CN103243130B - 一种一锅法制备γ-谷氨酰胺类化合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种一锅法制备γ-谷氨酰胺类化合物的方法。该方法包括下列步骤：采用5-羧乙基海因与胺类化合物进行水相酰胺化反应，形成5-羧乙基海因酰胺类化合物；反应完成后无需提取分离直接加入同时含有海因酶与氨甲酰酶的菌体为催化剂进行酶催化水解开环反应，得到γ-谷氨酰胺类化合物。本发明采用海因环共保护谷氨酸的α-氨基和α-羧基，仅暴露出γ-羧基，保证了酰胺化反应的位置专一性；采用水相酰胺化，中间产物无需提取分离直接进行下一步酶反应，“一锅法”反应过程可有效提高反应总收率，同时水相反应也避免了有机溶剂带来的环境污染问题；采用酶法水解开环，避免了多数化学合成中反复的保护与脱保护步骤，减少了副反应的发生。
Description
技术领域
本发明涉及一种采用一锅法制备γ-谷氨酰胺类化合物的方法。
背景技术
γ-谷氨酰胺类化合物(1)是由谷氨酸的γ-羧基与胺类化合物的氨基通过γ-酰胺键连接形成的酰胺类化合物。γ-谷氨酰胺类化合物在自然界中并不少见，例如：谷氨酰胺是生物有机体中最为丰富的游离氨基酸；茶氨酸(γ-谷氨酰乙胺)是茶叶特有的一种氨基酸，占茶叶游离氨基酸总量的50％以上，在干茶叶中的含量大约为1％～2％，具有重要的生理和药理作用，包括放松、降血压、抗肿瘤、提高学习能力、神经保护、抗疲劳和免疫作用等(帅玉英，张涛，江波等.茶氨酸的研究进展.食品与发酵工业，2008，34(11)：117～123.)；γ-谷氨酰甲胺与茶氨酸具有类似的味觉，在一些细菌和植物体内的甲胺代谢中以中间体形式存在(Tachiki T，Yamada T，Mizuno K，et al.γ-Glutamyl transfer reactions by glutaminase from Pseudomonasnitroreducens IFO12694and their application for the syntheses of theanine andγ-glutamylmethylamide.Bioscience，biotechnology，and biochemistry，1998，62(7)：1279～1283.)；其它γ-谷氨酰胺类化合物也具有类似的功效。正因为如此，食品和医药工业对于γ-谷氨酰胺类化合物的需求日益增长。
目前，γ-谷氨酰胺类化合物的合成方法主要有提取法、发酵法、化学合成法和酶法。提取法是经典的生产方法，主要以含γ-谷氨酰胺类化合物的动、植物组织和酵母为原料，通过添加适当的溶剂或结合淀粉酶、蛋白酶处理，再分离精制而成，但由于原料中γ-谷氨酰胺类化合物的含量都很低，需要消耗大量的原料与溶剂等缺点，因此已很少使用。发酵法生产就是通过选育(构建)γ-谷氨酰胺类化合物合成能力强和胞内产物含量高的微生物、筛选和优化培养配方、建立和优化发酵控制策略、改进和提高下游过程技术等，最终提高产物的收率和质量，发酵法的主要问题是转化效率低，发酵周期长，过低的产物含量需要复杂的分离工艺，设备投入大，生产成本高，而且产品纯度和收率相对较低，因而限制了该法的进一步推广。化学合成法通常都需要对谷氨酸的α-氨基和α-羧基分别分步进行保护，仅游离出γ-羧基进行酰胺化反应，反应结束后还需要再分别分步将α-氨基和α-羧基的保护基脱除，这样在反复的保护和脱保护过程中，容易造成酰胺键断裂、消旋化等现象，从而使得收率降低、光学纯度降低。Suzuki等利用γ-谷氨酰转肽酶，对于γ-谷氨酰化合物的酶法合成进行了较为细致的研究，制备了L-茶氨酸和D-茶氨酸等γ-谷氨酰胺类化合物(Suzuki H，Yamada C，Kato K.γ-Glutamyl Compounds and Their Enzymatic Production Using Bacterialγ-Glutamyltranspeptidase.Amino Acids，2007，32：333～340.)，但由于γ-谷氨酰转肽酶兼有转肽和水解活性，在反应过程中往往伴随着自转肽和产物水解等副反应，使得反应过程难以控制，严重影响了反应效率。我们在之前的研究(曹飞，韦萍，周佳栋，王月霞，武红丽，黄荣醒，张芙蓉.一种酶法制备光学活性茶氨酸的方法.CN：ZL200910183579.9，2009-09-23.)中，将海因酶法应用于茶氨酸的合成，但也存在以下两方面问题：一方面，在进行酰胺化反应时，采用的是有机相缩合试剂在有机溶剂中进行，而有机溶剂对环境不友好、对人体有危害，同时有机溶剂一般沸点较高，在产物分离时需要更高的代价；另一方面，酰胺化反应的产物需要首先从有机溶剂中分离提取出来，然后再加入到水相中进行酶催化水解开环反应，提取过程会造成部分产物损失，导致总收率下降。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种简便的、不产生消旋化和α-位羧基参与反应的、中间产物无需提取分离的、水相“一锅法”制备γ-谷氨酰胺类化合物的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
本发明以5-羧乙基海因为起始物，5-羧乙基海因其结构本身正是以海因环的形式将谷氨酸的α-氨基和α-羧基共保护起来，仅暴露出γ-羧基，保证了酰胺化反应的位置专一性，同时引入水相缩合试剂在水中进行酰胺化反应，反应完成后无需提取分离即可直接加入同时含有海因酶与氨甲酰酶的菌体为催化剂进行下一步酶催化水解开环反应，一步脱除α-氨基和α-羧基的共保护，得到γ-谷氨酰胺类化合物。这一“一锅法”反应过程减少了谷氨酸的加保护基、脱保护基等步骤，不产生消旋化和α-位羧基参与反应的问题，反应产物单一，中间产物无需提取分离即可直接进行下一步反应，有效提高了反应总收率，另外水相反应避免了有机溶剂带来的环境污染问题。
一种一锅法制备γ-谷氨酰胺类化合物的方法，包括下列步骤：
(1)5-羧乙基海因与胺类化合物进行水相酰胺化反应制备5-羧乙基海因酰胺类化合物。
在水中，采用水相缩合试剂将5-羧乙基海因(化合物2)末端羧基接上胺类化合物(化合物3)，得到5-羧乙基海因酰胺类化合物(化合物4)。水相缩合试剂与5-羧乙基海因的摩尔比为1～1.4：1，胺类化合物与5-羧乙基海因的摩尔比为1～1.6：1，5-羧乙基海因酰胺类化合物无需分离提取直接进行下一步酶催化水解开环反应。
其中，采用水相缩合试剂在5-羧乙基海因末端羧基接上胺类化合物，具体方法为先将水相缩合试剂与5-羧乙基海因反应1～8h，再加入胺类化合物反应10～18h。所述的水相缩合试剂为EDC·HCl/HOBt(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐/1-羟基-苯并三氮唑)、EDC·HCl/HOOBt(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐/3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮)、EDC·HCl/HOAt(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐/1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑)和EDC·HCl/HOSu(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐N-羟基琥珀酰亚胺)中的任意一种。R基团为脂肪胺(甲胺、乙胺、正丙胺、异丙胺、环丙胺、正丁胺、异丁胺、仲丁胺、叔丁胺、环丁胺、正戊胺、异戊胺、环戊胺、正己胺、环己胺、2-乙基己胺、正庚胺、2-庚胺、正辛胺等)或芳香胺(苯胺、邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯胺、苄胺、邻甲基苄胺、间甲基苄胺、对甲基苄胺、1-萘胺、2-萘胺等)的残基。
(2)5-羧乙基海因酰胺类化合物进行酶催化水解开环反应制备γ-谷氨酰胺类化合物。
以同时含有海因酶和氨甲酰酶的菌体为催化剂，在弱碱性条件下，催化水解5-羧乙基海因酰胺类化合物(化合物4)开环制备相应的γ-谷氨酰胺类化合物(化合物1)，将所得的酶转化溶液分离、浓缩得到γ-谷氨酰胺类化合物。
其中，所述的同时含有海因酶和氨甲酰酶的菌体为芽孢杆菌MH602(Bacillus fordiiMH602，中国典型培养物保藏中心保藏，CCTCC NO.M206144)或洋葱伯克霍尔德氏菌JS-02(Burkholderia cepecia JS-02，中国典型培养物保藏中心保藏，CCTCC NO.M202047)。以芽孢杆菌MH602为催化剂可制备得到γ-L-谷氨酰胺类化合物，以洋葱伯克霍尔德氏菌JS-02为催化剂可以制备得到γ-D-谷氨酰胺类化合物。所述的弱碱性条件为pH7.5～9.5。菌体与5-羧乙基海因酰胺类化合物的重量比为1：0.5～8。催化水解开环反应温度为35～45℃，反应时间为10～24h。
本发明的有益效果：
本发明的一锅法制备γ-谷氨酰胺类化合物方法与其他制备方法相比有如下优点：
1、采用海因环共保护谷氨酸中的α-氨基和α-羧基，仅暴露出γ-羧基，保证了酰胺化反应的位置专一性。
2、采用水相缩合试剂在水中进行酰胺化反应，中间产物无需提取分离即可直接进行下一步酶催化水解开环反应，“一锅法”有效提高了反应总收率，另外水相反应避免了有机溶剂带来的环境污染问题。
3、采用同时含有海因酶与氨甲酰酶的菌体为催化剂催化水解海因环开环，一步脱除α-氨基和α-羧基的共保护，得到γ-谷氨酰胺类化合物，避免了多数化学合成中反复的保护与脱保护步骤，操作简单。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、反应条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：5-羧乙基海因与乙胺进行水相酰胺化反应制备N-乙基海因丙酰胺。
5-羧乙基海因(0.01mol)加入25mL水中，室温搅拌溶解，加入EDC·HCl(0.012mol)和HOBt(0.012mol)，反应6h，加入乙胺盐酸盐(0.012mol)，反应过夜，得到N-乙基海因丙酰胺水溶液，无需提取分离直接进行下一步酶催化水解开环反应。取样进行产物表征：收率93％，1H NMR(DMSO-d6，500MHz)δ：10.59(s，1H)，7.88(s，1H)，7.79(s，1H)，4.03～4.00(m，1H)，3.06～3.03(m，2H)，2.15～2.09(m，2H)，1.89～1.72(m，2H)，1.03～0.98(m，3H)；HRMS(ESI)calcd for C8H13N3NaO3[M+Na]+222.0849，found222.0844。对比有机相酰胺化反应(反应步骤：5-羧乙基海因(0.01mol)加入25mL DMF，室温搅拌溶解，加入DIC(0.012mol)和HOBt(0.012mol)，反应6h，过滤取滤液，加入乙胺盐酸盐(0.012mol)，反应过夜，经萃取浓缩结晶后得到N-乙基海因丙酰胺1.67g，收率84％)，收率低于水相酰胺化反应。
实施例2：5-羧乙基海因与正丙胺进行水相酰胺化反应制备N-正丙基海因丙酰胺。
5-羧乙基海因(0.01mol)加入25mL水，室温搅拌溶解，加入EDC·HCl(0.01mol)和HOOBt(0.01mol)，反应2h，加入正丙胺(0.01mol)，反应过夜，得到N-正丙基海因丙酰胺水溶液，无需提取分离直接进行下一步酶催化水解开环反应。取样进行产物表征：收率91％，1H NMR(DMSO-d6，500MHz)δ：10.59(s，1H)，7.88(s，1H)，7.79(t，J＝5.3Hz，1H)，4.01(t，J＝5.6Hz，1H)，2.98(dd，J＝12.8，6.9Hz，2H)，2.17～2.11(m，2H)，1.89～1.72(m，2H)，1.42～1.35(m，2H)，0.82(t，J＝7.4Hz，3H)；HRMS(ESI)calcd for C9H15N3NaO3[M+Na]+236.1006，found236.1010。对比有机相酰胺化反应(反应步骤：5-羧乙基海因(0.01mol)加入25mL DMF，室温搅拌溶解，加入DIC(0.01mol)和HOOBt(0.01mol)，反应2h，过滤取滤液，加入正丙胺(0.01mol)，反应过夜，经萃取浓缩结晶后得到N-正丙基海因丙酰胺1.83g，收率86％)，收率低于水相酰胺化反应。
实施例3：5-羧乙基海因与异丙胺进行水相酰胺化反应制备N-异丙基海因丙酰胺。
5-羧乙基海因(0.01mol)加入25mL水，冰水浴搅拌溶解，加入EDC·HCl(0.011mol)和HOAt(0.011mol)，反应8h，加入异丙胺(0.013mol)，反应过夜，得到N-异丙基海因丙酰胺水溶液，无需提取分离直接进行下一步酶催化水解开环反应。取样进行产物表征：收率92％，1H NMR(DMSO-d6，500MHz)δ：10.60(s，1H)，7.88(s，1H)，7.68(d，J＝7.5Hz，1H)，4.03～3.99(m，1H)，3.86～3.72(m，1H)，2.14～2.06(m，2H)，1.88～1.68(m，2H)，1.02(d，J＝6.6Hz，6H)；HRMS(ESI)calcd for C9H15N3NaO3[M+Na]+236.1006，found236.1008。对比有机相酰胺化反应(反应步骤：5-羧乙基海因(0.01mol)加入25mL DMF，冰水浴搅拌溶解，加入DCC(0.011mol)和HOAt(0.011mol)，反应8h，过滤取滤液，加入异丙胺(0.013mol)，反应过夜，经萃取浓缩结晶后得到N-异丙基海因丙酰胺1.86g，收率87％)，收率低于水相酰胺化反应。
实施例4：5-羧乙基海因与甲胺进行水相酰胺化反应制备N-甲基海因丙酰胺。
5-羧乙基海因(0.01mol)加入25mL水中，冰水浴搅拌溶解，加入EDC·HCl(0.013mol)和HOOBt(0.013mol)，反应6h，加入甲胺水溶液(0.015mol)，反应16h，得到N-甲基海因丙酰胺水溶液，无需提取分离直接进行下一步酶催化水解开环反应。取样进行产物表征：收率90％，1H NMR(DMSO-d6，500MHz)δ：10.61(s，1H)，7.88(s，1H)，7.78(q，J＝6.9Hz，1H)，4.04～4.01(m，1H)，2.86(s，3H)，2.16～2.08(m，2H)，1.87～1.69(m，2H)；HRMS(ESI)calcd for C8H13N3NaO3[M+Na]+208.0692，found208.0685。对比有机相酰胺化反应(反应步骤：5-羧乙基海因(0.01mol)加入25mL DMF，室温搅拌溶解，加入DCC(0.013mol)和HOOBt(0.013mol)，反应6h，过滤取滤液，加入甲胺水溶液(0.015mol)，反应16h，经萃取浓缩结晶后得到N-甲基海因丙酰胺1.57g，收率85％)，收率低于水相酰胺化反应。
实施例5：5-羧乙基海因与苯胺进行水相酰胺化反应制备N-苯基海因丙酰胺。
5-羧乙基海因(0.01mol)加入25mL水，冰水浴搅拌溶解，加入EDC·HCl(0.012mol)和HOSu(0.012mol)，反应5h，加入苯胺(0.015mol)，反应18h，得到N-苯基海因丙酰胺水溶液，无需提取分离直接进行下一步酶催化水解开环反应。取样进行产物表征：收率95％，1H NMR(DMSO-d6，500MHz)δ：10.63(s，1H)，9.91(s，1H)，7.93(s，1H)，7.58～7.00(m，5H)，4.10(t，J＝5.5Hz，1H)，2.44～2.37(m，2H)，1.99～1.85(m，2H)；HRMS(ESI)calcd forC12H13N3NaO3[M+Na]+270.0849，found270.0842。对比有机相酰胺化反应(反应步骤：5-羧乙基海因(0.01mol)加入25mL DMF，冰水浴搅拌溶解，加入DIC(0.012mol)和HOSu(0.012mol)，反应5h，过滤取滤液，加入苯胺(0.015mol)，反应18h，经萃取浓缩结晶后得到N-苯基海因丙酰胺2.08g，收率84％)，收率低于水相酰胺化反应。
实施例6：5-羧乙基海因与苄胺进行水相酰胺化反应制备N-苄基海因丙酰胺。
5-羧乙基海因(0.01mol)加入25mL水，室温搅拌溶解，加入EDC·HCl(0.012mol)和HOBt(0.012mol)，反应8h，加入苄胺(0.013mol)，反应10h，得到N-苄基海因丙酰胺水溶液，无需提取分离直接进行下一步酶催化水解开环反应。取样进行产物表征：收率97％，1H NMR(DMSO-d6，500MHz)δ：10.62(s，1H)，8.34(t，J＝5.7Hz，1H)，7.90(s，1H)，7.32～7.21(m，5H)，4.25(d，J＝5.9Hz，2H)，4.05～4.02(m，1H)，2.26～2.20(m，2H)，1.94～1.76(m，2H)；HRMS(ESI)calcd for C13H15N3NaO3[M+Na]+284.1006，found284.1011。对比有机相酰胺化反应(反应步骤：5-羧乙基海因(0.01mol)加入25mL DMF，室温搅拌溶解，加入DCC(0.012mol)和HOBt(0.012mol)，反应8h，过滤取滤液，加入苄胺(0.013mol)，反应10h，经萃取浓缩结晶后得到N-苄基海因丙酰胺2.33g，收率89％)，收率低于水相酰胺化反应。实施例7：发酵产酶I。
取葡萄糖20g，玉米浆20mL，K2HPO4 15g，MgSO4 0.5g，5-羧乙基海因5g，pH7.5加自来水配制成0.5L液体发酵培养基，分装50mL培养基到500mL，加8层纱布，用牛皮纸包好后，0.1MPa高压蒸汽灭菌25min备用。
将芽孢杆菌MH602(Bacillus fordii MH602，CCTCC NO.M206144)，接在新鲜斜面培养基(斜面培养基(g·L-1：蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 5，琼脂20)上，活化培养24h，接入种子培养基(种子培养基(g·L-1)：葡萄糖15，蛋白胨20，K2HPO42，MgSO40.25)在33℃、220r·min-1振荡培养20h，培养结束接入发酵培养基，于33℃、200r·min-1发酵培养24h，发酵结束后，8000r·min-1离心25min，收集湿菌体。
实施例8：发酵产酶II。
取淀粉20g，蛋白胨20g，K2HPO4 15g，MgSO4 0.5g，5-甲硫乙基海因5g，pH7.5加自来水配制成0.5L液体发酵培养基，分装50mL培养基到500mL，加8层纱布，用牛皮纸包好后，0.1MPa高压蒸汽灭菌25min备用。
将洋葱伯克霍尔德氏菌JS-02(Burkholderia cepecia JS-02，CCTCC NO.M202047)，接在新鲜斜面培养基(斜面培养基(g·L-1)：蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 5，琼脂20)上，活化培养24h，接入种子培养基(种子培养基(g·L-1)：葡萄糖15，蛋白胨20，K2HPO42，MgSO40.25)在33℃、220r·min-1振荡培养20h。培养结束接入发酵培养基，于33℃、200r·min-1发酵培养24h。发酵结束后，8000r·min-1离心25min，收集湿菌体。
实施例9：酶催化水解N-乙基海因丙酰胺制备γ-L-谷氨酰乙胺(L-茶氨酸)。
取实施例1得到的得到N-乙基海因丙酰胺水溶液，加入Tris-HCl水溶液(pH9.0，0.1mol·L-1)稀释至100mL，加入实施例7得到的湿菌体1.5g，混合均匀置于水浴摇床反应18h，反应温度为37℃。反应结束后，8000r·min-1离心15min除去菌体，转至阴离子交换柱内，经洗脱浓缩结晶后得到γ-L-谷氨酰乙胺1.52g，收率94％，[α]D 25+8.0(c0.10，H2O)；1H NMR(D2O，300MHz)δ：3.76(t，J＝6.1Hz，1H)，3.20(q，J＝7.3Hz，2H)，2.43～2.36(m，2H)，2.15～2.10(m，2H)，1.10(t，J＝7.3Hz，3H)；HRMS(ESI)calcd for C7H14N2NaO3[M+Na]+197.0897，found197.0900。
实施例10：酶催化水解N-乙基海因丙酰胺制备γ-D-谷氨酰乙胺(D-茶氨酸)。
取实施例1得到的得到N-乙基海因丙酰胺水溶液，加入Tris-HCl水溶液(pH8.5，0.05mol·L-1)稀释至100mL，加入实施例8得到的湿菌体1.5g，混合均匀置于水浴摇床反应20h，反应温度为37℃。反应结束后，8000r·min-1离心15min除去菌体，转至阴离子交换柱内，经洗脱浓缩结晶后得到γ-D-谷氨酰乙胺1.38g，收率85％，[α]D 25-7.3(c0.10，H2O)；1H NMR(D2O，300MHz)δ：3.67(t，J＝6.1Hz，1H)，3.11(q，J＝7.3Hz，2H)，2.34～2.25(m，2H)，2.08～2.00(m，2H)，1.02(t，J＝7.3Hz，3H)；MSm/z：173.2(M-1)-。
实施例11：酶催化水解N-正丙基海因丙酰胺制备γ-L-谷氨酰正丙胺。
采用与实施例9相似的方法，改N-乙基海因丙酰胺水溶液为实施例2得到的N-正丙基海因丙酰胺水溶液，得到γ-L-谷氨酰正丙胺1.59g，收率93％，[α]D 25+5.9(c0.10，H2O)；1H NMR(D2O，300MHz)δ：3.95(t，J＝6.2Hz，1H)，3.15(t，J＝6.9Hz，2H)，2.51～2.46(m，2H)，2.32～2.27(m，2H)，1.54～1.49(m，2H)，0.87(t，J＝7.4Hz，3H)；MS m/z：187.4(M-1)-。
实施例12：酶催化水解N-异丙基海因丙酰胺制备γ-L-谷氨酰异丙胺。
采用与实施例9相似的方法，改N-乙基海因丙酰胺水溶液为实施例3得到的N-异丙基海因丙酰胺水溶液，得到γ-L-谷氨酰异丙胺1.63g，收率94％，[α]D 25+4.7(c0.10，H2O)；1H NMR(D2O，300MHz)δ：3.92～3.87(m，1H)，3.75(t，J＝6.0Hz，1H)，2.39～2.33(m，2H)，2.15～2.09(m，2H)，1.12(t，J＝6.7Hz，6H)；MS m/z：187.1(M-1)-。
实施例13：酶催化水解N-甲基海因丙酰胺制备γ-D-谷氨酰甲胺。
采用与实施例10相似的方法，改N-乙基海因丙酰胺水溶液为实施例4得到的N-甲基海因丙酰胺水溶液，得到γ-D-谷氨酰甲胺1.27g，收率88％，[α]D 25-4.2(c0.10，H2O)；1H NMR(D2O，300MHz)δ：3.76(t，J＝6.8Hz，1H)，2.71(s，3H)，2.41～2.36(m，2H)，2.13～2.08(m，2H)；MS m/z：160.0(M-1)-。
实施例14：酶催化水解N-苯基海因丙酰胺制备γ-L-谷氨酰苯胺。
采用与实施例9相似的方法，改N-乙基海因丙酰胺水溶液为实施例5得到的得到N-苯基海因丙酰胺水溶液，得到γ-L-谷氨酰苯胺1.94g，收率92％，[α]D 25+9.4(c0.10，H2O)；1H NMR(D2O，300MHz)δ：7.60～7.03(m，5H)，3.81(t，J＝5.2Hz，1H)，2.59～2.54(m，2H)，2.24～2.19(m，2H)；MS m/z：221.3(M-1)-。
实施例15：酶催化水解N-苄基海因丙酰胺制备γ-D-谷氨酰苄胺。
采用与实施例10相似的方法，改N-乙基海因丙酰胺水溶液为实施例6得到的得到N-苄基海因丙酰胺水溶液，得到γ-D-谷氨酰苄胺2.06g，收率90％，[α]D 25-8.2(c0.10，H2O)；1H NMR(D2O，300MHz)δ：7.62～7.11(m，5H)，4.44(s，2H)，3.79(t，J＝5.2Hz，1H)，2.22～2.17(m，2H)，2.06～2.01(m，2H)；MS m/z：235.1(M-1)-。
Claims (7)
1.一种一锅法制备γ-谷氨酰胺类化合物(1)的方法，其特征在于该方法包括下列步骤：
1)以5-羧乙基海因为起始物，与胺类化合物在水相缩合试剂作用下进行水相酰胺化反应，形成5-羧乙基海因酰胺类化合物，无需提取分离直接进行下一步酶反应；
所述的水相缩合试剂与5-羧乙基海因的摩尔比为1～1.4∶1，胺类化合物与5-羧乙基海因的摩尔比为1～1.6∶1；
所述的水相酰胺化反应为先将水相缩合试剂与5-羧乙基海因反应1～8h，再加入胺类化合物反应10～18h；
所述的水相缩合试剂为EDC·HCl/HOBt、EDC·HCl/HOOBt、EDC·HCl/HOAt和EDC·HCl/HOSu中的任意一种；
2)步骤1)得到的5-羧乙基海因酰胺类化合物，在弱碱性条件下，以同时含有海因酶与氨甲酰酶的菌体为催化剂，催化水解开环得到相应的γ-谷氨酰胺类化合物。
2.根据权利要求1所述的一锅法制备γ-谷氨酰胺类化合物的方法，其特征在于所述的γ-谷氨酰胺类化合物(1)的R基团为脂肪胺或芳香胺的残基。
3.根据权利要求1所述的一锅法制备γ-谷氨酰胺类化合物的方法，其特征在于步骤2)中，所述的同时含有海因酶和氨甲酰酶的菌体为芽孢杆菌(Bacillus fordii)MH602或洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepecia)JS-02。
4.根据权利要求1所述的一锅法制备γ-谷氨酰胺类化合物的方法，其特征在于步骤2)中，所述的弱碱性条件为pH7.5～9.5。
5.根据权利要求1所述的一锅法制备γ-谷氨酰胺类化合物的方法，其特征在于步骤2)中，所述的菌体与5-羧乙基海因酰胺类化合物的重量比为1∶0.5～8。
6.根据权利要求1所述的一锅法制备γ-谷氨酰胺类化合物的方法，其特征在于步骤2)中，所述的催化水解开环反应温度为35～45℃，反应时间为10～24h。
7.根据权利要求2所述的一锅法制备γ-谷氨酰胺类化合物的方法，其特征在于所述的脂肪胺为甲胺、乙胺、正丙胺、异丙胺、环丙胺、正丁胺、异丁胺、仲丁胺、叔丁胺、环丁胺、正戊胺、异戊胺、环戊胺、正己胺、环己胺、2-乙基己胺、正庚胺、2-庚胺和正辛胺中的任意一种；
所述的芳香胺为苯胺、邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯胺、苄胺、邻甲基苄胺、间甲基苄胺、对甲基苄胺、1-萘胺和2-萘胺中的任意一种。
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