CN112048010B - 水稻rip2蛋白在调控植物叶夹角中的应用 - Google Patents

水稻rip2蛋白在调控植物叶夹角中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了水稻RIP2蛋白在调控植物叶夹角中的应用。本发明运用CRISPER/Cas9技术对水稻基因RIP2进行敲除，利用农杆菌介导法将敲除载体转化水稻ZH11愈伤组织，经过潮霉素和靶序列区域的检测，得到RIP2的敲除株系，发现与未转化的水稻相比，敲除植株能促使水稻植株幼苗期叶夹角增大，而叶夹角增大有利于增加种植密度，具有提高水稻群体光合效率、提升产量的潜在价值，且敲除植株在幼苗期的叶夹角对芸苔素内酯不敏感，表明RIP2基因负调控叶夹角，缺失RIP2基因的表达会影响水稻体内芸苔素内酯的信号传导，因此，可将RIP2基因用于调控植物叶夹角。

Description

水稻RIP2蛋白在调控植物叶夹角中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及水稻RIP2蛋白在调控植物叶夹角中的应用。
背景技术
水稻是重要的粮食作物，与产量相关的形态相关基因被不断地挖掘和分析，逐步应用在具体的育种中，从而达到增产目的。水稻株型与产量关系密切，可通过调整水稻株型进而实现水稻产量的提高。水稻株型中的叶形态逐步成为育种家的关注点，目前已有多位水稻育种领域的学者提出水稻高产的理想株型包含叶形态的育种。合理的叶形态有利于改善水稻叶片的空间排列，对培育水稻的理想株型发挥关键作用。叶包含叶片、叶鞘、叶舌、叶耳、叶枕和叶脉等部分。叶片作为水稻进行光合作用的主要器官。尤其是直、长、窄、凹、厚的三片功能叶，可以进一步增加干物质的积累。所呈现的叶面积、叶卷曲度、叶夹角、比叶重和叶片披垂度等均为组成水稻叶形态的重要性状。
在水稻中，叶夹角指叶发育进程中叶片基部与茎之间的角度，是水稻株叶形态中重要的组成部分之一。根据研究表明，单株水稻的叶夹角的大小与光合效率、干物质的积累等关系密切，在群体种植情况下，叶夹角的大小和水稻的种植密度、单位面积叶片数、水稻下层光照、群体的光合效率、根系活力和对逆境胁迫的耐受性有较大影响，多方面影响水稻的产量。已有研究表明，叶夹角的形成多由叶枕发育，激素水平和环境因素等参与调控，其中油菜素内酯(brassinolide，BR)被研究调控叶夹角最为深入。因此，理解调控叶夹角形成与变化的多种分子机制网络，继而通过生物技术来驱动叶夹角在区域环境的精准变化是目前分子育种中的一个待解决的问题。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供水稻RIP2蛋白在调控植物叶夹角中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种水稻RIP2蛋白突变体。
本发明的再一目的在于提供一种水稻RIP2基因突变体。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
水稻RIP2蛋白在调控植物叶夹角中的应用。
所述的RIP2蛋白属于水稻RING_Ubox家族，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
编码所述RIP2蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述的水稻RIP2蛋白在调控植物叶夹角中的应用，为通过抑制水稻RIP2蛋白的表达量和/或活性，和/或将水稻RIP2蛋白失活，以增加植物叶片的夹角。
所述的植物为单子叶植物；优选为水稻；更优选为水稻中花11。
所述的叶夹角优选为三叶期第一片叶的叶夹角。
水稻RIP2蛋白在培育夹角增大的转基因水稻中的应用。
所述的水稻RIP2蛋白在培育转基因水稻中的应用，为通过抑制水稻RIP2蛋白的表达量和/或活性，和/或将水稻RIP2蛋白失活，以增加植物叶片的夹角。
所述的抑制水稻RIP2蛋白的表达量和/或活性优选为通过如下方法实现：通过基因突变的方式使RIP2基因的第124和第125位之间插入了一个碱基T(发生移码突变)，进而抑制RIP2蛋白的表达量和/或活性。
所述的基因突变可通过GRISPR/Cas9系统靶向突变RIP2基因，达到抑制水稻中RIP2蛋白的表达量和/或活性的目的。
所述的GRISPR/Cas9系统为含有gRNA靶序列的载体pBGK037-RIP2(将gRNA靶序列连接到CRISPR/Cas载体BGK032中)。
所述的gRNA靶序列为水稻RIP2基因的CDS正义链的第108～127位，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
一种水稻RIP2蛋白突变体，为如下任一序列：
a、如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；
b、由突变型RIP2基因所编码的序列；所述的突变型RIP2基因为RIP2基因的第124和第125位之间插入了一个碱基T。
所述的RIP2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
一种水稻RIP2基因突变体，为RIP2基因的第124和第125位之间插入了一个碱基T。
含有上述RIP2基因突变体的表达载体、重组微生物或转基因细胞系。
所述的微生物为农杆菌；优选为农杆菌EHA105。
所述的细胞为植物细胞；优选为水稻细胞。
所述的水稻RIP2蛋白突变体和/或水稻RIP2基因突变体在调控植物叶夹角中的应用。
所述的植物为单子叶植物；优选为水稻；更优选为水稻中花11。
一种用于编辑所述水稻RIP2基因的gRNA靶序列在调控植物叶夹角中的应用，该gRNA靶序列为水稻RIP2基因的CDS正义链的第108～127位，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，该gRNA靶序列与CRISPR/Cas9基因编辑系统配合作用，实现RIP2蛋白的编码基因的靶向突变。
所述的植物为单子叶植物；优选为水稻；更优选为水稻中花11。
一种调控植物叶夹角的方法，为通过调控水稻中RIP2蛋白的表达量和/或活性实现。
所述的调控为通过抑制水稻中RIP2蛋白的表达量，以增加植物叶片的夹角；或通过降低水稻中RIP2蛋白的活性，以增加植物叶片的夹角；或将水稻中RIP2蛋白失活，以增加植物叶片的夹角。
所述的抑制水稻中RIP2蛋白的表达量或降低水稻中RIP2蛋白的活性为通过如下方法实现：通过基因突变的方式使RIP2基因的第124和第125位之间插入了一个碱基T(发生移码突变)，进而抑制水稻中RIP2蛋白的表达量或降低水稻中RIP2蛋白的活性。
所述的植物为单子叶植物；优选为水稻；更优选为水稻中花11。
芸苔素内酯或其相关基因与水稻RIP2基因在调控植物叶夹角中的应用，芸苔素内酯参与水稻RIP2基因对植物叶夹角的调控，本发明中通过CRISPER/Cas9技术对水稻基因RIP2进行敲除，发现野生型水稻对芸苔素内酯敏感性高，可以增加水稻叶夹角，而敲除植株在幼苗期的叶夹角对芸苔素内酯不敏感，表明RIP2基因负调控叶夹角，缺失RIP2基因的表达会影响水稻体内芸苔素内酯的信号传导。
所述的芸苔素内酯的有效浓度为0～1μmol/L(不包括0)；优选为0.01～1μmol/L。
所述的芸苔素内酯的相关基因包括BR6ox、DWARF4、D11、BRI1、BZR1、DLT、BU1、BLE1和RAVL；其中，BR6ox在mRNA水平表达下调，DWARF4、D11、BRI1、BZR1、DLT、BU1、BLE1和RAVL在mRNA水平表达上调。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明通过运用CRISPER/Cas9技术对水稻基因RIP2进行敲除，利用农杆菌介导法将敲除载体转化水稻ZH11愈伤组织，经过潮霉素和靶序列区域的检测，得到RIP2的敲除株系，与未转化的水稻相比，敲除植株能促使水稻植株幼苗期叶夹角增大。
(2)本发明中所得叶夹角相关基因表达量通过全基因组表达谱获得，全基因组表达谱数据中含51个叶夹角调控基因表达量变化符合RIP2敲除材料叶夹角增大的表型，叶夹角增大有利于增加种植密度，具有提高水稻群体光合效率，提升产量的潜在价值。
(3)本发明通过CRISPER/Cas9技术对水稻基因RIP2进行敲除，发现与未转化的水稻相比，敲除植株在幼苗期表现出叶夹角增大的特性，且敲除植株在幼苗期的叶夹角对芸苔素内酯不敏感，表明RIP2基因负调控叶夹角，缺失RIP2基因的表达会影响水稻体内芸苔素内酯的信号传导。说明失活RIP2的表达与提高水稻叶夹角密切相关。
附图说明
图1是本发明实施例1中GRISPR/Cas9敲除载体pGBK032载体及RIP2基因的靶位点编辑结果示意图和波峰图(WT为中花11)；其中，A为GRISPR/Cas9敲除载体pGBK032载体；B为RIP2基因的靶位点编辑结果示意图；C为RIP2基因的靶位点编辑波峰图。
图2是本发明实施例1中叶夹角表型及数据统计图；其中，A为叶夹角表型；B为叶夹角数据统计图。
图3是本发明实施例2中水稻RIP2蛋白在水稻原生质体中的亚细胞定位图。
图4是本发明实施例3中ZH11和rip2对BR的响应图；其中，A为外源施加100nM的芸苔素内酯的叶夹角的应答情况；B为外源施加不同浓度的芸苔素内酯的叶夹角的应答情况。
图5是本发明实施例3中BR生物合成和信号传导部分基因在ZH11和rip2中表达变化图；其中，A为ZH11和rip2中BR生物合成相关基因的相对表达量测定结果；B为ZH11和rip2中BR信号传导相关基因的相对表达量测定结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
本发明中涉及的野生型水稻为中花11号(ZH11)，可通过常规市售获得。
本发明实施例中涉及的pBGK032质粒购于百格公司。
本发明实施例中涉及的pRTVcGFP质粒参考文献(He F,Zhang F,Sun W,et al.AVersatile Vector Toolkit for Functional Analysis of Rice Genes[J].Rice,2018,11(1):27.)获得。
本发明实施例中涉及的全基因表达模式委托诺禾致远公司进行。
实施例1、抑制水稻基因RIP2的表达能够增大叶夹角
本实施例中所涉及的基因RIP2来自于水稻(Oryza sativa L.)，基因RIP2的序列如SEQ ID No.1所示，编码SEQ ID No.2所示的RIP2蛋白。本实施例将运用CRISPER/Cas9技术对水稻基因RIP2进行敲除，进而研究其对水稻植株叶夹角的影响。具体如下：
一、基因敲除及验证
(1)RIP2基因敲除
水稻RING_Ubox家族的基因RIP2在水稻基因组注释计划中基因编号为Os10g0445400(SEQ ID NO.1：RIP2完整的读码框序列，其氨基酸序列为序列表中的SEQ IDNO.2)。CRISPR/Cas9基因敲除的载体pBGK032-RIP2的构建及转化委托百格公司进行：选取基因RIP2的CDS序列的108～127bp的序列为靶位点(SEQ ID NO.3：CTTGCGGGATTACGACGGGG，下划线部分为PAM序列)，连接到敲除载体pBGK032中，构建pBGK032-RIP2载体，再通过农杆菌EHA105介导，侵染水稻中花11的愈伤组织，获得转基因rip2的敲除株系。
(2)水稻基因组DNA的提取
离心管加入约1cm的rip2突变体三叶期的水稻叶片，加入钢珠与500μl TPS(100mMTris-HCL(pH 8.0)，10mM EDTA(乙二胺四乙酸，pH 8.0)，1M KCl，灭菌常温保存)，60Hz，100s组织研磨机研磨；74℃水浴30min，10000rpm离心5min；回收300μl上清加入1.5mL离心管，再加入300μl预冷无水乙醇，混匀，-20℃静置30min；10000rpm离心5min，弃上清，过夜倒置，加入200μl ddH2O混匀为基因组DNA水溶液。
(3)转基因阳性检测
检测主要采用PCR法，以水稻基因RIP2敲除T0代材料的基因组DNA为模板，采用引物对HPT-F(5’-CGAGAGCCTGACCTATTGCAT-3’)和HPT-R(5’-CTGCTCCATACAAGCCAACCAC-3’)进行PCR扩增。PCR程序为预变性95℃，5min，进入PCR循环，参数为变性95℃，30s，退火55℃，30s，延伸72℃，30s，共30个循环，再延伸72℃，10min。筛选得到T0代阳性转基因植株(阳性植株PCR扩增产物大小为481bp)。
(4)敲除材料靶序列基因型检测
以水稻基因RIP2敲除T0代材料的基因组DNA为模板，采用引物对SG4995-F(5’-ATGAGCTGTGAGTTCTTCCT-3’)和SG4995-R(5’-GTGTGGGCGAGACCTTGTAG-3’)进行PCR扩增。PCR程序为预变性95℃，5min，进入PCR循环，参数为变性95℃，30s，退火55℃，30s，延伸72℃，30s，共30个循环。筛选得到T0代阳性转基因植株(阳性植株PCR扩增产物大小为251bp)。
结果如图1所示，我们获得插入1bp的突变株系(在RIP2的第124和第125位之间插入了一个碱基T，造成移码突变，突变后的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)，进行表型观察。
二、水稻突变体的表型鉴定
分别观察20株野生型中花11和20株上述筛选得到的敲除材料rip2的叶夹角。播种后正常生长10d至三叶一心期，对第一叶叶枕部位拍照，使用软件image J对不完全叶的叶夹角进行测量，3次重复，以叶枕为交点，叶片为一边线，叶鞘为一边线。其发育表型如图2所示：可以看到rip2材料对比野生型有显著的叶夹角增大的表型。说明失活RIP2蛋白的表达可以提高叶夹角。
实施例2、RIP2的表达模式
一、融合蛋白RIP2-GFP载体的构建
(1)水稻总RNA的提取
选取野生型水稻中花11的三叶期叶片为材料，液氮研磨约10min至粉末状；取约100mg于离心管，加入1mL Trigol(来自总RNA提取试剂盒)，涡旋振荡10s，室温静置10min；加入200μl三氯甲烷，涡旋振荡10s，室温静置10min，4℃预冷离心机11000rpm，离心5min；取上层水相450μl至新的1.5mL管，加入450μl异丙醇，轻柔混匀，室温沉淀10min，4℃，11000rpm，离心10min；弃上清，加入1mL 75％(v/v)乙醇洗涤白色沉淀，静置2min，4℃，11000rpm，离心2min；弃上清，超净工作台放置约5min使酒精挥发；加入DEPC水40μl，65℃水浴10min令RNA溶解，水溶液保存于-80℃。
(2)第一链cDNA的反转录
按照Applied Biologic Materials公司的5×All-In-One RT MasterMix(withAccuRT Genomic DNA Removal Kit)的操作说明对提取的总RNA进行反转录：测量水稻总RNA的OD260/280；冰上tube管中加入2μg RNA，2μl 4×AccuRT Reaction Mix，加RNase&DNaseFree H2O补足8μl体系，室温放置5min；挪至冰上操作，加入2μl 5×AccuRT ReactionStopper混匀；再加入4μl All-In-One RT MasterMix，使用6μl RNase&DNase Free H2O补足20μl体系；通过PCR仪孵育(25℃，10min；42℃，15min；85℃，5min)反转录得到第一链cDNA产物，-20℃保存。
(3)构建质粒pRTVcGFP-RIP2
根据RIP2基因序列(SEQ ID NO.1)设计引物对RIP2-nGFP-F
(5’-CGGGATCCATGAGCTGTGAGTTCTTCC-3’)和RIP2-nGFP-R
(5’-CGGGATCCATGAGCTGTGAGTTCTTCC-3’)(下划线序列为BamHⅠ和KpnⅠ位点)。以中花11的cDNA为模板，使用高保真酶进行PCR扩增。PCR程序为预变性94℃，2min，进入PCR循环，参数为变性98℃，10s，退火57℃，30s，延伸68℃，30s，共30个循环，再延伸68℃，10min。获得RIP2 CDS片段(扩增产物大小为757bp)。扩增产物经过琼脂糖凝胶回收试剂盒回收该片段，利用BamHⅠ和KpnⅠ双酶切目的基因和质粒pRTVcGFP，使用T4 DNA连接酶16℃，6h连接，转化大肠杆菌DH-5α感受态细胞，经50μg/ml卡那霉素抗性平板筛选得到质粒pRTVcGFP-RIP2。
二、亚细胞定位
水稻原生质体的制备
(1)配制W5溶液：154mM氯化钠，125mM氯化钙，5mM氯化钾，2mM2-吗啉乙磺酸，pH5.7。
(2)将野生型水稻ZH11籽粒去壳，75％(v/v)酒精洗1min，无菌水洗3遍，5％(w/v)NaClO浸泡30min，无菌水洗3遍，置于1/2MS培养基(2.47g/L MS，20g/L蔗糖，15g/L琼脂粉)中，30℃/28℃，16h光培养/8h暗培养，10d后获得组培苗。然后将组培苗的根部至第一片叶之间的地上部，切至0.5mm到50mL锥形瓶中，加入抽滤灭菌的20mL酶解液(1.5％纤维素酶，0.3％离析酶，0.4M甘露醇，2mM 2-吗啉乙磺酸，0.1×W5，pH 5.7)锡纸包裹避光(纤维素酶和离析酶购自日本Yakult公司)；将锥形瓶置于真空泵中-20kP，30min；再将锥形瓶置于恒温培养箱，26℃，40rpm，4h；轻柔移去上清液，加入20mL W5溶液，再次置于恒温培养箱中26℃，80rpm，1h；将溶液轻柔过滤至50mL圆底离心管中，在锥形瓶中加入10mL W5溶液，用力摇晃1min使原生质体充分释放；1000g，28℃缓慢离心5min，弃上清；缓慢加入10mL W5溶液，1000g，28℃缓慢离心5min，弃上清；将沉淀轻摇匀，取1μl镜检，加入适量W5溶液将原生质体浓度数稀释至2×106，冰上放置待用。
(3)原生质体分离及原生质体转化步骤参考文献(A highly efficient ricegreen tissue protoplast system for transient gene expression and studyinglight/chloroplast-related processes)借助PEG(聚乙二醇)介导pRTVcGFP-RIP2转化到水稻原生质体中，结果如图3所示，RIP2-GFP和高尔基体Maker荧光相融合，表明RIP2定位于高尔基体中。
实施例3、水稻基因RIP2和BR的关系
(1)将野生型水稻中花11号(ZH11)和实施例1中筛选得到的rip2突变体使用水稻水培液28℃/26℃，9h/15h种植至二叶一心期。无水乙醇溶解芸苔素内酯(BL)为0.01μM，0.1μM，1μM。材料第一片叶叶枕处点1μl无水乙醇做为对照组，实验组在材料第一片叶叶枕处点分别施加等体积0.01、0.1和1μM芸苔素内酯溶液。原环境培养3d，对每株材料第一片叶的夹角处进行拍照观察，并使用image J测量其叶夹角变化(3次重复)。
结果如图4所示，可以看出ZH11在0～1μM梯度下其叶夹角分别为11°(无水乙醇对照)、27°、72°、96°，rip2在0～1μM梯度下其叶夹角分别为37°(无水乙醇对照)、34°、49°、51°。说明ZH11对芸苔素内酯BR敏感性高，rip2对芸苔素内酯BR敏感性低。
(2)提取ZH11和rip2突变体材料三叶期叶枕部位的RNA，反转录获得cDNA(方法参考实施例2)，选取BR生物合成和信号传导通路的部分基因进行qRT-PCR(actin作为内参基因)，验证BR相关基因的表达量变化。
结果如图5所示，相比于ZH11，rip2材料中BR相关基因BR6ox在mRNA水平表达下调，DWARF4、D11、BRI1、BZR1、DLT、BU1、BLE1和RAVL在mRNA水平表达上调，表明BR参与水稻基因RIP2对叶夹角的调控。
表1 qRT-PCR引物序列
Figure BDA0002641798560000081
Figure BDA0002641798560000091
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 水稻RIP2蛋白在调控植物叶夹角中的应用
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2212
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> RIP2基因
<400> 1
ggggctcgga ttagagttgg actcggcaac gcgacgagca ccaaaagcga gggaagaaaa 60
ccaatccgaa tccggagaga gaagcgcagg aggcaaaatc cactccaatt caacccaatc 120
acccgcggcg agccgagcgg gcggcggagc acgacgacga cgaggtttag gtaggggttc 180
ttggcttgtc ggcgtcggcg gcggcggcgg cggaggagga ggaggagtca gcgatgcgga 240
ggaggttcca ggactccgtc aaggccctcg aggccgacat cgagcacgcc aatgagctgt 300
gagttcttcc tcccttcgcc ggtcgcggct cgtggacggt ggtggtggtg gggggtttgc 360
gtgtggttca tctctctctt ttgcagggcg tcggagttct tgcgggatta cgacggggcg 420
gtgatccaga tgcggatggc gtacagcgcc gtcgcgcact tcctcgtgca gtggatcgac 480
tgcaagctcg ccggcgcgct cggcctcctc aagatcatga tctacaaggt ctcgcccaca 540
cccccgcgcc atcgccaatt cgcagctgat ttctcaccgg ctgggtaact aactaactaa 600
ctaactaact aactaatcac cgggttcttg ctggtaaatc gaatgcaggt gtacgccgat 660
ggcaccacgg ctctgccgga gtgggagagg gaggccagca tcaggcaatt ctacggtact 720
actactcaat cgcaaccatc tcctaacaac aagaacacga gcgattcaat ttcatggttg 780
tgatttctca aatttttttt gggtcgctgc aggtgtcatc ttcccgtcgc tgctccagct 840
gccgagtggg ataactgaat tggacgacag gaagcagagg aggctgtgcc ttcagaagtt 900
caggaaggtg gaggagaggg tctcggaggt ggatttggag agggagctcg agtgcggcat 960
ctgcctcgag gtgaatgcca agattgtgct gcccgattgc gcgcactcgc tgtgcatgag 1020
atgcttcgag gattggtaat ttgccctcct ccttcccctt taatttcccc tctccttaca 1080
ttttcgcgca tgcgccaaca caaacataga gatattaggt actatcaatt gttcatgtta 1140
gaatcaaata tagctgttgc gtgctctagg agacaaaatt tcgtttacct gaatgtggtg 1200
ttcaagaaag agagaaaaag attacctttg ccatatattg gctggttgtg ttcctcagga 1260
tgtaaagtca gttgtaaatc tcctgcactt ctgatagagt accacaatgc cctctccaca 1320
gagtctttaa ccatcttcat gcatcaagat gtagtccatc caatcaaacc tgcatccaga 1380
atgactttat ttataactgc agcaaacatt ctattgaact atgtcctgct cttgagcagg 1440
taataactta ttgatgtaaa agaagtaggc aaatagtcac aaaatgaact atatcataga 1500
tcggttgcat gatgctcctc caaaatacaa acctctgtat ctggtaacaa ttctcacctt 1560
ggttgaaggt tacacacgcg cacacacagt ctttgcatac tctcttatgc tgttagaaaa 1620
ctatgttgtt ctcagttcat tgtatggttg acttcacttt ccttatagtc aatcctaagt 1680
tgagagtgaa tcattaacca ctccttgtca gcaagcacaa caagatctgc aaccttgtcc 1740
gtactcttcc tacttgccga ggcgttcact tcgtctgatg catgaatctg atcgaattcc 1800
gtgggccatt taacgaaatt tggcttgtca catatgcagg aacaccaaat caaagtcgtg 1860
ccccttctgc cgcgcctgcc tcaagaaggt gaatccgagc agcctgtggt tgtacaccga 1920
cgaccgcgat gttgtggata tggatacgtt gactagggag aacattaggc gcctgttcat 1980
gttcataagt aagcttccac ttgtagtgct ccatgtggtt gaccttgaca tttacgagta 2040
ccgtatcaag tgaaactgta ctcttttgtt cataccggtg ggtctctgta catatcaaat 2100
tcatcggtgc tgatctgtga tagctcaacc tgaggctgca aattagcaga gttgtttgta 2160
gctcaacgag ttgataatat ttttgtgaaa agaagatgct gaagtgtact cc 2212
<210> 2
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> RIP2蛋白
<400> 2
Met Ser Cys Glu Phe Phe Leu Pro Ser Pro Val Ala Ala Arg Gly Arg
1 5 10 15
Trp Trp Trp Trp Gly Val Cys Val Trp Phe Ile Ser Leu Phe Cys Arg
20 25 30
Ala Ser Glu Phe Leu Arg Asp Tyr Asp Gly Ala Val Ile Gln Met Arg
35 40 45
Met Ala Tyr Ser Ala Val Ala His Phe Leu Val Gln Trp Ile Asp Cys
50 55 60
Lys Leu Ala Gly Ala Leu Gly Leu Leu Lys Ile Met Ile Tyr Lys Val
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Gly Thr Thr Ala Leu Pro Glu Trp Glu Arg Glu Ala Ser
85 90 95
Ile Arg Gln Phe Tyr Gly Val Ile Phe Pro Ser Leu Leu Gln Leu Pro
100 105 110
Ser Gly Ile Thr Glu Leu Asp Asp Arg Lys Gln Arg Arg Leu Cys Leu
115 120 125
Gln Lys Phe Arg Lys Val Glu Glu Arg Val Ser Glu Val Asp Leu Glu
130 135 140
Arg Glu Leu Glu Cys Gly Ile Cys Leu Glu Val Asn Ala Lys Ile Val
145 150 155 160
Leu Pro Asp Cys Ala His Ser Leu Cys Met Arg Cys Phe Glu Asp Trp
165 170 175
Asn Thr Lys Ser Lys Ser Cys Pro Phe Cys Arg Ala Cys Leu Lys Lys
180 185 190
Val Asn Pro Ser Ser Leu Trp Leu Tyr Thr Asp Asp Arg Asp Val Val
195 200 205
Asp Met Asp Thr Leu Thr Arg Glu Asn Ile Arg Arg Leu Phe Met Phe
210 215 220
Ile Ser Lys Leu Pro Leu Val Val Leu His Val Val Asp Leu Asp Ile
225 230 235 240
Tyr Glu Tyr Arg Ile Lys
245
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> gRNA靶序列
<400> 3
cttgcgggat tacgacgggg 20
<210> 4
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> RIP2蛋白突变体
<400> 4
Met Ser Cys Glu Phe Phe Leu Pro Ser Pro Val Ala Ala Arg Gly Arg
1 5 10 15
Trp Trp Trp Trp Gly Val Cys Val Trp Phe Ile Ser Leu Phe Cys Arg
20 25 30
Ala Ser Glu Phe Leu Arg Asp Tyr Asp Val Gly Gly Asp Pro Asp Ala
35 40 45
Asp Gly Val Gln Arg Arg Arg Ala Leu Pro Arg Ala Val Asp Arg Leu
50 55 60
Gln Ala Arg Arg Arg Ala Arg Pro Pro Gln Asp His Asp Leu Gln Gly
65 70 75 80
Val Arg Arg Trp His His Gly Ser Ala Gly Val Gly Glu Gly Gly Gln
85 90 95
His Gln Ala Ile Leu Arg Cys His Leu Pro Val Ala Ala Pro Ala Ala
100 105 110
Glu Trp Asp Asn
115
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HPT-F
<400> 5
cgagagcctg acctattgca t 21
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HPT-R
<400> 6
ctgctccata caagccaacc ac 22
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SG4995-F
<400> 7
atgagctgtg agttcttcct 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SG4995-R
<400> 8
gtgtgggcga gaccttgtag 20
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> RIP2-nGFP-F
<400> 9
cgggatccat gagctgtgag ttcttcc 27
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> RIP2-nGFP-R
<400> 10
cgggatccat gagctgtgag ttcttcc 27
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> actinF
<400> 11
tccagcagat gtggattgcc aagg 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> actinR
<400> 12
tctggtaccc tcatcaggca tctg 24
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> qRT-BR6ox-F
<400> 13
gcaaggaaga agcttgtt 18
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> qRT-BR6ox-R
<400> 14
ggaccaaaag aatacaggag 20
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> qRT-BLE1-F
<400> 15
gtcatgatga tcactcacat ggtc 24
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> qRT-BLE1-R
<400> 16
tatcttcgag gatttcatcg cgac 24
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> qRT-RAVL-F
<400> 17
tcctcaccaa ctccacatta cggt 24
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> qRT-RAVL-R
<400> 18
cagatcgaga tccaacgagg a 21
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> qRT-DWARF4-F
<400> 19
aaggacgtgc actacaaggg 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> qRT-DWARF4-R
<400> 20
aaggggaaga cgaaggcttg 20
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tgatcctgct tgctttgctg c 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> qRT-D11-R
<400> 22
gaacctcagc gtctcaccaa g 21
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> qRT-BRI1-F
<400> 23
tcagaacaac tacctcaccg gcg 23
<210> 24
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> qRT-BRI1-R
<400> 24
gccggttgct cgccaaa 17
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> qRT-GSK2-F
<400> 25
ctggttcttt cggtatcgtc t 21
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> qRT-GSK2-R
<400> 26
atattgggtt cacctgggac 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> qRT-OsBZR1-F
<400> 27
cctacaacct cgtcaacccg 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> qRT-OsBZR1-R
<400> 28
tgaaatcgcc caaatcgcag 20
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> qRT-DLT-F
<400> 29
catcaatcca ttgcagggac gat 23
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> qRT-DLT-R
<400> 30
cgttgagcgt gaagtgcagg aa 22
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> qRT-BU1-F
<400> 31
gtagccagct tgatctcatc tc 22
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> qRT-BU1-R
<400> 32
gggacgactc tactgcatca 20

Claims (8)

1.水稻RIP2蛋白在调控植物叶夹角中的应用，其特征在于：通过抑制水稻RIP2蛋白的表达量或活性，或将水稻RIP2蛋白失活，以增加植物叶片的夹角；
所述的抑制水稻RIP2蛋白的表达量或活性通过如下方法实现：通过基因突变的方式使RIP2基因的第124和第125位之间插入了一个碱基T，进而抑制RIP2蛋白的表达量和/或活性；
所述的植物为水稻；
所述的RIP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.水稻RIP2蛋白在培育夹角增大的转基因水稻中的应用，其特征在于：通过抑制水稻RIP2蛋白的表达量或活性，或将水稻RIP2蛋白失活，以增加植物叶片的夹角；
所述的抑制水稻RIP2蛋白的表达量或活性通过如下方法实现：通过基因突变的方式使RIP2基因的第124和第125位之间插入了一个碱基T，进而抑制RIP2蛋白的表达量和/或活性；
所述的植物为水稻；
所述的RIP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种水稻RIP2蛋白突变体，其特征在于，为如下任一序列：
a、如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；
b、由突变型RIP2基因所编码的序列；所述的突变型RIP2基因为RIP2基因的第124和第125位之间插入了一个碱基T；
所述的RIP2基因序列如SEQ ID NO.1所示。
4.一种水稻RIP2基因突变体，其特征在于：为RIP2基因的第124和第125位之间插入了一个碱基T；
所述的RIP2基因序列如SEQ ID NO.1所示。
5.含有权利要求4所述的RIP2基因突变体的表达载体、重组微生物或转基因细胞系。
6.权利要求3所述的水稻RIP2蛋白突变体和/或权利要求4水稻RIP2基因突变体在调控植物叶夹角中的应用，其特征在于：所述的植物为水稻。
7.一种用于编辑水稻RIP2基因的gRNA靶序列在调控植物叶夹角中的应用，其特征在于：
所述gRNA靶序列为水稻RIP2基因的CDS正义链的第108～127位，其核苷酸序列如SEQID NO.3所示；
所述的RIP2基因序列如SEQ ID NO.1所示；
所述的植物为水稻。
8.一种调控植物叶夹角的方法，其特征在于：为通过调控水稻中RIP2蛋白的表达量和/或活性实现；
所述的调控为通过抑制水稻中RIP2蛋白的表达量，以增加植物叶片的夹角；或通过降低水稻中RIP2蛋白的活性，以增加植物叶片的夹角；或将水稻中RIP2蛋白失活，以增加植物叶片的夹角；
所述的抑制水稻中RIP2蛋白的表达量或降低水稻中RIP2蛋白的活性为通过如下方法实现：通过基因突变的方式使RIP2基因的第124和第125位之间插入了一个碱基T，进而抑制水稻中RIP2蛋白的表达量或降低水稻中RIP2蛋白的活性；
所述的RIP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述的植物为水稻。
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