CN1639353A - 生产核黄素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及转录终止子，涉及含有至少一个这样的转录终止子的生物，还涉及生产核黄素的方法，其中培养能够生产核黄素并且含有至少一个所述转录终止子的生物，其中该特定转录终止子操作性连接到至少一个rib基因上。
Description
发明领域
本发明涉及转录终止子，涉及能够产生核黄素并含有至少一个此类转录终止子的生物，还涉及改进的生产核黄素的方法，其中培养能够产生核黄素并具有至少一个所述转录终止子的生物。
背景技术
所有植物和大量微生物都生产维生素B2(也叫做核黄素)。其是人和动物所必需的，因为人和动物不能合成维生素B2。核黄素在代谢中起着重要的作用。从而，例如，其参与糖类的利用。维生素B2缺乏与口腔和喉的粘膜炎症、皮肤褶的瘙痒和炎症和类似皮肤损伤、结膜炎症、视力下降和角膜混浊相关。在婴儿和儿童中，可导致生长停止和体重降低。因此，维生素B2具有巨大的经济重要性，例如作为针对维生素缺乏的维生素产品和作为动物饲料添加剂。其被加入到各种食品中。其还被用作食品着色剂，例如用在蛋黄酱、冰淇淋、牛奶冻中。
可用化学方法或微生物方法生产维生素B2(见，例如，Kurth等，1996，Riboflavin，《Ullmann’s Encyclopedia of industrial chemistry》，VCHWeinheim)。在化学生产方法中，核黄素通常作为多步方法的最终纯产物得到，这必须使用相对昂贵的起始材料如D-核糖。
化学合成核黄素的替代方法是通过微生物发酵生产维生素B2。在此情况中的起始材料为可再生的原材料，如糖或植物油。现已公知通过发酵真菌如阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyii)或棉阿舒囊霉(Ashbyagossypii)生产核黄素(The Merck Index，Windholz等，eds.Merck & Co.，1183页，1983)，但是酵母(例如假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)和酵母属(Saccharomyces))或细菌(例如芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridia)或棒状杆菌属(Corynebacteria))也已经被描述为核黄素生产菌。EP-A-0 405 370和EP-A-0 821 063描述了使用细菌的重组菌株生产核黄素，该菌株从用核黄素生物合成基因转化的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)得到。
专利WO 95/26406或WO 93/03183和DE 44 20 785描述了从真核生物棉阿舒囊霉和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)克隆核黄素生物合成的特异性基因、用这些基因转化的微生物，以及这些微生物用于合成核黄素的用途。
在两种生物中，6种酶催化从三磷酸鸟苷(GTP)和5-磷酸核酮糖开始形成核黄素。这包括GTP被GTP环式水解酶-II(rib1基因产物)转化成5-磷酸2，5-二氨基-6-(核糖基氨基)-4(3H)-嘧啶酮。后者然后被2，5-二氨基-6-(核糖基氨基)-4(3H)-嘧啶酮-5-磷酸还原酶(rib7基因产物)还原成5-磷酸2，5-二氨基-6-核醇基(ribityl)氨基-2，4(1H，3H)-嘧啶，并随后被特异性脱氨酶(rib2基因产物)脱氨基成5-磷酸5-氨基-6-ribityl氨基-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮。磷酸然后被非特异性磷酸酶清除。
在核黄素生物合成的最后酶促步骤中，除了GTP以外的第二种起始材料5-磷酸核酮糖被3，4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸合成酶(rib3基因产物)转化成4-磷酸3，4-二羟基-2-丁酮(DBP)。
DBP和5-氨基-6-ribityl氨基-2，4-(1H，3H)-嘧啶二酮都是酶促合成6，7-二甲基-8-ribity-二氧四氢蝶啶的前体。该反应被rib4基因产物(DMRL合酶)催化。DMRL随后被核黄素合酶(rib5基因产物)转化成核黄素(Bacher等(1993)，Bioorg.Chem.Front.Vol.3，Springer Verlag)。
尽管在核黄素的生产中取得了这些进步，但是仍然需要提高和增加维生素B2的生产力以满足不断增加的需求和使核黄素的生产更有效率。
发明内容
本发明的一个目的是进一步提高维生素B2的生产力。
我们已经发现通过一种核黄素生产方法达到了该目的，其中培养能够产生核黄素并且具有至少一个如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ IDNo.3所示的转录终止子的生物，其中此特定的转录终止子操作性连接到至少一个rib基因(核黄素生物合成基因)上，并且从培养基中回收以增加的程度形成的核黄素。
在此核黄素生产方法中，根据本发明有利的是与至少一个选自rib1、rib2、rib3、rib4、rib5和rib7的基因操作性连接。选自由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示序列组成的组的本发明转录终止子与至少一个核黄素生物合成基因(rib基因)的操作性连接当存在于细菌、真菌、酵母和植物中时，可增加这些生物中相应的一个或多个基因的表达和/或对所形成的转录物产生稳定作用，从而增加这些生物中核黄素的产量(与阿舒囊霉(Ashbya)ATCC10895野生型相比)。在这方面，可以使来自所述组的本发明终止子操作性连接一个或多个rib基因，其中每个基因各自与该终止子操作性连接，或者一组基因(例如基因簇或操纵子)与该终止子操作性地连接。本申请还包括在适合生产核黄素的生物中存在所提到的这些终止子中的不同终止子。在这种情况下，这些不同的终止子各操作性地单独连接到rib基因上，或者这些不同的终止子操作性的连接到成组排列的rib基因上。从而，就可能为了本发明的目的，在适于生产核黄素的生物中，每个所述的转录终止子单独地，或其两个或全部三个以每种想得到的组合操作性地连接到rib基因上。本发明的转录终止子操作性地连接到参与核黄素生产的一个或多个其他基因上也是可能的。
操作性连接是指具有调节和编码功能的核苷酸序列(例如启动子、编码序列、终止子和适宜时的其他调节元件)以某种顺序排列，使得每个调节元件都能够在编码序列的表达中执行其正确功能。这些调节性核苷酸序列可以是天然来源的或者通过化学合成得到。用于核苷酸序列的操作性连接的基因工程方法已经成为常规实验室操作的一部分，并可以参考例如D.M.Glover等，DNA Cloning Vol.1，(1995)，IRL Press(ISBN019-963476-9)中的方法。在这里也可以参考本领域技术人员公知的合成核苷酸序列的方法和在核苷酸序列中交换碱基的方法。
至少一个rib基因操作性连接如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQID No.3中所示的一个本发明转录终止子将有利地导致转录终止增加。这反过来间接影响终止子上游基因的转录速率，因为转录设备，即RNA聚合酶和辅助转录因子，在阅读本发明的终止子后可以更有效地释放，从而可更快地用于新一轮的转录(Alberts等，第三版，Molekularbiologie derZelle，VCH Verlag)。因此，可以以这种方式增加相应基因的转录速率。这意味着基因表达的增加以及相应编码的基因产物活性的增加，这最终导致核黄素生产力的明显增加。此外，本发明的每种转录终止子都可以对所形成的转录物发挥稳定作用。在这种情况下，例如，从转录物3’端的降解(例如通过外切核酸酶)可以被减慢或者实质上被阻止。其结果是转录物因为被较慢地降解，所以能够更大程度地被翻译，转而导致相应编码的酶的活性增加。
在根据本发明的有利的方法中，使用如SEQ ID No.1所示转录终止子，该序列与野生型ATCC 10895的rib2基因的转录终止子的序列相比在位置13处通过将鸟嘌呤置换为腺嘌呤而被修饰。在同样有利的方法中，使用如SEQ ID No.2所示的转录终止子，该序列与野生型ATCC 10895的rib2基因的转录终止子的序列相比在位置25处通过将鸟嘌呤置换为腺嘌呤而被修饰。在同样有利的方法中，使用如SEQ ID No.3所示的转录终止子，该序列与野生型ATCC 10895的rib2基因的转录终止子的序列相比在位置13和25处通过将鸟嘌呤置换为腺嘌呤而被修饰。优选使用如SEQ ID No.3所示的转录终止子的方法。
适宜时，本发明的每种转录终止子可以以一个或者多个拷贝存在于生产核黄素所用的生物的基因组中。这取决于终止子是否操作性连接到一个还是多个基因上。从而，可以想到，例如，如SEQ ID No.1中所示的终止子操作性连接仅一个rib基因或多个(优选分开组织的)rib基因(或参与核黄素合成的其他基因)。这同样适用于如SEQ ID No.2中所示终止子或如SEQ ID No.3中所示终止子。
因此，本发明包括在适于生产核黄素的生物的基因组中单独使用本发明的每种转录终止子或使用所有三种转录终止子的组合，尤其是以单拷贝或多拷贝使用。
增加核黄素生产的方法有利地使用能够产生核黄素的生物进行。本发明的方法中适宜的生物或宿主生物原则上为能够合成核黄素的所有生物。优选天然能够合成核黄素的生物。然而，由于导入全部维生素B2合成基因而能够合成核黄素的生物也适于本发明的方法。
生物如细菌、酵母、真菌或植物均适用于本发明的方法。
可提及的实例为真核生物如在Indian Chem Engr.Section B，Vol 37，No.1，2(1995)15页，表6中描述的真菌，如阿舒囊霉属(Ashbya)或假囊酵母属(Eremothecium)，酵母，如假丝酵母属、酵母属或毕赤酵母属(Pichia)，或植物，如拟南芥(arabidopsis)、番茄、马铃薯、玉米、大豆、油籽油菜、大麦、小麦、黑麦、稻、粟、棉花、豆类、甜菜、向日葵、亚麻、大麻、canola、燕麦、烟草、紫花苜蓿、莴苣或各种树、坚果和葡萄树种，或原核生物，如革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌，如棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、蓝细菌(Cyanobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)或克雷伯氏菌属(Klebsiella)。
优选的生物选自下面的属：棒状杆菌属、短杆菌属、芽孢杆菌属，埃希氏菌属、阿舒囊霉属、假囊酵母属、假丝酵母属(Candida)或酵母属(Saccharomyces)，或植物如玉米、大豆、油籽油菜、大麦、小麦、马铃薯或番茄。
尤其优选的生物选自下面的属和种：棉阿舒囊霉、阿舒假囊酵母、酿酒酵母、Candida flaveri、无名假丝酵母(Candida famata)、产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)或枯草芽孢杆菌。尤其优选的植物为玉米、大豆、油籽油菜、大麦、小麦、马铃薯和番茄。尤其优选棉阿舒囊霉或阿舒假囊酵母。
本发明还包括核黄素生产菌株。例如，可以通过经典的(化学的或物理的)或基因工程的方法从适于生产核黄素的野生型菌株开始产生这些核黄素生产菌株，并且适宜时这些菌株可以在rib基因框之外还具有与野生型菌株不同的其它基因修饰。
本发明上述rib基因包括那些来自能够产生核黄素的生物的基因。优选来自如枯草芽孢杆菌、酿酒酵母或棉阿舒囊霉等生物的基因。尤其优选棉阿舒囊霉rib基因。此处还包括这些基因的功能类似物、功能等价物或衍生物。
功能类似物指例如rib基因或它们的酶促活性的功能同系物，即催化和rib基因酶相同反应的酶。
功能等价物指例如，在衍生的氨基酸水平上具有至少35％同源性、优选至少40％同源性、尤其优选至少45％同源性、特别尤其优选50％同源性的等位基因变体。等位基因变体尤其包括可通过核苷酸的缺失、插入或置换得到的功能变体，其中该衍生合成的蛋白保留酶促活性。
这种类型的DNA序列可以从已知rib基因的DNA序列或这些序列的部分出发，例如使用常规杂交方法或PCR技术，从上述棉阿舒囊霉以外的其他真核生物或原核生物分离。这些DNA序列在标准条件下与所述序列杂交。有利的是将保守区的短寡核苷酸用于杂交，保守区可通过与来自大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的相应基因以技术人员公知的方式进行对比来鉴定。
标准条件指，例如，在浓度0.1到5×SSC(1×SSC＝0.15M NaCl，15mM柠檬酸钠，pH7.2)的水性缓冲液中或还存在50％甲酰胺时温度42到58℃，例如，在5×SSC中和存在50％甲酰胺时42℃。DNA杂交的实验条件记载在遗传学相关教科书中，例如，Sambrook等，“Molecular Cloning”，Cold Spring Harbor Laboratory，1989。同系物还指截短的序列或单链DNA。
衍生物指起始密码子前的核苷酸序列被改变从而基因表达和/或蛋白质表达被改变(优选增加)的变体。
为了在生物中最优表达异源基因，有利地是改变核酸序列以符合在该生物中使用的特定密码子选择。通过计算机分析相关生物中的其他已知基因可容易地建立密码子选择。
对于增加维生素B2生产力，还有利的是将下述两方面组合起来，即一方面增加所述rib基因编码的天然酶促活性且另一方面通过额外将至少一种上述基因或者这些基因中的多个的组合导入到能够生产核黄素的生物中来增强基因的表达。
增加细胞中rib基因产物的酶活性有许多可能方案。一种可能方案是将基因操作性连接到选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3的本发明终止子之一上，导致特定基因或多个所述基因的转录速率增加和/或所形成的转录物被稳定化。另一个可能方案是修饰内源rib基因，使得它们编码与未修饰(最初的或野生型)的酶相比具有增加的rib活性的酶。酶活性的增加可通过例如修饰催化中心以导致增加的底物转化或者通过废除酶抑制剂的影响来实现。这意味着酶具有增加的比活或它们的活性不被抑制。
在另一有利的实施方案中还可以通过增加细胞中酶的合成(例如通过消除抑制酶合成的因子或者通过增加促进合成增强的因子或调节元件的活性)来增加酶活性。导入其他基因拷贝也可导致增加特定的酶活性。这些措施将增加细胞中基因产物的总活性而不改变比活。还可以组合使用这些方法，即增加比活和增加总活性。原则上可以通过技术人员已知的所有方法将这些修饰导入这些基因、其调节元件、终止子或启动子的核酸序列中。
为该目的可以对序列进行例如诱变，如定点诱变，参见D.M.Glover等，DNA Cloning Vol.1，(1995)，IRL Press(ISBN 019-963476-9)，第6章，193页及以下页中的描述。Spee等(Nucleic Acids Research，Vol.21，No.3，1993：777-778)描述了使用dITP进行诱变的PCR方法。使用体外重组技术进行分子进化由Stemmer(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.91，1994：10747-10751)描述。Moore等(Nature Biotechnology Vol.14，1996：458-467)描述了PCR方法和重组方法的组合。然后将修饰的核酸序列通过载体返回到生物体中。
为增加酶活性，还可以将改变的启动子区置于天然基因的前面，从而增加基因的表达，并最终提高活性。
有利的启动子序列存在于例如，cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6或γ-PR或在γ-PL启动子中，它们可以有利地在革兰氏阴性细菌中使用。其他有利的调节序列存在于例如，革兰氏阳性启动子amy和SPO2，酵母或真菌启动子ADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH或植物启动子CaMV/35S [Franck等，Cell 21(1980)285-294]、PRP1[Ward等，Plant.Mol.Biol.22(1993)]、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、LEB4、nos或泛素或菜豆蛋白启动子中。在此方面，有利的还有来自例如汉逊酵母属(Hansenula)的丙酮酸脱羧酶和甲醇氧化酶的启动子。其他有利的植物启动子为，例如，苯磺酰胺诱导型(EP 388186)、四环素诱导型(Gatz等，(1992)Plant J.2,397-404)、脱落酸诱导型(EP335528)或乙醇或环己酮诱导型(WO9321334)启动子。尤其有利的植物启动子为那些保证在发生嘌呤或其前体的生物合成的植物的组织或部分中表达的那些启动子。尤其值得一提的是确保叶特异表达的启动子。应该提及来自马铃薯的胞质FBPase的启动子或来自马铃薯的ST-LSI启动子(Stockhaus等，EMBO J.8(1989)2445-245)。还可以并且有利的是使用来自大豆(Glycine max)的磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶的启动子(也见Genebank记录号U87999)或如EP 249676中的另一种节-特异性启动子。
原则上可以在本发明的方法中使用具有类似于上面提到的调节序列的所有天然启动子。也可以有利地使用合成的启动子。
除了根据本发明的更有效的转录终止，还可以在3’末端通过插入至少一个如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的转录终止子以例如增加mRNA的稳定性从而使翻译增加成为可能。这同样导致相应表达的基因的更高的酶活性。通过3’端额外导入的序列可以进一步增强转录物的稳定性。
还有利的是在能够产生核黄素的生物中导入与至少一个本发明的转录终止子操作性连接的至少一个上述的rib基因或几个基因的组合以通过增加基因拷贝数增加基因表达。这些基因拷贝可受到天然调节或修饰的调节所谓修饰的调节-即此时天然调节区已经被修饰以致它们可以导致基因表达增加，或者可以使用外来基因或甚至异源基因的调节序列。上述方法的组合尤其有利。
本发明还涉及含有至少一个如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQID No.3所示的转录终止子和至少一个与这些终止子之一操作性地相连的rib基因的基因构建体。本发明的基因构建体优选含有rib1、rib2、rib3、rib4、rib5和rib7中的至少一个基因。
本发明的一个有利的变体包括含有至少一个如SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2或SEQ ID No.3所示的转录终止子或上述类型的基因构建体，和用于选择和用于在宿主细胞中复制或整合到宿主细胞基因组中的额外的核酸序列的载体。
本发明的基因构建体还可以含有待被导入生物的其他基因。这些基因可以处于分开的调节区下或者与rib基因处于相同的调节区下。这些基因为，例如，可使合成增加成为可能的其他生物合成基因。
为了表达，将基因构建体插入到上述宿主生物中，有利地插入到可以使基因在宿主中获得最佳表达的载体，例如，质粒、噬菌体或其他DNA中。合适的质粒的实例在大肠杆菌中为pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11或pBdCI，在链霉菌中为pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361，在芽孢杆菌中为pUB110、pC194或pBD214，在棒状杆菌属中为pSA77或pAJ667，在真菌中为pALS1、pIL2或pBB116，在酵母中为2μm、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23或在植物中为pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004或pDH51或上述质粒的衍生物。所述质粒代表可用的质粒的一小部分。其他质粒是技术人员熟知的并且可例如在书籍Cloning Vectors(编辑Pouwels P.H.等，Elsevier，Amsterdam-NewYork OXfoxd，1985，ISBN 0 444 904018)中发现。适宜的植物载体在“Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology”(CRCPress)，6/7章，71-119页中描述。
为了表达存在的其他基因，基因构建体优选还含有3’和/或5’末端调节序列以增加表达，为最佳表达，这些调节序列的选择依赖于所选的宿主生物和基因。
这些调节序列旨在使得这些基因的特异表达和蛋白表达成为可能。这可能意味着，例如，根据宿主生物，只有在诱导后基因才表达和/或过表达，或者其立即表达和/或过表达。
为此目的，调节序列或因子可优选对导入的基因的表达具有有益效果，从而增加表达。因此，可以通过使用强转录信号如启动子和/或增强子，有利地在转录水平上实现调节元件的增强作用。然而，还可以通过例如提高mRNA的稳定性来增强翻译。
在载体的另一个实施方案中，本发明的基因构建体还可以有利地以线性DNA的形式导入到微生物中，并通过异源或同源重组整合到宿主生物的基因组中。该线性DNA可由作为载体的线性化质粒或仅仅该核酸片段组成。
还可以使用在细胞中能自主复制的任何适宜质粒(但是特别是具有来自酿酒酵母的2μm质粒的复制起点的质粒)以及如上述的整合到宿主基因组的线性DNA片段作为载体。该整合可通过异源或同源重组发生。但是优选地，如所提到的，通过同源重组发生(Steiner等，Genetics，Vol.140，1995：973-987)。而且这些rib基因可以单个地存在于基因组的不同位置或不同载体上，或者一起存在于基因组中或一个载体上。
本发明的转录终止子、上述基因构建体或载体(根据本发明优选含有至少一个rib基因和适宜地与其操作性连接的调节序列，例如至少一个本发明的转录终止子)原则上可以通过技术人员公知的所有方法导入所用的生物中。
它们有利地通过转化、转染、电穿孔，使用所谓的基因枪或通过显微注射导入到生物或其细胞中。适用于微生物的方法可由技术人员在教科书Sambrook，J.等(1989)Moleular cloning：A Laboratory Monual，coldSpring Harbor Laboratory Press，F.M.Ausubel等(1994)Currentprotocols in molecular biology，John Wiley and Sons，D.M.Glover等，DNA Cloning Vol.1，(1995)，IRL Press(ISBN 019-963476-9)，Kaiser等(1994)Methods in yeast Genetics，cold Spring Harbor Laboratory Press或Guthrie等，Guide to yeast Genetics and Molecular Biology，Methods inEnzymology，1994，Academic Press中找到。
可提及的有利方法的实例为通过同源或异源重组，例如在ura-3基因，特别是如在德国申请DE 19801120.2中描述的阿舒囊霉属ura-3基因的帮助下导入DNA，和/或者通过下述REMI方法(＝限制酶介导的整合)导入DNA。
REMI技术是基于将已经在两端被相同限制性内切酶切割的线性DNA构建体与用于该DNA构建体的此限制性切割的限制性内切酶共转化到生物中。然后，此限制性内切酶切割此限制酶和DNA构建体共同所导入的生物的基因组DNA。这导致细胞自身修复机制的活化。这些修复机制修复基因组DNA中内切酶导致的链断裂，这也伴随着共转化的DNA构建体以一定频率掺入到基因组中。通常在DNA的两端会保留限制性切割位点。
该技术由Blker等(Mol Gen Genet，248，1995：547-552)描述，用于真菌的插入诱变。Schiestl和Petes(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，1991：7585-7589)使用该方法研究在酵母中是否发生异源重组。该方法被Brown等(Mol.Gen.Genet.251，1996：75-80)描述用于诱导型报道基因的稳定转化和受调节的表达。该系统到现在为止还没有被用作优化代谢途径或商业性过表达蛋白的基因工程工具。
已经通过核黄素合成的实例表明可以通过REMI方法将生物合成基因整合到上述生物的基因组中，从而可能优化生产初级或次级代谢(特别是生物合成途径)的代谢产物的生产方法，所述代谢产物为例如氨基酸如赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸或色氨酸，维生素如维生素A、B2、B6、B12、C、D、E或F、S-腺苷甲硫氨酸、生物素、泛酸或叶酸，类胡萝卜素如β-胡萝卜素、番茄红素、角黄素、虾青素或玉米黄质，或蛋白质如水解酶如脂肪酶、酯酶、酰胺酶、腈水解酶、蛋白酶，调节剂如细胞因子，例如淋巴因子，如MIF、MAF、TNF，白介素如白介素1，干扰素如γ-干扰素、tPA，激素如蛋白激素、糖激素、寡肽激素或多肽激素如血管加压素、内啡肽、内抑素(endostatin)、制管张素(angiostatin)、生长因子、红细胞生成素、转录因子，整合蛋白如GPIIb/IIIa或αvβIII，受体如各种谷氨酸受体，血管生成因子如血管紧张素。
REMI方法也可以用于使本发明的转录终止子、含有操作性连接至少一个rib基因的至少一个本发明转录终止子的上述基因构建体或上述载体定位到基因组中转录活性位点处。
转录终止子和/或所述基因构建体有利地与至少一个报道基因一起克隆到另一个DNA构建体中，该DNA构建体被导入基因组中。该报道基因应该可以容易通过生长、荧光、化学或生物发光分析或通过光度测量来检测。可提及的报道基因的实例为抗生素抗性基因、水解酶基因、荧光蛋白基因、生物发光基因、葡萄糖苷酶基因、过氧化物酶基因或生物合成基因如核黄素基因、萤光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因、gfp基因、脂肪酶基因、酯酶基因、过氧化物酶基因、β-内酰胺酶基因、乙酰-、磷酸-或腺苷转移酶基因。这些基因使得可以容易地测量和定量转录活性及由此基因的表达。对于生物合成基因自身使得检测容易的情形，可以省去额外的报道基因，例如，对于核黄素的情况。
如果要将多个基因导入生物中，可在单个载体中将它们与一个报道基因一起导入生物中，或者每个基因各与一个报道基因在一个载体中导入生物，可以同时或相继导入不同载体。也可以在REMI技术中使用编码特定活性的基因片段。
原则上，所有已知的限制酶都适用于将调节序列或基因构建体整合入生物基因组的此方法。但较小优选仅仅识别4个碱基对作为限制性切割位点的限制酶，因为它们在基因组或将要整合的载体中切割太频繁；优选识别6、7、8个或更多碱基对作为切割位点的酶，如BamHI、EcoRI、BglII、SphI、SpeI、XbaI、XhoI、NcoI、SalI、CIaI、KpnI、HindIII、SacI、PstI、Bpn1、NotI、SrfI或SfiI，这里仅提及少部分可能的酶。有利的是所使用的酶在将要导入的DNA中没有其他切割位点，这将增加整合效率。通常，在REMI混合物中使用5到500U，优选10到250，尤其优选10到100U酶。酶有利地在水性溶液中使用，该水性溶液含有用于稳定渗透压的物质，如糖如蔗糖、海藻糖或葡萄糖，多元醇如甘油或聚乙二醇，有利地在pH5到9、优选6到8、尤其优选7到8的范围内缓冲的缓冲液，如Tris、MOPS、HEPES、MES或PIPES和/或用于稳定核酸的物质，如Mg、Cu、Co、Fe、Mn或Mo的无机或有机盐。适宜时还可以存在其他物质，如EDTA、EDDA、DTT、β-巯基乙醇或核酸酶抑制剂。然而，也可以无这些加入而实施REMI技术。该方法在5到80℃、优选10到60℃、尤其优选20到40℃温度范围内实施。所有公知的使细胞膜去稳定的方法都适于该方法，例如，电穿孔、与载物小泡(loaded vesicle)融合或使用各种碱金属或碱土金属盐如锂、铷或钙盐，优选锂盐去稳定的方法。
将外来基因转入植物的基因组中称为转化。在此情况下，可以使用记载的用于植物转化和从植物组织或植物细胞再生植物的方法来实现瞬时或稳定转化。适宜的方法为通过聚乙二醇诱导的DNA摄入的原生质体转化、使用基因枪、电穿孔、在含有DNA的溶液中孵育干胚胎、显微注射和农杆菌介导的基因转移。所述方法在例如B.Jenes等，基因转移技术，《Transgenic Plants》，Vol.1，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu编辑，Academic Press(1993)128-143和Potrykus Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)中描述。
所要表达的构建体优选被克隆到适于转化根癌农杆菌的载体例如pBin19中(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。用根癌农杆菌对植物进行的转化描述在例如Hfgen和Willmitzer的Nucl.Acid Res.(1988)16，9877中。
用根据本发明的表达载体转化的农杆菌同样也可以用于以公知的方式(例如通过在农杆菌溶液中浸泡受伤的叶子或叶片然后在适宜的培养基中培养)转化植物，尤其是农作物，如谷物、玉米、大豆、稻、棉花、甜菜、canola、向日葵、亚麻、大麻、马铃薯、烟草、番茄、油籽油菜、紫花苜蓿、莴苣和各种树、坚果和葡萄树种，和豆类。
遗传修饰的植物细胞可以通过技术人员公知的所有方法再生。合适的方法可在S.D.Kung和R.Wu，Potrykus或Hfgen和Willmitzer的上述出版物中找到。
本发明还包括能够产生核黄素和含有至少一个如SEQ ID No.1、SEQID No.2或SEQ ID No.3中所示的转录终止子或根据本发明的基因构建体或载体类型的生物。该生物有利的选自：棒状杆菌属、短杆菌属、芽孢杆菌属、梭菌属、埃希氏菌属、蓝细菌、阿舒囊霉属、假囊酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属或酵母菌属，或植物如拟南芥、玉米、大豆、油籽油菜、大麦、小麦、黑麦、粟、燕麦、甜菜、马铃薯、向日葵、豆类或番茄。优选的生物选自芽孢杆菌属、棒状杆菌属、短杆菌属、埃希氏菌属、假丝酵母属、假囊酵母属或阿舒囊霉属或玉米、大豆、油籽油菜、大麦、小麦、马铃薯或番茄。尤其优选棉阿舒囊霉、阿舒假囊酵母、酿酒酵母、Candidaflaveri、无名假丝酵母、产氨棒状杆菌或枯草芽孢杆菌。尤其优选棉阿舒囊霉或阿舒假囊酵母。
本发明还包括特征在于是核黄素生产突变株或生产菌株的生物。这些菌株可例如通过经典的(化学或物理的)或基因工程的方法从野生型菌株开始制备，并且适宜时这些菌株除rib基因框中的遗传修饰外还具有其它的遗传修饰。
本发明的生物与阿舒囊霉ATCC 10895野生型相比的区别还在于表现出至少一个与如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3中所示转录终止子之一操作性相连的rib基因的转录速率增加。本发明的生物与阿舒囊霉ATCC 10895野生型相比还能够提高核黄素的生产。
用于生产核黄素的生物在本发明的方法中培养于允许这些生物生长的培养基中。该培养基可是合成或天然的培养基。针对生物所用的培养基是技术人员公知的。为了微生物的生长，所用的培养基含有碳源、氮源、无机盐和适宜时，少量维生素和微量元素。
有利的碳源为，例如，糖，如单糖、二糖或多糖，如葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纤维素，复合糖来源如糖蜜，磷酸糖如1，6-二磷酸果糖，糖醇如甘露糖醇，多元醇如甘油，醇如甲醇或乙醇，羧酸如柠檬酸、乳酸或乙酸，脂肪如大豆油或菜籽油，氨基酸如氨基酸混合物，例如所谓的水解酪蛋白氨基酸(Difco)或单独的氨基酸如甘氨酸或天冬氨酸，或氨基糖，后者也可用作氮源。
有利的氮源为有机或无机氮化合物或含有这些化合物的物质。实例为铵盐，如NH4Cl或(NH4)2SO4、硝酸盐、尿素，或复杂氮源，如玉米浆、酿酒酵母自溶物、大豆粉、小麦麸、酵母提取物、肉膏、酪蛋白水解物、酵母或马铃薯蛋白，这些复杂氮源常常也可用作碳源。
无机盐的实例为钙、镁、钠、钴、钼、锰、钾、锌、铜和铁的盐。特别可以提及的这些盐中的阴离子为氯离子、硫酸根离子或磷酸根离子。增加本发明的方法的生产力的一个重要因素是控制生产培养基中Fe2+或Fe3+离子的浓度。
适宜时向营养培养基加入其他生长因子例如维生素或生长促进物质如生物素、核黄素、硫胺素、叶酸、烟酸、泛酸或吡哆醇，氨基酸如丙氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸或缬氨酸，羧酸如柠檬酸、甲酸、庚二酸或乳酸，或如二硫苏糖醇等物质。
所述营养物的混合比例取决于发酵的类型并且将根据各具体情况分别建立。培养基组分可以在它们被分开灭菌(如果必须)或一起灭菌后在发酵开始时就存在，或者按需要在发酵过程中随后连续加入或间断加入。
建立培养条件使生物最优化生长并且得到最佳可能的产率。优选的培养温度为15℃到40℃。25℃到37℃的温度尤其有利。pH优选保持在3到9的范围内。5到8的pH值尤其有利。几小时到几天、优选8小时到21天、尤其优选4小时到14天的培养时间通常足够了。在这期间，在培养基中积累最大量的产物。
用于培养基的有利优化的可能方案可由技术人员在例如教科书Applied Microbiol Physiology，“实践方法”(Eds.P.M.Rhodes，P.F.Stanbury，IRL-Press，1997，53-73页，ISBN 0 19 963577 3)中找到。对芽孢杆菌和其他生物，有利的培养基和培养条件描述在例如出版物EP-A-0 405370，特别是实施例9中，对于假丝酵母属描述在出版物WO 88/09822，特别是表3中，对于阿舒囊霉描述在Schmidt等的文章(Microbiology，142，1996：419-426)中。
本发明的方法可以连续地或在分批或补料分批过程中批式进行。
根据所用的生物的最初生产力水平，可通过本发明的方法不同程度地增加核黄素的生产力。生产力通常有利地增加至少5％，优选至少10％，尤其优选20％，非常尤其优选至少100％，在每种情况下都是与最初生物相比而言的。
本发明还包括根据本发明的含有至少一个如SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2或SEQ ID No.3所示的转录终止子或根据本发明的基因构建体或载体的生物用于提高核黄素的生产的用途。生物优选棉阿舒囊霉。
本发明同样涉及至少一个如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ IDNo.3所示的转录终止子在制备用于提高核黄素生产力的生产生物中的用途。本发明也包括至少一个如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的转录终止子在增加参与生产核黄素的基因的转录速率中的用途。因此，本发明还涉及至少一个如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的转录终止子用于提高核黄素的生产的用途。
通过下面的实施例更详细地但是非限制性地解释本发明。
一般方法
除非特别说明，按照Sambrook等(1989)(Cold Spring Harbor Lab.Press：ISBN 0-87969-309-6)的描述实施一般的核酸方法，例如，克隆、限制性切割、琼脂糖凝胶电泳、DNA片段的连接、微生物的转化、细菌的培养和重组DNA的序列分析。
使用ABI的激光荧光DNA测序仪通过Sanger的方法(Sanger等(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA74，5463-5467)测序重组DNA分子。对聚合酶链式反应得到的片段测序并检查以避免将要表达的构建体中的聚合酶错误。
rib基因的分离
来自棉阿舒囊霉和酿酒酵母的rib基因1、2、3、4、5和7的分离在专利WO 95/26406和WO 93/03183中，特别是实施例中描述，并且相应地实施。此处直接参考这些出版物。
终止子区域的序列比较
从分离的rib基因开始，还鉴定并分析了rib2基因的终止子区。这揭示了下面的序列：
阿舒囊霉ATCC 10895的rib2基因的终止子(SEQ ID No.4)：
终止-TGATTTTGCTGCGAATTGTAGATGG
本发明的终止子具有下面的序列：
如(SEQ ID No.1)中所示本发明的终止子：
终止-TGATTTTGCTGC
AAATTGTAGATGG
如(SEQ ID No.2)中所示本发明的终止子：
终止-TGATTTTGCTGCGAATTGTAGATG
A
如(SEQ ID No.3)中所示本发明的终止子：
终止-TGATTTTGCTGC
AAATTGTAGATG
A
通过加下划线表示不同核苷酸。合成核苷酸序列或置换或诱变单个核苷酸的方法根据常规实验室操作实施并且这些方法在例如D.M.Glover等，DNA Cloning Vol.1，(1995)，IRL Press(ISBN 019-963476-9)中描述。
本发明的终止子和来自阿舒囊霉ATCC 10895的rib2基因的终止子的序列如序列表中SEQ ID No.1到SEQ ID No.4所示。
序列表
<110>巴斯福股份公司(BASF Aktiengesellschaft)
<120>生产核黄素的方法
<130>1
<160>4
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>终止子1
<220>
<221>终止子
<222>(1)..(25)
<223>终止子1
<400>1
tgattttgct gcaaattgta gatgg 25
<210>2
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>终止子2
<220>
<221>终止子
<222>(1)..(25)
<223>终止子2
<400>2
tgattttgct gcgaattgta gatga 25
<210>3
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>终止子3
<220>
<221>终止子
<222>(1)..(25)
<223>终止子3
<400>3
tgattttgct gcaaattgta gatga 25
<210>4
<211>25
<212>DNA
<213>棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)
<220>
<221>终止子
<222>(1)..(25)
<223>rib2-基因终止子
<400>4
tgattttgct gcgaattgta gatgg 25
Claims (27)
1.一种生产核黄素的方法，其中
a)培养能够生产核黄素并且具有至少一个如SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2或SEQ ID No.3所示的转录终止子的生物，其中该特定转录终止子操作性连接至少一个rib基因，和
b)从培养基中回收所形成的核黄素。
2.根据权利要求1的方法，其中操作性连接是连接到rib1、rib2、rib3、rib4、rib5和rib7中的至少一个基因上。
3.根据权利要求1或2的方法，其中使用如SEQ ID No.1所示转录终止子，其序列与野生型ATCC 10895的rib2基因的转录终止子序列相比在13位通过由腺嘌呤代替鸟嘌呤而被修饰。
4.根据权利要求1或2的方法，其中使用如SEQ ID No.2所示转录终止子，其序列与野生型ATCC 10895的rib2基因的转录终止子序列相比在25位通过由腺嘌呤代替鸟嘌呤而被修饰。
5.根据权利要求1或2的方法，其中使用如SEQ ID No.3所示转录终止子，其序列与野生型ATCC 10895的rib2基因的转录终止子序列相比在13位和25位通过由腺嘌呤代替鸟嘌呤而被修饰。
6.根据权利要求1到5任一项的方法，其中使用细菌、酵母、真菌或植物作为能够生产核黄素的生物。
7.根据权利要求1到6任一项的方法，其中使用选自：棒状杆菌属、短杆菌属、芽孢杆菌属、梭菌属、埃希氏菌属、蓝细菌、阿舒囊霉属、假囊酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属和酵母属，及植物如拟南芥、玉米、大豆、油籽油菜、大麦、小麦、黑麦、粟、燕麦、甜菜、马铃薯、向日葵、豆类和番茄的生物。
8.根据权利要求1到7任一项的方法，其中棉阿舒囊霉、 阿舒假囊酵母、酿酒酵母、Candida flaveri、无名假丝酵母、产氨棒状杆菌或枯草芽孢杆菌用作所述生物。
9.根据权利要求1到8任一项的方法，其中使用棉阿舒囊霉或阿舒假囊酵母。
10.具有如SEQ ID No.1所示序列的转录终止子。
11.具有如SEQ ID No.2所示序列的转录终止子。
12.具有如SEQ ID No.3所示序列的转录终止子。
13.根据权利要求10的转录终止子，其与阿舒囊霉ATCC 10895的rib2基因的转录终止子相比在13位通过由腺嘌呤代替鸟嘌呤而被修饰。
14.根据权利要求11的转录终止子，其与阿舒囊霉ATCC 10895的rib2基因的转录终止子相比在25位通过由腺嘌呤代替鸟嘌呤而被修饰。
15.根据权利要求12的转录终止子，其与阿舒囊霉ATCC 10895的rib2基因的转录终止子相比在13位和25位通过由腺嘌呤代替鸟嘌呤而被修饰。
16.含有至少一个权利要求10到15任一项的转录终止子和至少一个操作性连接到此特定终止子上的rib基因的基因构建体。
17.根据权利要求16的基因构建体，其含有至少一个选自rib1、rib2、rib3、rib4、rib5和rib7的基因。
18.载体，其含有至少一个权利要求10到15任一项的转录终止子或权利要求16或17的基因构建体，以及用于选择和在宿主细胞中复制或者整合到宿主细胞基因组中的额外核苷酸序列。
19.一种能够生产核黄素的生物，其含有至少一个权利要求10到15任一项的转录终止子或权利要求16或17的基因构建体或权利要求18的载体。
20.根据权利要求19的生物，其选自：棒状杆菌属、短杆菌属、芽孢杆菌属、梭菌属、埃希氏菌属、蓝细菌、阿舒囊霉属、假囊酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属和酵母属，及植物如拟南芥、玉米、大豆、油籽油菜、大麦、小麦、黑麦、粟、燕麦、甜菜、马铃薯、向日葵、豆类和番茄。
21.根据权利要求19或20的生物，其是棉阿舒囊霉、阿舒假囊酵母、酿酒酵母、Candida flaveri、无名假丝酵母、产氨棒状杆菌或枯草芽孢杆菌。
22.根据权利要求19到21任一项的生物，其是棉阿舒囊霉或阿舒假囊酵母。
23.根据权利要求19到22任一项的生物，其与野生型阿舒囊霉ATCC10895相比，显示出与选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3的转录终止子操作性连结的rib基因的转录速率增加。
24.根据权利要求19到23任一项的生物，其与野生型阿舒囊霉ATCC10895相比能够提高核黄素生产。
25.根据权利要求19到24任一项的生物在提高核黄素生产中的用途。
26.至少一个权利要求10到15任一项的转录终止子在制备用于提高核黄素生产的生产生物中的用途。
27.至少一个权利要求10到15任一项的转录终止子在增加参与核黄素生产的基因的转录速率中的用途。
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