CN1161471C

CN1161471C - 乳清苷-5′-磷酸脱羧酶基因、含该基因的构建体及用途

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Publication number: CN1161471C
Application number: CNB988131110A
Authority: CN
Inventors: M; M·蓬佩朱斯; J·L·雷沃伊尔塔多瓦尔; ��ɣ��˹��; M·A·桑托斯加西尔
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1998-01-15
Filing date: 1998-12-18
Publication date: 2004-08-11
Anticipated expiration: 2018-12-18
Also published as: DE19801120A1; JP2002508950A; IL137006A0; ATE296835T1; EP1047710B1; CN1285873A; WO1999036432A3; ZA99236B; US6927026B1; WO1999036432A2; EP1047710A2; DE59812837D1

Abstract

本发明涉及具有序列1序列的乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因或其同系物，含有该基因或其同系物的基因构建体及其用途。本发明还涉及含有具有序列1序列的乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因或其同系物的载体或生物体。此外，本发明涉及产生尿嘧啶营养缺陷型微生物的方法和将DNA导入尿嘧啶营养缺陷型微生物的方法。

Description

乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因、含该基因的构建体及用途

本发明涉及具有序列1序列的乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因或其同系物及其用途。本发明还涉及含有具有序列1序列的乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因或其同系物的载体或生物体。

本发明还涉及产生尿嘧啶营养缺陷型微生物的方法和将DNA插入尿嘧啶营养缺陷型微生物的方法。

维生素B2也称核黄素，是人和动物必需的。维生素B1缺陷与口部和咽喉粘膜炎症、瘙痒和皮肤皱褶炎症和类似皮肤损伤、结膜炎、视敏度下降以及角膜混浊相关联。在婴幼儿中，会引发生长停止和体重下降。因此维生素B2具有经济上的重要性，特别是在维生素缺陷时作为维生素添加剂和动物饲料添加剂。此外，它还用作食品色素，例如用于蛋黄酱、冰激凌、牛奶冻等。

维生素B2通过化学或微生物方法制备(参见，例如Kurth et al.，1996，核黄素，《Ullmann工业化学百科全书》，VCH weinheim)。在化学制备方法中，核黄素通常作为多阶段过程的纯化终产物获得，其中需要使用相对昂贵的起始原料，如D-核糖。另一种获得核黄素的方法是利用微生物制备该物质。这种情况下使用的起始原料是可再生的原料，如糖或植物油。通过阿舒氏假囊酵母或棉桃阿舒氏囊霉等真菌发酵制备核黄素已为人所知(Merck Index，Windholz et al.，eds.Merck & Co.，p1183，1983)，但如假丝酵母、毕赤酵母和糖酵母等酵母菌或如芽孢杆菌、梭菌或棒杆菌等细菌也已被报导用作核黄素生产者。

DE 44 20 785公开了棉桃阿舒氏囊霉的6个核黄素生物合成基因和用这些基因转化的微生物以及这些微生物作为核黄素生产者的用途。

迄今为止，将基因插入棉桃阿舒氏囊霉等核黄素真菌生产者是利用leu2(亮氨酸营养缺陷型)，thr4(苏氨酸营养缺陷型)或kan(卡那霉素抗性)标记(WO 92/00379)。酵母菌中报导的其他标记是met15(蛋氨酸营养缺陷型，Cost et al.，Yeast，Vol.12，1996：939-941)。这种标记的缺陷是转化效率极低和/或选择时必需一直添加抗生素。但是，在上述各例中，反向选择丢失了标记而保留了插入基因的微生物是不可能的或者极其困难，所以一般不可能向这些微生物中再插入带有这些标记的基因。因此，需要一种具有较高转化效率、容易选择和可以进行反向选择的选择标记。

啤酒糖酵母的乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因(URA3基因)是具有所需特性的经典标记之一，可用于将基因转化进酵母菌和真菌等微生物。种特异性URA3基因的分离和真菌相应基因(pyrG)的分离以及具柄毕赤酵母、博伊丁氏假丝酵母、马克斯克鲁维氏酵母、Yamadazymaohmeri、麦芽糖假丝酵母、黑曲霉、米曲霉、构巢曲霉、卷枝毛霉、布拉氏须霉、产黄青霉和泡盛曲霉的该基因序列已经在多种文献中报导(Appl.Environ.Microbiol.，Vol.60，No.12，1994：4245-4254，Nucl.Acids Res.，Vol.18，No.23，1990：7183，J.Ferment.Bioeng.，Vol.73，No.4，1992：255-260，Yeast，Vol.9，1993：677-681，Yeast，Vol.10，1994：1601-1612，Curr.Genet.，Vol.23，1993：205-210，Nucl.Acids Res.，Vol.16，No.5，1988：2339，Curr.Genet.，Vol.16，1989：159-163，Gene，Vol.61，1987：385-399，Gene，Vol.116，1992：59-67，Mol.Gen.Genet.，Vol.224，1990：269-278，Nucl.Acids Res.，Vol.16，No.16，1988：8177，Nucl.Acids Res.，Vol.18，No.23，1990：7183和Curr.Genet.，Vol.27，1995：536-540)。

Rose等的研究(Gene，Vol.29，1984：113-124)已经证实啤酒糖酵母的URA3基因实际上能够互补大肠杆菌等原核生物中的相应突变(pyrF基因＝URA3)，并可用作选择标记。

但是，对棉桃阿舒氏囊霉的核黄素生物合成(维生素B2生物合成)的研究已经证实，啤酒糖酵母的URA3基因或大肠杆菌的pyrF基因不能互补棉桃阿舒氏囊霉的尿嘧啶营养缺陷型突变体，因此，这些基因不能用于将基因克隆进棉桃阿舒氏囊霉中。

因为棉桃阿舒氏囊霉中相应于URA3基因或pyrE基因的基因还是未知的，已经尝试克隆该基因。采用文献中描述的方法，通过与URA3基因片段杂交，或利用基于各种乳清苷-5’-磷酸脱羧酶的保守氨基酸序列的简并寡核苷酸筛选cDNA文库或进行PCR，来克隆阿舒氏囊霉的尝试未能成功(Bergkamp et al.Yeast，Vol.9，1993：677-681，Piredda et al.，Yeast，Vol.10，1994：1601-1612，Benito et al.，Gene，Vol.116，1992：59-67和Diaz-Minguez et al.，Mol.Gen.Genet.，Vol.224，1990：269-278)。

本发明的目的之一是提供易于选择的标记，其可以高效转化，容易进行反向选择，这使得它可以将基因插入微生物中。

我们发现，利用具有序列1序列的新型乳清苷-5’-磷酸脱羧酶或与序列1序列具有至少80％同源性的其同系物可以实现该目的。

具有序列1序列的新型乳清苷-5’-磷酸脱羧酶的同系物是指例如等位变体，其衍生氨基酸水平的同源性至少为80％，优选至少90％，更优选至少95％。序列1衍生的氨基酸序列可以参见序列1。等位变体具体包括可以通过缺失、插入或置换序列1所示序列的核苷酸获得的功能变体，插入一个或多个基因时该衍生的合成蛋白的酶活性最好仍保留。但是，如果要通过产生尿嘧啶营养缺陷型微生物的新方法借助于序列1或其同系物在乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因中产生突变，将使用无功能基因，即产生无酶活性蛋白的基因。在这种情况下，优选使用与序列1或其同系物具有同源性的序列，最好为在3’或5’端的序列。

序列1的同系物还包括例如真菌或植物同系物、截短序列、编码和非编码DNA序列的单链DNA或RNA。序列1的同系物在序列1所示全部DNA区域中在DNA水平的同源性为至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，最优选至少90％。

序列1的同系物也包括例如启动子变体的衍生物。所示核苷酸序列上游的启动子可以通过一个或多个核苷酸交换、插入和/或缺失进行修饰，而不影响启动子的功能特性或活性。也可以修饰启动子序列使其活性提高，或用活性更高的启动子完全取代，来自异源生物的启动子也可以。

衍生物也包括在起始密码子前-1到-200之间区域的核苷酸序列已经被修饰从而改变，优选增加了基因表达和/或蛋白表达的变体。

也可以并优选从梅奇酵母科的微生物中分离序列1或其同系物，特别优选从假囊酵母属、阿舒氏囊霉属或针孢酵母属的微生物中分离，更优选从阿舒氏假囊酵母或棉桃阿舒氏囊霉中分离。

新的基因构建体是指URA3基因序列序列1和其同系物已经与一个或多个调节信号有效连接，使得基因表达增加较为有利。这些调节序列的实例是诱导物或抑制物结合因而调节核酸表达的序列。除了这些新的调节序列之外，在结构基因之前的这些序列的天然调节也还可以存在，适当的时候，也可以进行遗传修饰，以便关闭天然调节，增加基因表达。但是，基因构建体也可以具有较简单的结构，即没有在序列1或其同系物之前插入其他调节信号，具有调节作用的天然启动子未缺失。相反，天然调节序列已经被突变使得不再存在调节，基因表达增加。基因构建体还可以包括与启动子有效连接的一个或多个所谓的增强子序列，使得核酸序列表达增加得以实现。还可以在DNA序列3’端插入其他有利的序列，如其他调节元件或终止子。URA3基因在基因构建体中可以以一个或多个拷贝存在，基因也可以被灭活。在新方法中，可以借助这(种)些灭活基因产生尿嘧啶营养缺陷型突变体。在基因构建体中存在其他基因以便将其插入微生物中较为有利。这些基因可以位于URA3基因内部，在这种情况下，在构建体中存在一个完整拷贝的URA3基因和/或另一个可选择的基因例如leu2，thr4或kan较为有利，或者它们可以位于URA3基因之外。即使在构建体中存在完整URA3基因，适当的时候，也可以存在其他标记如上述标记以便进行选择。

新方法中的有利调节序列存在于例如cos，tac，trp，tet，trp-tet，lpp，lac，lpp-lac，lacIq，T7，T5，T3，gal，trc，ara，SP6，λ-P_R或λ-P_L等启动子中，优选用于革兰氏阴性细菌。其他有利调节序列存在于例如革兰氏阳性启动子amy和SP02中，酵母菌或真菌启动子ADC1，MFα，AC，P-60，CYC1，GAPDH，TEF，rp28，ADH或植物启动子CaMV/35S，SSU，OCS，lib4，usp，STLS1，B33，nos或遍在蛋白或菜豆蛋白启动子中。在这种连接中的有利的启动子也可以是来自例如汉逊酵母的丙酮酸脱羧酶和甲醇氧化酶启动子。也可以使用人工启动子进行调节。

原则上，在新方法中可以使用如上所述的所有天然启动子和其调节序列。也可以并优选另外还使用合成启动子。

如上所述的基因构建体也包括待插入微生物的基因。这些基因可以插入ura3，leu2，thr4或kan等标记基因内部或之外。原则上，借助于具有序列1序列的新URA3基因或其同系物，所有种类的基因都可以插入微生物中。可以并优选通过URA3序列在宿主微生物中插入并表达调节基因，如诱导物或抑制物基因，或者通过其酶活性干预调节的酶的基因，或者一种生物合成途径的一个或多个或所有基因，如rib基因等核黄素生物合成的基因，或者产生其他精细化学产物、次级代谢物或蛋白的多个生物合成途径的基因，如生物素、赖氨酸、蛋氨酸、维生素B12或类胡萝卜素生物合成的基因，或者产生调味品、生长因子或气味物质的基因，或者蛋白酶或脂酶等酶的单独的基因。插入的基因可以有自身的启动子或者处于序列1或其同系物序列的启动子的控制之下。

为在前述宿主生物体中表达，优选基因构建体插入载体中，如质粒、噬菌体或其他DNA，它们使基因在宿主中最佳表达成为可能。大肠杆菌中合适质粒的实例为pLG338，pACYC184，pBR322，pUC18，pUC19，pKC30，pRep4，pHS2，pPLc236，pMBL24，pLG200，pUR290，pIN-III¹¹³-B1，λgt11或pBdCI，链霉菌中合适的质粒为pIJ101，pIJ364，pIJ702或pIJ361，在芽孢杆菌中合适的质粒为pUB110，pC194或pBD214，在棒杆菌中合适的质粒为pSA77或pAJ667，在真菌中合适的质粒为pALS1，pIL2或pBB116，在酵母菌中合适的质粒为2μm，pAG-1，Yep13或pEMBLYe23，在植物中合适的质粒为pLGV23，pGHlac⁺，pBIN19，pAK2004或pDH51。所述质粒代表可能的质粒中的一小部分选择。其他质粒是本领域技术人员熟知的，可以参见例如《克隆载体》(Pouwels P.H.等编，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN 0 444 904 018)。

为了表达所存在的其他基因，基因构建体优选包括其他3’和/或5’末端调节序列，以增强表达，这种调节序列根据选定的宿主生物和基因来进行选择以进行最佳表达。

这些调节序列旨在使基因和蛋白特异表达成为可能。这可能意味着，根据宿主生物，基因仅在诱导后表达或过表达，或其立即表达和/或过表达。

调节序列或因子也可以优选对导入的基因的表达具有有益效果，因此增加其表达。调节元件可以以这种方式通过使用强转录信号如启动子和/或增强子在转录水平得以增强。但是，也可以通过例如提高mRNA的稳定性来增加翻译。

在载体的另一个实施方案中，新基因构建体也优选以线性DNA形式导入微生物中，并通过同源或异源重组整合进宿主生物的基因组。该线性DNA可以为线性质粒或只有作为载体的基因构建体。

原则上对新基因构建体合适的宿主生物是所有的原核或真核生物。优选所用的宿主生物是微生物如细菌、真菌、酵母菌、动物或植物细胞。优选使用真菌或酵母菌，特别优选真菌，更优选假囊酵母、阿舒氏囊霉或针孢酵母等梅奇酵母科的真菌。

本发明还涉及产生尿嘧啶营养缺陷型微生物的方法。为了产生尿嘧啶营养缺陷型突变体，对具有序列1序列的乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因或其同系物通过例如诱变进行修饰，使得该基因编码的蛋白被灭活。该灭活的基因随后通过例如转化或电穿孔被导入微生物。最后，在微生物中的同源重组产生营养缺陷型突变体，它们可以通过对5-氟乳清酸的抗性来筛选(见Boeke et al.，Mol.Gen.Genet.，Vol.197，1984：345-346)。

本发明还涉及将DNA插入生物体的方法，包括将一种含有具有序列1序列的完整URA3基因或其同系物的载体插入乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因(URA3基因)有缺陷的一种生物体内，优选一种微生物体内，优选与其他DNA一起插入，更优选与至少一种其他基因一起插入，并在不含尿嘧啶的培养基中培养该生物体。只有能够获得载体的生物体能在该培养基中生长。优选线性DNA在该方法中用作载体。在该方法中使用的微生物优选是真菌，特别是假囊酵母、阿舒氏囊霉或针孢酵母等梅奇酵母科的真菌，特别优选阿舒氏囊霉属的微生物。

用作载体的可以是任何可在细胞中自主复制的合适质粒(特别是携带啤酒糖酵母2m质粒的复制起点的质粒)，也可以是如上所述整合进宿主基因组的线性DNA片段。整合可以通过同源或异源重组进行。但如上所述，优选通过同源重组进行(Steiner et al.，Genetics，Vol.140，1995：973-987)。

具有序列1的新URA3基因或其同系物优选用作新方法中的选择标记。也可以并优选使用该选择标记基因将基因插入棉桃阿舒氏囊霉。

其他优点是在转化棉桃阿舒氏囊霉时，可以借助于该基因进行选择，而不需使用外源DNA(即不是来源于棉桃阿舒氏囊霉的DNA)。

在用具有序列1的基因或其同系物转化棉桃阿舒氏囊霉时也可以插入其他任何基因。这使得可以构建在质粒或其基因组中携带多个拷贝的单个基因或多个基因的菌株。

也可以构建基因的染色体拷贝通过插入具有序列1的URA3基因或其同系物被破坏的阿舒氏囊霉菌株。

AgURA3基因的特别优点是可以在同一菌株中连续使用标记几次。

如果同样的核苷酸序列以相同的方向置于基因的5’和3’(所谓的同向重复)，需要时可以通过同源重组和在含尿嘧啶和FOA的培养基中选择再次缺失AgURA3基因，然后在另一轮中借助于该基因插入其他DNA。其他优点是与thr、leu或kan标记相比显著较高的转化效率。在新方法中，载体包括至少一种核黄素生物合成的基因作为其他基因。核黄素生物合成的基因是指这些基因参与阿舒氏囊霉等核黄素生产者的整个代谢中的合成代谢。

实施例：

实施例1：由棉桃阿舒氏囊霉ATCC10895制备基因组基因文库

棉桃阿舒氏囊霉ATCC10895的基因组DNA通过WO 97/03208所述的方法制备。衍生自该DNA的基因组基因文库在pRS314和Yep351(Hill et al.，Yeast，Vol.2，1986：163-167)中构建，使用的方法参见Sambrook，J.et al.(1989)《分子克隆：实验室指南》，冷泉港实验室出版社或者F.M.et al.(1994)《分子生物学最新方法》，John Wiley and Sons。根据WO 97/03208可以预期其他质粒如pRS系列的质粒(Sikorski and Hieter，Genetics，1989，：19-27)或粘粒如SuperCosl(Stratagene，La Jolla，USA)也适用于产生基因文库。

实施例2：

最初试图通过啤酒糖酵母相应的URA3营养缺陷型突变体的功能互补从棉桃阿舒氏囊霉中克隆乳清苷-5’-磷酸脱羧酶(OMP-DC)基因。

为此，由棉桃阿舒氏囊霉的基因组DNA在pRS314中构建基因文库(如实施例1所述)。该DNA用于转化啤酒糖酵母菌株MW3317-21A(基因型：MATα，trp1，ade8ΔKpn，ura3-52，hom3-10，met13，met4，ade2，his3-Kpn，参见例如Kramer et al.，Mol.Cell.Biol.9，1989：4432-4440)，使用乙酸锂法(参见，例如Kramer et al.，Mol.Cell.Biol.9，1989：4432-4440)。没有获得啤酒糖酵母菌株ura3基因的基因组缺失被阿舒氏囊霉的基因片段互补的克隆。

通过大肠杆菌pyrF突变体中的功能互补克隆棉桃阿舒氏囊霉的URA3基因的尝试也未成功。

实施例3：

通过与啤酒糖酵母相应基因片段的杂交从棉桃阿舒氏囊霉中克隆OMP-DC基因的尝试也告失败。

为此目的，啤酒糖酵母的完整URA3基因(基因文库条目yscodcd)用作探针(长度1.1kb)，以筛选棉桃阿舒氏囊霉的基因组粘粒基因文库(参见实施例1)。按照文献所述进行试验(Sambrook，J.et al.(1989)《分子克隆：实验室指南》，冷泉港实验室出版社或者F.M.et al.(1994)《分子生物学最新方法》，John Wiley andSons)，使用的杂交温度为52℃到68℃。不可能在基因文库中鉴定到任何与作为探针的啤酒糖酵母URA3基因产生阳性信号的克隆。

实施例4：

在另一种方法中，试图利用简并寡核苷酸和PCR技术通过扩增基因片段扩增棉桃阿舒氏囊霉的OMP-DC基因。

在该试验中，比较了下列生物体的乳清苷-5’-磷酸脱羧酶的已知氨基酸序列，选出了所有酶中显示最大保守程度的区域：

黑曲霉(入藏号：P07817)

构巢曲霉(入藏号：P10652)

粟酒裂殖酵母(入藏号：P14965)

产黄青霉(入藏号：P09463)

乳克鲁维氏酵母(入藏号：P07922)

白色假丝酵母(入藏号：P13649)

粗糙链孢霉(入藏号：P05035)

玉蜀黍黑粉菌(入藏号：P15188)

啤酒糖酵母(入藏号：Q01637)

黑尾果蝇(入藏号：Q01637)

小鼠(入藏号：P13439)

人(入藏号：P11172)

括号中给出的代号来自于SWISSPIR-Translated DatenbankRelease 103。

简并寡核苷酸根据该信息合成。

简并寡核苷酸是指合成时在一些位置整合了核苷酸混合物的寡核苷酸。

在寡核苷酸中，R代表G或A，Y代表C或T，W代表A或T，M代表A或C，K代表G或T，S代表C或G，H代表A、C或T，V代表A、C或G，B代表C、G或T，D代表A、G或T，N代表G、A、T或C。

使用了下列寡核苷酸：

URA3-A：5’-YTNGGNCCNTAYATHTGY-3’

URA3-B：5’-TAYTGYTGNCCNARYTTRTCNCC-3’

URA3-C：5’-TTYYTNATHTTYGARGAYMGNAARTT-3’

URA3-D：5’-GCNARNARNARNARNCCNC-3’

使用这些寡核苷酸作为引物，用棉桃阿舒氏囊霉的基因组DNA作为模板进行PCR。

使用下列引物组合：

URA3-A+URA3-B；URA3-A+URA3-D；URA3-C+URA3-B以及URA3-C+URA3-D。

使用下列杂交温度：52℃、48℃、44℃、40℃和37℃。

PCR产物通过常规方法克隆进载体pGEMT(Promega)并测序。不可能扩增与上述已知OMP-DC基因显示同源性的任何片段。

实施例5：

如DE 44 20 785 A1所述从棉桃阿舒氏囊霉构建cDNA文库(实施例1)。

实施例6：基因文库中核酸序列的分析

从大肠杆菌克隆中选择出包括如实施例5所述来自棉桃阿舒氏囊霉的基因文库的单个克隆。在合适的培养基中(如加有100mg/l氨苄青霉素的Luria肉汤)通过常规方法培养细胞，从这些细胞中分离质粒DNA。

在载体部分杂交的寡核苷酸作为测序cDNA克隆的引物。克隆的cDNA片段以这种方式检测。如实施例7所述分析序列。

实施例7：

使用BLAST算法(Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215，403-410)和借助于PAM250权重表的Clustal算法，或Wilbur-Lipman DNA序列比较算法(如在DNAstar提供的程序包MegAlign3.06中运行)，通过比较新鉴定的序列与现有DNA和蛋白数据库，进行计算机辅助的核苷酸序列分析。

实施例8：

鉴定携带棉桃阿舒氏囊霉OMP-DC基因(AgURA3)的大肠杆菌克隆。

如实施例6和7所述检测大量克隆(＞100克隆)后，发现了与已知OMP-DC基因具有类似性的序列。类似过程用于再次筛选阿舒氏囊霉基因文库(见实施例1)，可能鉴定产生特异阳性信号并携带共同的1.3kb XhoI-EcoRI片段的克隆和粘粒。对所述克隆测序产生了序列1所述的序列。该序列与已知URA3基因具有类似性并编码大小为约29246道尔顿的蛋白。

实施例9：具有抗生素抗性基因AgURA3基因的染色体拷贝的破坏

基因的破坏是指该基因的染色体拷贝的功能被破坏，通过以下方法破坏(a)缺失基因序列的一部分，(b)向基因中引入一段外源DNA打断基因，(c)用外源DNA取代基因的一部分。可以使用任何外源DNA，但优选赋予对任何合适化学品的抗性的基因。任何合适的抗性基因可以用于破坏基因。

为了破坏棉桃阿舒氏囊霉ATCC10895的AgURA3基因，使用来自Tn903的卡那霉素抗性基因，其处于棉桃阿舒氏囊霉的TEF启动子控制之下(参见Yeast 10，pp1793-3808，1994或WO 92/00379)。该基因5’和3’侧翼有几个限制性内切酶切割位点，所以可以使用常规体外DNA操作构建基因盒，它使得任何所需的基因破坏的构建成为可能。

AgURA3的内部370bp PstI-KpnI片段(序列1中442位到892位)用上述抗性盒取代。产生的构建体命名为ura3∷G418。所得的质粒可以在转化进大肠杆菌之后复制。Ura3∷G418构建体的XhoI-SphI片段(见图1)通过琼脂糖凝胶电泳纯化，然后从凝胶中洗脱出DNA(参见Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76，615-619，1979)，将DNA用来转化棉桃阿舒氏囊霉。图1A显示AgURA3基因以及5’和3’非翻译区(5’-UTR和3’-UTR)的限制图。图1B显示如上所述插入卡那霉素抗性盒(TEF-kanR)的位置。

通过原生质体转化(Gene 109，99-105，1991)等或优选通过电穿孔(BioRad Gene Pulser，条件：小池裂缝宽度0.4mm，1500V，25μF，100Ω)将片段转化进棉桃阿舒氏囊霉。在含有G418的固体培养基中选择转化细胞(WO 97/03208)。

产生的G418抗性克隆通过常规PCR和Southern印迹分析方法分析(Sambrook，J.et al.(1989)《分子克隆：实验室指南》，冷泉港实验室出版社或者F.M.et al.(1994)《分子生物学最新方法》，John Wiley and Sons)，以证实AgURA3基因的基因组拷贝是否确实被破坏。AgURA3基因被破坏的克隆是尿嘧啶营养缺陷型，对1mg/ml 5’-氟乳清酸(FOA)具有抗性。

实施例10：不使用抗生素抗性基因破坏AgURA3基因的基因组拷贝

使用URA3基因的最大好处是可以选择基因存在和基因不存在。可以用具有功能灭活URA3基因的FOA微生物进行筛选，通过选择尿嘧啶原养型选择功能活性的URA3基因。

为了破坏URA3基因的基因组拷贝，为简便起见，URA3基因的内部片段(PstI片段)从具有序列1序列的基因的编码区中缺失(序列1序列的442位到520位)。用该缺失的ura3片段转化棉桃阿舒氏囊霉如实施例10所述进行。不使用缺失基因的部分区域的方法，原则上也可以使用所有其他灭活基因的方法，如通过插入、重复、倒转、取代几个核苷酸产生突变或点突变。不优选点突变，因为其容易回复。

转化子通过对FOA的抗性选择。与野生型克隆相反，携带破坏的AgURA3基因的克隆对1mg/ml FOA具有抗性。

实施例11：使用AgURA3基因将其他DNA插入棉桃阿舒氏囊霉

借助WO 97/03208(实施例4和5)所述的质粒pAG100，将WO97/03208所述的异柠檬酸裂合酶基因插入棉桃阿舒氏囊霉的AgURA3破坏突变体(见实施例9和10)，使用AgURA3基因代替G418抗性作为棉桃阿舒氏囊霉中的选择标记。

序列表

(1)一般信息：

(i)申请人：

(A)名称：BASF Aktiengesellschaft

(B)街道：Carl Boshch Strasse

(C)城市：Ludwigshafen

(D)联邦州：Rheinland-Pfalz

(E)国家：德国

(F)邮编：D-67056

(ii)发明名称：乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因、含该基因的构建体及用途

(iii)序列数：2

(iv)计算机可读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM兼容

(C)操作系统：DOS

(D)软件：PatentIn Release #1.0，Version #1.25(EPO)

(2)序列1资料：

(i)序列特征：

(A)长度：1380碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假设：非

(iii)反义：无

(vi)原始来源：

(A)生物：棉桃阿舒氏囊霉

(vii)直接来源：

(B)克隆：ura3

(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：210..1013

(ix)特征：

(A)名称/关键词：5’UTR

(B)位置：1..199

(ix)特征：

(A)名称/关键词：3’UTR

(B)位置：1014..1380

(xi)序列描述：序列1：

CTCGAGCAAC TCATTGGAAG CCCTTCGCAA ACGACCTCTA TATCTCGTCT CAAGTTCCTA 60

CTATCATGTA TGCTGTCACT ACAGAAAAAT TTTTGTCTAT AGCTGGCAAG AAGCACATCA 120

CATACATTCT GATGGTGTAG GCTCCACATC ACAGTAAGCA TTTGTATAAG GCTGATCACA 180

TAGGGTGCTA CCGACCTAGC CATTGCCAC ATG TCA ACG AAA TCT TAC GCA GAA 233

Met Ser Thr Lys Ser Tyr Ala Glu

1 5

AGG GCC AAG GCA CAC AAT TCG CCA GTT GCT AGA AAG CTT CTG GCA TTG 281

Arg Ala Lys Ala His Asn Ser Pro Val Ala Arg Lys Leu Leu Ala Leu

10 15 20

ATG CAC GAG AAG AAA ACC AAT CTC TGC GCT TCC CTT GAT GTG CGG ACG 329

Met His Glu Lys Lys Thr Asn Leu Cys Ala Ser Leu Asp Val Arg Thr

25 30 35 40

TCT AGA AAG CTT CTG GAG CTA GCA GAC ACG CTG GGA CCG CAC ATT TGT 377

Ser Arg Lys Leu Leu Glu Leu Ala Asp Thr Leu Gly Pro His Ile Cys

45 50 55

CTG CTG AAG ACA CAT GTC GAC ATA CTG ACG GAC TTC GAC ATC GAG ACG 425

Leu Leu Lys Thr His Val Asp Ile Leu Thr Asp Phe Asp Ile Glu Thr

60 65 70

ACA GTC AAG CCG CTG CAG CAG CTT GCG GCT AAG CAC AAC TTC ATG ATC 473

Thr Val Lys Pro Leu Gln Gln Leu Ala Ala Lys His Asn Phe Met Ile

75 80 85

TTC GAG GAC CGC AAG TTC GCT GAC ATT GGC AAC ACG GTT AAG CTG CAG 521

Phe Glu Asp Arg Lys Phe Ala Asp Ile Gly Asn Thr Val Lys Leu Gln

90 95 100

TAC TCC TCC GGC GTG TAC CGT ATC GCG GAG TGG GCG GAT ATT ACC AAT 569

Tyr Ser Ser Gly Val Tyr Arg Ile Ala Glu Trp Ala Asp Ile Thr Asn

105 110 115 120

GCA CAC GGC GTC ACC GGC CCC GGT GTG ATA GCC GGG CTG AAG GAG GCT 617

Ala His Gly Val Thr Gly Pro Gly Val Ile Ala Gly Leu Lys Glu Ala

125 130 135

GCG AAA CTG GCC TCA CAG GAA CCC AGG GGG TTG CTG ATG CTG GCA GAG 665

Ala Lys Leu Ala Ser Gln Glu Pro Arg Gly Leu Leu Met Leu Ala Glu

140 145 150

CTC TCT TCT CAG GGC TCT TTG GCG CGC GGA GAC TAT ACC GCG GGC GTC 713

Leu Ser Ser Gln Gly Ser Leu Ala Arg Gly Asp Tyr Thr Ala Gly Val

155 160 165

GTT GAA ATG GCG AAG CTG GAC GAA GAC TTT GTG ATC GGG TTC ATC GCG 761

Val Glu Met Ala Lys Leu Asp Glu Asp Phe Val Ile Gly Phe Ile Ala

170 175 180

CAG CGT GAC ATG GGT GGG CGT GCA GAC GGC TTT GAC TGG CTC ATC ATG 809

Gln Arg Asp Met Gly Gly Arg Ala Asp Gly Phe Asp Trp Leu Ile Met

185 190 195 200

ACC CCG GGG GTT GGC CTG GAC GAC AAA GGA GAC GGC CTG GGC CAG CAG 857

Thr Pro Gly Val Gly Leu Asp Asp Lys Gly Asp Gly Leu Gly Gln Gln

205 210 215

TAC CGC ACG GTG GAT GAG GTC GTC AGC GAC GGT ACC GAT GTG ATC ATT 905

Tyr Arg Thr Val Asp Glu Val Val Ser Asp Gly Thr Asp Val Ile Ile

220 225 230

GTT GGC AGA GGG CTC TTT GAC AAG GGA AGA GAC CCC AAG GTC GAG GGT 953

Val Gly Arg Gly Leu Phe Asp Lys Gly Arg Asp Pro Lys Val Glu Gly

235 240 245

GCC CGC TAC CGC AAG GCC GGT TGG GAG GCT TAC TTG CGC CGT ATG GGC 1001

Ala Arg Tyr Arg Lys Ala Gly Trp Glu Ala Tyr Leu Arg Arg Met Gly

250 255 260

GAG ACT TCG TAGTCTATCG CTGGCGCCCA CAGTATATAG GCGGATTCCA 1050

Glu Thr Ser

265

CCGCCGATTA CCATCTCAGC AACCTTTTTG TAATTATATG CCCCTATTGC CCTTATTTCC 1110

GAGCTGGTGC CGGGATCGGT TTATAGACGG GCAACAAGTT GATACTTTGT TCAGTAGCAT 1170

GCATCCAACA CTTGCAGGCT TGGGGTGTGG AAGGCCTCGC CGCGGATAAT TCGTATTACC 1230

CGCACTTCGT GAAGTATTGC TTTATGAAAA ATCTTCACTT TGGGCTAACT AGAGCCATAA 1290

CTCGACACAA GCCCCTTCCT ACACACTTCG AGCTGGGACT AAAGTGACAA CGAATAGCAA 1350

ATAATTAGCA AATATGGATG CGTTGAATTC 1380

(2)序列2资料：

(i)序列特征：

(A)长度：267氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：序列2：

Met Ser Thr Lys Ser Tyr Ala Glu Arg Ala Lys Ala His Asn Ser Pro

1 5 10 15

Val Ala Arg Lys Leu Leu Ala Leu Met His Glu Lys Lys Thr Asn Leu

20 25 30

Cys Ala Ser Leu Asp Val Arg Thr Ser Arg Lys Leu Leu Glu Leu Ala

35 40 45

Asp Thr Leu Gly Pro His Ile Cys Leu Leu Lys Thr His Val Asp Ile

50 55 60

Leu Thr Asp Phe Asp Ile Glu Thr Thr Val Lys Pro Leu Gln Gln Leu

65 70 75 80

Ala Ala Lys His Asn Phe Met Ile Phe Glu Asp Arg Lys Phe Ala Asp

85 90 95

Ile Gly Asn Thr Val Lys Leu Gln Tyr Ser Ser Gly Val Tyr Arg Ile

100 105 110

Ala Glu Trp Ala Asp Ile Thr Asn Ala His Gly Val Thr Gly Pro Gly

115 120 125

Val Ile Ala Gly Leu Lys Glu Ala Ala Lys Leu Ala Ser Gln Glu Pro

130 135 140

Arg Gly Leu Leu Met Leu Ala Glu Leu Ser Ser Gln Gly Ser Leu Ala

145 150 155 160

Arg Gly Asp Tyr Thr Ala Gly Val Val Glu Met Ala Lys Leu Asp Glu

165 170 175

Asp Phe Val Ile Gly Phe Ile Ala Gln Arg Asp Met Gly Gly Arg Ala

180 185 190

Asp Gly Phe Asp Trp Leu Ile Met Thr Pro Gly Val Gly Leu Asp Asp

195 200 205

Lys Gly Asp Gly Leu Gly Gln Gln Tyr Arg Thr Val Asp Glu Val Val

210 215 220

Ser Asp Gly Thr Asp Val Ile Ile Val Gly Arg Gly Leu Phe Asp Lys

225 230 235 240

Gly Arg Asp Pro Lys Val Glu Gly Ala Arg Tyr Arg Lys Ala Gly Trp

245 250 255

Glu Ala Tyr Leu Arg Arg Met Gly Glu Thr Ser

260 265

Claims

1.具有序列1序列的乳清苷-5′-磷酸脱羧酶基因或与序列1序列具有至少80％同源性并且编码具有酶活性的乳清苷-5′-磷酸脱羧酶的其同系物。

2.权利要求1的基因或其同系物编码的氨基酸序列。

3.含有权利要求1或2的具有序列1序列的乳清苷-5′-磷酸脱羧酶基因或其同系物的基因构建体，其中基因或其同系物与一个或多个调节信号有效连接。

4.权利要求3的基因构建体，其基因表达通过调节信号得以增加。

5.包含权利要求3的基因构建体的载体。

6.包含权利要求3的基因构建体的微生物。

7.产生尿嘧啶营养缺陷型微生物的方法，包括修饰权利要求1的具有序列1序列的乳清苷-5′-磷酸脱羧酶基因或其同系物，使得该基因编码的蛋白无活性，该修饰基因被导入微生物中并通过同源重组整合进生物体基因组中，然后通过对5-氟乳清酸的抗性选择这些微生物。

8.将DNA插入微生物中的方法，包括以下步骤：将权利要求1的包括具有序列1序列的完整乳清苷-5′-磷酸脱羧酶基因或其同系物，与至少一种其他基因一起，插入乳清苷-5′-磷酸脱羧酶基因有缺陷的微生物中，在无尿嘧啶培养基中培养该微生物。

9.权利要求8的方法，其中线性DNA被用作载体。

10.权利要求8的方法，其中棉桃阿舒氏囊霉菌株用作乳清苷-5′-磷酸脱羧酶基因有缺陷的微生物。

11.权利要求8的方法，其中至少一种核黄素生物合成基因被作为其他基因插入微生物中。

12.权利要求1的基因序列或其同系物在棉桃阿舒氏囊霉中作为选择标记的用途。