CN101560532B - L-茶氨酸酶法转化制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及L-茶氨酸酶法转化制备方法。该制备方法以L-谷氨酸-γ-烷基酯或L-谷氨酰肼和乙胺作为原料，将含有γ-谷氨酰转肽酶的菌体细胞或该酶提取液与含有L-谷氨酸-γ-烷基酯或L-谷氨酰肼和乙胺的水溶液混合，在25℃～60℃下进行酶促反应，利用等电点结晶或等电点结晶与离子交换树脂相结合的方法分离转化产物，得到高纯度的L-茶氨酸。该方法以L-谷氨酸-γ-烷基酯或L-谷氨酰肼为主要原料，具有原料价格低廉，操作简便，转化时间短，生产成本低等优点。
Description
一、技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及L-茶氨酸的酶法转化制备方法。
二、背景技术
L-茶氨酸(L-Theanine)是一种存在于茶叶中的天然氨基酸，其结构式为：CH3CH2NHCOCH2CH2CH(NH2)COOH。它是茶叶中的主要游离氨基酸和主要呈味物质。由于L-茶氨酸具有降低血压，松弛神经，减肥，抗疲劳，提高免疫力等多种生理功能，所以在食品、保健品及药品领域应用广泛。
根据目前文献报导，L-茶氨酸的制备方法主要有以下三种：
1、从茶叶中提取
茶叶中L-茶氨酸含量较为丰富。该法用开水浸泡茶叶，然后用有机溶剂萃取和离子交换分离来提取L-茶氨酸。目前该法存在的主要问题是工序多，得率比较低，成本较高。
2、化学合成法
1942年，以色列人N.Lichtenstein(J.Am.Chem.Soc.，1942，64，1021-1022)首次在实验室用吡咯烷酮酸和33％乙胺水溶液反应得到茶氨酸，该方法收率较低。
2004年，陈新等(CN 1280261C，2004)用L-吡咯烷酮酸与无水乙胺，在抗氧化剂存在或用干燥乙胺气体排尽空气环境下进行反应，L-茶氨酸收率达58％。
2005年，焦庆才等(CN 1228314C，2005)用邻苯二甲酰基作为保护基，脱水生成N-邻苯二甲酰-L-谷氨酸酐，与2mol/L乙胺水溶液反应生成中间产物N-邻苯二甲酰-L-茶氨酸，以水合肼反应除保护基，L-茶氨酸收率超过50％。
虽然化学合成法比从茶叶中直接提取步骤更简单，但化学合成过程中需要对活性基团进行保护和去保护，并且合成出来的茶氨酸常含有D型产物，需要经拆分才能得到L型茶氨酸。
3、酶法合成
近年来微生物酶法合成L-茶氨酸发展迅速，常用的酶有谷氨酰胺酶、谷氨酰胺合成酶和γ-谷氨酰转肽酶。
2002年，日本人H.Suzuki等(Enzyme and Microbial Technology，2002，31(6)，884-889)首次利用从转基因大肠杆菌SH642(含有重组质粒pUC18-GGT)中得到的γ-谷氨酰转肽酶作催化剂，以L-谷氨酰胺和乙胺混合溶液为底物生物催化合成L-茶氨酸，底物转化率为60％。
2005年，日本太阳化学株式会社立木隆等(CN 1688705A，2005)利用从土壤中分离的具有谷氨酰胺酶活性的香茅醇假单胞菌GEA作为L-茶氨酸产生菌，以L-谷氨酰胺和乙胺为底物合成L-茶氨酸。
2007年，王贤波等(茶叶科学，2007，27(1)，61～66)利用转基因大肠杆菌(含有重组质粒pET-GGT)，催化L-谷氨酰胺和盐酸乙胺反应生成L-茶氨酸，L-谷氨酰胺转化率为48.22％。
2007年，日本人Senba Hisao等(JP 2007185132A)利用谷氨酰胺酶催化L-谷氨酸-γ-乙酯和乙胺反应生成L-茶氨酸，L-谷氨酸-γ-乙酯转化率为71％。
2008年，贾晓鹤等(食品工业科技，2008，29(2)，166～169)利用转基因大肠杆菌(含有重组质粒pET28a-GGT)粗酶液作为催化剂，催化L-谷氨酰胺和乙胺合成L-茶氨酸，L-谷氨酰胺转化率达到57.8％。
2008年，江波等(CN 101343618A，2008)利用具有γ-谷氨酰转肽酶活性的枯草芽孢杆菌SK11.004(CCTCC NO：M 208083)，催化L-谷氨酰胺和乙胺合成L-茶氨酸，转化率达80％以上。
2008年，姚忠等(CN 101270376A，2008)利用具有γ-谷氨酰转肽酶活性的枯草芽孢杆菌NX-2(CGMCC No.0833)，催化L-谷氨酰胺和乙胺合成L-茶氨酸，转化率达57.5％以上。
由于酶法合成L-茶氨酸与化学合成法相比不会产生消旋现象，而且转化率较高，所以受到了广泛重视和研究，并已经进入工业化应用领域。
到目前为止，利用微生物来源或基因工程来源的γ-谷氨酰转肽酶作为催化剂，以L-谷氨酸-γ-烷基酯或L-谷氨酰肼和乙胺为底物，酶法制备L-茶氨酸的方法还未见文献报导。
三、发明内容
本发明需要解决的问题是提供一种高效、低成本的制备L-茶氨酸的方法。
目前受技术和成本的限制，我国氨基酸工业中L-茶氨酸的产量不能满足国内外市场的需求。本发明采用廉价的L-谷氨酸-γ-烷基酯或L-谷氨酰肼和乙胺为起始原料，利用γ-谷氨酰转肽酶作催化剂制备L-茶氨酸，反应条件温和，底物转化率高。
本发明可以通过以下的技术方案来达到：
L-茶氨酸酶法转化制备方法，其步骤为：
(1)将含有γ-谷氨酰转肽酶的菌体细胞或该酶提取液与含有L-谷氨酸-γ-烷基酯或L-谷氨酰肼和乙胺的水溶液混合，加入表面活性剂和金属离子，在pH9～11，温度25℃～60℃条件下进行酶促反应；
(2)通过等电点结晶法或等电点结晶与离子交换树脂相结合的方法对反应生成物进行分离，得到高纯度的L-茶氨酸。
上述步骤(1)所用的γ-谷氨酰转肽酶来源于现已报道的微生物菌株或基因工程菌：枯草芽孢杆菌NX-2(CGMCC No.0833)或枯草芽孢杆菌SK11.004(CCTCC NO：M 208083)或大肠杆菌SH642(含有重组质粒pUC 18-GGT)或基因工程菌GGT(含有重组质粒pET28a-GGT)。所用底物为L-谷氨酸-γ-烷基酯或L-谷氨酰肼和乙胺的混合水溶液，其浓度分别为0.1mol/L～0.8mol/L和0.1mol/L～14mol/L，反应液中L-谷氨酸-γ-烷基酯或L-谷氨酰肼和乙胺摩尔比为1∶3～1∶18，最适摩尔比为1∶6～1∶10，溶液pH为9～11，调溶液pH所用的无机酸为盐酸或硫酸或磷酸。所述的表面活性剂为吐温-80或十六烷基三甲基溴化铵或聚乙二醇辛基苯基醚，其浓度为0.05g/L～50g/L；所述的金属离子为钾离子或钠离子或钙离子或镁离子或锰离子，其浓度为5×10-4mol/L～5×10-1mol/L。酶促反应中反应温度为25℃～60℃，最适反应温度为30℃～45℃。
本发明与现有技术相比其有益效果是：
本发明的主要特点在于利用廉价的L-谷氨酸-γ-烷基酯或L-谷氨酰肼代替L-谷氨酰胺作为酶促反应的底物。本发明与现有技术相比，可以降低生产成本，解决了现有技术以L-谷氨酰胺和乙胺为制备原料成本较高的问题。
四、具体实施方式
实施例一
L-茶氨酸酶法转化制备方法，其具体步骤如下：
1、将1000mL发酵液离心得到的枯草芽孢杆菌NX-2菌体21g加入到1000mL转化液中，转化液含20g L-谷氨酸-γ-甲酯，45g乙胺，10mL 5％吐温-80，10mL1mol/L氯化钾，30％盐酸调pH至10，35℃反应16h。反应液中L-茶氨酸浓度(g/mL)为1.64％，底物L-谷氨酸-γ-甲酯的摩尔转化率达到76％。
2、将反应液离心去菌体，用30％盐酸调上清液pH到3，酸化液升温到70～80℃，加入活性炭脱色，将脱色液通过732型阳离子交换树脂柱吸附。用3％氨水洗脱L-茶氨酸饱和吸附柱，收集含L-茶氨酸的洗脱液400mL，真空减压浓缩到200mL，保温60～70℃，加入活性炭脱色，继续将脱色液真空减压浓缩到60mL左右，趁热加入二倍量95％酒精，冷却到10℃左右结晶5小时，真空过滤，75％酒精洗涤，烘干得12.2g精品，结晶母液回收酒精后循环套用。
实施例二
L-茶氨酸酶法转化制备方法，其具体步骤如下：
1、将1000mL发酵液离心得到的枯草芽孢杆菌SK11.004菌体18g加入到1000mL转化液中，转化液含40g L-谷氨酸-γ-乙酯，80g乙胺，10mL 1％十六烷基三甲基溴化铵，10mL 1mol/L氯化钠，30％盐酸调pH至10，35℃反应20h。反应液中L-茶氨酸浓度(g/mL)为3.10％，底物L-谷氨酸-γ-乙酯的摩尔转化率达到78％。
2、将反应液离心去菌体，用30％盐酸调上清液pH到3，酸化液升温到70～80℃，加入活性炭脱色，将脱色液通过732型阳离子交换树脂柱吸附。用3％氨水洗脱L-茶氨酸饱和吸附柱，收集含L-茶氨酸的洗脱液650mL，真空减压浓缩到300mL，保温60～70℃，加入活性炭脱色，继续将脱色液真空减压浓缩到100mL左右，趁热加入二倍量95％酒精，冷却到10℃左右结晶8小时，真空过滤，75％酒精洗涤，烘干得22.6g精品，结晶母液回收酒精后循环套用。
实施例三
L-茶氨酸酶法转化制备方法，其具体步骤如下：
1、将1000mL发酵液离心得到的大肠杆菌SH642(含有重组质粒pUC18-GGT)菌体15g加入到1000mL转化液中，转化液含60g L-谷氨酸-γ-丙酯，112g乙胺，20mL 1％聚乙二醇辛基苯基醚，10mL 1mol/L氯化钙，30％盐酸调pH至10，35℃反应26h。反应液中L-茶氨酸浓度(g/mL)为3.98％，底物L-谷氨酸-γ-丙酯的摩尔转化率达到72％。
2、将反应液离心去菌体，用30％盐酸调上清液pH到3，酸化液升温到70～80℃，加入活性炭脱色，将脱色液通过732型阳离子交换树脂柱吸附。用3％氨水洗脱L-茶氨酸饱和吸附柱，收集含L-茶氨酸的洗脱液980mL，真空减压浓缩到400mL，保温60～70℃，加入活性炭脱色，继续将脱色液真空减压浓缩到130mL左右，趁热加入二倍量95％酒精，冷却到10℃左右结晶6小时，真空过滤，75％酒精洗涤，烘干得29.1g精品，结晶母液回收酒精后循环套用。
实施例四
L-茶氨酸酶法转化制备方法，其具体步骤如下：
1、将1000mL发酵液离心得到的基因工程菌GGT(含有重组质粒pET28a-GGT)菌体17g加入到1000mL转化液中，转化液含80g L-谷氨酸-γ-丁酯，120g乙胺，20mL 1％聚乙二醇辛基苯基醚，10mL 1mol/L氯化镁，30％盐酸调pH至10，35℃反应30h。反应液中L-茶氨酸浓度(g/mL)为4.88％，底物L-谷氨酸-γ-丁酯的摩尔转化率达到71％。
2、将反应液离心去菌体，用30％盐酸调上清液pH到3，酸化液升温到70～80℃，加入活性炭脱色，将脱色液通过732型阳离子交换树脂柱吸附。用3％氨水洗脱L-茶氨酸饱和吸附柱，收集含L-茶氨酸的洗脱液1200mL，真空减压浓缩到450mL，保温60～70℃，加入活性炭脱色，继续将脱色液真空减压浓缩到200mL左右，趁热加入二倍量95％酒精，冷却到10℃左右结晶8小时，真空过滤，75％酒精洗涤，烘干得35.5g精品，结晶母液回收酒精后循环套用。
实施例五
L-茶氨酸酶法转化制备方法，其具体步骤如下：
1、将1000mL发酵液离心得到的枯草芽孢杆菌NX-2菌体23g加入到1000mL转化液中，转化液含40g L-谷氨酰肼，90g乙胺，20mL 0.5％吐温-80，10mL1mol/L氯化钾，30％盐酸调pH至10，45℃反应22h。反应液中L-茶氨酸浓度(g/mL)为3.22％，底物L-谷氨酰肼的摩尔转化率达到74％。
2、将反应液离心去菌体，用30％盐酸调上清液pH到3，酸化液升温到70～80℃，加入活性炭脱色，将脱色液通过732型阳离子交换树脂柱吸附。用3％氨水洗脱L-茶氨酸饱和吸附柱，收集含L-茶氨酸的洗脱液650mL，真空减压浓缩到310mL，保温60～70℃，加入活性炭脱色，继续将脱色液真空减压浓缩到100mL左右，趁热加入二倍量95％酒精，冷却到10℃左右结晶6小时，真空过滤，75％酒精洗涤，烘干得23.6g精品，结晶母液回收酒精后循环套用。
实施例六
L-茶氨酸酶法转化制备方法，其具体步骤如下：
1、将1000mL发酵液离心得到的枯草芽孢杆菌SK11.004菌体20g加入到1000mL转化液中，转化液含60g L-谷氨酰肼，150g乙胺，10mL 1％十六烷基三甲基溴化铵，10mL 1mol/L氯化钠，30％盐酸调pH至10，40℃反应28h。反应液中L-茶氨酸浓度(g/mL)为4.67％，底物L-谷氨酰肼的摩尔转化率达到72％。
2、将反应液离心去菌体，用30％盐酸调上清液pH到3，酸化液升温到70～80℃，加入活性炭脱色，将脱色液通过732型阳离子交换树脂柱吸附。用3％氨水洗脱L-茶氨酸饱和吸附柱，收集含L-茶氨酸的洗脱液950mL，真空减压浓缩到500mL，保温60～70℃，加入活性炭脱色，继续将脱色液真空减压浓缩到140mL左右，趁热加入二倍量95％酒精，冷却到10℃左右结晶7小时，真空过滤，75％酒精洗涤，烘干得34.5g精品，结晶母液回收酒精后循环套用。
实施例七
L-茶氨酸酶法转化制备方法，其具体步骤如下：
1、将1000mL发酵液离心得到的大肠杆菌SH642(含有重组质粒pUC18-GGT)菌体15g加入到1000mL转化液中，转化液含80g L-谷氨酰肼，200g乙胺，20mL1％十六烷基三甲基溴化铵，10mL 1mol/L氯化钙，30％盐酸调pH至10，40℃反应33h。反应液中L-茶氨酸浓度(g/mL)为6.48％，底物L-谷氨酰肼的摩尔转化率达到75％。
2、将反应液离心去菌体，用30％盐酸调上清液pH到3，酸化液升温到70～80℃，加入活性炭脱色，将脱色液通过732型阳离子交换树脂柱吸附。用3％氨水洗脱L-茶氨酸饱和吸附柱，收集含L-茶氨酸的洗脱液1100mL，真空减压浓缩到550mL，保温60～70℃，加入活性炭脱色，继续将脱色液真空减压浓缩到200mL左右，趁热加入二倍量95％酒精，冷却到10℃左右结晶8小时，真空过滤，75％酒精洗涤，烘干得47.9g精品，结晶母液回收酒精后循环套用。
实施例八
L-茶氨酸酶法转化制备方法，其具体步骤如下：
1、将1000mL发酵液离心得到的基因工程菌GGT(含有重组质粒pET28a-GGT)菌体18g加入到1000mL转化液中，转化液含100g L-谷氨酰肼，250g乙胺，20mL 1％聚乙二醇辛基苯基醚，20mL 1mol/L氯化镁，30％盐酸调pH至10，42℃反应38h。反应液中L-茶氨酸浓度(g/mL)为8.43％，底物L-谷氨酰肼的摩尔转化率达到78％。
2、将反应液离心去菌体，用30％盐酸调上清液pH到3，酸化液升温到70～80℃，加入活性炭脱色，将脱色液通过732型阳离子交换树脂柱吸附。用3％氨水洗脱L-茶氨酸饱和吸附柱，收集含L-茶氨酸的洗脱液1400mL，真空减压浓缩到700mL，保温60～70℃，加入活性炭脱色，继续将脱色液真空减压浓缩到250mL左右，趁热加入二倍量95％酒精，冷却到10℃左右结晶10小时，真空过滤，75％酒精洗涤，烘干得62.4g精品，结晶母液回收酒精后循环套用。
Claims (4)
1.一种L-茶氨酸酶法转化制备方法，其特征是由以下步骤构成：
(1)将具有γ-谷氨酰转肽酶活性的保藏号为CGMCC NO：0833的菌株枯草芽孢杆菌NX-2或保藏号为CCTCC NO：M 208083的枯草芽孢杆菌SK11.004与含有L-谷氨酸-γ-甲酯的乙胺水溶液或L-谷氨酸-γ-乙酯的乙胺水溶液或L-谷氨酸-γ-丙酯的乙胺水溶液或L-谷氨酸-γ-丁酯的乙胺水溶液或L-谷氨酰肼的乙胺水溶液混合，加入表面活性剂和金属离子，在pH 9～11，温度30℃～45℃条件下进行酶促反应；
(2)通过等电点结晶法或等电点结晶与离子交换树脂相结合的方法对反应生成物进行分离，得到高纯度的L-茶氨酸。
2.根据权利要求1所述的L-茶氨酸酶法转化制备方法，其特征在于步骤(1)所用的底物为L-谷氨酸-γ-甲酯和乙胺或L-谷氨酸-γ-乙酯和乙胺或L-谷氨酸-γ-丙酯和乙胺或L-谷氨酸-γ-丁酯和乙胺或L-谷氨酰肼和乙胺。
3.根据权利要求1所述的L-茶氨酸酶法转化制备方法，其特征在于步骤(1)中底物L-谷氨酸-γ-甲酯或L-谷氨酸-γ-乙酯或L-谷氨酸-γ-丙酯或L-谷氨酸-γ-丁酯或L-谷氨酰肼与乙胺的摩尔比为1∶3～1∶10。
4.根据权利要求1所述的L-茶氨酸酶法转化制备方法，其特征在于步骤(1)中反应溶液pH 9～11，调溶液pH所用的无机酸为盐酸或硫酸或磷酸；反应温度30℃～45℃。
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