为有T-DNA插入A与B配对的产物太大无法得到扩增片段，野生型的植株由于没有T-DNA的插入，只有A和B配对可以得到产物，杂合植株则A和C配对以及A和B配对时都可以扩增得到产物。根据插入位点设计的引物序列为A(引物)：5′ACACCAGCGTATGTCCTT 3′B(引物)：5′ATGCTCCTCCCCAGCTTTTT 3′C(引物)：5′AATCCAGATCCCCCGAATTA3′。PCR反应体系的总体积为20μl，DNA模板1ul(约50ng)、1×Taq酶反应缓冲液、25mM MgCL21.2ul、2mM dNTP 1.5ul、10uM引物0.2ul、0.3单位Taq酶，加水至20μl。反应程序为：94℃变性5min，94℃45s、55℃45s、72℃1min30cycles，72℃延伸5min。PCR结果，如图23，4，8，10，14，16，18，20，21为T-DNA纯合；1，9，19为T-DNA杂合；2，5，6，7，11，12，13，15，17，为T-DNA阴性。结果表明这个T-DNA插在第4个EXON，位于ATG下游963bp处。

实施例2：鉴定突变体表型

将已鉴定好基因型的纯合和野生型家系(水稻品种中花11)催芽后直播到南方水稻土中(按照常规方法)。在正常生长情况下，转ila1基因的水稻与野生型(即未转基因)水稻在苗期没有明显差别，但是在分蘖期和抽穗期转ila1基因的水稻植株叶片夹角明显比野生型(即未转基因)水稻植株要大，在分蘖期表现为叶片披散(见图3A，3B)。

实施例3：转i1a1基因水稻的细胞学观察

1、叶枕的横切面观察

取转ila1基因的水稻突变体和野生型水稻叶夹角差异最大的叶枕进行观察。经过徒手切片结果表明，叶枕处的厚壁细胞在转ila1基因水稻和野生型水稻中存在很大差异。转ila1基因的水稻中包围在维管束附近的厚壁细胞明显比野生型少(见图4)。而对同一时期的叶片和叶鞘切片观察，两者没有明显差异。

2、叶枕细胞壁组分测定

取转ila1基因的水稻突变体和野生型水稻叶枕进行细胞壁糖成分分析。结果表明，突变体中细胞壁单糖木糖、阿拉伯糖和葡萄糖含量显著下降，纤维素含量也显著下降(见图5)，下降程度均大于30％。

具体测定方法如下：将干燥的水稻叶片打磨成粉末，过100目筛，经70％乙醇和氯仿/甲醇(体积比为1∶1v/v)抽提后，干燥。经α淀粉酶(购自西格玛奥德里奇公司)酶解样品中的淀粉后，用蒸馏水洗三次，干燥。称取2mg样品，加入2M三氟乙酸在121℃水解90min，经硼氢化钠还(10mg/ml)原后，加入吡啶和乙酸酐，加热到120℃，生成单糖乙酰化衍生物。样品经SP2380色谱柱恒流模式(1ml/min)分离后通过质谱检测(安捷伦气相色谱9700A/质谱5975C)，以肌醇为内标，计算各单糖的成分。为确定纤维素含量，称取2mg样品，加入Updegraff试剂(乙酸∶硝酸∶水，体积比为8∶1∶2，v/v/v)消解非纤维素多糖，水洗三次并干燥后，加入72％浓硫酸并稀释以降解纤维素。取10μl降解产物，加入新配制的蒽酮试制(2mg/ml)，于80℃温浴30min，冷却后，测定吸光值(625nm)，并依据标准曲线计算纤维素含量。

实施例4：ILA1的启动子表达模式。

为了研究ILA1在水稻各个组织的的表达模式，将ILA1启动子连接GUS报告基因转化水稻中花11。

启动子GUS载体构建方法如下：首先通过查找NCBI数据库http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，找到其所对应的基因组序列(BAC克隆号AP007231)，用引物ILA1PF(5’-CCAGTCGACCACTACGACGATCAATCACG-3’)和ILA1PR(5’-CCAGGATCCACAGCAAAGGCGCAACTCTT-3’)，扩增片断，反应条件为：94℃预变性3min；94℃30sec，50℃30sec，72℃2min，30个循环；72℃延伸5min。用BamHI和SalI双酶切，回收次PCR片段；同时，用同样的方法酶切遗传转化载体pDX2181(华中农业大学生命科技学院林拥军教授惠赠)，用BamHI和SalI双酶切，酶切完毕，用氯仿∶异戊醇(体积比为24∶1)抽提，纯化酶切产物。用包含ILA1基因组的酶切片段和酶切后的载体做连接反应，转化大肠杆菌DH10β(大肠杆菌DH10β菌株购自Invitrogen公司)。通过酶切筛选阳性克隆，获得转化表达载体pDX2181-ILA1P(见图6)。

通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法(如下述具体步骤)将以上遗传转化表达载体pDX2181-ILA1P导入到水稻品种中花11(中国水稻研究所提供的一个公开使用的水稻品种，)中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗、移栽，得到转基因植株。农杆菌介导的水稻(中花11)遗传转化方法(体系)在Hiei等人报道的方法(Hiei等，Efficient transformation of rice，Oryza sativaL.，mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA，Plant J，6：271-282，1994)基础上改良进行(如下述具体步骤)。

具体遗传转化步骤如下：

(1)愈伤组织诱导：将成熟的水稻种子中花11去壳，然后依次用70％浓度的的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl₂)种子表面消毒15分钟；用灭菌水洗种子4-5次；将该消过毒的种子放在诱导培养基上(成分见后)；将接种后的愈伤组织诱导培养基置于黑暗处培养4周，培养温度25±1℃。

(2)愈伤继代：挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基(成分见后)上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

(3)预培养：挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基(成分见后)上黑暗下培养2周，培养温度25±1℃。

(4)农杆菌培养：在带有对应抗性选择的LA培养基上(成分见后)预培养农杆菌EHA105(来源于CAMBIA，商用菌株)两天，培养温度28℃；将所述的农杆菌转移至悬浮培养基(成分见后)里，于28℃摇床上培养2-3小时。

(5)农杆菌侵染：将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀ 0.8-1.0；将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基(成分见后)上培养3天，培养温度19-20℃。

(6)愈伤洗涤和选择培养：用灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；浸泡在含400ppm羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；再转移愈伤至选择培养基(成分见后)上选择2-3次，每次2周(第一次筛选羧苄青霉素浓度为400ppm，第二次及以后为250ppm，潮霉素浓度250ppm)。

(7)分化：将抗性愈伤转移至预分化培养基(成分见后)上黑暗处培养5-7周；转移预分化培养的愈伤至分化培养基上(成分见后)，光照下培养，培养温度26℃。

(8)生根：剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。

(9)移栽：洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，在最初的几天保持水分湿润。

培养基组分及其配方：(1)试剂和溶液缩写：本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(CaseinEnzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6mix(N6微量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmix(MS微量成分溶液)。(2)主要溶液配方：

1)N6培养基大量元素母液[10倍浓缩液(10X)]的配制：

逐一溶解，然后室温下用蒸馏水定容至1000ml。

2)N6培养基微量元素母液[100倍浓缩液(100X)]的配制

室温下溶解并定容至1000ml。

3)铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100X)的配制

准备800ml双蒸水并加热至70℃，加入乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)3.73克，充分溶解后在70℃水浴中保持2小时，定容至1000ml，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(100X)配制

加水定容至1000ml，4℃保存备用。

5)MS培养基大量元素母液(10X)的配制

室温下溶解并定容至1000ml。

6)MS培养基微量元素母液(100X)的配制

室温下溶解并定容至1000ml。

7)2，4-D贮存液，6-BA贮存液，萘乙酸(NAA)贮存液，吲哚乙酸(IAA)贮存液：1均为mg/ml。

8)葡萄糖贮存液：0.5g/ml。

9)AS贮存液的配制：秤取AS 0.392g，DMSO 10ml。

(3)用于水稻遗传转化的培养基配方

1)愈伤组织诱导培养基

加蒸馏水至900ml，用1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。

2)继代培养基

3)预培养基

加蒸馏水至250ml，用1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

4)共培养基

加蒸馏水至250ml，用1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)。

5)悬浮培养基

加蒸馏水至100ml，用1N氢氧化钾调节pH值至5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。

使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液。

6)选择培养基

加蒸馏水至250ml，用1N氢氧化钾调节pH值到6.0，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250μl HN和400ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

7)预分化培养基

加蒸馏水至250ml，用1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250μl HN和200ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

8)分化培养基

加蒸馏水至900ml，用1N氢氧化钾调节节pH值到6.0。煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。

9)生根培养基

加蒸馏水至900ml，用1N氢氧化钾调节pH值到5.8。煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。

本发明通过遗传转化共产生了15株水稻植株，其中得到12株为阳性植株，对转基因阳性植株的不同组织进行GUS染色，结果表明在叶枕处有很强的表达，而在其它组织或器官中检测不到明显GUS表达或者很微弱(见图7)，说明ILA1基因主要在水稻叶枕这个部位特异表达。由于叶片夹角主要是受叶枕控制，ILA1基因在叶枕特异表达这一结果进一步支持了ILA1基因控制叶夹角这一结论。

Claims

1.MAPKKK家族ILA1基因在控制水稻叶夹角中的应用，其特征在于，该基因的核苷酸序列如序列表SEQ NO：1中第50-1744位所示。