CN108660249A - 一种水稻nog1基因的功能标记及其应用 - Google Patents

一种水稻nog1基因的功能标记及其应用 Download PDF

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邹虎成
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Abstract

本发明公开了一种水稻NOG1基因的功能标记及其应用。本发明基于水稻NOG1基因在启动子区域存在一处12bp的InDel，根据该InDel设计合成了2条引物：NOG‑F和NOG‑R，两条引物在同一PCR体系中对水稻DNA进行扩增，然后对扩增产物通过电泳检测NOG1基因的基因型。利用该功能标记该水稻NOG1基因的功能标记可在水稻苗期区分水稻材料为每穗粒数多类型水稻还是每穗粒数少类型水稻，因而可快速地进行大规模的亲本材料基因型筛选、和/或后代基因型的早期选择，进而加快育种进程。

Description

一种水稻NOG1基因的功能标记及其应用
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，特别涉及一种水稻NOG1基因的功能标记及其应用。
背景技术
水稻作为最早被驯化的作物之一，养育了世界上三分之一的人口。随着人口数量日益增长，以及耕地面积的缩小，为保障世界粮食安全，必须要提高水稻单位面积产量。
水稻单位产量由穗粒数、穗数和千粒重所决定，高产的水稻品种应具有穗粒和有效穗数多，千粒重大的特征，它们是高产育种的基本目标。水稻的穗粒数水稻NOG1定位在水稻第1染色体上，是控制水稻穗粒数的主效基因。该基因编码一个烯酰辅酶A水合酶/异构酶(ECH)，是脂肪酸β氧化途径中的关键酶。研究表明，NOG1在水稻抽穗前的所有时期和组织部位均有表达；原位杂交表明，该基因在发育中幼穗的枝梗原基中表达比幼穗中的其他地方高。多/少穗粒数水稻之间NOG1的启动子区域有一处12bp的插入缺失以及15个SNP位点的差异，穗粒数多少的改变主要是由于12bp的插入缺失所引起。该12bp序列是一个转录转录因子结合位点，因拷贝数不同，影响NOG1基因转录水平。研究表明多粒型材料(Guichao2)有2个12bp的拷贝，少粒型(SIL76)只有1个拷贝。研究NOG1的过表达水稻植株证明，该基因的转录水平可以显著提高籽粒数量，同时不会给穗粒数、粒重、结实率和抽穗期带来负面影响，说明NOG1基因在水稻高产育种中能发挥重要的作用。在水稻的长期种植中，多粒型的NOG1基因型原则上应受到人工选择；但事实上，目前仍有相当一部分的水稻品种携带的NOG1基因性为少粒型。
作为控制水稻产量性状的重要基因，目前尚未有针对NOG1开发的功能标记。使得对该基因座位的育种亲本材料选择带有一定盲目性，也无法通过分子标记对子代材料进行早期的分子标记选择。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种水稻NOG1基因的功能标记。
本发明的另一目的在于提供所述水稻NOG1基因的功能标记的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种水稻NOG1基因的功能标记，所述的水稻NOG1基因的共显性功能标记NOG通过如下两条引物获得功能标记，序列方向为5’-3’：
NOG-F：GGGATATTGATTGATGCTGG；
NOG-R：GCACCCAAGAGTTAATCAGA。
所述的引物用于扩增水稻基因组DNA时，在每穗粒数少类型水稻中显示为150bp的片段，在每穗粒数多类型水稻中显示为162bp的片段。
所述的水稻NOG1基因的功能标记，采用以下步骤进行分子标记：
(1)提取水稻基因组DNA；
(2)PCR扩增：将所述的NOG-F和NOG-R加到PCR反应体系中，并对步骤(1)中提取得到的水稻基因组DNA进行扩增，得到扩增产物；
(3)将步骤(2)中得到的扩增产物进行凝胶电泳，并进行染色，得到电泳图；
(4)根据步骤(3)中得到的电泳图进行分析，如果显示为150bp的片段，则为每穗粒数少类型水稻，如果显示为162bp的片段，则为每穗粒数多类型水稻。
步骤(1)中所述的水稻基因组DNA的提取方法为常规提取方法；优选为TPS简易法。
步骤(2)中所述的PCR的反应体系为20μl反应体系：2.0μl的10×PCR buffer；0.5μl的10mM dNTPs；10μM的NOG-F和10μM的NOG-R各0.5μl；0.2μl的Taq DNA聚合酶，2.0μl的模板DNA；14.3μl的ddH2O。
步骤(2)中所述的PCR的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，34个循环；最后72℃延伸5min。
步骤(3)中所述的凝胶电泳为在聚丙烯酰胺变性凝胶中进行电泳；优选为在6％(w/w)聚丙烯酰胺变性凝胶中进行电泳。
步骤(3)中所述的染色为采用硝酸银进行染色。
所述的水稻NOG1基因的功能标记在水稻育种中的应用，该水稻NOG1基因的功能标记可快速地进行大规模的亲本材料基因型筛选和/或后代基因型的早期选择，进而加快育种进程。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)水稻的产量性状是数量性状，是由基因组中大量基因调控的(当然最终产量还受到各种栽培措施的影响)，其中NOG1基因是其中的一个主效基因，本发明针对NOG1基因开发了区分多/少粒基因型的功能标记，通过功能标记，可以判断水稻品种在NOG1的这个位点上是“少粒型(每穗粒数少类型)”还是“多粒型(每穗粒数多类型)”，如是“少粒型”，则可通过改良这个基因座位获得更高的产量水稻材料品种品种；如是“多粒型”，则说明想要获得更高的产量只能通过改良其他的基因座位了。因此，本发明提供的功能标记可以为水稻高产育种中提供技术支持，从而为水稻的育种节省时间和成本。
(2)本发明利用PCR和电泳技术即可有效地对水稻NOG1基因进行基因型筛选鉴别，可在水稻苗期区分水稻材料的NOG1基因类型；利用本发明的功能标记，可快速高通量地对育种亲本以及杂交后代进行NOG1基因型的选择；从而加速NOG1基因在水稻高产育种中的利用。
附图说明
图1是本发明NOG功能标记的位置示意图(扩增区段的方框内碱基为12bpInDel，图中显示为单拷贝类型；扩增区域带有下划波浪线的序列为NOG-R结合位置)。
图2是本发明NOG功能标记检测8个水稻品种的电泳图；其中，M为DNA分子量marker；泳道1～8分别是籼稻品种成龙水晶米、粳稻品种日本晴、籼稻品种马尾粘、籼稻品种特青、籼稻品种矮脚南特、粳稻品种桂花黄、粳稻品种铁秆乌稻、粳稻品种京稻1号。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。以下实施例中的实验方法均为常规方法，所涉及的实验试剂均为常规生化试剂。
实施例1设计功能标记
基于水稻NOG1基因在启动子区域存在一处12bp的InDel(插入缺失标记)，根据该InDel设计了PCR功能标记。
水稻NOG1基因共显性功能标记命名为NOG，其中，NOG包括2条引物，引物序列如下(引物方向为5’-3’)：
NOG-F：GGGATATTGATTGATGCTGG；
NOG-R：GCACCCAAGAGTTAATCAGA。
实施例2利用功能标记NOG检测8个水稻品种
(1)提取8个水稻品种(籼稻品种成龙水晶米、粳稻品种日本晴、籼稻品种马尾粘、籼稻品种特青、籼稻品种矮脚南特、粳稻品种桂花黄、粳稻品种铁秆乌稻、粳稻品种京稻1号)的基因组DNA：分别取苗期水稻叶片，通过TPS简易法获得水稻基因组DNA。
(2)PCR扩增
PCR反应体系为20μl：2.0μl的10×PCR buffer；0.5μl的10mM dNTPs；10μM的两种引物(实施例1中的NOG-F和NOG-R)各0.5μl；0.2μl的Taq DNA聚合酶，2.0μl的模板DNA；14.3μl的ddH2O。
PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，34个循环；最后72℃延伸5min后得到扩增产物；。
(3)扩增产物的检测
将扩增产物在6％(w/w)聚丙烯酰胺变性凝胶中进行电泳，硝酸银染色得到电泳图。
(4)结果与分析
电泳结果如图2所示，经NOG功能标记检测，扩增片段大小与图1中设计目标一致：多粒材料籼稻品种成龙水晶米、特青、矮脚南特和粳稻品种桂花黄、铁秆乌稻、京稻1号，经NOG功能标记检测，显示162bp的片段；少粒品种籼稻品种马尾粘和粳稻品种日本晴，NOG功能标记检测，显示为150bp的片段。结果表明NOG功能标记能很好地区分少粒和多粒品种，可用于水稻NOG1基因型的分子标记辅助选择。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种水稻NOG1基因的功能标记及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> NOG-F
<400> 1
gggatattga ttgatgctgg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> NOG-R
<400> 2
gcacccaaga gttaatcaga 20

Claims (6)

1.一种水稻NOG1基因的功能标记，其特征在于，所述的水稻NOG1基因的共显性功能标记NOG通过如下两条引物获得功能标记：
NOG-F：GGGATATTGATTGATGCTGG；
NOG-R：GCACCCAAGAGTTAATCAGA。
2.根据权利要求1所述的水稻NOG1基因的功能标记，其特征在于：所述的引物用于扩增水稻基因组DNA时，在每穗粒数少类型水稻中显示为150bp的片段，在每穗粒数多类型水稻中显示为162bp的片段。
3.根据权利要求1所述的水稻NOG1基因的功能标记，其特征在于，采用以下步骤进行分子标记：
(1)提取水稻基因组DNA；
(2)PCR扩增：将所述的NOG-F和NOG-R加到PCR反应体系中，并对步骤(1)中提取得到的水稻基因组DNA进行扩增，得到扩增产物；
(3)将步骤(2)中得到的扩增产物进行凝胶电泳，并进行染色，得到电泳图；
(4)根据步骤(3)中得到的电泳图进行分析，如果显示为150bp的片段，则为每穗粒数少类型水稻，如果显示为162bp的片段，则为每穗粒数多类型水稻。
4.根据权利要求3所述的水稻NOG1基因的功能标记，其特征在于：
步骤(2)中所述的PCR的反应体系为20μl反应体系：2.0μl的10×PCR buffer；0.5μl的10mM dNTPs；10μM的NOG-F和10μM的NOG-R各0.5μl；0.2μl的Taq DNA聚合酶，2.0μl的模板DNA；14.3μl的ddH2O；
步骤(2)中所述的PCR的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，34个循环；最后72℃延伸5min。
5.根据权利要求3所述的水稻NOG1基因的功能标记，其特征在于：
步骤(3)中所述的凝胶电泳为在聚丙烯酰胺变性凝胶中进行电泳；
步骤(3)中所述的染色为采用硝酸银进行染色。
6.权利要求1～5任一项所述的水稻NOG1基因的功能标记在水稻育种中的应用。
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