CN107540563B - 盐酸利托君的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种盐酸利托君的合成方法，包括以下步骤：对氯苯甲醛和丙酮酸为底物，催化反应，纯化，得到(R)‑1‑(4‑氯苯基)‑1‑羟基丙烷‑2‑酮；以(R)‑1‑(4‑氯苯基)‑1‑羟基丙烷‑2‑酮和甲酸铵为底物，催化反应，纯化，得到(1R,2S)‑2‑氨基‑1‑(4‑氯苯基)‑1‑丙醇；(1R,2S)‑2‑氨基‑1‑(4‑氯苯基)‑1‑丙醇和LiOH·H2O反应，生成4‑((1R,2S)‑2‑氨基‑1‑羟丙基)苯酚；4‑((1R,2S)‑2‑氨基‑1‑羟丙基)苯酚与4‑(2‑氯乙醇)苯酚反应生成盐酸利托君。本发明成本低；反应条件温和，适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及原料药及药物中间体的制备方法，具体地指一种盐酸利托君的合成方法。
背景技术
利托君是比利时Solvay公司研发的β2肾上腺素受体激动剂，1973年首次在瑞典上市。利托君可激动子宫平滑肌的β2受体，抑制子宫平滑肌收缩的频率、强度和延续时间等，从而延长妊娠期，并且可增加胎儿心肺的成熟，有利于婴儿的健康，其用于妊娠20周以上的孕妇抗早产治疗。
目前利托君的制备方法已有较多报道，其中绝大多是首先通过4-羟基苯丙酮的溴代反应制备α-溴-4-羟基苯丙酮，然后依次通过与对羟基苯乙胺胺化及羰基的选择性还原还制备，但是其工艺复杂，且大部分合成的利托君为非手性。
因此，研发一种高效的具有手性的盐酸利托君的合成方法显得十分必要。
发明内容
本发明所要解决的问题就是要提供一种盐酸利托君的合成方法，该方法在保证高转化率的基础上，简化生产工艺和降低生产成本。
为解决上述技术问题，本发明所提供的盐酸利托君的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：以式Ⅱ化合物对氯苯甲醛和式Ⅲ化合物丙酮酸为底物与缓冲溶液构成反应体系，添加催化剂和添加剂，反应，纯化，得到式Ⅳ化合物(R)-1-(4-氯苯基)-1-羟基丙烷-2-酮；
步骤2：以式Ⅳ化合物(R)-1-(4-氯苯基)-1-羟基丙烷-2-酮和甲酸铵为底物，与缓冲溶液构成反应体系，添加催化剂，反应，纯化，得到式Ⅴ化合物(1R,2S)-2-氨基-1-(4-氯苯基)-1-丙醇；
步骤3：式Ⅴ化合物(1R,2S)-2-氨基-1-(4-氯苯基)-1-丙醇和LiOH·H2O在催化剂的作用下于溶剂中反应，生成式Ⅵ化合物4-((1R,2S)-2-氨基-1-羟丙基)苯酚；
步骤4：式Ⅵ化合物4-((1R,2S)-2-氨基-1-羟丙基)苯酚与4-(2-氯乙醇)苯酚在缚酸剂和催化剂的作用下于溶剂中反应生成式Ⅰ化合物盐酸利托君，
反应式如下：
其中，X选自Cl，Br，I。
优选地，步骤1中，缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液、Tri-HCl缓冲溶液、硼酸盐缓冲溶液、甘氨酸缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液、MOPS缓冲溶液中的一种，添加剂为MgCl2。
进一步地，步骤1中，所述催化剂为来源于Zymomonas mobilis的苯丙酮合成酶的基因工程菌全细胞及辅酶硫胺素焦磷酸。
进一步地，步骤1中，来源于Zymomonas mobilis的苯丙酮合成酶的基因工程菌中外源苯丙酮合成酶的编码基因是序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
进一步地，步骤1中，控制来源于Zymomonas mobilis的苯丙酮合成酶的基因工程菌全细胞的浓度为80-120g/L；控制辅酶硫胺素焦磷酸的浓度为1-3mM；控制MgCl2的浓度为4-7mM。
更进一步地，步骤2中，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液或柠檬酸盐缓冲溶液，控制反应体系pH为5.5-8。
更进一步地，步骤2中，所述催化剂为来源于Saccharomyces cerevisiae的亮氨酸脱氢酶基因工程菌全细胞破碎酶液、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌全细胞破碎酶液及辅酶，辅酶为NAD+。
更进一步地，步骤2中，来源于Saccharomyces cerevisiae的亮氨酸脱氢酶的基因工程菌中外源亮氨酸脱氢酶的编码基因是序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌中外源甲酸脱氢酶的编码基因是序列表中SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
再更进一步地，步骤2中，控制来源于Saccharomyces cerevisiae的亮氨酸脱氢酶的基因工程菌细胞破碎酶液浓度为10-12g/L，控制来源于Candida boidinii甲酸盐脱氢酶的基因工程菌细胞破碎酶液浓度为30-70g/L，控制辅酶NADP+的浓度为0.1-0.5g/L。
再更进一步地，步骤3中，所述催化剂为乙酰丙酮酸铜和双(4-羟基-2,6-二甲基苯基)草酸酰胺；所述溶剂为DMSO或DMA或NMP和水的混合溶液。
来源于Zymomonas mobilis的苯丙酮合成酶的基因工程菌全细胞，制备方法是：选择来源于Zymomonas mobilis的苯丙酮合成酶的基因序列，进行人工设计，设计后的基因序列如序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列所示；将该序列通过全基因合成，克隆入表达载体pET28a的Nde I和Xho I酶切位点，转化宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞；挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体；将重组表达载体转入E.coli BL21(DE3)菌株中，获得可以诱导表达重组苯丙酮合成酶的重组苯丙酮合成酶基因工程菌。将重组苯丙酮合成酶基因工程菌接种到含有卡那霉素的LB培养基中，于37℃过夜培养，得到种子培养液；将种子培养液接种到含卡那霉素的TB培养基中，接种量为含卡那霉素的TB培养基体积的1％；然后置于37℃下培养2-5h，加入无菌的IPTG诱导，使IPTG终浓度达到0.1mM，置于25℃下继续培养20h。最后通过高速离心得到来源于Zymomonas mobilis的苯丙酮合成酶的基因工程菌全细胞。
来源于Saccharomyces cerevisiae的亮氨酸脱氢酶的基因工程菌全细胞，制备方法是：选择来源于Saccharomyces cerevisiae的亮氨酸脱氢酶的基因序列，进行人工设计，设计后的基因序列如序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列所示；将该序列通过全基因合成，克隆入表达载体pET28a的Nde I和Xho I酶切位点，转化宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞；挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体；将重组表达载体转入E.coliBL21(DE3)菌株中，获得可以诱导表达重组亮氨酸脱氢酶的重组亮氨酸脱氢酶基因工程菌。将重组亮氨酸脱氢酶基因工程菌接种到含有卡那霉素的LB培养基中，于37℃过夜培养，得到种子培养液；将种子培养液接种到含卡那霉素的TB培养基中，接种量为含卡那霉素的TB培养基体积的1％；然后置于37℃下培养2-5h，加入无菌的IPTG诱导，使IPTG终浓度达到0.1mM，置于25℃下继续培养20h。最后通过高速离心得到来源于Saccharomycescerevisiae的亮氨酸脱氢酶的基因工程菌全细胞。超声破胞，得到来源于Saccharomycescerevisiae的亮氨酸脱氢酶的基因工程菌细胞破碎酶液。
来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶的基因工程菌细胞破碎酶液，制备方法是：选择来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶的基因序列，进行人工设计，设计后的基因序列如序列表中SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列所示；将该序列通过全基因合成，克隆入表达载体pET28a的Nde I和Xho I酶切位点，转化宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞；挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体；将重组表达载体转入E.coli BL21(DE3)菌株中，获得可以诱导表达重组甲酸脱氢酶的重组甲酸脱氢酶基因工程菌。将重组甲酸脱氢酶基因工程菌接种到含有卡那霉素的LB培养基中，于37℃过夜培养，得到种子培养液；将种子培养液接种到含卡那霉素的TB培养基中，接种量为含卡那霉素的TB培养基体积的1％；然后置于37℃下培养2-5h，加入无菌的IPTG诱导，使IPTG终浓度达到0.1mM，置于25℃下继续培养20h。最后通过高速离心得到来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶的基因工程菌全细胞。超声破胞，得到来源于Candida boidinii甲酸盐脱氢酶的基因工程菌细胞破碎酶液。
本发明的优点主要体现在如下几方面：
其一，本发明原料供应充足，价格低廉，不需另行制备，试剂价格低廉，产物易重结晶纯化，从而降低了成本；
其二，本发明化学合成法和酶法结合，反应条件温和，适合工业化生产；
其三，本发明反应条件易控制，操作简便，工艺流程简单，对设备无特殊要求，适于大规模生产。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，但该实施例不应该理解为对本发明的限制，仅作举例而已。同时通过说明本发明的优点将变得更加清楚和容易理解。
实施例1
来源于Zymomonas mobilis的苯丙酮合成酶的基因工程菌全细胞，制备方法是：选择来源于Zymomonas mobilis的苯丙酮合成酶的基因序列，进行人工设计，设计后的基因序列如序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列所示；将该序列通过全基因合成，克隆入表达载体pET28a的Nde I和Xho I酶切位点，转化宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞；挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体；将重组表达载体转入E.coli BL21(DE3)菌株中，获得可以诱导表达重组苯丙酮合成酶的重组苯丙酮合成酶基因工程菌。将重组苯丙酮合成酶基因工程菌接种到含有卡那霉素的LB培养基中，于37℃过夜培养，得到种子培养液；将种子培养液接种到含卡那霉素的TB培养基中，接种量为含卡那霉素的TB培养基体积的1％；然后置于37℃下培养2-5h，加入无菌的IPTG诱导，使IPTG终浓度达到0.1mM，置于25℃下继续培养20h。最后通过高速离心得到来源于Zymomonas mobilis的苯丙酮合成酶的基因工程菌全细胞。
来源于Saccharomyces cerevisiae的亮氨酸脱氢酶的基因工程菌全细胞，制备方法是：选择来源于Saccharomyces cerevisiae的亮氨酸脱氢酶的基因序列，进行人工设计，设计后的基因序列如序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列所示；将该序列通过全基因合成，克隆入表达载体pET28a的Nde I和Xho I酶切位点，转化宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞；挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体；将重组表达载体转入E.coliBL21(DE3)菌株中，获得可以诱导表达重组亮氨酸脱氢酶的重组亮氨酸脱氢酶基因工程菌。将重组亮氨酸脱氢酶基因工程菌接种到含有卡那霉素的LB培养基中，于37℃过夜培养，得到种子培养液；将种子培养液接种到含卡那霉素的TB培养基中，接种量为含卡那霉素的TB培养基体积的1％；然后置于37℃下培养2-5h，加入无菌的IPTG诱导，使IPTG终浓度达到0.1mM，置于25℃下继续培养20h。最后通过高速离心得到来源于Saccharomycescerevisiae的亮氨酸脱氢酶的基因工程菌全细胞。超声破胞，得到来源于Saccharomycescerevisiae的亮氨酸脱氢酶的基因工程菌细胞破碎酶液。
来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶的基因工程菌细胞破碎酶液，制备方法是：选择来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶的基因序列，进行人工设计，设计后的基因序列如序列表中SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列所示；将该序列通过全基因合成，克隆入表达载体pET28a的Nde I和Xho I酶切位点，转化宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞；挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体；将重组表达载体转入E.coli BL21(DE3)菌株中，获得可以诱导表达重组甲酸脱氢酶的重组甲酸脱氢酶基因工程菌。将重组甲酸脱氢酶基因工程菌接种到含有卡那霉素的LB培养基中，于37℃过夜培养，得到种子培养液；将种子培养液接种到含卡那霉素的TB培养基中，接种量为含卡那霉素的TB培养基体积的1％；然后置于37℃下培养2-5h，加入无菌的IPTG诱导，使IPTG终浓度达到0.1mM，置于25℃下继续培养20h。最后通过高速离心得到来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶的基因工程菌全细胞。超声破胞，得到来源于Candida boidinii甲酸盐脱氢酶的基因工程菌细胞破碎酶液。
实施例2
以式Ⅱ化合物对氯苯甲醛和式Ⅲ化合物丙酮酸为底物与缓冲溶液构成反应体系，添加催化剂和添加剂，反应，纯化，得到式Ⅳ化合物(R)-1-(4-氯苯基)-1-羟基丙烷-2-酮。
具体反应过程如下：反应在1L摇瓶中进行，反应体系控制为300mL，以式Ⅱ化合物对氯苯甲醛(29.51g，0.21mol)和式Ⅲ化合物丙酮酸(24.64g，0.28mol)为底物，以柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液为溶剂，以来源于Zymomonas mobilis的苯丙酮合成酶的基因工程菌全细胞及辅酶硫胺素焦磷酸为催化剂。控制来源于Zymomonas mobilis的苯丙酮合成酶的基因工程菌全细胞的浓度为100g/L，控制辅酶硫胺素焦磷酸的浓度为2.5mM。向反应体系中加入MgCl2，控制MgCl2的浓度为5mM，控制转化体系的pH值为6.5，体系转化的温度为28℃，摇床的转速控制为160r/min，利用HPLC-MS和HPLC进行监控，直至底物完全利用，得到(R)-1-(4-氯苯基)-1-羟基丙烷-2-酮的转化液，纯化，得到式Ⅳ化合物(R)-1-(4-氯苯基)-1-羟基丙烷-2-酮(35.06g，0.19mol)，光学纯度为99.2％，转化过程的收率为90.48％。
反应式如下：
实施例3
以式Ⅳ化合物(R)-1-(4-氯苯基)-1-羟基丙烷-2-酮和甲酸铵为底物，与缓冲溶液构成反应体系，添加催化剂，反应，纯化，得到式Ⅴ化合物(1R,2S)-2-氨基-1-(4-氯苯基)-1-丙醇。
反应在1L摇瓶中进行，反应体系控制为300mL，以式Ⅳ化合物(R)-1-(4-氯苯基)-1-羟基丙烷-2-酮(35.06g，0.19mol)和甲酸铵(23.94g，0.38mol)为底物，以磷酸盐缓冲溶液为溶剂，以来源于Saccharomyces cerevisiae的亮氨酸脱氢酶的基因工程菌破碎酶液、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶的基因工程菌细胞破碎酶液及辅酶NAD+为催化剂。控制来源于Saccharomyces cerevisiae的亮氨酸脱氢酶的基因工程菌破碎酶液浓度为10g/L，控制来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶的基因工程菌破碎酶液浓度为40g/L，控制辅酶NADP+的浓度为0.4g/L。控制转化体系的pH值为6.5，转化温度为37℃，摇床的转速控制为160r/min，转化时间为24h。转化后纯化得到式Ⅴ化合物(1R,2S)-2-氨基-1-(4-氯苯基)-1-丙醇(31.54g，0.17mol)，光学纯度为98.4％，转化过程的收率为89.47％。
反应式如下：
实施例4
式Ⅴ化合物(1R,2S)-2-氨基-1-(4-氯苯基)-1-丙醇和LiOH·H2O在催化剂的作用下于溶剂中反应，生成式Ⅵ化合物4-((1R,2S)-2-氨基-1-羟丙基)苯酚。
在装有机械搅拌的1L的三口瓶中加入式Ⅴ化合物(1R,2S)-2-氨基-1-(4-氯苯基)-1-丙醇(92.75g，0.5mol)、乙酰丙酮酸铜(6.5g，25mmol)、LiOH·H2O(44g，1mol)和双(4-羟基-2,6-二甲基苯基)草酸酰胺(28.2g，25mmol)。氩气保护后往反应瓶中加入400mLDMSO和100mL的水。之后将反应升温至130℃反应24h，冷却至室温，然后用2mol/L的HCl酸化，乙酸乙酯后用乙酸乙酯萃取三次，收集有机相，干燥后减压浓缩，柱层析分离得到式Ⅵ化合物4-((1R,2S)-2-氨基-1-羟丙基)苯酚(63.46g，0.38mol)，产率76％。
反应式如下：
实施例5
式Ⅵ化合物4-((1R,2S)-2-氨基-1-羟丙基)苯酚与4-(2-氯乙醇)苯酚在缚酸剂和催化剂的作用下于溶剂中反应生成式Ⅰ化合物盐酸利托君。
在装有机械搅拌的1L的三口瓶中加入式Ⅵ化合物4-((1R,2S)-2-氨基-1-羟丙基)苯酚(83.5g，0.5mol)、三乙胺(50.0g，0.5mol)、碘化钾(1g)和无水乙醇400mL，将反应温度升温控制到55℃，充分搅拌均匀后向反应体系中缓慢滴加4-(2-氯乙醇)苯酚(93.6g，0.6mol)，大约60min滴完。升温到80℃，继续反应6h，TLC检测反应结束，冷却至室温后过滤收集滤液，滤液用盐酸调节PH为4-5。减压回收乙醇，所得剩余物用正己烷和乙酸乙酯混合溶剂重结晶，得到白色固体式Ⅰ化合物盐酸利托君(139.11g，0.43mol)，收率为86％。
反应式如下：
其中，X为Cl。
本说明书中未作详细描述的内容，属于本专业技术人员公知的现有技术。
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Claims (6)
1.一种盐酸利托君的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：以式Ⅱ化合物对氯苯甲醛和式Ⅲ化合物丙酮酸为底物与缓冲溶液构成反应体系，添加催化剂和添加剂，反应，纯化，得到式Ⅳ化合物(R)-1-(4-氯苯基)-1-羟基丙烷-2-酮，所述添加剂为MgCl2；
步骤2：以式Ⅳ化合物(R)-1-(4-氯苯基)-1-羟基丙烷-2-酮和甲酸铵为底物，与缓冲溶液构成反应体系，添加催化剂，反应，纯化，得到式Ⅴ化合物(1R,2S)-2-氨基-1-(4-氯苯基)-1-丙醇；
步骤3：式Ⅴ化合物(1R,2S)-2-氨基-1-(4-氯苯基)-1-丙醇和LiOH·H2O在催化剂的作用下于溶剂中反应，生成式Ⅵ化合物4-((1R,2S)-2-氨基-1-羟丙基)苯酚；
步骤4：式Ⅵ化合物4-((1R,2S)-2-氨基-1-羟丙基)苯酚与式Ⅶ化合物在缚酸剂和催化剂的作用下于溶剂中反应生成式Ⅰ化合物盐酸利托君，
反应式如下：
其中，X选自Cl，Br，I；
所述步骤1中，所述催化剂为来源于Zymomonas mobilis的苯丙酮合成酶的基因工程菌全细胞及辅酶硫胺素焦磷酸,来源于Zymomonas mobilis的苯丙酮合成酶的基因工程菌中外源苯丙酮合成酶的编码基因是序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
所述步骤2中，所述催化剂为来源于Saccharomyces cerevisiae的亮氨酸脱氢酶基因工程菌全细胞破碎酶液、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶的基因工程菌全细胞破碎酶液及辅酶，辅酶为NAD+，来源于Saccharomyces cerevisiae的亮氨酸脱氢酶的基因工程菌中外源亮氨酸脱氢酶的编码基因是序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶的基因工程菌中外源甲酸脱氢酶的编码基因是序列表中SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；
所述步骤3中，所述催化剂为乙酰丙酮酸铜和双(4-羟基-2,6-二甲基苯基)草酸酰胺。
2.根据权利要求1所述的盐酸利托君的合成方法，其特征在于，所述步骤1中，所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液、Tri-HCl缓冲溶液、硼酸盐缓冲溶液、甘氨酸缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液、MOPS缓冲溶液中的一种。
3.根据权利要求2所述的盐酸利托君的合成方法，其特征在于，所述步骤1中，控制来源于Zymomonas mobilis的苯丙酮合成酶的基因工程菌全细胞的浓度为80-120g/L；控制辅酶硫胺素焦磷酸的浓度为1-3mM；控制MgCl2的浓度为4-7mM。
4.根据权利要求3所述的盐酸利托君的合成方法，其特征在于，所述步骤2中，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液或柠檬酸盐缓冲溶液，控制反应体系pH为5.5-8。
5.根据权利要求4所述的盐酸利托君的合成方法，其特征在于，所述步骤2中，控制来源于Saccharomyces cerevisiae的亮氨酸脱氢酶的基因工程菌细胞破碎酶液浓度为10-12g/L，控制来源于Candida boidinii甲酸盐脱氢酶的基因工程菌细胞破碎酶液浓度为30-70g/L，控制辅酶NAD+的浓度为0.1-0.5g/L。
6.根据权利要求5所述的盐酸利托君的合成方法，其特征在于，所述步骤3中，所述溶剂为DMSO或DMA或NMP和水的混合溶液。
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