CN107475288B - GmMAPKKK基因在提高植株对大豆花叶病毒病的抗性中的应用 - Google Patents

GmMAPKKK基因在提高植株对大豆花叶病毒病的抗性中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107475288B
CN107475288B CN201710764320.8A CN201710764320A CN107475288B CN 107475288 B CN107475288 B CN 107475288B CN 201710764320 A CN201710764320 A CN 201710764320A CN 107475288 B CN107475288 B CN 107475288B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
soybean
plant
gmmapkkk
transgenic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710764320.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107475288A (zh
Inventor
唐桂香
刘宝
贺红利
马露萍
查霆
庞劲松
何梦迪
寻红卫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University ZJU
Northeast Normal University
Original Assignee
Zhejiang University ZJU
Northeast Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University ZJU, Northeast Normal University filed Critical Zhejiang University ZJU
Priority to CN201710764320.8A priority Critical patent/CN107475288B/zh
Publication of CN107475288A publication Critical patent/CN107475288A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107475288B publication Critical patent/CN107475288B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8283—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for virus resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明公开了一种抗大豆花叶病毒病基因GmMAPKKK及其在提高植株抗大豆花叶病毒病中的应用，属于生物技术领域。所述应用为培育抗大豆花叶病毒病的大豆品种，其方法包括：从大豆花叶病毒抗性植株中克隆GmMAPKKK基因，并构建重组表达载体，利用农杆菌介导技术将重组表达载体转入大豆受体材料中，经筛选、培育获得转基因大豆T0代植株；T0代植株自花授粉获得T1代种子；T1代种子经培育、筛选，获得GmMAPKKK基因过表达的后代植株。GmMAPKKK基因可能通过茉莉酸途径，促进PR1基因、超氧化物歧化酶相关基因(SOD)和抗坏血酸氧化酶相关基因(APX)表达，提高植株对大豆花叶病毒病的防御反应。

Description

GmMAPKKK基因在提高植株对大豆花叶病毒病的抗性中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及GmMAPKKK基因在提高植株对大豆花叶病毒病的抗性中的应用。
背景技术
在大豆生长发育过程中常遭遇许多病虫害的危害，病虫害是导致大豆产量和品质降低的主要因素之一。花叶病毒病是危害我国大豆生产的主要病害，田间大豆受花叶病毒侵染后呈现为不同程度的花叶和皱缩症状，部分表现出叶脉坏死、矮化症状，且感病植株产生的种子常出现褐色或黑色斑点，严重影响大豆的品质。在花叶病毒病爆发严重的年份，大豆产量可减少10-30％，严重时甚至大面积区域颗粒无收。因此，花叶病毒病成为中国大豆产业面临的一个主要问题，直接影响了大豆的产量和品质。寻找有效阻止大豆病毒侵染及预防侵染后病毒扩散等防治方法，成了保持我国大豆产业继续蓬勃发展的当务之急。
在整个生命周期中，植物要应对生长环境带来的复杂多样性，包括不适宜的温度，水分条件，病毒，虫害等。为了防止和避免生物和非生物胁迫带来的危害，植物逐渐形成了自身复杂而精妙的信号传导和调控机制，其中可逆磷酸化是目前研究较多的信号转导机制之一。促丝裂原活化蛋白激酶信号通路是生物体内最重要的信号转导系统之一，其通过磷酸化反应，不仅参与调节细胞分裂和分化等多种生理过程，而且响应生物和非生物胁迫，在细胞程序性死亡等生命活动中均发挥重要功能。
MAPK级联途径是植物生长发育周期中必不可少的信号传导和调控途径之一，其几乎参与了包括配子和化胎发育、形态建成、衰老、脱落、育性、种子的形成等每个方面，尤其在细胞增殖和细胞分化中都起着关键的作用。MAPK级联途径主要包含三类蛋白激酶：促丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs/MPKs)、促丝裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKKs/MAP2Ks/MEKs)以及促丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAPKKKs/MAP3Ks/MEKKs)。当植物受到刺激信号时，最上游的MAPKKK家族受该外界信号刺激被激活，该家族相应成员通过磷酸化反应激活下游MAPKK家族成员，进一步MAPKK继续磷酸化激活MAPK，最终使其活化进而转入细胞核内。整个磷酸化途径可概括描述为：MAPKKK--MAPKK--MAPK。MAPK级联途径是植物对生物胁迫系统性防卫反应过程中的重要元件。MAPK级联途经参与早期多个防御反应的信号传递过程，包括防卫基因激活、植保素合成、细胞壁加固、过氧化物产生、HR反应、植物抗病相关激素的合成和信号传递等。
伴随着基因工程技术的快速发展，基因水平上的免疫逐渐被认为是增强植物对抗病害的最佳途径。近年来国内外有大量报道证实，通过将病毒衣壳蛋白基因(CP gene)、移动蛋白基因(MP gene)、复制酶基因(Replicase gene)等一个或者多个基因导入植物体内，获得转基因植株，在抵抗病毒感染时，抗性有一定程度的增强。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高植株抵抗大豆花叶病毒病能力的方法，从抗大豆花叶病毒病品种中发现抗病基因，通过转基因技术将其转入花叶病毒抗性低的植物品种中，用于增强植物抗病能力，从而提高产量。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明通过芯片检测花叶病毒抗病品种(吉75)与易感品种(长农16)的基因表达差异，从中找到抗大豆花叶病毒病基因GmMAPKKK，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明从花叶病毒抗病品种(吉75)中克隆得到GmMAPKKK基因，将其构建重组表达载体并转入大豆品种天隆一号，得到的转基因植株后代，对其进行抗病性检测，发现GmMAPKKK基因过表达显著增强转基因植株对大豆花叶病毒病的抗性。
本发明实验数据分析表明，GmMAPKKK基因被导入到大豆基因组中后超表达，在T1代转基因大豆植株中基因表达量的增高有利于增强转基因植株对花叶病毒的抗病效果，增强植株对大豆花叶病毒的耐受性，可对病毒免疫或延迟发病。GmMAPKKK基因通过促进PR1的表达，进一步提高对SMV的抗性。GmMAPKKK基因通过提高SOD相关基因的表达量，产生相应大量的SOD，及时清除体内的超氧阴离子自由基，同时APX相关基因的大量表达，也保证生成的APX消除植株受胁迫产生的过量H2O2。通过上述实验，本发明发现并证实了GmMAPKKK基因为高效的大豆内源抗病毒病基因。
因此，本发明提供了核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的GmMAPKKK基因在提高植株对大豆花叶病毒病的抗性中的应用。
作为优选，所述的植株为大豆品系。
本发明还提供了一种培育抗大豆花叶病毒病的大豆品种的方法，包括以下步骤：
(1)利用RT-PCR方法，从大豆花叶病毒抗性植株中克隆GmMAPKKK基因，并构建重组表达载体；
(2)利用农杆菌介导技术将重组表达载体转入大豆受体材料中，经筛选、培育获得转基因大豆T0代植株；
(3)转基因大豆T0代植株自花授粉获得T1代种子；
(4)T1代种子经培育、筛选，获得GmMAPKKK基因过表达的后代植株。
步骤(1)中，所述大豆花叶病毒抗性植株的品种为吉75。所述GmMAPKKK基因的核苷酸序列如如SEQ ID NO.1所示。
步骤(1)中，构建重组表达载体时，采用的原始载体为pB7FWG2.0。
步骤(2)中，所述的农杆菌为根癌农杆菌EHA101。
本发明研究发现，相较于其他的大豆品种，天隆一号为适宜大豆农杆菌介导转化的受体。作为优选，步骤(2)中，所述的大豆受体材料为大豆品种天隆一号的子叶节。
作为优选，步骤(2)中，在农杆菌与大豆受体材料共培养的培养基中加入α硫辛酸，以提高大豆农杆菌介导的转化效率，其中α硫辛酸与培养基的质量体积比为25mg/L。
步骤(2)和(4)中，所述的筛选采用的方法为草丁膦涂抹法、bar试纸条检测法、PCR鉴定法中的至少一种。
本发明具备的有益效果：
本发明将GmMAPKKK基因导入大豆的转基因实验表明，转入GmMAPKKK基因的大豆对大豆花叶病毒病抗病性有所提高，GmMAPKKK基因可能通过茉莉酸途径，促进PR1基因，超氧化物歧化酶相关基因(SOD)和抗坏血酸氧化酶相关基因(APX)表达，提高植株对大豆花叶病毒病的防御反应。因此，GmMAPKKK基因可用于培育具有高度抗大豆花叶病毒病的植物新品种。
附图说明
图1为大豆GmMAPKKK与其他作物MAPKKK基因多序列比对构建系统进化树，包括拟南芥MAPKKK，水稻MAPKKK，高粱MAPKKK，玉米MAPKKK，苹果MAPKKK，可可树MAPKKK，番茄MAPKKK，棉花MAPKKK，蒺藜苜蓿MAPKKK，毛竹MAPKKK，挪威云杉MAPKKK，无油樟MAPKKK，莱茵衣藻MAPKKK，团藻MAPKKK和黄瓜MAPKKK。
图2为转GmMAPKKK基因重组表达载体pB7FWG2.0。
图3为T1代转GmMAPKKK基因大豆植株草丁膦涂抹法检测结果，其中1-7表示7个独立的转基因株系的阳性植株叶片；CK为非转基因植株叶片。
图4为T1代转GmMAPKKK基因大豆植株bar试纸条检测结果，其中1-7表示7个独立的转基因株系的阳性植株；CK为非转基因植株。
图5为T1代转GmMAPKKK基因大豆植株PCR检测结果，其中1-7表示7个独立的转基因株系的阳性植株；CK为非转基因植株。
图6为目的基因GmMAPKKK在非转基因植株CK和转基因植株中的表达情况，其中1-7表示7个独立的转基因株系的阳性植株；CK为非转基因植株。
图7为非转基因植株CK和转基因植株中MAPK激酶的含量，其中1-7表示7个独立的转基因株系的阳性植株；CK为非转基因植株。
图8为接种SMV后转GmMAPKKK基因植株与非转基因植株CK中叶片与植株差异，其中a、c、e为非转基因植株CK病叶及植株形态；b、d、f为转GmMAPKKK基因植株病叶及植株形态。
图9为非转基因植株和转基因植株的P/N值比较，其中1-7表示7个独立的转基因株系的阳性植株；CK为非转基因植株。
图10为接种SMV 0、24、48、72小时后转基因植株与非转基因植株中GmMAPKKK基因的半定量表达情况，其中1-7表示7个独立的转基因株系的阳性植株；CK为非转基因植株。
图11为接种SMV后15天内转基因植株与非转基因植株中GmMAPKKK基因的定量表达情况，其中1-7表示7个独立的转基因株系的阳性植株；CK为非转基因植株。
图12为接种SMV 0、24、48、72小时后转基因植株与非转基因植株中防御基因PR1的半定量表达情况，其中1-7表示7个独立的转基因株系的阳性植株；CK为非转基因植株。
图13为接种SMV 0、24、48、72小时后转基因植株与非转基因植株中qPR1基因的定量表达情况，其中1-7表示7个独立的转基因株系的阳性植株；CK为非转基因植株。
图14为接种SMV后DAB染色法检测H2O2含量结果，a为非转基因植株叶片；b为转GmMAPKKK基因植株叶片。
图15为接种SMV后NBT染色法检测超氧阴离子O2 ·-含量结果，a、c为非转基因植株叶片及显微观察；b、d为转GmMAPKKK基因植株叶片及显微观察。
图16为接种SMV后15天后转基因植株与非转基因植株中ROS相关基因的定量表达情况。基因包括：SOD(Fe-1)、SOD(Fe-2)、SOD(Fe-3)、SOD(Cu-Zn)、GR、GPX6、APX4、MDHAR。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
下述实施例中的方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1
1、GmMAPKKK基因的获得和生物信息学分析
GmMAPKKK基因是通过芯片检测花叶病毒接种抗病品种(吉75)与感病品种(长农16)的基因表达差异，利用抗病基因保守结构域建库，从中找到的新型抗大豆花叶病毒病基因。基因序列如SED ID NO.1所示。
从NCBI上获得其他多个目标物种的序列，利用Mega软件进行系统进化制作，利用DNAMAN软件，找到保守结构域，并对大豆GmMAPKKK基因与其他物种MAPKKK基因进行多序列比对。
由系统进化树(图1)可以看出大豆GmMAPKKK基因与苹果、可可树、番茄、高粱MAPKKK基因亲缘关系较近，与玉米、棉花、黄瓜等较远。
同源性多序列比对表明大豆GmMAPKKK基因与可可树、番茄、高粱MAPKKK基因编码蛋白的序列同源一致性较高，达到45.59％，反映出GmMAPKKK基因的蛋白序列保守性较高。
2、转GmMAPKKK基因大豆的获得及T1代转基因阳性苗的鉴定
本实验以在生产上推广应用，由中国农业科学院油料作物所周新安教授育成的大豆品种天隆一号为大豆转化受体材料。
本实验的载体是农杆菌重组表达载体pB7FWG2.0-GmMAPKKK(图2)，双元载体利用Gateway技术进行载体构建，将抗病候选基因克隆到表达载体pB7FWG2.0上，转入根癌农杆菌EHA101中以获得的。
本实验是在Zhang和Paz等人方法基础上，通过对新型抗氧化剂α硫辛酸的优化，在共培养基中加入25mg/Lα硫辛酸，提高了大豆农杆菌介导的转化效率。大豆子叶节农杆菌介导的转化体系，经由大豆灭菌、大豆萌发、农杆菌侵染、共培养、诱导芽诱导、诱导芽伸长、诱导芽生根、组培苗温室驯化等步骤获得T0代转基因大豆，T0经草丁膦涂抹、bar试纸条和PCR快速鉴定明确为转基因阳性苗，自花授粉得到T1代转基因阳性苗。
转基因阳性苗检测对象为T1代转基因大豆植株7个株系(分别编号为1-7)的120株转基因植株，依次采用草丁膦涂抹法、bar试纸条检测法、PCR快速鉴定法对其鉴定，只有当三种方法检测结果均显示为阳性苗时，相应的植株才为转基因阳性植株，否则为转基因阴性植株。鉴定结果如表1显示，120株转基因大豆植株中，只有18株为阴性苗，其余108株均为转基因阳性苗，遗传稳定性较好。
表1T1代转GmMAPKKK基因大豆植株鉴定结果
草丁膦涂抹法检测结果如图3显示，在草丁膦的作用下，非转基因植株(CK)同一叶片的左右两个半叶呈现明显差异，涂抹草丁膦的右侧半叶颜色蜡黄，最终枯萎死亡，不沾染草丁膦的左侧半叶保持鲜绿正常状态；7个独立的转化株系共获得120株T1代转基因植株，其中102株草丁膦涂抺鉴定表现为左右两侧叶片(不涂草丁膦与涂草丁膦)均保持鲜绿正常生长状态，表现出对草丁膦良好的抗性，由此推测这102株大豆植株中含有草丁膦选择标记基因Bar基因，为转基因阳性植株，另外18株叶片则为转基因阴性植株，对草丁膦不具有抗性，症状与CK相似。
bar试纸条检测结果如图4所示，T1代非转基因植株CK的测试线不显现红色，仅显示一条对照线，由此说明该植株中不含bar蛋白；对经草丁膦初步筛检测显示阳性的102株转基因植株再进行bar试纸条测定，结果显示，对照线和测试线均呈现红色，表明均为阳性植株。
PCR检测结果如图5显示，非转基因植株(CK)DNA扩增结果显示没有相应的bar基因目的条带(436bp)；而102株T1代转基因植株DNA扩增产物中均能检测到目的条带，为阳性植株。
3、转GmMAPKKK植株基因分析
3.1T1代转基因植株GmMAPKKK基因表达量测定。
取新鲜T1代7个独立转GmMAPKKK基因株系和非转基因株系CK的适量新鲜叶片，采用Trizol法提取对叶片中的RNA。通过RNA电泳检测RNA质量情况，若有降解则需重新取样提取降解样品RNA，未降解的进一步在Nanodrop仪器上将最初样品RNA的浓度调整到200ng/μL。再将调好浓度的RNA溶液通过反转录PCR合成cDNA，并再利用Nanodrop仪器进行测定将反转录产物cDNA的浓度调为100ng/μL。
以大豆actin基因为内参基因，用GmMAPKKK序列信息(Acession:NM_001254074.1)设计引物且具体引物信息如表2。用qRT-PCR法进行GmMAPKKK基因定量特异性扩增。
qRT-PCR结果如图6所示，目的基因GmMAPKKK基因在T1代转基因植株叶部能正常表达，且不同转基因株系GmMAPKKK基因表达量不同，1，2，3，6，7株系表现为表达量均比对照上调2.40-4.54倍，3号株系表现为GmMAPKKK表达量最高，4，5号株系GmMAPKKK基因表达量低。
表2T1代转基因植株qRT-PCR引物
3.2T1代转GmMAPKKK基因植株MAPK激酶活性测定。
利用酶联免疫吸附剂测定ELISA试剂盒测定MAPK激酶活性，根据MAPK激酶浓度和520nm所测吸光值，绘制标准曲线，结果如图7所示，转基因植株与非转基因植株上游促丝裂原激活蛋白激酶含量有差异但不明显，均在300-350U/L。
4、GmMAPKKK基因功能分析
4.1T1代转GmMAPKKK基因植株大豆花叶病毒接种和抗性鉴定
选取携带SMV G7系病毒的病叶，于大豆单叶期对T1代转基因大豆进行花叶病毒摩擦接种试验。大豆叶片在接种3周内，观察叶片受花叶病毒侵染情况，并在3周后采用ACD公司的DAS-ELISA试剂盒对转基因植株与非转基因植株进行花叶病毒定性检测。
花叶病毒接种3周后转基因植株和非转基因植株长势相似，部位相同的感病叶片，拍照观察结果显示(图8)，非转基因植株受侵染叶片总数较多，部分叶片显著畸形皱缩变小且有疱状凸起，部分叶片有显著黄绿斑驳相间的斑点。转GmMAPKKK基因大豆植株受侵染叶片总数较少，部分叶片有轻微皱缩但皱缩程度明显比非转基因植株轻，部分叶片有零星黄绿斑点。从感染SMV后的表型观察可知，同一环境下接种同一病毒，转GmMAPKKK基因大豆植株的SMV抗性强于非转基因植株，受侵染的程度低。
ELISA检测和表型观察均显示转GmMAPKKK基因提高了大豆对SMV的抗性和耐受力，感病程度有效下降(图9)。
4.2SMV接种后转基因植株GmMAPKKK基因相对表达量检测
如图10所示，GmMAPKKK基因在大豆叶片的表达随着花叶病毒侵染时间的增加而加强，转基因1、2、3、6和7号株系的表达高于非转基因植株CK，3号和6号株系表达最高，在接种花叶病毒3天后表达量明显升高，表明在抵抗大豆花叶病毒侵染的过程中，转GmMAPKKK基因植株和非转基因植株体内均有GmMAPKKK基因的响应，且整体而言，转基因植株的响应情况更明显。
提取接种SMV后3天、6天、9天、12天、15天后T1代GmMAPKKK转基因植株的RNA，逆转录出cDNA，以cDNA为模板，以大豆中的actin基因为参照基因进行荧光定量PCR。
如图11显示，4号与5号株系本身超表达GmMAPKKK含量较低，在接种SMV后表达量仍然明显低于其他转基因植株，其余1号、2号、3号、6号和7号这5个转基因株系在接种SMV后15天内的表达均明显高于非转基因植株，具体如下，同比与非转基因植株CK，转GmMAPKKK基因植株，3天后GmMAPKKK基因表达上调1.23-2.49倍，6天后上调1.8-4.41倍，9天后达到一个阶段高峰2.47-11.01倍，12天后上调1.56-3.68倍，15天后达到2.34-4.49倍，且3号株系目的基因GmMAPKKK表达量最高。
4.3SMV接种后转基因植株防御基因相对表达量检测
提取接种SMV前和接种SMV后24h、48h、72h后T1代GmMAPKKK转基因植株的RNA，逆转录出cDNA，以cDNA为模板，用大豆中的actin基因所涉及的引物进行PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，反复调节cDNA浓度，使actin基因的表达量一致，再以此浓度的cDNA为模板，用目的基因的引物进行PCR扩增，从而分析比较非转基因植株和GmMAPKKK转基因植株防御基因的转录水平。
实验结果表明，防御基因PR3(JA诱导的SAR防御标记)、OSM(依赖于JA/ET协同诱导)、EBF(负调控ET途径)、ERF1和ERS2(ET诱导的防御标记)的表达量均较低，PR1(水杨酸诱导的SAR防御标记)表达量较高。PR1半定量显示(图12)，随着病毒侵染的深入，接种后72小时，防御基因PR1的表达量均明显升高，转基因植株和非转基因植株的差异不明显。
提取接种SMV前和接种SMV后24h、48h、72h后T1转GmMAPKKK基因植株的RNA，逆转录出cDNA，以cDNA为模板，以大豆中的actin基因为参照基因进行荧光定量PCR。结果如图13显示，随着SMV侵染时间的增加，qPR1基因表达量逐步升高，其中3号株系最高，明显高于非转基因株系，与接种前非转基因植株体内PR1含量相比，非转基因植株CK达到了未接种SMV前的9.45倍，转基因株系qPR1基因表达量大部分都达到了非转基因植株接种前的10倍以上，其中3号株系qPR1基因表达量最高，达到自身接种前的6.11倍，CK接种前的16.5倍，同时段CK的1.75倍，表明在未接种SMV时和接种SMV产生抗性过程中，转GmMAPKKK基因植株qPR1的含量均高于非转基因植株，即转GmMAPKKK基因增强了相关防御基因的表达。
4.4SMV接种后转基因植株ROS相关基因表达量分析及生理测定
4.4.1DAB染色法检测H2O2含量
接种SMV后15天，用DAB(3,3N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride)组织染色法检测转GmMAPKKK基因植株与非转基因植株中H2O2的含量，棕色显示越多，则说明H2O2含量越高。结果如图14所示，非转基因植株叶片被染棕色的程度高于转基因植株，说明在感染SMV后，转GmMAPKKK基因植株叶片积累的H2O2含量低于非转基因植株。
4.4.2NBT染色法检测超氧阴离子含量
超氧化物岐化酶(Superoxide Dismutase，SOD)能催化超氧化物阴离子O2 ·-发生岐化作用，生成过氧化氢(H2O2)和氧气(O2)，超氧化物阴离子O2 ·-将NBT还原为蓝色的甲臜(formazan)沉淀，且该蓝色沉淀不溶于水和乙醇。而SOD可清除超氧阴离子，从而抑制了甲醛的形成。NBT染色反应液蓝色愈深，说明超氧化物阴离子O2 ·-含量愈高，超氧化物岐化酶活性愈低，反之则SOD酶活性愈高。据此通过比色分析就可以观察出超氧化物阴离子O2 ·-含量和超氧化物岐化酶活性水平。
接种SMV后15天，用NBT组织染色法检测转GmMAPKKK基因植株与非转基因植株中O2 ·-的含量，蓝色斑点显示越多，则说明O2 ·-含量越高。结果如图15所示，非转基因植株叶片被染蓝色的程度高于转基因植株，说明在感染SMV后，转GmMAPKKK基因植株叶片积累的O2 ·-含量低于非转基因植株。
4.4.3荧光定量PCR检测ROS相关基因的表达。
在接种花叶病毒3天后，SOD和APX等相关基因荧光定量表达分析表明(图16)，除了MDHAR，大部分抗氧化系统相关基因都表现出转GmMAPKKK基因植株高于非转基因植株，SOD最明显，故进一步选取三个SOD关键基因(SOD-Fe 1、SOD-Fe 2、SOD-Fe 3)进行定量检测，该类基因在转GmMAPKKK基因植株中的表达是非转基因植株中的3.24-4.75倍，该结果也验证了转基因植株在对抗SMV的过程中，产生了较多的SOD来消除由于病毒胁迫产生的H2O2。同时，转GmMAPKKK基因植株内APX相关基因含量是非转基因的1.64倍，说明该基因调控产生更多的APX以降低超氧阴离子自由基的含量。由此可知，超表达GmMAPKKK基因对ROS系统有一定的影响，且对SOD的影响最明显。
本研究利用实验室前期获得的T1代转GmMAPKKK基因7个大豆株系，采用草丁膦涂抹法、bar试纸条检测法和PCR法同时对转基因植株进行鉴定筛选，由此确定目的基因已成功导入大豆基因组，并获得稳定遗传的转基因阳性植株；实时荧光定量PCR结果表明T1代7个独立转基因株系中GmMAPKKK基因表达量虽存在差异，但转基因植株目的基因表达量均高于非转基因植株，且其中4个株系中目的基因超表达；通过摩擦接种花叶病毒再配合进行DAS-ELISA检测，结果表明转GmMAPKKK能在一定程度上提高了大豆植株对SMV的耐受性；进一步实时荧光定量PCR结果表明SMV接种前后大部分转基因株系中目的基因表达量均明显高于非转基因植株，且3号株系在接种后9天时目的基因GmMAPKKK表达量最高，达到非转基因株系的11.01倍；6个防御基因的半定量表达情况及PR1定量检测情况推测，GmMAPKKK基因可能通过参与JA途径，促进PR1的表达，进一步提高对SMV的抗性；NBT和DAB染色实验显示，转GmMAPKKK基因植株在受到花叶病毒胁迫时，体内H2O2和O2 ·-的含量仍能维持一个较稳定且较低的状态。进一步分析ROS相关基因定量表达，发现在SMV胁迫下，转GmMAPKKK基因植株SOD相关基因和APX相关基因表达量均升高，说明GmMAPKKK基因通过增强SOD等活性来提高对抗SMV胁迫的能力。此外，3号株系的GmMAPKKK基因在表达量、SMV抗性、防御基因表达量以及ROS能力均高于非转基因植株及其他转基因株系，可以作为选育大豆抗SMV种质创新的材料。
序列表
<110> 浙江大学,东北师范大学
<120> GmMAPKKK基因在提高植株对大豆花叶病毒病的抗性中的应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1026
<212> DNA
<213> 大豆(Glycine max)
<400> 1
atggattggg ttcgaggaga cgctgtcgga cgaggaagct ttgctaccgt tagtttagct 60
attccaacga cgaattacaa tcagtttccg tctctaaccg tggttaagtc cgctgacgct 120
caaacctcgt gctggctcag aaacgagaaa cacgtgctgg atcgcctagg ttcgtgtccg 180
aggataattc gctgcttcgg agatgactgc agtttcgaga acggcgtcga gtactacaat 240
ttgttcctcg aatacgccgc cggcgggagt ctcgccgacg aattgaggaa ccacgatggc 300
aggattcccg agcctcaggc tcgggaatac acgagggaca tcgtggaggg tttgagccac 360
gtgcacaaaa acgggtttgt tcactgcgat ataaagctgc agaacatcct cgtattcgag 420
gacggaagga ttaaaattgc ggatttcggc ctcgcgaggg aggcagggga gagacagggg 480
aagaagagtg aatgcagggg gactccgatg tttatgtcgc cggagcaagt gaccggcggc 540
gagtgtgaat cgcccgcgga tatatgggct ttgggatgtg cagttgtgga gatggtgacc 600
gggaaaccgg cgtggcaggt ggagaatggg tcgagcatgt ggtcgctgtt gcttcgaatt 660
ggggtgggac aagaggttcc cgagatccct aataatttgt ccgaagatgg aaaagatttc 720
attgaaaaat gtttcattaa ggatcctaag aagaggtgga gcgcagaaat gctattgaaa 780
cacccttttc tactcaacga tgacactgtt tcatttaagc gcgttcatga gtcgcccaga 840
agccactttg atttccccga ttgggtttct agcgtggcga attcgcttcc cagttcgccg 900
gaatttcaag aaaagtgggg ttttgatgat gagttctgtt cgccggagga ccggctccgg 960
cagcttttga ctgttaatcg gccggcgagt tggtcggaat cagatgggtg gagtagtgtt 1020
aggtga 1026
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atcttgactg agcgtggtta ttcc 24
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gctggtcctg gctgtctcc 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggcgtattcg aggaacaaat 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gctggtcctg gctgtctcc 19

Claims (7)

1.核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的GmMAPKKK基因在提高植株对大豆花叶病毒病的抗性中的应用，所述植株为大豆品系。
2.一种培育抗大豆花叶病毒病的大豆品种的方法，包括以下步骤：
(1)利用RT-PCR方法，从大豆花叶病毒抗性植株中克隆核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的GmMAPKKK基因，并构建重组表达载体；
(2)利用农杆菌介导技术将重组表达载体转入大豆受体材料中，经筛选、培育获得转基因大豆T0代植株；
(3)转基因大豆T0代植株自花授粉获得T1代种子；
(4)T1代种子经培育、筛选，获得GmMAPKKK基因过表达的后代植株。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，构建重组表达载体时，采用的原始载体为pB7FWG2.0。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的农杆菌为根癌农杆菌EHA101。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的大豆受体材料为大豆品种天隆一号的子叶节。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，在农杆菌与大豆受体材料共培养的培养基中加入α硫辛酸，其中α硫辛酸与培养基的质量体积比为25mg/L。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)和(4)中，所述的筛选采用的方法为草丁膦涂抹法、bar试纸条检测法、PCR鉴定法中的至少一种。
CN201710764320.8A 2017-08-30 2017-08-30 GmMAPKKK基因在提高植株对大豆花叶病毒病的抗性中的应用 Active CN107475288B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710764320.8A CN107475288B (zh) 2017-08-30 2017-08-30 GmMAPKKK基因在提高植株对大豆花叶病毒病的抗性中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710764320.8A CN107475288B (zh) 2017-08-30 2017-08-30 GmMAPKKK基因在提高植株对大豆花叶病毒病的抗性中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107475288A CN107475288A (zh) 2017-12-15
CN107475288B true CN107475288B (zh) 2019-11-08

Family

ID=60604127

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710764320.8A Active CN107475288B (zh) 2017-08-30 2017-08-30 GmMAPKKK基因在提高植株对大豆花叶病毒病的抗性中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107475288B (zh)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108315309A (zh) * 2018-04-23 2018-07-24 中国科学院遗传与发育生物学研究所 水稻OsMKKK10突变蛋白及其编码基因与应用
CN111254159B (zh) * 2018-11-30 2023-03-31 东北农业大学 一种大豆GmST1基因突变体植株及其制备方法
CN110305876A (zh) * 2019-06-12 2019-10-08 南京农业大学 一个大豆花叶病毒SC18株系抗性基因GmNIK及其应用
CN111073905B (zh) * 2019-12-11 2022-08-23 南京农业大学 大豆丝裂原活化蛋白激酶GmMMK1编码基因的应用
CN110951755B (zh) * 2019-12-23 2022-03-29 南京农业大学 大豆花叶病毒保守片段cfo及由其构建的反向重复载体在大豆对smv广谱抗性中的应用
CN112961843B (zh) * 2021-04-20 2023-01-03 浙江大学 植物免疫调节相关蛋白及其应用
CN117247964B (zh) * 2023-09-04 2024-05-28 南京农业大学 一个能够调控大豆花叶病毒抗性的E3泛素连接酶基因GmPUB20的应用
CN117384941B (zh) * 2023-10-18 2024-04-05 河北省农林科学院粮油作物研究所 一种提高大豆抗病毒性能的基因及其应用
CN117551672A (zh) * 2023-12-11 2024-02-13 南京农业大学 一个抗大豆花叶病毒基因GmCSD的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102952809A (zh) * 2011-12-13 2013-03-06 华中农业大学 Mapkkk家族ila1基因在控制水稻叶夹角中的应用
CN104262472A (zh) * 2014-09-23 2015-01-07 东北师范大学 植物抗花叶病毒相关蛋白rsmv7及其编码基因和应用
CN107058381A (zh) * 2017-01-13 2017-08-18 吉林省农业科学院 一种获得耐盐转基因大豆材料的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102952809A (zh) * 2011-12-13 2013-03-06 华中农业大学 Mapkkk家族ila1基因在控制水稻叶夹角中的应用
CN104262472A (zh) * 2014-09-23 2015-01-07 东北师范大学 植物抗花叶病毒相关蛋白rsmv7及其编码基因和应用
CN107058381A (zh) * 2017-01-13 2017-08-18 吉林省农业科学院 一种获得耐盐转基因大豆材料的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Glycine max mitogen-activated protein kinase kinase kinase 2-like (LOC100798607), mRNA，NCBI Reference Sequence: NM_001254074.1;GenBank;《GenBank》;20161030;第1页 *
Identifcation, Nomenclature, and Evolutionary Relationships of Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) Genes in Soybean;Achal Neupane et al.;《Evolutionary Bioinformatics》;20131231;第9卷;第363-386页 *
抗病基因KR3在大豆中的转化研究;王浩铭等;《中国油料作物学报》;20141231;第36卷(第5期);第586-592页 *
转GmMAPKKK基因大豆花叶病毒抗性研究;马露萍;《中国学位论文全文数据库》;20181112;第1-74页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107475288A (zh) 2017-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107475288B (zh) GmMAPKKK基因在提高植株对大豆花叶病毒病的抗性中的应用
Shao et al. Using CRISPR/Cas9 genome editing system to create MaGA20ox2 gene‐modified semi‐dwarf banana
Ullah et al. Drought coping strategies in cotton: increased crop per drop
Fadón et al. Unveiling winter dormancy through empirical experiments
Liu et al. Overexpression of maize SDD1 (ZmSDD1) improves drought resistance in Zea mays L. by reducing stomatal density
Joshi et al. In vitro screening of rice genotypes for drought tolerance using polyethylene glycol
CN103237893A (zh) 抗病原体的植物及其生产方法
CN107429259A (zh) 通过增加莨菪亭含量，增加转基因植物中大豆锈病抗性的方法
Kuluev et al. Effect of ectopic expression of NtEXPA5 gene on cell size and growth of organs of transgenic tobacco plants
CN106011146B (zh) OsMADS47基因在调控水稻粒型中的应用
Vi et al. Overexpression of the ZmDEF1 gene increases the resistance to weevil larvae in transgenic maize seeds
Prabha et al. Phytoplasmas, the fast spreading vector borne pathogens of flower crops: Indian scenario
CN105524933B (zh) OsJMJ714影响水稻籽粒大小以及盐胁迫耐性的功能及其应用
CN101948870B (zh) 减少植物分枝数量和提高叶绿素和花色素苷含量的方法
CN100497637C (zh) 融合高光效和抗早衰性状的水稻育种方法
BRPI0605648B1 (pt) construções de dna que contém a seqüência codificante do gene hahb-10 de helianthus annuus e método para gerar plantas com ciclo de vida reduzido e com alta tolerância a herbicidas
Li et al. Collection, conservation, evaluation and utilization of Vitis amurensis germplasm resources in China
Zhang et al. Nonglandular prickle formation is associated with development and secondary metabolism‐related genes in Rosa multiflora
CN104774853B (zh) E3泛素连接酶基因OsPIW调控水稻根的功能与应用
CN106831966A (zh) 增强植物耐盐碱胁迫能力的基因及其应用
CN110484545A (zh) 一种从野生大豆中分离出来的抗花叶病毒GsCAD1基因、编码蛋白及其应用
Fortes et al. Organogenic nodule formation in hop: a tool to study morphogenesis in plants with biotechnological and medicinal applications
Ratna Kumar et al. Adaptation and Mitigation Strategies of Plant under Drought and High‐Temperature Stress
Mir et al. Biotechnological advances in litchi (Litchi chinensis Sonn.): present scenario and future prospects in crop improvement-a review
CN103421788A (zh) 水稻逆境应答型启动子OsSN1P的分离和利用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant