CN101126103A - 微生物发酵法制备高f值玉米蛋白肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种微生物发酵法制备高F值玉米蛋白肽的方法，是以膨化玉米黄粉为原料，加重量比为10倍的水后用胶体磨超微粉碎，高温灭菌冷却后接种黑曲霉发酵液8％－10％，40－50℃保温水解20－24小时，灭菌后降温至35℃，按体积比3％－5％接种纳豆芽孢杆菌悬液，保温发酵18－20小时，然后高温灭菌、离心除渣、脱色后取上清液，再经浓缩、喷雾干燥制得高F值玉米蛋白肽粉末。本发明采用挤压膨化和超微粉碎等水解前处理工艺，打开玉米蛋白的紧密结构，降低其疏水性，使酶解容易进行，可大幅度提高产品的得率。

Description

微生物发酵法制备高F值玉米蛋白肽的方法

(一)技术领域

本发明涉及生物制备技术领域，具体涉及一种制备高F值玉米蛋白肽的方法。

(二)背景技术

玉米是是世界三大粮食作物之一，又是重要的饲料原料，由于其单产高，增产潜力大，在农业生产中占有重要的地位。利用玉米蛋白可以提取玉米醇溶蛋白，玉米黄色素、谷氨酸等优良产品，还能够制备具有多种生理功能的玉米活性肽，如玉米蛋白肽、高F值低聚肽、降血压肽等，从而使玉米加工的附加值大幅度提高。虽然玉米的使用范围很广，但长期以来，人们对玉米的利用主要是生产淀粉，玉米蛋白资源浪费很大。为此，世界上一些发达国家正积极致力于玉米蛋白开发利用新途径的研究。

在我国玉米深加工主要是提取淀粉国内有玉米湿法淀粉厂600多家，生产量占全国各种淀粉产量的80％，而淀粉生产只利用了玉米的65％，其它部分却进入了副产品中。我国每年生产淀粉消费玉米700多万吨，年产玉米蛋白粉(俗称黄粉)200多万吨，这些玉米蛋白粉含有60％左右的蛋白质，主要为醇溶蛋白(Zero68％)、谷蛋白(glutelin22％)、球蛋白(globulins1.2％)和白蛋白(albumin)。从营养的角度来看，玉米蛋白的氨基酸含量极不平衡，尤其是必需氨基酸赖氨酸和色氨酸比较缺乏，使其价值较低，从而限制了它的应用，长期以来，玉米蛋白粉只能作为饲料廉价出售或自然排放，我国每年随废液排走的玉米蛋白质高达8万多吨，不仅污染了环境而且造成了蛋白资源的浪费。

由于玉米蛋白具有特殊的蛋白质氨基酸组成，三种支链氨基酸含量较高(BCAA：Val，Ile，Leu)，而芳香族氨基酸(AAA：Tyr，Phe，Trp)的含量较低，通过体外水解，调节产物的肽片断长度，减少游离氨基酸的生成可制备高F值玉米寡肽混合物，而高F值玉米寡肽混合物具有良好的溶解性、流动性、热稳定性，而且粘度低，在体内吸收快、利用率高等优点，同时具有抗氧化性、消除疲劳、降低血氨浓度、降血压、促进乙醇代谢等独特的生理活性，玉米肽的开发成功将会对玉米深加工业产生重大影响，也将为人类的健康提供一个良好的新食物源，是一种比较理想的新型玉米深加工产品。由于该产品的应用范围很广，市场开发潜力很大，因此，潜藏着巨大的商机和很好的经济效益。本项目就是利用玉米蛋白独特的蛋白质结构和资源优势，结合现代生物科技，生产高F值玉米蛋白低聚肽应用于健康食品工业，从而开发玉米深加工新的领域。

国内目前在高F值低聚肽方面的研究处于起步阶段，而且主要以动物蛋白质为原料制取。国外有以动物蛋白为原料制取本产品的报导，但存在着成本高、含有致热因子等缺陷，因此使用范围极为有限。尤其是近年来受“疯牛病”的影响，许多国家和地区抵制以动物蛋白为原料制取的高F值低聚肽，使得高F值低聚肽在国际市场上极为紧缺。而以安全性极高的植物蛋白为原料制取的高F值低聚肽，将在国际市场上成为走俏商品。

1976年YamashitaM等首次利用胃蛋白酶和链霉蛋白酶从鱼蛋白和大豆分离蛋白中制取了低苯丙氨酸含量的低聚肽混合物；1982年NakhosZ等采用α-胰凝乳蛋白酶和梭肽酶A作用于大豆蛋白也得到类似的产物；1986年SoichiA等研究了胃蛋白酶、链霉蛋白酶、木瓜蛋白酶以及α-胰凝乳蛋白酶修饰乳清蛋白制取低苯丙氨酸的各种生产工艺和方法，结果表明，以胃蛋白酶和链霉蛋白酶两步水解法的产品得率较高，产品中苯丙氨酸含量也较低；1990年shin-yaT.等采用嗜碱蛋白酶和肌动蛋白酶降解玉米醇溶蛋白研制出无苦味高F值寡肽，并用其喂养有肝损伤的小白鼠，结果证实高F值寡肽可以对严重肝损伤有一定的治疗效果。1991年ShujiA.等以酪蛋白为原料，采用嗜热菌蛋白酶和木瓜蛋白酶两步水解成功地制取了高F值寡肽混合物；1996年西班牙学者BaudstaJ.等报道了以葵花蛋白为原料，酶法制取低分子量高F值蛋白质水解物的研究并且2000年把这种水解物应用到肝病患者的治疗。在我国市场上也有高F值氨基酸制品销售，但大多数都是氨基酸混合物，其中最有代表的是六合氨基酸，肝性脑病患者用六合氨基酸静滴，与左旋多巴、谷氨酸钠分别治疗作对比，结果表明六合氨基酸优于其他两组。此后，不少医院将高F值氨基酸用于常规治疗。郭俊生等人用大豆蛋白质制取了高支低芳氨基酸混合物，其BCAA/AAA摩尔比为51.8，经过动物试验表明，该种氨基酸混合物能提高肝性脑病大鼠的血清支/芳比，纠正血清氨基酸谱紊乱，改善肝性脑病症状。目前国内多见使用的是高F值氨基酸，尚未见低聚肽制品在我国的实用报道。

研究发现，高F值氨基酸在胃肠中的稳定性低于高F值低聚肽，且其生产成本较高，因此，高F值低聚肽的实用价值更高。随着高F值低聚肽制品的问世，口服高F值低聚肽可以以较低的价格及稳定的功效，取代氨基酸制剂。查新结果表明，目前以玉米蛋白粉制取高F值低聚肽，均采用直接水解法，但玉米蛋白具有特殊的异味，颜色深黄，结构紧密，且疏水性较强，酶解不容易进行，因此，产品得率较低。目前国内外未见产业化生产高F值低聚肽的相关报道。

(三)发明内容

本发明的目的在于提供一种可大幅度提高产品的得率，可延长玉米产业链，提升玉米的附加值，实现玉米精深加工副产物的高附加值综合利用的微生物发酵法制备高F值玉米蛋白肽的方法。

本发明的目的是这样实现的：它是以膨化玉米黄粉为原料，加重量比为10倍的水后用胶体磨超微粉碎，高温灭菌冷却后接种黑曲霉发酵液8％-10％，40-50℃保温水解20-24小时，灭菌后降温至35℃，按体积比3％-5％接种纳豆芽孢杆菌悬液，保温发酵18-20小时，然后高温灭菌、离心除渣、脱色后取上清液，再经浓缩、喷雾干燥制得高F值玉米蛋白肽粉末。

本发明还有这样一些技术特征：

1、所述的黑曲霉发酵液的发酵液蛋白酶活≥1000μ/ml；

2、所述的纳豆芽孢杆菌预先富集培养诱变，富集诱变方法为：

2.1、将100-300ml包含比例为m/v的牛肉膏1％、蛋白胨1％、氯化钠0.5％的肉汤培养基110-150℃灭菌10-30分钟，接种纳豆芽孢杆菌，摇床培养18-20小时，制成菌体悬液I；

2.2、将100-300ml包含比例为m/v的牛肉膏0.5％、蛋白胨0.5％、芳香族氨基酸0.1％、苯丙氨酸∶酪氨酸∶色氨酸＝1∶1∶1的肉汤培养基110-150℃灭菌10-30分钟，接种上述菌体悬液I 5％，摇床培养48小时，制成菌体悬液II，同时检测发酵液中的芳香族氨基酸含量；

2.3、将100ml-200包含比例为m/v的葡萄糖0.5％，芳香族氨基酸0.2％的培养基110-150℃灭菌10-30分钟，接种上述菌体悬液II5％，摇床培养48小时，制成菌体悬液III，同时检测发酵液中的芳香族氨基酸含量；

2.4、按上步培养基配方，0.1％逐级增大芳香族氨基酸的比例，培养条件不变，以此类推，直至培养基中的芳香族氨基酸浓度达到1％，结束富集诱变过程，分离纯化最后一步菌体悬液，得到能够消化芳香族氨基酸的诱变菌株；

3、所述的摇床转速为150转/分钟。

高F值玉米蛋白肽具有抗疲劳、消除或减轻肝性脑损伤、缓解酒精中毒、抑制癌细胞增值、降低血清胆固醇浓度等多种生理功效。我国玉米年产量1.1亿吨，局世界第二，仅次于美国，但由于对玉米的综合利用程度不够，缺乏高科技含量、高附加值及市场潜力巨大的玉米精深加工产品，到目前为止，玉米蛋白只能作为饲料廉价出售或自然排放，不仅污染了环境而且造成了蛋白资源的浪费，我国玉米产业优势还没有充分发挥出来。为改变这一现状，促进我国玉米经济的发展，本项目以玉米淀粉厂的下脚料——玉米蛋白为原料，同时添加其它辅料并采用现代生物工程技术，生产出对人体具有特殊营养保健功能的高附加值产品——玉米高F值低聚肽。本发明可延长玉米产业链，提升玉米的附加值，实现玉米精深加工副产物的高附加值综合利用，大幅度提升玉米精深加工企业经济效益，使我国的玉米资源优势转化为经济优势，不仅是发展食品工业和蛋白饲料工业所必需，而且也是为农业产业化发展所急需，通过综合利用深度加工，资源得到合理利用，不仅使企业的经济效益有较大提高，而月可以减轻对环境的污染。玉米的增产为综合利用精深加工提供了丰富的资源，而综合利用精深加工又为玉米提供了广泛的出路，为人民生活提供了丰富的食品和保健品的原料来源，特别是采用现代生物发酵工艺、酶工程和分离技术，使其精深加工产品在食品、医药、造纸、纺织和环保等相关行业都得到了广泛的应用，不断满足人们日益增长的物质需要，又为农业、化工业和酶制剂工业提供了广阔的市场发展空间，促进种植、加工、养殖的良性循环，从而加快了国民经济的发展速度。

本发明采用挤压膨化和超微粉碎等水解前处理工艺，打开玉米蛋白的紧密结构，降低其疏水性，使酶解容易进行，可大幅度提高产品的得率，以高F值玉米蛋白肽为主体原料，复配多种益生元，开发多种健康食品。

(四)附图说明

图1为芳香族氨基酸变化率示意图；

图2为具体实施方式的流程图。

(五)具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明：

1.1、发酵菌种来源

本实施例中黑曲霉和纳豆芽孢杆菌购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号黑曲霉CICC2377，用于生产酸性蛋白酶；纳豆芽孢杆菌CICC20443用于消化酶解玉米蛋白后产生的芳香族氨基酸。

1.2菌种诱变

结合图2，本实施例选取的黑曲霉CICC2377是专门生产酸性蛋白酶的真菌，发酵液可直接作用于玉米蛋白粉浆，产生玉米蛋白肽和多种氨基酸，其中包含一定量的芳香族氨基酸，用纳豆芽孢杆菌CICC20443消除大部分芳香族氨基酸后方能制备高F值玉米蛋白肽，但该纳豆芽孢杆菌需预先富集培养诱变后，方能具有消化芳香族氨基酸的功能，富集诱变方法如下：

●将100ml肉汤培养基(牛肉膏1％，蛋白胨1％，氯化钠0.5％，比例为m/v，以下比例同)，121℃灭菌20分钟，接种纳豆芽孢杆菌CICC20443，摇床(150转/分钟)培养18小时，制成菌体悬液I。

●将100ml肉汤培养基(牛肉膏0.5％，蛋白胨0.5％，芳香族氨基酸0.1％，苯丙氨酸∶酪氨酸∶色氨酸＝1∶1∶1)121℃灭菌20分钟，接种上述菌体悬液I5％，摇床(150转/分钟)培养48小时，制成菌体悬液II，同时检测发酵液中的芳香族氨基酸含量。

●将100ml培养基(葡萄糖0.5％，芳香族氨基酸0.2％)121℃灭菌20分钟，接种上述菌体悬液II5％，摇床(150转/分钟)培养48小时，制成菌体悬液III，同时检测发酵液中的芳香族氨基酸含量。

●按上步培养基配方，0.1％逐级增大芳香族氨基酸的比例，培养条件不变，以此类推，直至培养基中的芳香族氨基酸浓度达到1％，结束富集诱变过程，分离纯化最后一步菌体悬液，得到能够消化芳香族氨基酸的诱变菌株，在本项目中将该菌命名为HD01，在此诱变过程中，芳香族氨基酸的变化率如图1所示。

结合图1，经过第8次富集培养，该菌株已经将芳香族氨基酸的利用率提高到70％以上，故将富集菌株HD01作为消化芳香族氨基酸的生产菌株待用。

1.3高F值玉米蛋白肽的制备

以膨化玉米黄粉为原料，加重量比为10倍的水胶体磨超微粉碎，高温灭菌冷却后接种黑曲霉发酵液8％(发酵液蛋白酶活≥1000μ/ml)，50℃保温水解20小时，灭菌后降温至35℃，按体积比5％接种纳豆芽孢杆菌悬液，保温发酵18小时，然后高温灭菌、离心除渣、脱色后取上清液，再经浓缩、喷雾干燥制得高F值玉米蛋白肽粉末。最后可以以高F值玉米蛋白肽为主体原料，复配多种益生元，开发多种健康食品。

Claims (4)

1.一种微生物发酵法制备高F值玉米蛋白肽的方法，其特征在于它是以膨化玉米黄粉为原料，加重量比为10倍的水后用胶体磨超微粉碎，高温灭菌冷却后接种黑曲霉发酵液8％-10％，40-50℃保温水解20-24小时，灭菌后降温至35℃，按体积比3％-5％接种纳豆芽孢杆菌悬液，保温发酵18-20小时，然后高温灭菌、离心除渣、脱色后取上清液，再经浓缩、喷雾干燥制得高F值玉米蛋白肽粉末。

2.根据权利要求1所述的微生物发酵法制备高F值玉米蛋白肽的方法，其特征在于所述的黑曲霉发酵液的发酵液蛋白酶活≥1000μ/ml。

3.根据权利要求1或2所述的微生物发酵法制备高F值玉米蛋白肽的方法，其特征在于所述的纳豆芽孢杆菌预先富集培养诱变，富集诱变方法为：

3.1、将100-300ml包含比例为m/v的牛肉膏1％、蛋白胨1％、氯化钠0.5％的肉汤培养基110-150℃灭菌10-30分钟，接种纳豆芽孢杆菌，摇床培养18-20小时，制成菌体悬液I；

3.2、将100-300ml包含比例为m/v的牛肉膏0.5％、蛋白胨0.5％、芳香族氨基酸0.1％、苯丙氨酸∶酪氨酸∶色氨酸＝1∶1∶1的肉汤培养基110-150℃灭菌10-30分钟，接种上述菌体悬液I 5％，摇床培养48小时，制成菌体悬液II，同时检测发酵液中的芳香族氨基酸含量；

3.3、将100ml-200包含比例为m/v的葡萄糖0.5％，芳香族氨基酸0.2％的培养基110-150℃灭菌10-30分钟，接种上述菌体悬液II5％，摇床培养48小时，制成菌体悬液III，同时检测发酵液中的芳香族氨基酸含量；

3.4、按上步培养基配方，0.1％逐级增大芳香族氨基酸的比例，培养条件不变，以此类推，直至培养基中的芳香族氨基酸浓度达到1％，结束富集诱变过程，分离纯化最后一步菌体悬液，得到能够消化芳香族氨基酸的诱变菌株。

4.根据权利要求3所述的微生物发酵法制备高F值玉米蛋白肽的方法，其特征在于所述的摇床转速为150转/分钟。

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