CN113817654A - 一种生产核黄素的发酵培养基及发酵方法 - Google Patents

一种生产核黄素的发酵培养基及发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生产核黄素的发酵培养基及发酵方法，所述发酵培养基中的组分及其用量为：葡萄糖20‑30g/L、酵母粉10‑20g/L、黄豆饼粉10‑20g/L、玉米浆10‑20g/L、柠檬酸钠2‑5g/L、磷酸氢二钾3‑6g/L、硫酸铵1‑3g/L、硝酸钠0.5‑1.5g/L和谷氨酰胺母液100‑200mL，其余为水；发酵方法包括：(1)配置发酵培养基；(2)灭菌；(3)接种枯草芽孢杆菌种子液；(4)发酵培养。有益效果：本发明加入柠檬酸钠目的为了抑制糖酵解途径，增加HMP途径碳通量；谷氨酰胺作为三磷酸鸟苷(GTP)的合成前体也直接促进核黄素生成；本发明的发酵方法使维生素B2的生产水平以及转化率有了大幅度的提升，且降低了发酵成本，并且本发明的发酵方法简单易行。

Description

一种生产核黄素的发酵培养基及发酵方法
技术领域：
本发明专利属于生物发酵工程技术领域，具体涉及一种生产核黄素的发酵培养基及发酵方法。
背景技术：
核黄素(Riboflavin)，又称维生素B2，是人体必需的13种维生素之一，在自然界中分布广泛，是B族维生素的成员之一。核黄素是黄素酶类的辅酶组成部分，在生物体内主要以黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的形式存在，以辅酶或辅基的形式参与各种酶系统反应。作为黄素蛋白的辅酶在呼吸和生物氧化中起着重要作用，直接参与碳水化合物、蛋白质、脂肪的生物氧化作用，是维持机体正常代谢和生理功能所必须的营养素。同时，核黄素也具有促进发育和细胞再生，帮助消除口腔内炎症，增进视力等功效。人和动物体内缺少内源性核黄素生成途径，必须从食物中获取。缺少核黄素会诱发多种心血管疾病。核黄素成为一种重要的饲料添加剂、食品添加剂、药品和食品染料，市场每年需求约8000-10000吨。
工业上生产核黄素的方法主要分为化学合成法、半微生物发酵合成法和微生物发酵法。化学合成法和半微生物发酵合成法发展较早，生产工艺相对成熟，但由于环境污染严重、操作流程复杂等缺陷已被限制使用。在现有的微生物发酵工艺中，有部分企业采用酵母菌发酵生产核黄素，但整体周期较长；大部分企业采用芽孢杆菌进行发酵，但由于核黄素代谢途径较为复杂，代谢过程受核黄素操纵子、嘌呤从头合成途径及戊糖磷酸(HMP)途径协同调控，同时发酵后期铵离子浓度增加也会使代谢流发生偏移，影响核黄素的生成，导致产品实际产量及转化率相对偏低，生产成本较高。
因此，改进核黄素的发酵配方及过程控制工艺，在提高产量水平的同时，降低生产成本，对提高国内核黄素的产量及产品市场竞争力具有重要的意义。
发明内容：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种生产核黄素的发酵培养基及发酵方法，本发明提供的生产核黄素的发酵培养基能够促进核黄素生产，发酵方法能够大幅度提升维生素B2的生产水平以及转化率，且降低了发酵成本。
本发明的技术方案一方面公开了一种生产核黄素的发酵培养基，所述发酵培养基中的组分及其用量为：葡萄糖20-30g/L、酵母粉10-20g/L、黄豆饼粉10-20g/L、玉米浆10-20g/L、柠檬酸钠2-5g/L、磷酸氢二钾3-6g/L、硫酸铵1-3g/L、硝酸钠0.5-1.5g/L和谷氨酰胺母液100-200mL，其余为水。
进一步的，所述谷氨酰胺母液的浓度为40-50g/L。
本发明的技术方案另一方面公开了一种生产核黄素的发酵方法，其包括以下步骤：(1)配置发酵培养基；(2)灭菌；(3)接种枯草芽孢杆菌种子液；(4)发酵培养；
(1)配置发酵培养基：将葡萄糖、酵母粉、黄豆饼粉、玉米浆、柠檬酸钠、磷酸、硫酸铵、硝酸钠、谷氨酰胺母液和水按照配比称量好，接着将上述原料混合充分溶解，得到发酵培养基；
(2)灭菌：将步骤(1)中配置好的所述发酵培养基进行灭菌；
(3)接种枯草芽孢杆菌种子液：将OD值为10-12的枯草芽孢杆菌种子液接种到步骤(2)中灭菌后的所述发酵培养基中，接种的所述枯草芽孢杆菌种子液的体积占所述发酵培养基的体积的10-15％，得到发酵液；
(4)发酵培养：将步骤(3)中的所述发酵液于发酵罐中发酵，控制所述发酵罐内的罐压、通气量以及搅拌速度，使得所述发酵液中的溶氧量控制在25-35％，发酵周期为40h，既得核黄素，其中在发酵过程中通过添加pH调节剂调节所述发酵液的pH值，使得所述发酵液在0-20h的pH值为6.9-7.1，20-30h的pH值为6.7-6.9，30-40h的pH值为6.4-6.6。
进一步的，步骤(2)中的所述灭菌的温度为121-125℃，灭菌的时间为20-30min。
进一步的，制备步骤(3)中所述枯草芽孢杆菌种子液的方法包括以下步骤：a、选取菌种；b、斜面培养；c、一级种子培养；d、二级种子培养；
a、选取菌种：选取合格且优良的枯草芽孢杆菌，其保藏地为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.21202；
b、斜面培养：将步骤a中的所述枯草芽孢杆菌接种至斜面培养基，接着在温度为35-37℃培养箱内培养24-30h；
c、一级种子培养：从步骤b培养完成的所述斜面培养基上刮取两环菌种接种于摇瓶内的100ml的液体培养基上，摇瓶的转速200rpm，培养的温度为36.5-38℃，培养周期为24-25h，得到OD值为8-9的一级种子；
d、二级种子培养：将步骤c中的所述一级种子接种到置于二级种子罐中的二级种子培养基上，接种的所述一级种子的体积占所述二级种子培养基的体积的12-16％，所述二级种子罐中的罐压控制在0.03-0.05Mpa，通气比控制在0.6-1.0vvm，罐温控制在36-36.5℃，所述二级种子罐内的搅拌速度控制在160-200rpm，培养周期为18-20h，得到OD值为10-12的所述枯草芽孢杆菌种子液。
进一步的，步骤d中所述二级种子培养基的组成为：葡萄糖15g/L、酵母粉15g/L、硫酸铵6g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、硫酸镁1.2g/L、消泡剂0.3mL/L、生物素0.2mg/L、VB1 2mg/L，其余为水。
进一步的，在步骤(4)中所述发酵罐中的所述发酵液的发酵条件为：所述发酵罐内的发酵温度控制在36-37℃，所述发酵罐内的压力控制在0.04-0.08Mpa，所述发酵罐内的通气量控制在10-35L/min，所述发酵罐内的搅拌速度控制在200-800rpm。
进一步的，步骤(4)中的所述pH调节剂选用氨水。
本发明的优点：
1、本发明的发酵培养基中的玉米浆、黄豆饼粉和酵母粉作为有机氮源在发酵工业中被广为应用，其含有的氨基酸、维生素及生长因子，不仅有利于菌体生长还可提高产酸及转化率；硫酸铵以及硝酸钠作为无机氮源在核黄素发酵的过程中也起到了促进菌体生长及核黄素合成的关键作用；加入柠檬酸钠目的为了抑制糖酵解途径，增加HMP途径碳通量；谷氨酰胺作为三磷酸鸟苷(GTP)的合成前体也直接促进核黄素生成，本发明中发酵培养基中的谷氨酰胺母液是谷氨酰胺提取过程产生的副产品，其含有较多的谷氨酰胺，使用它代替纯的谷氨酰胺，可以降低核黄素的生产成本。
2、本发明的发酵方法通过在发酵过程中加入pH调节剂控制发酵液在不同发酵时间的pH值来实现有效地控制发酵液中铵离子的浓度，同时也使维生素B2的生产水平以及转化率有了大幅度的提升，且降低了发酵成本，并且本发明的发酵方法简单易行。
具体实施方式：
下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：一种生产核黄素的发酵培养基，所述发酵培养基中的组分及其用量为：葡萄糖20g/L、酵母粉10g/L、黄豆饼粉10g/L、玉米浆10g/L、柠檬酸钠2g/L、磷酸氢二钾3g/L、硫酸铵1g/L、硝酸钠0.5g/L和谷氨酰胺母液100mL，其余为水，所述谷氨酰胺母液的浓度为45g/L。
发酵培养基中的玉米浆、黄豆饼粉和酵母粉作为有机氮源在发酵工业中被广为应用，其含有的氨基酸、维生素及生长因子，不仅有利于菌体生长还可提高产酸及转化率；硫酸铵以及硝酸钠作为无机氮源在核黄素发酵的过程中也起到了促进菌体生长及核黄素合成的关键作用；加入柠檬酸钠目的为了抑制糖酵解途径，增加HMP途径碳通量；谷氨酰胺作为三磷酸鸟苷(GTP)的合成前体也直接促进核黄素生成，本发明中发酵培养基中的谷氨酰胺母液是谷氨酰胺提取过程产生的副产品，其含有较多的谷氨酰胺，使用它代替纯的谷氨酰胺，可以降低核黄素的生产成本。
利用上述发酵培养基来生产核黄素的发酵方法，其包括以下步骤：(1)配置发酵培养基；(2)灭菌；(3)接种枯草芽孢杆菌种子液；(4)发酵培养。
(1)配置发酵培养基：将葡萄糖、酵母粉、黄豆饼粉、玉米浆、柠檬酸钠、磷酸、硫酸铵、硝酸钠、谷氨酰胺母液和水按照配比称量好，接着将上述原料混合充分溶解，得到发酵培养基。
(2)灭菌：将步骤(1)中配置好的所述发酵培养基进行灭菌，灭菌的温度为121℃，灭菌的时间为25min。
(3)接种枯草芽孢杆菌种子液：将OD值为10-12的枯草芽孢杆菌种子液接种到步骤(2)中灭菌后的所述发酵培养基中，接种的所述枯草芽孢杆菌种子液的体积占所述发酵培养基的体积的15％，得到发酵液。
其中所述枯草芽孢杆菌种子液的方法包括以下步骤：a、选取菌种；b、斜面培养；c、一级种子培养；d、二级种子培养。
a、选取菌种：选取合格且优良的枯草芽孢杆菌，其保藏地为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.21202。
b、斜面培养：将步骤a中的所述枯草芽孢杆菌接种至斜面培养基，接着在温度为37℃培养箱内培养24h。
c、一级种子培养：从步骤b培养完成的所述斜面培养基上刮取两环菌种接种于摇瓶内的100ml的液体培养基上，摇瓶的转速200rpm，培养的温度为37℃，培养周期为24h，得到OD值为8-9的一级种子。
d、二级种子培养：将步骤c中的所述一级种子接种到置于二级种子罐中的二级种子培养基上，接种的所述一级种子的体积占所述二级种子培养基的体积的15％，所述二级种子罐中的罐压控制在0.03-0.05Mpa，通气比控制在0.6-1.0vvm，罐温控制在36℃，所述二级种子罐内的搅拌速度控制在160-200rpm，培养周期为18-20h，得到OD值为10-12的所述枯草芽孢杆菌种子液；其中所述二级种子培养基的组成为：葡萄糖15g/L、酵母粉15g/L、硫酸铵6g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、硫酸镁1.2g/L、消泡剂0.3mL/L、生物素0.2mg/L、VB1 2mg/L，其余为水。
(4)发酵培养：将步骤(3)中的所述发酵液于发酵罐中发酵，控制所述发酵罐内的罐压、通气量以及搅拌速度，使得所述发酵液中的溶氧量控制在25-35％，发酵周期为40h，既得核黄素，其中在发酵过程中通过添加pH调节剂调节所述发酵液的pH值，使得所述发酵液在0-20h的pH值为6.9，20-30h的pH值为6.7，30-40h的pH值为6.4，所述pH调节剂选用氨水。
在步骤(4)中所述发酵罐中的所述发酵液的发酵条件为：所述发酵罐内的发酵温度控制在37℃，所述发酵罐内的压力控制在0.04-0.08Mpa，所述发酵罐内的通气量控制在10-35L/min，所述发酵罐内的搅拌速度控制在200-800rpm。
重复上述发酵过程3次，发酵结束后测定发酵液中的核黄素含量，并计算转化率。
本发明的发酵方法通过在发酵过程中加入pH调节剂控制发酵液在不同发酵时间的pH值来实现有效地控制发酵液中铵离子的浓度，同时也使维生素B2的生产水平以及转化率有了大幅度的提升，且降低了发酵成本，并且本发明的发酵方法简单易行。
实施例2：一种生产核黄素的发酵培养基，所述发酵培养基中的组分及其用量为：葡萄糖20g/L、酵母粉15g/L、黄豆饼粉15g/L、玉米浆20g/L、柠檬酸钠2g/L、磷酸氢二钾4g/L、硫酸铵3g/L、硝酸钠1.0g/L和谷氨酰胺母液100mL，其余为水，所述谷氨酰胺母液的浓度为45g/L。
发酵培养基中的玉米浆、黄豆饼粉和酵母粉作为有机氮源在发酵工业中被广为应用，其含有的氨基酸、维生素及生长因子，不仅有利于菌体生长还可提高产酸及转化率；硫酸铵以及硝酸钠作为无机氮源在核黄素发酵的过程中也起到了促进菌体生长及核黄素合成的关键作用；加入柠檬酸钠目的为了抑制糖酵解途径，增加HMP途径碳通量；谷氨酰胺作为三磷酸鸟苷(GTP)的合成前体也直接促进核黄素生成，本发明中发酵培养基中的谷氨酰胺母液是谷氨酰胺提取过程产生的副产品，其含有较多的谷氨酰胺，使用它代替纯的谷氨酰胺，可以降低核黄素的生产成本。
利用上述发酵培养基来生产核黄素的发酵方法，其包括以下步骤：(1)配置发酵培养基；(2)灭菌；(3)接种枯草芽孢杆菌种子液；(4)发酵培养。
(1)配置发酵培养基：将葡萄糖、酵母粉、黄豆饼粉、玉米浆、柠檬酸钠、磷酸、硫酸铵、硝酸钠、谷氨酰胺母液和水按照配比称量好，接着将上述原料混合充分溶解，得到发酵培养基。
(2)灭菌：将步骤(1)中配置好的所述发酵培养基进行灭菌，灭菌的温度为121℃，灭菌的时间为25min。
(3)接种枯草芽孢杆菌种子液：将OD值为10-12的枯草芽孢杆菌种子液接种到步骤(2)中灭菌后的所述发酵培养基中，接种的所述枯草芽孢杆菌种子液的体积占所述发酵培养基的体积的15％，得到发酵液。
其中所述枯草芽孢杆菌种子液的方法包括以下步骤：a、选取菌种；b、斜面培养；c、一级种子培养；d、二级种子培养。
a、选取菌种：选取合格且优良的枯草芽孢杆菌，其保藏地为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.21202。
b、斜面培养：将步骤a中的所述枯草芽孢杆菌接种至斜面培养基，接着在温度为37℃培养箱内培养24h。
c、一级种子培养：从步骤b培养完成的所述斜面培养基上刮取两环菌种接种于摇瓶内的100ml的液体培养基上，摇瓶的转速200rpm，培养的温度为37℃，培养周期为24h，得到OD值为8-9的一级种子。
d、二级种子培养：将步骤c中的所述一级种子接种到置于二级种子罐中的二级种子培养基上，接种的所述一级种子的体积占所述二级种子培养基的体积的15％，所述二级种子罐中的罐压控制在0.03-0.05Mpa，通气比控制在0.6-1.0vvm，罐温控制在36℃，所述二级种子罐内的搅拌速度控制在160-200rpm，培养周期为18-20h，得到OD值为10-12的所述枯草芽孢杆菌种子液；其中所述二级种子培养基的组成为：葡萄糖15g/L、酵母粉15g/L、硫酸铵6g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、硫酸镁1.2g/L、消泡剂0.3mL/L、生物素0.2mg/L、VB1 2mg/L，其余为水。
(4)发酵培养：将步骤(3)中的所述发酵液于发酵罐中发酵，控制所述发酵罐内的罐压、通气量以及搅拌速度，使得所述发酵液中的溶氧量控制在25-35％，发酵周期为40h，既得核黄素，其中在发酵过程中通过添加pH调节剂调节所述发酵液的pH值，使得所述发酵液在0-20h的pH值为7.0，20-30h的pH值为6.8，30-40h的pH值为6.6，所述pH调节剂选用氨水。
在步骤(4)中所述发酵罐中的所述发酵液的发酵条件为：所述发酵罐内的发酵温度控制在37℃，所述发酵罐内的压力控制在0.04-0.08Mpa，所述发酵罐内的通气量控制在10-35L/min，所述发酵罐内的搅拌速度控制在200-800rpm。
重复上述发酵过程3次，发酵结束后测定发酵液中的核黄素含量，并计算转化率。
本发明的发酵方法通过在发酵过程中加入pH调节剂控制发酵液在不同发酵时间的pH值来实现有效地控制发酵液中铵离子的浓度，同时也使维生素B2的生产水平以及转化率有了大幅度的提升，且降低了发酵成本，并且本发明的发酵方法简单易行。
实施例3：一种生产核黄素的发酵培养基，所述发酵培养基中的组分及其用量为：葡萄糖25g/L、酵母粉15g/L、黄豆饼粉15g/L、玉米浆15g/L、柠檬酸钠4g/L、磷酸氢二钾4g/L、硫酸铵3g/L、硝酸钠1.0g/L和谷氨酰胺母液100mL，其余为水，所述谷氨酰胺母液的浓度为45g/L。
发酵培养基中的玉米浆、黄豆饼粉和酵母粉作为有机氮源在发酵工业中被广为应用，其含有的氨基酸、维生素及生长因子，不仅有利于菌体生长还可提高产酸及转化率；硫酸铵以及硝酸钠作为无机氮源在核黄素发酵的过程中也起到了促进菌体生长及核黄素合成的关键作用；加入柠檬酸钠目的为了抑制糖酵解途径，增加HMP途径碳通量；谷氨酰胺作为三磷酸鸟苷(GTP)的合成前体也直接促进核黄素生成，本发明中发酵培养基中的谷氨酰胺母液是谷氨酰胺提取过程产生的副产品，其含有较多的谷氨酰胺，使用它代替纯的谷氨酰胺，可以降低核黄素的生产成本。
利用上述发酵培养基来生产核黄素的发酵方法，其包括以下步骤：(1)配置发酵培养基；(2)灭菌；(3)接种枯草芽孢杆菌种子液；(4)发酵培养。
(1)配置发酵培养基：将葡萄糖、酵母粉、黄豆饼粉、玉米浆、柠檬酸钠、磷酸、硫酸铵、硝酸钠、谷氨酰胺母液和水按照配比称量好，接着将上述原料混合充分溶解，得到发酵培养基。
(2)灭菌：将步骤(1)中配置好的所述发酵培养基进行灭菌，灭菌的温度为121℃，灭菌的时间为25min。
(3)接种枯草芽孢杆菌种子液：将OD值为10-12的枯草芽孢杆菌种子液接种到步骤(2)中灭菌后的所述发酵培养基中，接种的所述枯草芽孢杆菌种子液的体积占所述发酵培养基的体积的15％，得到发酵液。
其中所述枯草芽孢杆菌种子液的方法包括以下步骤：a、选取菌种；b、斜面培养；c、一级种子培养；d、二级种子培养。
a、选取菌种：选取合格且优良的枯草芽孢杆菌，其保藏地为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.21202。
b、斜面培养：将步骤a中的所述枯草芽孢杆菌接种至斜面培养基，接着在温度为37℃培养箱内培养24h。
c、一级种子培养：从步骤b培养完成的所述斜面培养基上刮取两环菌种接种于摇瓶内的100ml的液体培养基上，摇瓶的转速200rpm，培养的温度为37℃，培养周期为24h，得到OD值为8-9的一级种子。
d、二级种子培养：将步骤c中的所述一级种子接种到置于二级种子罐中的二级种子培养基上，接种的所述一级种子的体积占所述二级种子培养基的体积的15％，所述二级种子罐中的罐压控制在0.03-0.05Mpa，通气比控制在0.6-1.0vvm，罐温控制在36℃，所述二级种子罐内的搅拌速度控制在160-200rpm，培养周期为18-20h，得到OD值为10-12的所述枯草芽孢杆菌种子液；其中所述二级种子培养基的组成为：葡萄糖15g/L、酵母粉15g/L、硫酸铵6g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、硫酸镁1.2g/L、消泡剂0.3mL/L、生物素0.2mg/L、VB1 2mg/L，其余为水。
(4)发酵培养：将步骤(3)中的所述发酵液于发酵罐中发酵，控制所述发酵罐内的罐压、通气量以及搅拌速度，使得所述发酵液中的溶氧量控制在25-35％，发酵周期为40h，既得核黄素，其中在发酵过程中通过添加pH调节剂调节所述发酵液的pH值，使得所述发酵液在0-20h的pH值为6.9，20-30h的pH值为6.7，30-40h的pH值为6.4，所述pH调节剂选用氨水。
在步骤(4)中所述发酵罐中的所述发酵液的发酵条件为：所述发酵罐内的发酵温度控制在37℃，所述发酵罐内的压力控制在0.04-0.08Mpa，所述发酵罐内的通气量控制在10-35L/min，所述发酵罐内的搅拌速度控制在200-800rpm。
重复上述发酵过程3次，发酵结束后测定发酵液中的核黄素含量，并计算转化率。
本发明的发酵方法通过在发酵过程中加入pH调节剂控制发酵液在不同发酵时间的pH值来实现有效地控制发酵液中铵离子的浓度，同时也使维生素B2的生产水平以及转化率有了大幅度的提升，且降低了发酵成本，并且本发明的发酵方法简单易行。
实施例4：一种生产核黄素的发酵培养基，所述发酵培养基中的组分及其用量为：葡萄糖20g/L、酵母粉15g/L、黄豆饼粉10g/L、玉米浆20g/L、柠檬酸钠3g/L、磷酸氢二钾6g/L、硫酸铵3g/L、硝酸钠1.0g/L和谷氨酰胺母液200mL，其余为水，所述谷氨酰胺母液的浓度为45g/L。
发酵培养基中的玉米浆、黄豆饼粉和酵母粉作为有机氮源在发酵工业中被广为应用，其含有的氨基酸、维生素及生长因子，不仅有利于菌体生长还可提高产酸及转化率；硫酸铵以及硝酸钠作为无机氮源在核黄素发酵的过程中也起到了促进菌体生长及核黄素合成的关键作用；加入柠檬酸钠目的为了抑制糖酵解途径，增加HMP途径碳通量；谷氨酰胺作为三磷酸鸟苷(GTP)的合成前体也直接促进核黄素生成，本发明中发酵培养基中的谷氨酰胺母液是谷氨酰胺提取过程产生的副产品，其含有较多的谷氨酰胺，使用它代替纯的谷氨酰胺，可以降低核黄素的生产成本。
利用上述发酵培养基来生产核黄素的发酵方法，其包括以下步骤：(1)配置发酵培养基；(2)灭菌；(3)接种枯草芽孢杆菌种子液；(4)发酵培养。
(1)配置发酵培养基：将葡萄糖、酵母粉、黄豆饼粉、玉米浆、柠檬酸钠、磷酸、硫酸铵、硝酸钠、谷氨酰胺母液和水按照配比称量好，接着将上述原料混合充分溶解，得到发酵培养基。
(2)灭菌：将步骤(1)中配置好的所述发酵培养基进行灭菌，灭菌的温度为121℃，灭菌的时间为25min。
(3)接种枯草芽孢杆菌种子液：将OD值为10-12的枯草芽孢杆菌种子液接种到步骤(2)中灭菌后的所述发酵培养基中，接种的所述枯草芽孢杆菌种子液的体积占所述发酵培养基的体积的15％，得到发酵液。
其中所述枯草芽孢杆菌种子液的方法包括以下步骤：a、选取菌种；b、斜面培养；c、一级种子培养；d、二级种子培养。
a、选取菌种：选取合格且优良的枯草芽孢杆菌，其保藏地为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.21202。
b、斜面培养：将步骤a中的所述枯草芽孢杆菌接种至斜面培养基，接着在温度为37℃培养箱内培养24h。
c、一级种子培养：从步骤b培养完成的所述斜面培养基上刮取两环菌种接种于摇瓶内的100ml的液体培养基上，摇瓶的转速200rpm，培养的温度为37℃，培养周期为24h，得到OD值为8-9的一级种子。
d、二级种子培养：将步骤c中的所述一级种子接种到置于二级种子罐中的二级种子培养基上，接种的所述一级种子的体积占所述二级种子培养基的体积的15％，所述二级种子罐中的罐压控制在0.03-0.05Mpa，通气比控制在0.6-1.0vvm，罐温控制在36℃，所述二级种子罐内的搅拌速度控制在160-200rpm，培养周期为18-20h，得到OD值为10-12的所述枯草芽孢杆菌种子液；其中所述二级种子培养基的组成为：葡萄糖15g/L、酵母粉15g/L、硫酸铵6g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、硫酸镁1.2g/L、消泡剂0.3mL/L、生物素0.2mg/L、VB1 2mg/L，其余为水。
(4)发酵培养：将步骤(3)中的所述发酵液于发酵罐中发酵，控制所述发酵罐内的罐压、通气量以及搅拌速度，使得所述发酵液中的溶氧量控制在25-35％，发酵周期为40h，既得核黄素，其中在发酵过程中通过添加pH调节剂调节所述发酵液的pH值，使得所述发酵液在0-20h的pH值为7.0，20-30h的pH值为6.8，30-40h的pH值为6.6，所述pH调节剂选用氨水。
在步骤(4)中所述发酵罐中的所述发酵液的发酵条件为：所述发酵罐内的发酵温度控制在37℃，所述发酵罐内的压力控制在0.04-0.08Mpa，所述发酵罐内的通气量控制在10-35L/min，所述发酵罐内的搅拌速度控制在200-800rpm。
重复上述发酵过程3次，发酵结束后测定发酵液中的核黄素含量，并计算转化率。
本发明的发酵方法通过在发酵过程中加入pH调节剂控制发酵液在不同发酵时间的pH值来实现有效地控制发酵液中铵离子的浓度，同时也使维生素B2的生产水平以及转化率有了大幅度的提升，且降低了发酵成本，并且本发明的发酵方法简单易行。
实施例5：一种生产核黄素的发酵培养基，所述发酵培养基中的组分及其用量为：葡萄糖30g/L、酵母粉20g/L、黄豆饼粉20g/L、玉米浆20g/L、柠檬酸钠4g/L、磷酸氢二钾4g/L、硫酸铵3g/L、硝酸钠1.5g/L和谷氨酰胺母液200mL，其余为水，所述谷氨酰胺母液的浓度为45g/L。
发酵培养基中的玉米浆、黄豆饼粉和酵母粉作为有机氮源在发酵工业中被广为应用，其含有的氨基酸、维生素及生长因子，不仅有利于菌体生长还可提高产酸及转化率；硫酸铵以及硝酸钠作为无机氮源在核黄素发酵的过程中也起到了促进菌体生长及核黄素合成的关键作用；加入柠檬酸钠目的为了抑制糖酵解途径，增加HMP途径碳通量；谷氨酰胺作为三磷酸鸟苷(GTP)的合成前体也直接促进核黄素生成，本发明中发酵培养基中的谷氨酰胺母液是谷氨酰胺提取过程产生的副产品，其含有较多的谷氨酰胺，使用它代替纯的谷氨酰胺，可以降低核黄素的生产成本。
利用上述发酵培养基来生产核黄素的发酵方法，其包括以下步骤：(1)配置发酵培养基；(2)灭菌；(3)接种枯草芽孢杆菌种子液；(4)发酵培养。
(1)配置发酵培养基：将葡萄糖、酵母粉、黄豆饼粉、玉米浆、柠檬酸钠、磷酸、硫酸铵、硝酸钠、谷氨酰胺母液和水按照配比称量好，接着将上述原料混合充分溶解，得到发酵培养基。
(2)灭菌：将步骤(1)中配置好的所述发酵培养基进行灭菌，灭菌的温度为121℃，灭菌的时间为25min。
(3)接种枯草芽孢杆菌种子液：将OD值为10-12的枯草芽孢杆菌种子液接种到步骤(2)中灭菌后的所述发酵培养基中，接种的所述枯草芽孢杆菌种子液的体积占所述发酵培养基的体积的15％，得到发酵液。
其中所述枯草芽孢杆菌种子液的方法包括以下步骤：a、选取菌种；b、斜面培养；c、一级种子培养；d、二级种子培养。
a、选取菌种：选取合格且优良的枯草芽孢杆菌，其保藏地为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.21202。
b、斜面培养：将步骤a中的所述枯草芽孢杆菌接种至斜面培养基，接着在温度为37℃培养箱内培养24h。
c、一级种子培养：从步骤b培养完成的所述斜面培养基上刮取两环菌种接种于摇瓶内的100ml的液体培养基上，摇瓶的转速200rpm，培养的温度为37℃，培养周期为24h，得到OD值为8-9的一级种子。
d、二级种子培养：将步骤c中的所述一级种子接种到置于二级种子罐中的二级种子培养基上，接种的所述一级种子的体积占所述二级种子培养基的体积的15％，所述二级种子罐中的罐压控制在0.03-0.05Mpa，通气比控制在0.6-1.0vvm，罐温控制在36℃，所述二级种子罐内的搅拌速度控制在160-200rpm，培养周期为18-20h，得到OD值为10-12的所述枯草芽孢杆菌种子液；其中所述二级种子培养基的组成为：葡萄糖15g/L、酵母粉15g/L、硫酸铵6g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、硫酸镁1.2g/L、消泡剂0.3mL/L、生物素0.2mg/L、VB1 2mg/L，其余为水。
(4)发酵培养：将步骤(3)中的所述发酵液于发酵罐中发酵，控制所述发酵罐内的罐压、通气量以及搅拌速度，使得所述发酵液中的溶氧量控制在25-35％，发酵周期为40h，既得核黄素，其中在发酵过程中通过添加pH调节剂调节所述发酵液的pH值，使得所述发酵液在0-20h的pH值为7.0，20-30h的pH值为6.8，30-40h的pH值为6.6，所述pH调节剂选用氨水。
在步骤(4)中所述发酵罐中的所述发酵液的发酵条件为：所述发酵罐内的发酵温度控制在37℃，所述发酵罐内的压力控制在0.04-0.08Mpa，所述发酵罐内的通气量控制在10-35L/min，所述发酵罐内的搅拌速度控制在200-800rpm。
重复上述发酵过程3次，发酵结束后测定发酵液中的核黄素含量，并计算转化率。
本发明的发酵方法通过在发酵过程中加入pH调节剂控制发酵液在不同发酵时间的pH值来实现有效地控制发酵液中铵离子的浓度，同时也使维生素B2的生产水平以及转化率有了大幅度的提升，且降低了发酵成本，并且本发明的发酵方法简单易行。
实施例6：一种生产核黄素的发酵培养基，所述发酵培养基中的组分及其用量为：葡萄糖30g/L、酵母粉20g/L、黄豆饼粉20g/L、玉米浆20g/L、柠檬酸钠2g/L、磷酸氢二钾4g/L、硫酸铵3g/L、硝酸钠1.0g/L和谷氨酰胺母液100mL，其余为水，所述谷氨酰胺母液的浓度为45g/L。
发酵培养基中的玉米浆、黄豆饼粉和酵母粉作为有机氮源在发酵工业中被广为应用，其含有的氨基酸、维生素及生长因子，不仅有利于菌体生长还可提高产酸及转化率；硫酸铵以及硝酸钠作为无机氮源在核黄素发酵的过程中也起到了促进菌体生长及核黄素合成的关键作用；加入柠檬酸钠目的为了抑制糖酵解途径，增加HMP途径碳通量；谷氨酰胺作为三磷酸鸟苷(GTP)的合成前体也直接促进核黄素生成，本发明中发酵培养基中的谷氨酰胺母液是谷氨酰胺提取过程产生的副产品，其含有较多的谷氨酰胺，使用它代替纯的谷氨酰胺，可以降低核黄素的生产成本。
利用上述发酵培养基来生产核黄素的发酵方法，其包括以下步骤：(1)配置发酵培养基；(2)灭菌；(3)接种枯草芽孢杆菌种子液；(4)发酵培养。
(1)配置发酵培养基：将葡萄糖、酵母粉、黄豆饼粉、玉米浆、柠檬酸钠、磷酸、硫酸铵、硝酸钠、谷氨酰胺母液和水按照配比称量好，接着将上述原料混合充分溶解，得到发酵培养基。
(2)灭菌：将步骤(1)中配置好的所述发酵培养基进行灭菌，灭菌的温度为121℃，灭菌的时间为25min。
(3)接种枯草芽孢杆菌种子液：将OD值为10-12的枯草芽孢杆菌种子液接种到步骤(2)中灭菌后的所述发酵培养基中，接种的所述枯草芽孢杆菌种子液的体积占所述发酵培养基的体积的15％，得到发酵液。
其中所述枯草芽孢杆菌种子液的方法包括以下步骤：a、选取菌种；b、斜面培养；c、一级种子培养；d、二级种子培养。
a、选取菌种：选取合格且优良的枯草芽孢杆菌，其保藏地为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.21202。
b、斜面培养：将步骤a中的所述枯草芽孢杆菌接种至斜面培养基，接着在温度为37℃培养箱内培养24h。
c、一级种子培养：从步骤b培养完成的所述斜面培养基上刮取两环菌种接种于摇瓶内的100ml的液体培养基上，摇瓶的转速200rpm，培养的温度为37℃，培养周期为24h，得到OD值为8-9的一级种子。
d、二级种子培养：将步骤c中的所述一级种子接种到置于二级种子罐中的二级种子培养基上，接种的所述一级种子的体积占所述二级种子培养基的体积的15％，所述二级种子罐中的罐压控制在0.03-0.05Mpa，通气比控制在0.6-1.0vvm，罐温控制在36℃，所述二级种子罐内的搅拌速度控制在160-200rpm，培养周期为18-20h，得到OD值为10-12的所述枯草芽孢杆菌种子液；其中所述二级种子培养基的组成为：葡萄糖15g/L、酵母粉15g/L、硫酸铵6g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、硫酸镁1.2g/L、消泡剂0.3mL/L、生物素0.2mg/L、VB1 2mg/L，其余为水。
(4)发酵培养：将步骤(3)中的所述发酵液于发酵罐中发酵，控制所述发酵罐内的罐压、通气量以及搅拌速度，使得所述发酵液中的溶氧量控制在25-35％，发酵周期为40h，既得核黄素，其中在发酵过程中通过添加pH调节剂调节所述发酵液的pH值，使得所述发酵液在0-20h的pH值为6.9，20-30h的pH值为6.7，30-40h的pH值为6.4，所述pH调节剂选用氨水。
在步骤(4)中所述发酵罐中的所述发酵液的发酵条件为：所述发酵罐内的发酵温度控制在37℃，所述发酵罐内的压力控制在0.04-0.08Mpa，所述发酵罐内的通气量控制在10-35L/min，所述发酵罐内的搅拌速度控制在200-800rpm。
重复上述发酵过程3次，发酵结束后测定发酵液中的核黄素含量，并计算转化率。
本发明的发酵方法通过在发酵过程中加入pH调节剂控制发酵液在不同发酵时间的pH值来实现有效地控制发酵液中铵离子的浓度，同时也使维生素B2的生产水平以及转化率有了大幅度的提升，且降低了发酵成本，并且本发明的发酵方法简单易行。
对比例1：采用传统的方法进行发酵生产核黄素，具体过程如下：
(1)配置发酵培养基：将各原料按照葡萄糖20g/L、酵母粉15g/L、黄豆饼粉10g/L、玉米浆20g/L、磷酸氢二钾6g/L、硫酸铵3g/L、硝酸钠1.0g/L，其余为水的配比称量好，接着将上述原料混合充分溶解，得到发酵培养基。
(2)灭菌：将步骤(1)中配置好的所述发酵培养基进行灭菌，灭菌的温度为121℃，灭菌的时间为25min。
(3)接种枯草芽孢杆菌种子液：将OD值为10-12的枯草芽孢杆菌种子液接种到步骤(2)中灭菌后的所述发酵培养基中，接种的所述枯草芽孢杆菌种子液的体积占所述发酵培养基的体积的15％，得到发酵液。
其中所述枯草芽孢杆菌种子液的方法包括以下步骤：a、选取菌种；b、斜面培养；c、一级种子培养；d、二级种子培养。
a、选取菌种：选取合格且优良的枯草芽孢杆菌，其保藏地为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.21202。
b、斜面培养：将步骤a中的所述枯草芽孢杆菌接种至斜面培养基，接着在温度为37℃培养箱内培养24h。
c、一级种子培养：从步骤b培养完成的所述斜面培养基上刮取两环菌种接种于摇瓶内的100ml的液体培养基上，摇瓶的转速200rpm，培养的温度为37℃，培养周期为24h，得到OD值为8-9的一级种子。
d、二级种子培养：将步骤c中的所述一级种子接种到置于二级种子罐中的二级种子培养基上，接种的所述一级种子的体积占所述二级种子培养基的体积的15％，所述二级种子罐中的罐压控制在0.03-0.05Mpa，通气比控制在0.6-1.0vvm，罐温控制在36℃，所述二级种子罐内的搅拌速度控制在160-200rpm，培养周期为18-20h，得到OD值为10-12的所述枯草芽孢杆菌种子液；其中所述二级种子培养基的组成为：葡萄糖15g/L、酵母粉15g/L、硫酸铵6g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、硫酸镁1.2g/L、消泡剂0.3mL/L、生物素0.2mg/L、VB12mg/L，其余为水。
(4)发酵培养：将步骤(3)中的所述发酵液于发酵罐中发酵，控制所述发酵罐内的罐压、通气量以及搅拌速度，使得所述发酵液中的溶氧量控制在25-35％，发酵周期为40h，既得核黄素，其中在发酵过程中通过添加pH调节剂调节所述发酵液的pH值，使得所述发酵液全程pH值为7.0，所述pH调节剂选用氨水。
在步骤(4)中所述发酵罐中的所述发酵液的发酵条件为：所述发酵罐内的发酵温度控制在37℃，所述发酵罐内的压力控制在0.04-0.08Mpa，所述发酵罐内的通气量控制在10-35L/min，所述发酵罐内的搅拌速度控制在200-800rpm。
重复上述发酵过程3次，发酵结束后测定发酵液中的核黄素含量，并计算转化率。
对比例2：一种生产核黄素的发酵培养基，所述发酵培养基中的组分及其用量为：葡萄糖20g/L、酵母粉15g/L、黄豆饼粉10g/L、玉米浆20g/L、柠檬酸钠3g/L、磷酸氢二钾6g/L、硫酸铵3g/L、硝酸钠1.0g/L和谷氨酰胺母液200mL，其余为水，所述谷氨酰胺母液的浓度为45g/L。
利用上述发酵培养基来生产核黄素的发酵方法，其包括以下步骤：(1)配置发酵培养基；(2)灭菌；(3)接种枯草芽孢杆菌种子液；(4)发酵培养。
(1)配置发酵培养基：将葡萄糖、酵母粉、黄豆饼粉、玉米浆、柠檬酸钠、磷酸、硫酸铵、硝酸钠、谷氨酰胺母液和水按照配比称量好，接着将上述原料混合充分溶解，得到发酵培养基。
(2)灭菌：将步骤(1)中配置好的所述发酵培养基进行灭菌，灭菌的温度为121℃，灭菌的时间为25min。
(3)接种枯草芽孢杆菌种子液：将OD值为10-12的枯草芽孢杆菌种子液接种到步骤(2)中灭菌后的所述发酵培养基中，接种的所述枯草芽孢杆菌种子液的体积占所述发酵培养基的体积的15％，得到发酵液。
其中所述枯草芽孢杆菌种子液的方法包括以下步骤：a、选取菌种；b、斜面培养；c、一级种子培养；d、二级种子培养。
a、选取菌种：选取合格且优良的枯草芽孢杆菌，其保藏地为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.21202。
b、斜面培养：将步骤a中的所述枯草芽孢杆菌接种至斜面培养基，接着在温度为37℃培养箱内培养24h。
c、一级种子培养：从步骤b培养完成的所述斜面培养基上刮取两环菌种接种于摇瓶内的100ml的液体培养基上，摇瓶的转速200rpm，培养的温度为37℃，培养周期为24h，得到OD值为8-9的一级种子。
d、二级种子培养：将步骤c中的所述一级种子接种到置于二级种子罐中的二级种子培养基上，接种的所述一级种子的体积占所述二级种子培养基的体积的15％，所述二级种子罐中的罐压控制在0.03-0.05Mpa，通气比控制在0.6-1.0vvm，罐温控制在36℃，所述二级种子罐内的搅拌速度控制在160-200rpm，培养周期为18-20h，得到OD值为10-12的所述枯草芽孢杆菌种子液；其中所述二级种子培养基的组成为：葡萄糖15g/L、酵母粉15g/L、硫酸铵6g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、硫酸镁1.2g/L、消泡剂0.3mL/L、生物素0.2mg/L、VB12mg/L，其余为水。
(4)发酵培养：将步骤(3)中的所述发酵液于发酵罐中发酵，控制所述发酵罐内的罐压、通气量以及搅拌速度，使得所述发酵液中的溶氧量控制在25-35％，发酵周期为40h，既得核黄素，其中在发酵过程中通过添加pH调节剂调节所述发酵液的pH值，使得所述发酵液全程pH值为7.0，所述pH调节剂选用氨水。
在步骤(4)中所述发酵罐中的所述发酵液的发酵条件为：所述发酵罐内的发酵温度控制在37℃，所述发酵罐内的压力控制在0.04-0.08Mpa，所述发酵罐内的通气量控制在10-35L/min，所述发酵罐内的搅拌速度控制在200-800rpm。
重复上述发酵过程3次，发酵结束后测定发酵液中的核黄素含量，并计算转化率。
本发明检测结果：
实施例1-6和对比例1-2的实验结果对比如下表所示；
表1实施例1-6与对比例1-2的核黄素的指标汇总
Figure BDA0003342724720000261
从上表可以看出，通过本发明实施例4和实施例6的方法发酵生产的核黄素含量和转化率最高，通过本发明实施例4的方法发酵生产的核黄素含量和转化率相比通过对比例2的方法发酵生产的核黄素含量和转化率明显要高，说明在发酵过程中加入pH调节剂控制发酵液在不同发酵时间的pH值发生改变相比发酵液的pH值始终为7而言更好的促使维生素B2的生产水平以及转化率大幅度提升，通过对比例2的方法发酵生产的核黄素含量和转化率相比通过对比例1的方法发酵生产的核黄素含量和转化率明显要高，说明在发酵培养基中添加柠檬酸钠和谷氨酰胺有效的提高了核黄素的含量及转化率。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种生产核黄素的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基中的组分及其用量为：葡萄糖20-30g/L、酵母粉10-20g/L、黄豆饼粉10-20g/L、玉米浆10-20g/L、柠檬酸钠2-5g/L、磷酸氢二钾3-6g/L、硫酸铵1-3g/L、硝酸钠0.5-1.5g/L和谷氨酰胺母液100-200mL，其余为水。
2.根据权利要求1所述的一种生产核黄素的发酵培养基，其特征在于，所述谷氨酰胺母液的浓度为40-50g/L。
3.一种利用权利要求1或2所述的发酵培养基生产核黄素的发酵方法，其特征在于，其包括以下步骤：(1)配置发酵培养基；(2)灭菌；(3)接种枯草芽孢杆菌种子液；(4)发酵培养；
(1)配置发酵培养基：将葡萄糖、酵母粉、黄豆饼粉、玉米浆、柠檬酸钠、磷酸、硫酸铵、硝酸钠、谷氨酰胺母液和水按照配比称量好，接着将上述原料混合充分溶解，得到发酵培养基；
(2)灭菌：将步骤(1)中配置好的所述发酵培养基进行灭菌；
(3)接种枯草芽孢杆菌种子液：将OD值为10-12的枯草芽孢杆菌种子液接种到步骤(2)中灭菌后的所述发酵培养基中，接种的所述枯草芽孢杆菌种子液的体积占所述发酵培养基的体积的10-15％，得到发酵液；
(4)发酵培养：将步骤(3)中的所述发酵液于发酵罐中发酵，控制所述发酵罐内的罐压、通气量以及搅拌速度，使得所述发酵液中的溶氧量控制在25-35％，发酵周期为40h，既得核黄素，其中在发酵过程中通过添加pH调节剂调节所述发酵液的pH值，使得所述发酵液在0-20h的pH值为6.9-7.1，20-30h的pH值为6.7-6.9，30-40h的pH值为6.4-6.6。
4.根据权利要求3所述的一种生产核黄素的发酵方法，其特征在于，步骤(2)中的所述灭菌的温度为121-125℃，灭菌的时间为20-30min。
5.根据权利要求3所述的一种生产核黄素的发酵方法，其特征在于，制备步骤(3)中所述枯草芽孢杆菌种子液的方法包括以下步骤：a、选取菌种；b、斜面培养；c、一级种子培养；d、二级种子培养；
a、选取菌种：选取合格且优良的枯草芽孢杆菌，其保藏地为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.21202；
b、斜面培养：将步骤a中的所述枯草芽孢杆菌接种至斜面培养基，接着在温度为35-37℃培养箱内培养24-30h；
c、一级种子培养：从步骤b培养完成的所述斜面培养基上刮取两环菌种接种于摇瓶内的100ml的液体培养基上，摇瓶的转速200rpm，培养的温度为36.5-38℃，培养周期为24-25h，得到OD值为8-9的一级种子；
d、二级种子培养：将步骤c中的所述一级种子接种到置于二级种子罐中的二级种子培养基上，接种的所述一级种子的体积占所述二级种子培养基的体积的12-16％，所述二级种子罐中的罐压控制在0.03-0.05Mpa，通气比控制在0.6-1.0vvm，罐温控制在36-36.5℃，所述二级种子罐内的搅拌速度控制在160-200rpm，培养周期为18-20h，得到OD值为10-12的所述枯草芽孢杆菌种子液。
6.根据权利要求5所述的一种生产核黄素的发酵方法，其特征在于，步骤d中所述二级种子培养基的组成为：葡萄糖15g/L、酵母粉15g/L、硫酸铵6g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、硫酸镁1.2g/L、消泡剂0.3mL/L、生物素0.2mg/L、VB1 2mg/L，其余为水。
7.根据权利要求3所述的一种生产核黄素的发酵方法，其特征在于，在步骤(4)中所述发酵罐中的所述发酵液的发酵条件为：所述发酵罐内的发酵温度控制在36-37℃，所述发酵罐内的压力控制在0.04-0.08Mpa，所述发酵罐内的通气量控制在10-35L/min，所述发酵罐内的搅拌速度控制在200-800rpm。
8.根据权利要求3所述的一种生产核黄素的发酵方法，其特征在于，步骤(4)中的所述pH调节剂选用氨水。
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