KR20010043867A - 리보플라빈을 생산하는 유전적 방법 - Google Patents

리보플라빈을 생산하는 유전적 방법 Download PDF

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KR20010043867A
KR20010043867A KR1020007013352A KR20007013352A KR20010043867A KR 20010043867 A KR20010043867 A KR 20010043867A KR 1020007013352 A KR1020007013352 A KR 1020007013352A KR 20007013352 A KR20007013352 A KR 20007013352A KR 20010043867 A KR20010043867 A KR 20010043867A
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ala
leu
gly
val
glu
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KR1020007013352A
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English (en)
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헤닝 알퇴퍼
하랄트 조일베르거
오스카 첼더
호세 루이스 레부엘타도발
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스타르크, 카르크
바스프 악티엔게젤샤프트
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P25/00—Preparation of compounds containing alloxazine or isoalloxazine nucleus, e.g. riboflavin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract

본 발명은 리보플라빈 생성을 위한 유전적 방법에 관한 것이다. 생물에서, 특히 박테리아, 진균, 효모 및 식물에서의 리보플라빈 생합성 유전자 또는 그의 조합의 특정한 선택, 및 그의 발현은 이들 생물에서의 리보플라빈 생성 증가를 유도한다.
본 발명은 추가로 핵산 단편을 포함하는 벡터를 발현시키기 위해, 서열 번호 1, 서열 번호 3 또는 서열 번호 5를 갖는 유전자 또는 이들의 기능적 균등물을 포함하는 핵산 단편 및 1개 이상의 핵산 단편 또는 1개 이상의 벡터를 포함하는 생물에 관한 것이다.

Description

리보플라빈을 생산하는 유전적 방법 {Genetic Method for Producing Riboflavin}
(1) ALGEMEINE INFORMATION:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: BASF Aktiengesellschaft
(B) STRASSE: Carl-Bosch-Strasse 38
(C) ORT: Ludwigshafen
(D) BUNDESLAND: Rheinland-Pfalz
(E) LAND: Bundesrepublik Deutschland
(F) POSTLEITZAHL: D-67056
(ii) ANMELDETITEL: Genetisches Verfahren zur Herstellung von
Riboflavin
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 10
(iv) COMPUTER-LESBARE FORM:
(A) DATENTRAEGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (EPA)
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LAEGE: 655 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsaeure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKUALUS: DNS (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iii) ANTISENSE: NEIN
(vi) URSPRUENLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Ashbya gossypii
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(B) CLON: ITA 17
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLUESSEL: CDS
(B) LAGE: 11..649
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
ACCAAGCAAC ATG ACA AGC CCA TGC ACT GAT ATC GGT ACC GCT ATA GAG 49
Met Thr Ser Pro Cys Thr Asp Ile Gly Thr Ala Ile Glu
1 5 10
CAG TTC AAG CAA AAT AAG ATG ATC ATC GTC ATG GAC CAC ATC TCG AGA 97
Gln Phe Lys Gln Asn Lys Met Ile Ile Val Met Asp His Ile Ser Arg
15 20 25
GAA AAC GAG GCC GAT CTA ATA TGT GCA GCA GCG CAC ATG ACT GCC GAG 145
Glu Asn Glu Ala Asp Leu Ile Cys Ala Ala Ala His Met Thr Ala Glu
30 35 40 45
CAA ATG GCA TTT ATG ATT CGG TAT TCC TCG GGC TAC GTT TGC GCT CCA 193
Gln Met Ala Phe Met Ile Arg Tyr Ser Ser Gly Tyr Val Cys Ala Pro
50 55 60
ATG ACC AAT GCG ATT GCC GAT AAG CTA GAC CTA CCG CTC ATG AAC ACA 241
Met Thr Asn Ala Ile Ala Asp Lys Leu Asp Leu Pro Leu Met Asn Thr
65 70 75
TTG AAA TGC AAG GCT TTC TCC GAT GAC AGA CAC AGC ACT GCG TAT ACA 289
Leu Lys Cys Lys Ala Phe Ser Asp Asp Arg His Ser Thr Ala Tyr Thr
80 85 90
ATC ACC TGT GAC TAT GCG CAC GGG ACG ACG ACA GGT ATC TCC GCA CGT 337
Ile Thr Cys Asp Tyr Ala His Gly Thr Thr Thr Gly Ile Ser Ala Arg
95 100 105
GAC CGG GCG TTG ACC TGT AAT CAG TTG GCG AAC CCG GAG TCC AAG GCT 385
Asp Arg Ala Leu Thr Cys Asn Gln Leu Ala Asn Pro Glu Ser Lys Ala
110 115 120 125
ACC GAC TTC ACG AAG CCA GGC CAC ATT GTG CCA TTG CGT GCC CGT GAC 433
Thr Asp Phe Thr Lys Pro Gly His Ile Val Pro Leu Arg Ala Arg Asp
130 135 140
GGC GGC GTG CTC GAG CGT GAC GGG CAC ACC GAA GCG GCG CTC GAC TTG 481
Gly Gly Val Leu Glu Arg Asp Gly His Thr Glu Ala Ala Leu Asp Leu
145 150 155
TGC AGA CTA GCG GGT GTG CCA GAG GTC GCT GCT ATT TGT GAA TTA GTA 529
Cys Arg Leu Ala Gly Val Pro Glu Val Ala Ala Ile Cys Glu Leu Val
160 165 170
AGC GAA AGG GAC GTC GGG CTG ATG ATG ACT TTG GAT GAG TGT ATA GAA 577
Ser Glu Arg Asp Val Gly Leu Met Met Thr Leu Asp Glu Cys Ile Glu
175 180 185
TTC AGC AAG AAG CAC GGT CTT GCC CTC ATC ACC GTC GAT GAC CTG AAG 625
Phe Ser Lys Lys His Gly Leu Ala Leu Ile Thr Val Asp Asp Leu Lys
190 195 200 205
GCT GCA GTT GCC GCC AAG CAG TAGACGGCA 655
Ala Ala Val Ala Ala Lys Gln
210
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LAENGE: 212 Aminosaeuren
(B) ART: Aminosaeure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKUELS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
Met Thr Ser Pro Cys Thr Asp Ile Gly Thr Ala Ile Glu Gln Phe Lys
1 5 10 15
Gln Asn Lys Met Ile Ile Val Met Asp His Ile Ser Arg Glu Asn Glu
20 25 30
Ala Asp Leu Ile Cys Ala Ala Ala His Met Thr Ala Glu Gln Met Ala
35 40 45
Phe Met Ile Arg Tyr Ser Ser Gly Tyr Val Cys Ala Pro Met Thr Asn
50 55 60
Ala Ile Ala Asp Lys Leu Asp Leu Pro Leu Met Asn Thr Leu Lys Cys
65 70 75 80
Lys Ala Phe Ser Asp Asp Arg His Ser Thr Ala Tyr Thr Ile Thr Cys
85 90 95
Asp Tyr Ala His Gly Thr Thr Thr Gly Ile Ser Ala Arg Asp Arg Ala
100 105 110
Leu Thr Cys Asn Gln Leu Ala Asn Pro Glu Ser Lys Ala Thr Asp Phe
115 120 125
Thr Lys Pro Gly His Ile Val Pro Leu Arg Ala Arg Asp Gly Gly Val
130 135 140
Leu Glu Arg Asp Gly His Thr Glu Ala Ala Leu Asp Leu Cys Arg Leu
145 150 155 160
Ala Gly Val Pro Glu Val Ala Ala Ile Cys Glu Leu Val Ser Glu Arg
165 170 175
Asp Val Gly Leu Met Met Thr Leu Asp Glu Cys Ile Glu Phe Ser Lys
180 185 190
Lys His Gly Leu Ala Leu Ile Thr Val Asp Asp Leu Lys Ala Ala Val
195 200 205
Ala Ala Lys Gln
210
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LAENGE: 529 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsaeure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKUELS: DNS (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iii) ANTISENSE: NEIN
(vi) URSPRUENLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Ashbya gossypii
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON: ITA 17
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLUESSEL: CDS
(B) LAGE: 8..526
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
AGTGACA ATG ATT AAG GGA TTA GGC GAA GTT GAT CAA ACC TAC GAT GCG 49
Met Ile Lys Gly Leu Gly Glu Val Asp Gln Thr Tyr Asp Ala
1 5 10
AGC TCT GTC AAG GTT GGC ATT GTC CAC GCG AGA TGG AAC AAG ACT GTC 97
Ser Ser Val Lys Val Gly Ile Val His Ala Arg Trp Asn Lys Thr Val
15 20 25 30
ATT GAC GCT CTC GTC CAA GGT GCA ATT GAG AAA CTG CTT GCT ATG GGA 145
Ile Asp Ala Leu Val Gln Gly Ala Ile Glu Lys Leu Leu Ala Met Gly
35 40 45
GTG AAG GAG AAG AAT ATC ACT GTA AGC ACC GTT CCA GGT GCG TTT GAA 193
Val Lys Glu Lys Asn Ile Thr Val Ser Thr Val Pro Gly Ala Phe Glu
50 55 60
CTA CCA TTT GGC ACT CAG CGG TTT GCC GAG CTG ACC AAG GCA AGT GGC 241
Leu Pro Phe Gly Thr Gln Arg Phe Ala Glu Leu Thr Lys Ala Ser Gly
65 70 75
AAG CAT TTG GAC GTG GTC ATC CCA ATT GGA GTC CTG ATC AAA GGC GAC 289
Lys His Leu Asp Val Val Ile Pro Ile Gly Val Leu Ile Lys Gly Asp
80 85 90
TCA ATG CAC TTT GAA TAT ATA TCA GAC TCT GTG ACT CAT GCC TTA ATG 337
Ser Met His Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ser Val Thr His Ala Leu Met
95 100 105 110
AAC CTA CAG AAG AAG ATT CGT CTT CCT GTC ATT TTT GGT TTG CTA ACG 385
Asn Leu Gln Lys Lys Ile Arg Leu Pro Val Ile Phe Gly Leu Leu Thr
115 120 125
TGT CTA ACA GAG GAA CAA GCG TTG ACA CGT GCA GGC CTC GGT GAA TCT 433
Cys Leu Thr Glu Glu Gln Ala Leu Thr Arg Ala Gly Leu Gly Glu Ser
130 135 140
GAA GGC AAG CAC AAC CAC GGT GAA GAC TGG GGT GCT GCT GCC GTG GAG 481
Glu Gly Lys His Asn His Gly Glu Asp Trp Gly Ala Ala Ala Val Glu
145 150 155
ATG GCT GTA AAG TTT GGC CCA CGC GCC GAA CAA ATG AAG AAG TGAATA 529
Met Ala Val Lys Phe Gly Pro Arg Ala Glu Gln Met Lys Lys
160 165 170
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LAENGE: 172 Aminosaeuren
(B) ART: Aminosaeure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKUELS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
Met Ile Lys Gly Leu Gly Glu Val Asp Gln Thr Tyr Asp Ala Ser Ser
1 5 10 15
Val Lys Val Gly Ile Val His Ala Arg Trp Asn Lys Thr Val Ile Asp
20 25 30
Ala Leu Val Gln Gly Ala Ile Glu Lys Leu Leu Ala Met Gly Val Lys
35 40 45
Glu Lys Asn Ile Thr Val Ser Thr Val Pro Gly Ala Phe Glu Leu Pro
50 55 60
Phe Gly Thr Gln Arg Phe Ala Glu Leu Thr Lys Ala Ser Gly Lys His
65 70 75 80
Leu Asp Val Val Ile Pro Ile Gly Val Leu Ile Lys Gly Asp Ser Met
85 90 95
His Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ser Val Thr His Ala Leu Met Asn Leu
100 105 110
Gln Lys Lys Ile Arg Leu Pro Val Ile Phe Gly Leu Leu Thr Cys Leu
115 120 125
Thr Glu Glu Gln Ala Leu Thr Arg Ala Gly Leu Gly Glu Ser Glu Gly
130 135 140
Lys His Asn His Gly Glu Asp Trp Gly Ala Ala Ala Val Glu Met Ala
145 150 155 160
Val Lys Phe Gly Pro Arg Ala Glu Gln Met Lys Lys
165 170
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LAENGE: 712 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsaeure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKUELS: DNS (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iii) ANTISENSE: NEIN
(vi) URSPRUENLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Ashbya gossypii
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(B) CLON: ITA 17
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLUESSEL: CDS
(B) LAGE: 5..712
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
TAGG ATG TTT ACC GGT ATA GTG GAA CAC ATT GGC ACT GTT GCT GAG TAC 49
Met Phe Thr Gly Ile Val Glu His Ile Gly Thr Val Ala Glu Tyr
1 5 10 15
TTG GAG AAC GAT GCC AGC GAG GCA GGC GGC AAC GGT GTG TCA GTC CTT 97
Leu Glu Asn Asp Ala Ser Glu Ala Gly Gly Asn Gly Val Ser Val Leu
20 25 30
ATC AAG GAT GCG GCT CCG ATA CTG GCG GAT TGC CAC ATC GGT GAC TCG 145
Ile Lys Asp Ala Ala Pro Ile Leu Ala Asp Cys His Ile Gly Asp Ser
35 40 45
ATT GCA TGC AAT GGT ATC TGC CTG ACG GTG ACG GAG TTC ACG GCC GAT 193
Ile Ala Cys Asn Gly Ile Cys Leu Thr Val Thr Glu Phe Thr Ala Asp
50 55 60
AGC TTC AAG GTC GGG ATC GCA CCA GAA ACA GTT TAT CGG ACG GAA GTC 241
Ser Phe Lys Val Gly Ile Ala Pro Glu Thr Val Tyr Arg Thr Glu Val
65 70 75
AGC AGC TGG AAA GCT GGC TCC AAG ATC AAC CTA GAA AGG GCC ATC TCG 289
Ser Ser Trp Lys Ala Gly Ser Lys Ile Asn Leu Glu Arg Ala Ile Ser
80 85 90 95
GAC GAC AGG CGC TAC GGC GGG CAC TAC GTG CAG GGC CAC GTC GAC TCG 337
Asp Asp Arg Arg Tyr Gly Gly His Tyr Val Gln Gly His Val Asp Ser
100 105 110
GTG GCC TCT ATT GTA TCC AGA GAG CAC GAC GGG AAC TCT ATC AAC TTT 385
Val Ala Ser Ile Val Ser Arg Glu His Asp Gly Asn Ser Ile Asn Phe
115 120 125
AAG TTT AAA CTG CGC GAT CAA GAG TAC GAG AAG TAC GTA GTA GAA AAG 433
Lys Phe Lys Leu Arg Asp Gln Glu Tyr Glu Lys Tyr Val Val Glu Lys
130 135 140
GGT TTT GTG GCG ATC GAC GGT GTG TCG CTG ACT GTA AGC AAG ATG GAT 481
Gly Phe Val Ala Ile Asp Gly Val Ser Leu Thr Val Ser Lys Met Asp
145 150 155
CCA GAT GGC TGT TTC TAC ATC TCG ATG ATT GCA CAC ACG CAG ACC GCT 529
Pro Asp Gly Cys Phe Tyr Ile Ser Met Ile Ala His Thr Gln Thr Ala
160 165 170 175
GTA GCC CTT CCA CTG AAG CCG GAC GGT GCC CTC GTG AAC ATA GAA ACG 577
Val Ala Leu Pro Leu Lys Pro Asp Gly Ala Leu Val Asn Ile Glu Thr
180 185 190
GAT GTT AAC GGC AAG CTA GTA GAG AAG CAG GTT GCA CAG TAC CTG AAT 625
Asp Val Asn Gly Lys Leu Val Glu Lys Gln Val Ala Gln Tyr Leu Asn
195 200 205
GCG CAG CTG GAA GGT GAG AGC TCG CCA TTG CAG CGC GTG CTC GAA AGG 673
Ala Gln Leu Glu Gly Glu Ser Ser Pro Leu Gln Arg Val Leu Glu Arg
210 215 220
ATT ATT GAA TCC AAG CTT GCT AGC ATC TCA AAT AAG TG 712
Ile Ile Glu Ser Lys Leu Ala Ser Ile Ser Asn Lys
225 230 235
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LAENGE: 235 Aminosaeuren
(B) ART: Aminosaeure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKUELS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
Met Phe Thr Gly Ile Val Glu His Ile Gly Thr Val Ala Glu Tyr Leu
1 5 10 15
Glu Asn Asp Ala Ser Glu Ala Gly Gly Asn Gly Val Ser Val Leu Ile
20 25 30
Lys Asp Ala Ala Pro Ile Leu Ala Asp Cys His Ile Gly Asp Ser Ile
35 40 45
Ala Cys Asn Gly Ile Cys Leu Thr Val Thr Glu Phe Thr Ala Asp Ser
50 55 60
Phe Lys Val Gly Ile Ala Pro Glu Thr Val Tyr Arg Thr Glu Val Ser
65 70 75 80
Ser Trp Lys Ala Gly Ser Lys Ile Asn Leu Glu Arg Ala Ile Ser Asp
85 90 95
Asp Arg Arg Tyr Gly Gly His Tyr Val Gln Gly His Val Asp Ser Val
100 105 110
Ala Ser Ile Val Ser Arg Glu His Asp Gly Asn Ser Ile Asn Phe Lys
115 120 125
Phe Lys Leu Arg Asp Gln Glu Tyr Glu Lys Tyr Val Val Glu Lys Gly
130 135 140
Phe Val Ala Ile Asp Gly Val Ser Leu Thr Val Ser Lys Met Asp Pro
145 150 155 160
Asp Gly Cys Phe Tyr Ile Ser Met Ile Ala His Thr Gln Thr Ala Val
165 170 175
Ala Leu Pro Leu Lys Pro Asp Gly Ala Leu Val Asn Ile Glu Thr Asp
180 185 190
Val Asn Gly Lys Leu Val Glu Lys Gln Val Ala Gln Tyr Leu Asn Ala
195 200 205
Gln Leu Glu Gly Glu Ser Ser Pro Leu Gln Arg Val Leu Glu Arg Ile
210 215 220
Ile Glu Ser Lys Leu Ala Ser Ile Ser Asn Lys
225 230 235
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LAENGE: 6317 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsaeure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKUELS: DNS (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iii) ANTISENSE: NEIN
(vi) URSPRUENLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Ashbya gossypii
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(B) CLON: 5
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLUESSEL: CDS
(B) LAGE: 2306..2944
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLUESSEL: CDS
(B) LAGE: 3575..4282
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLUESSEL: CDS
(B) LAGE: 4717..5235
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
ACTAGTGGAT CCCCCGGGCT GCAGGAATTC GATATCAAGC TTGTCTCAAA ATCTCTGATG 60
TTACATTGCA CAAGATAAAA ATATATCATC ATGAACAATA AAACTGTCTG CTTACATAAA 120
CAGTAATACA AGGGGTGTTA TGAGCCATAT TCAACGGGAA ACGTCTTGCT CGAAGCTTGC 180
CTCGTCCCGC CGGGTCACCC GGCCAGCGAC ATGGAGGCCC AGAATACCCT CCTTGACAGT 240
CTTGACGTGC GCAGCTCAGG GGCATGATGT GACTGTCGCC CGTACATTTA GCCCATACAT 300
CCCCATGTAT AATCATTTGC ATCCATACAT TTTGATGGCC GCACGGCGCG AACGAAAAAT 360
TACGGCTCCT CGCTGCAGAC CTGCGAGCAG GGAAACGCTC CCCTCACAGA CGCGTTGAAT 420
TCTCCCCACG GCGCGCCCCT GTAGAGAAAT ATAAAAGGTT AGGATTTGCC ACTGAGGTTC 480
TTCTTTCATA TACTTCCTTT TAAAATCTTG CTAGGATACA GTTCTCACAT CACATCCGAA 540
CATAAACAAA AATGGGTAAG GAAAAGACTC ACGTTTCGAG GCCGCGATTA AATTCCAACA 600
TGGATGCTGA TTTATATGGG TATAAATGGG CTCGCGATAA TGTCGGGCAA TCAGGTGCGA 660
CAATCTATCG ATTGTATGGG AAGCCCGATG CGCCAGAGTT GTTTCTGAAA CATGGCAAAG 720
GTAGCGTTGC CAATGATGTT ACAGATGAGA TGGTCAGACT AAACTGGCTG ACGGAATTTA 780
TGCCTCTTCC GACCATCAAG CATTTTATCC GTACTCCTGA TGATGCATGG TTACTCACCA 840
CTGCGATCCC CGGGAAAACA GCATTCCAGG TATTAGAAGA ATATCCTGAT TCAGGTGAAA 900
ATATTGTTGA TGCGCTGGCA GTGTTCCTGC GCCGGTTGCA TTCGATTCCT GTTTGTAATT 960
GTCCTTTTAA CAGCGATCGC GTATTTCGTC TCGCTCAGGC GCAATCACGA ATGAATAACG 1020
GTTTGGTTGA TGCGAGTGAT TTTGATGACG AGCGTAATGG CTGGCCTGTT GAACAAGTCT 1080
GGAAAGAAAT GCATAAGCTT TTGCCATTCT CACCGGATTC AGTCGTCACT CATGGTGATT 1140
TCTCACTTGA TAACCTTATT TTTGACGAGG GGAAATTAAT AGGTTGTATT GATGTTGGAC 1200
GAGTCGGAAT CGCAGACCGA TACCAGGATC TTGCCATCCT ATGGAACTGC CTCGGTGAGT 1260
TTTCTCCTTC ATTACAGAAA CGGCTTTTTC AAAAATATGG TATTGATAAT CCTGATATGA 1320
ATAAATTGCA GTTTCATTTG ATGCTCGATG AGTTTTTCTA ATCAGAATTG GTTAATTGGT 1380
TGTAACACTG GCAGAGCATT ACGCTGACTT GACGGGACGG CGGCTTTGTT GAATAAATCG 1440
AACTTTTGCT GAGTTGAAGG ATCAGATCAC GCATCTTCCC GACAACGCAG ACCGTTCCGT 1500
GGCAAAGCAA AAGTTCAAAA TCACCAACTG GTCCACCTAC AACAAAGCTC TCATCAACCG 1560
TGGCTCCCTC ACTTTCTGGC TGGATGATGG GGCGATTCAG GCCTGGTATG AGTCAGCAAC 1620
ACCTTCTTCA CGAGGCAGAC CTCAGCGCTA TTCTGACCTT GCCATCACGA CTGTGCTGGT 1680
CATTAAACGC GTATTCAGGC TGACCCTGCG CGCTGCGCAG GGCTTTATTG ATTCCATTTT 1740
TACACTGATG AATGTTCCGT TGCGCTGCCC GGATTACAGC TGTAATTGAC AAGCCAGACA 1800
GAACAAAGGG ACTTGGCACT TGTAACAGAA ATTCCAAGTA AATAAGGGGA GTTATTCAAG 1860
AACGCCATTG CTACATTGGG TCACGATGTT CGAGCCGGAA TTCGCATTAT CCATTGAACA 1920
CAGCCGCCAA CATAACCGGA AAACTCACAC TTGATTGCAA AGGAACAGCA CATCCCAAGT 1980
CACTAGAAGA TCCCTTCTTG CACGGTCGTT TCTGAAACTC TACGATTAAT GGAACAATGA 2040
GTAAGTCCTC AAATGTACCA CCTATCTGTA GTTTACTATC GGATTTACTG GCTAAGAGCT 2100
GACCTGTTAG GCAAGTGAAA CATATCACAT CGCCAGCAGG TTGGGCTACC AAGGATAGTT 2160
GATGACTTCC ATCACCTATA AAAGCGGCTT GAGTGCTTTT GCAATGATTC TGTTCACATG 2220
ATGGACAAGA AATACGTACA AAAATTTCAA CGTTTTACAA GTTCCCAAGC TTAGTCAACT 2280
CATCACCAAC GACAAACCAA GCAAC ATG ACA AGC CCA TGC ACT GAT ATC GGT 2332
Met Thr Ser Pro Cys Thr Asp Ile Gly
1 5
ACC GCT ATA GAG CAG TTC AAG CAA AAT AAG ATG ATC ATC GTC ATG GAC 2380
Thr Ala Ile Glu Gln Phe Lys Gln Asn Lys Met Ile Ile Val Met Asp
10 15 20 25
CAC ATC TCG AGA GAA AAC GAG GCC GAT CTA ATA TGT GCA GCA GCG CAC 2428
His Ile Ser Arg Glu Asn Glu Ala Asp Leu Ile Cys Ala Ala Ala His
30 35 40
ATG ACT GCC GAG CAA ATG GCA TTT ATG ATT CGG TAT TCC TCG GGC TAC 2476
Met Thr Ala Glu Gln Met Ala Phe Met Ile Arg Tyr Ser Ser Gly Tyr
45 50 55
GTT TGC GCT CCA ATG ACC AAT GCG ATT GCC GAT AAG CTA GAC CTA CCG 2524
Val Cys Ala Pro Met Thr Asn Ala Ile Ala Asp Lys Leu Asp Leu Pro
60 65 70
CTC ATG AAC ACA TTG AAA TGC AAG GCT TTC TCC GAT GAC AGA CAC AGC 2572
Leu Met Asn Thr Leu Lys Cys Lys Ala Phe Ser Asp Asp Arg His Ser
75 80 85
ACT GCG TAT ACA ATC ACC TGT GAC TAT GCG CAC GGG ACG ACG ACA GGT 2620
Thr Ala Tyr Thr Ile Thr Cys Asp Tyr Ala His Gly Thr Thr Thr Gly
90 95 100 105
ATC TCC GCA CGT GAC CGG GCG TTG ACC TGT AAT CAG TTG GCG AAC CCG 2668
Ile Ser Ala Arg Asp Arg Ala Leu Thr Cys Asn Gln Leu Ala Asn Pro
110 115 120
GAG TCC AAG GCT ACC GAC TTC ACG AAG CCA GGC CAC ATT GTG CCA TTG 2716
Glu Ser Lys Ala Thr Asp Phe Thr Lys Pro Gly His Ile Val Pro Leu
125 130 135
CGT GCC CGT GAC GGC GGC GTG CTC GAG CGT GAC GGG CAC ACC GAA GCG 2764
Arg Ala Arg Asp Gly Gly Val Leu Glu Arg Asp Gly His Thr Glu Ala
140 145 150
GCG CTC GAC TTG TGC AGA CTA GCG GGT GTG CCA GAG GTC GCT GCT ATT 2812
Ala Leu Asp Leu Cys Arg Leu Ala Gly Val Pro Glu Val Ala Ala Ile
155 160 165
TGT GAA TTA GTA AGC GAA AGG GAC GTC GGG CTG ATG ATG ACT TTG GAT 2860
Cys Glu Leu Val Ser Glu Arg Asp Val Gly Leu Met Met Thr Leu Asp
170 175 180 185
GAG TGT ATA GAA TTC AGC AAG AAG CAC GGT CTT GCC CTC ATC ACC GTC 2908
Glu Cys Ile Glu Phe Ser Lys Lys His Gly Leu Ala Leu Ile Thr Val
190 195 200
GAT GAC CTG AAG GCT GCA GTT GCC GCC AAG CAG TAGACGGCAA CGAGTTCTTT 2961
Asp Asp Leu Lys Ala Ala Val Ala Ala Lys Gln
205 210
AAGTCGGTGT TCATTTATGT AATATACCAT TTCGTCGAAA AAGTCAAATG GTATGAACTA 3021
GATTTATCAA TAGTATCTAA GAGTTATGGT ATTCGCAAAA GCTTATCGAT ACCGTCGACA 3081
TGGCGCGGGC GAATACCAAC CCACAGGAGC CAGATATAAG ACCAATCCCG GCGGGTGTGC 3141
CAGCCGCCAT CAGAGACAGC GGGCCAGCAA GGCATGTGAA GTCAAAAGGC GCCAGCTCCT 3201
TATCCGCTCC CGCACAAGCA GGACCGGCAT ATCCCGATGA GCGCGCCAGC ACCCAGACGC 3261
TACACCACCA TTCGAAGTAG ACTTTAAAAG AGCGCTTTCC AGCTTCTCAG GCAGTTAGCT 3321
CTACGACAAA GGAACCAAGT GATTTTCCCG ATAGACGCGA CTTGCTCAAC GATGTTTCTG 3381
TGACCAGCGC AAGGAGAGAT AGTCCTAAAG TATAATCAGA TAGTTAGTCG TATCTTCTAG 3441
TTTTATTAGT CAGCTACATG GCGAACCGCC ATTTCCTTAT GCATGTCTTA CGAGTTTAAA 3501
AAGCTCGCGG TAGCAGAAAA GAAGATGCAT AGATGGCATA CCGAAGCCTA TATCGCCCAT 3561
AGAAGTTGAT AGG ATG TTT ACC GGT ATA GTG GAA CAC ATT GGC ACT GTT 3610
Met Phe Thr Gly Ile Val Glu His Ile Gly Thr Val
1 5 10
GCT GAG TAC TTG GAG AAC GAT GCC AGC GAG GCA GGC GGC AAC GGT GTG 3658
Ala Glu Tyr Leu Glu Asn Asp Ala Ser Glu Ala Gly Gly Asn Gly Val
15 20 25
TCA GTC CTT ATC AAG GAT GCG GCT CCG ATA CTG GCG GAT TGC CAC ATC 3706
Ser Val Leu Ile Lys Asp Ala Ala Pro Ile Leu Ala Asp Cys His Ile
30 35 40
GGT GAC TCG ATT GCA TGC AAT GGT ATC TGC CTG ACG GTG ACG GAG TTC 3754
Gly Asp Ser Ile Ala Cys Asn Gly Ile Cys Leu Thr Val Thr Glu Phe
45 50 55 60
ACG GCC GAT AGC TTC AAG GTC GGG ATC GCA CCA GAA ACA GTT TAT CGG 3802
Thr Ala Asp Ser Phe Lys Val Gly Ile Ala Pro Glu Thr Val Tyr Arg
65 70 75
ACG GAA GTC AGC AGC TGG AAA GCT GGC TCC AAG ATC AAC CTA GAA AGG 3850
Thr Glu Val Ser Ser Trp Lys Ala Gly Ser Lys Ile Asn Leu Glu Arg
80 85 90
GCC ATC TCG GAC GAC AGG CGC TAC GGC GGG CAC TAC GTG CAG GGC CAC 3898
Ala Ile Ser Asp Asp Arg Arg Tyr Gly Gly His Tyr Val Gln Gly His
95 100 105
GTC GAC TCG GTG GCC TCT ATT GTA TCC AGA GAG CAC GAC GGG AAC TCT 3946
Val Asp Ser Val Ala Ser Ile Val Ser Arg Glu His Asp Gly Asn Ser
110 115 120
ATC AAC TTT AAG TTT AAA CTG CGC GAT CAA GAG TAC GAG AAG TAC GTA 3994
Ile Asn Phe Lys Phe Lys Leu Arg Asp Gln Glu Tyr Glu Lys Tyr Val
125 130 135 140
GTA GAA AAG GGT TTT GTG GCG ATC GAC GGT GTG TCG CTG ACT GTA AGC 4042
Val Glu Lys Gly Phe Val Ala Ile Asp Gly Val Ser Leu Thr Val Ser
145 150 155
AAG ATG GAT CCA GAT GGC TGT TTC TAC ATC TCG ATG ATT GCA CAC ACG 4090
Lys Met Asp Pro Asp Gly Cys Phe Tyr Ile Ser Met Ile Ala His Thr
160 165 170
CAG ACC GCT GTA GCC CTT CCA CTG AAG CCG GAC GGT GCC CTC GTG AAC 4138
Gln Thr Ala Val Ala Leu Pro Leu Lys Pro Asp Gly Ala Leu Val Asn
175 180 185
ATA GAA ACG GAT GTT AAC GGC AAG CTA GTA GAG AAG CAG GTT GCA CAG 4186
Ile Glu Thr Asp Val Asn Gly Lys Leu Val Glu Lys Gln Val Ala Gln
190 195 200
TAC CTG AAT GCG CAG CTG GAA GGT GAG AGC TCG CCA TTG CAG CGC GTG 4234
Tyr Leu Asn Ala Gln Leu Glu Gly Glu Ser Ser Pro Leu Gln Arg Val
205 210 215 220
CTC GAA AGG ATT ATT GAA TCC AAG CTT GCT AGC ATC TCA AAT AAG TGATTAGAAG 4289
Leu Glu Arg Ile Ile Glu Ser Lys Leu Ala Ser Ile Ser Asn Lys
225 230 235
GACAAGCTGC AAGATAAGAA GCCCCCCGTT AACTTAGTGT AGGCAACCTT AGCCTTAGAT 4349
TATCCGCTAA CGTCATTCTG TATTTTACTC ATATTATATG TAATATAGGG GGGTTATCCG 4409
AGATACTAGA CTACTAGCGT ACTAGAGGAT TATACATGGT ATAATGATAC AGGAAGTGAA 4469
AATCCGAAAG GTTCAGACGA TGAAAAGAGT TTGAGACGCA TCAATGATCA GCTTTGAGCT 4529
ATATGTAAGT CTATTAATTG ATTACTAATA GCAATTTATG GTATCCTCTG TTCTGCATAT 4589
CGACGGTTAC TCACGTGATG ATCAGCTTGA GGCTTCGCGG ATAAAGTTCC ATCGATTACT 4649
ATAAAACCAT CACATTAAAC GTTCACTATA GGCATACACA CAGACTAAGT TCAAGTTAGC 4709
AGTGACA ATG ATT AAG GGA TTA GGC GAA GTT GAT CAA ACC TAC GAT GCG 4758
Met Ile Lys Gly Leu Gly Glu Val Asp Gln Thr Tyr Asp Ala
1 5 10
AGC TCT GTC AAG GTT GGC ATT GTC CAC GCG AGA TGG AAC AAG ACT GTC 4806
Ser Ser Val Lys Val Gly Ile Val His Ala Arg Trp Asn Lys Thr Val
15 20 25 30
ATT GAC GCT CTC GTC CAA GGT GCA ATT GAG AAA CTG CTT GCT ATG GGA 4854
Ile Asp Ala Leu Val Gln Gly Ala Ile Glu Lys Leu Leu Ala Met Gly
35 40 45
GTG AAG GAG AAG AAT ATC ACT GTA AGC ACC GTT CCA GGT GCG TTT GAA 4902
Val Lys Glu Lys Asn Ile Thr Val Ser Thr Val Pro Gly Ala Phe Glu
50 55 60
CTA CCA TTT GGC ACT CAG CGG TTT GCC GAG CTG ACC AAG GCA AGT GGC 4950
Leu Pro Phe Gly Thr Gln Arg Phe Ala Glu Leu Thr Lys Ala Ser Gly
65 70 75
AAG CAT TTG GAC GTG GTC ATC CCA ATT GGA GTC CTG ATC AAA GGC GAC 4998
Lys His Leu Asp Val Val Ile Pro Ile Gly Val Leu Ile Lys Gly Asp
80 85 90
TCA ATG CAC TTT GAA TAT ATA TCA GAC TCT GTG ACT CAT GCC TTA ATG 5046
Ser Met His Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ser Val Thr His Ala Leu Met
95 100 105 110
AAC CTA CAG AAG AAG ATT CGT CTT CCT GTC ATT TTT GGT TTG CTA ACG 5094
Asn Leu Gln Lys Lys Ile Arg Leu Pro Val Ile Phe Gly Leu Leu Thr
115 120 125
TGT CTA ACA GAG GAA CAA GCG TTG ACA CGT GCA GGC CTC GGT GAA TCT 5142
Cys Leu Thr Glu Glu Gln Ala Leu Thr Arg Ala Gly Leu Gly Glu Ser
130 135 140
GAA GGC AAG CAC AAC CAC GGT GAA GAC TGG GGT GCT GCT GCC GTG GAG 5190
Glu Gly Lys His Asn His Gly Glu Asp Trp Gly Ala Ala Ala Val Glu
145 150 155
ATG GCT GTA AAG TTT GGC CCA CGC GCC GAA CAA ATG AAG AAG TGAATATTAA 5242
Met Ala Val Lys Phe Gly Pro Arg Ala Glu Gln Met Lys Lys
160 165 170
AAAATCACTA CTTAAAATTA ACGTTTTTAT TATGTCTATA TCAAATTCTT ACGTGATAAC 5302
TTTTGATTTC GCTTCCTGGA TTGGCGCAAG GCCTCCCTGT GTCGCAGTTT TTGTTCACGG 5362
GTCCACACAG CTCTGTTTTC CCAGAACATA TCCTCCCAGC TAGCATCTCA AATAAGTGAT 5422
TATATTATCT TGGGTGCTGT ATATGTTATG TATGTCTTAC GACTGTGAAT CAGAGGGGTG 5482
GCAGCTGGAA CACCAGCGAC ACACCTTCGT CTCCCGCGGT GATCAGCCTT CTGTTTTCCT 5542
CAAGTAGTAC AAAGTCTAGG ACACCCATGT TGTGGCCAAC GCAAACATGG AGCTGCTGCC 5602
CGTTACGCAC GTCGAACTCG TAGACCTTGC CGTCAATGCA CGAGGCGAAC AGGTGGAAAC 5662
CGGTGGTCTT GTCAAACGCC AGCTTCGTGA CCGAGTCCGG CAGCACGAAC TTGTGTCTGA 5722
CCTTCAACGT CACAGTGTCG TACAGCAGAA TGTCGCCCGA AACCAGGCCC ACGACCATGA 5782
AGTTCATCCG AGACGAGAAT GCAATTGACT CTATCGAGGC GTCCATCTCC TCCTGGTCCT 5842
CCTTGAGTTC GATCGTCTGC GTCAGGTGCG ACACTGCACC CTGCGCCGCG TTGATCACCG 5902
CCAGCAGCCC GCTGTTCGAG CCGCACGCCA CGATGGGCGA ACCGCGGTTG ATCCCCAGCG 5962
GGAGCGTGCT CAACGTTATC CACTGCGCCT CCTGGCCCTT GAGTTCAGAC GGCGTCACCT 6022
TGAATACCTG TTGCCCGCTG TAGCAGTTCC AGCCAATTAT GGTCCCATCG AGGGAGCACG 6082
TCACCAGTAT GACGTTTTCG TCGTCTGCCG CAGTCTCCAG GAACACACCC ATCGTACAGT 6142
CCTGGGCGTG GGCCACCCCC GTCATCAGCA GCACAGGCGT GTTGTTCTGC GTGTCCATCT 6202
CGTAGCACCA CACCGACCCG TCCACAGCGC CAATCGCAAA AATCCCAGCT CTGTGCGGGT 6262
GCACCTTCAG CCAGGTCACC TCGTCCACCT CCTGCAGCCC GGGGGATCCA CTAGT 6317
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 8:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LAENGE: 212 Aminosaeuren
(B) ART: Aminosaeure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKUELS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
Met Thr Ser Pro Cys Thr Asp Ile Gly Thr Ala Ile Glu Gln Phe Lys
1 5 10 15
Gln Asn Lys Met Ile Ile Val Met Asp His Ile Ser Arg Glu Asn Glu
20 25 30
Ala Asp Leu Ile Cys Ala Ala Ala His Met Thr Ala Glu Gln Met Ala
35 40 45
Phe Met Ile Arg Tyr Ser Ser Gly Tyr Val Cys Ala Pro Met Thr Asn
50 55 60
Ala Ile Ala Asp Lys Leu Asp Leu Pro Leu Met Asn Thr Leu Lys Cys
65 70 75 80
Lys Ala Phe Ser Asp Asp Arg His Ser Thr Ala Tyr Thr Ile Thr Cys
85 90 95
Asp Tyr Ala His Gly Thr Thr Thr Gly Ile Ser Ala Arg Asp Arg Ala
100 105 110
Leu Thr Cys Asn Gln Leu Ala Asn Pro Glu Ser Lys Ala Thr Asp Phe
115 120 125
Thr Lys Pro Gly His Ile Val Pro Leu Arg Ala Arg Asp Gly Gly Val
130 135 140
Leu Glu Arg Asp Gly His Thr Glu Ala Ala Leu Asp Leu Cys Arg Leu
145 150 155 160
Ala Gly Val Pro Glu Val Ala Ala Ile Cys Glu Leu Val Ser Glu Arg
165 170 175
Asp Val Gly Leu Met Met Thr Leu Asp Glu Cys Ile Glu Phe Ser Lys
180 185 190
Lys His Gly Leu Ala Leu Ile Thr Val Asp Asp Leu Lys Ala Ala Val
195 200 205
Ala Ala Lys Gln
210
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 9:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LAENGE: 235 Aminosaeuren
(B) ART: Aminosaeure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKUELS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
Met Phe Thr Gly Ile Val Glu His Ile Gly Thr Val Ala Glu Tyr Leu
1 5 10 15
Glu Asn Asp Ala Ser Glu Ala Gly Gly Asn Gly Val Ser Val Leu Ile
20 25 30
Lys Asp Ala Ala Pro Ile Leu Ala Asp Cys His Ile Gly Asp Ser Ile
35 40 45
Ala Cys Asn Gly Ile Cys Leu Thr Val Thr Glu Phe Thr Ala Asp Ser
50 55 60
Phe Lys Val Gly Ile Ala Pro Glu Thr Val Tyr Arg Thr Glu Val Ser
65 70 75 80
Ser Trp Lys Ala Gly Ser Lys Ile Asn Leu Glu Arg Ala Ile Ser Asp
85 90 95
Asp Arg Arg Tyr Gly Gly His Tyr Val Gln Gly His Val Asp Ser Val
100 105 110
Ala Ser Ile Val Ser Arg Glu His Asp Gly Asn Ser Ile Asn Phe Lys
115 120 125
Phe Lys Leu Arg Asp Gln Glu Tyr Glu Lys Tyr Val Val Glu Lys Gly
130 135 140
Phe Val Ala Ile Asp Gly Val Ser Leu Thr Val Ser Lys Met Asp Pro
145 150 155 160
Asp Gly Cys Phe Tyr Ile Ser Met Ile Ala His Thr Gln Thr Ala Val
165 170 175
Ala Leu Pro Leu Lys Pro Asp Gly Ala Leu Val Asn Ile Glu Thr Asp
180 185 190
Val Asn Gly Lys Leu Val Glu Lys Gln Val Ala Gln Tyr Leu Asn Ala
195 200 205
Gln Leu Glu Gly Glu Ser Ser Pro Leu Gln Arg Val Leu Glu Arg Ile
210 215 220
Ile Glu Ser Lys Leu Ala Ser Ile Ser Asn Lys
225 230 235
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 10:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LAENGE: 172 Aminosaeuren
(B) ART: Aminosaeure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKUELS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
Met Ile Lys Gly Leu Gly Glu Val Asp Gln Thr Tyr Asp Ala Ser Ser
1 5 10 15
Val Lys Val Gly Ile Val His Ala Arg Trp Asn Lys Thr Val Ile Asp
20 25 30
Ala Leu Val Gln Gly Ala Ile Glu Lys Leu Leu Ala Met Gly Val Lys
35 40 45
Glu Lys Asn Ile Thr Val Ser Thr Val Pro Gly Ala Phe Glu Leu Pro
50 55 60
Phe Gly Thr Gln Arg Phe Ala Glu Leu Thr Lys Ala Ser Gly Lys His
65 70 75 80
Leu Asp Val Val Ile Pro Ile Gly Val Leu Ile Lys Gly Asp Ser Met
85 90 95
His Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ser Val Thr His Ala Leu Met Asn Leu
100 105 110
Gln Lys Lys Ile Arg Leu Pro Val Ile Phe Gly Leu Leu Thr Cys Leu
115 120 125
Thr Glu Glu Gln Ala Leu Thr Arg Ala Gly Leu Gly Glu Ser Glu Gly
130 135 140
Lys His Asn His Gly Glu Asp Trp Gly Ala Ala Ala Val Glu Met Ala
145 150 155 160
Val Lys Phe Gly Pro Arg Ala Glu Gln Met Lys Lys
165 170
리보플라빈으로도 불리우는 비타민 B2는 모든 식물 및 수많은 미생물에 의해 생성된다. 인간 및 동물이 비타민 B2를 합성할 수 없기 때문에 비타민 B2는 인간 및 동물에게 필수적이다. 리보플라빈은 대사에서 중요한 역할을 한다. 그러므로, 예를 들면, 이는 탄수화물의 이용에 관여된다. 비타민 B2 결핍은 구강 및 인후의 점막 염증, 피하 지방 후에서의 소양증 및 염증 및 유사한 피부 병변, 연결막의 염증, 시력 저하 및 각막 혼탁에 관련되어 있다. 유아 및 아동에게서는 성장 중단 및 체중 감소가 일어날 수 있다. 그러므로 비타민 B2는 예를 들면, 비타민 결핍증을 위한 비타민 제품 및 동물 사료 첨가제로서 커다란 경제적 중요성을 갖는다. 다양한 식료품류에 첨가된다. 비타민 B2는 또한 예를 들면, 마요네즈, 아이스 크림, 블라망쥬에 식용 색소로서 사용된다.
비타민 B2는 화학적 또는 미생물학적으로 생산된다 (참조, 예를 들면, 커어스 등, 1996, 리보플라빈: Ullmann's Encyclopedia of industrial chemistry, VCH Weinheim). 화학적 생산 방법에서, 리보플라빈은 통상 다단계 방법에서 순수한 최종 생성물로서 얻어지고, 예를 들면, D-리보스와 같은 비교적 비싼 출발 물질을 사용하는 것이 필요하다.
리보플라빈의 화학적 합성에 대한 대안은 미생물의 발효에 의해 비타민 B2를 생성하는 것이다. 이 경우에서 출발 물질은 당 또는 식물유와 같은 재생 가능한 원료 물질이다. 에레모테시움 아시바이 (Eremothecium ashbyii) 또는 아시비아 고씨피 (Ashbya gossypii)와 같은 진균의 발효에 의한 리보플라빈의 생산이 알려져 있으나 (머크 인덱스, 윈드홀즈 등 편집, Merck ＆ Co., 페이지 1183, 1983), 예를 들면, 칸디다 (Candida), 피치아 (Pichia)및 사카로마이세스 (Saccharomyces)와 같은 효모 또는 예를 들면, 바실러스 (Bacillus), 클로스트리디아 (Clostridia) 또는 코리네박테리아 (Corynebacteria)와 같은 박테리아 역시 리보플라빈 생산자로서 기술되었다. EP-A-0 405 370 및 EP-A-0 821 063은 재조합 박테리아 균주를 사용하여 리보플라빈을 생산하는 것을 기술하고 있는데, 이 균주는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)를 리보플라빈 생합성 유전자로 형질 전환시켜 얻어졌다.
특허 WO 95/26406 또는 WO 93/03183 및 DE 44 20 785는 진핵 생물 아시비아 고씨피 (Ashbya Gossypii) 및 사카로마이세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae)로부터 리보플라빈 생합성에 특이적인 유전자 클로닝, 및 이들 유전자로 형질 전환된 미생물, 및 리보플라빈 합성을 위한 이러한 미생물의 용도를 기술한다.
상기 두 가지 생물 모두에서, 6개의 효소가 구아노신 트리포스페이트 (GTP) 및 리불로스 5-포스페이트로 출발하는 리보플라빈 형성을 촉매한다. 이는 GTP 사이클로히드롤라제-II (rib1 유전자 생성물)에 의해 GTP를 2,5-디아미노-6-(리보실아미노)-4(3H)-피리미디논 5-포스페이트로 변환시키는 것을 포함한다. 이 생성물은 이후 2,5-디아미노-6-(리보실아미노)-4(3H)-피리미디논 5-포스페이트 환원 효소 (rib7 유전자 생성물)에 의해 2,5-디아미노-6-리비틸아미노-2,4-(1H,3H)-피리미딘 5-포스페이트로 환원되고 이후 특이적인 탈아미노화 효소 (rib2 유전자 생성물)에 의해 5-아미노-6-리비틸아미노-2,4-(1H,3H)-피리미딘디온 5-포스페이트로 탈아미노화된다. 이 포스페이트는 이후 비특이적인 탈인산 가수분해 효소에 의해 제거된다.
리보플라빈 생합성의 마지막 효소 단계에서 GTP 외에 다른 출발 물질인 리불로스 5-포스페이트는, 3,4-디히드록시-2-부타논-4-포스페이트 신타아제 (rib3 유전자 생성물)에 의해 3,4-디히드록시-2-부타논 4-포스페이트 (DBP)로 변환된다.
DBP와 5-아미노-6-리비틸아미노-2,4(1H,3H)-피리미딘디온은 모두 6,7-디메틸-8-리비틸루마진의 효소적 합성을 위한 전구체이다. 이 반응은 rib4 유전자 생성물 (DMRL 신타아제)에 의해 촉매된다. DMRL은 이후 리보플라빈 신타아제 (rib5 유전자 생성물)에 의해 리보플라빈으로 변환된다 (바쳐 등 (1993), Bioorg. Chem. Front. Vol. 3, Springer Verlag).
리보플라빈 생산 방법의 이러한 발전에도 불구하고, 여전히 증가하는 수요를 충족시키고 더욱 효율적인 리보플라빈 생성을 위해 비타민 B2 생산성을 개선시키고 증가시킬 필요가 있다.
본 발명은 리보플라빈을 생산하는 유전적 방법에 관한 것이다. 생물, 구체적으로 박테리아, 진균, 효모 및 식물에서 리보플라빈 생합성 유전자 또는 그의 조합의 특정한 선택, 및 이의 발현은 이들 생물에서의 리보플라빈 생산 증가를 유도한다.
본 발명은 추가로 서열 번호 1, 서열 번호 3 또는 서열 번호 5의 서열을 갖는 유전자 또는 이들의 기능적 균등물을 포함하는 핵산 단편, 이 핵산 단편을 포함하는 발현 벡터 및 1개 이상의 핵산 단편 또는 1개 이상의 벡터를 포함하는 생물에 관한 것이다.
비타민 B2 생산성을 더욱 개선시키는 것이 본 발명의 목적이다.
본 발명자들은 이러한 목적이 리보플라빈을 합성할 수 있는 생물을 사용하는 리보플라빈의 생산 증가 방법으로서 그 생물체 내의 효소 3,4-디히드록시-2-부타논-4-포스페이트 신타아제, 디메틸-8-리비틸루마진 신타아제 및 리보플라빈 신타아제 또는 이들의 기능적 유사체의 활성을 증가시키는 것인 방법에 의해 성취됨을 알았다. 리보플라빈의 생산 증가 방법은 리보플라빈을 합성할 수 있고 추가적으로 효소 3,4-디히드록시-2-부타논-4-포스페이트 신타아제 (rib3 유전자 생성물), 디메틸-8-리비틸루마진 신타아제 (rib4 유전자 생성물) 및 리보플라빈 신타아제 (rib5 유전자 생성물) 또는 이들의 기능적 유사효소를 코딩하는 유전자의 조합을 포함하는 생물로 편리하게 수행된다.
천연 효소 활성을 증가시키는 것과 상기 언급된 유전자 조합을 도입시켜 유전자 발현을 증가시키는 것의 조합도 비타민 B2 생산성을 증가시키는 데 유익하다.
본 발명에 따른 방법에 적합한 생물 또는 숙주 생물은 원칙적으로는 리보플라빈을 합성할 수 있는 모든 생물이다. 천연적으로 리보플라빈을 합성할 수 있는 생물이 바람직하다. 그러나, 완전한 비타민 B2 합성 유전자를 도입하면 그로 인해 리보플라빈을 합성할 수 있는 생물 역시 본 발명에 따른 방법에 적합하다. 박테리아, 효모, 진균 또는 식물과 같은 생물은 본 발명에 따른 방법에 적합하다. 언급될 수 있는 예는 아시비아 (Ashbya) 또는 에레모테시움 (Eremothecium)과 같은 진균 {이는 문헌 (Indian Chem. engr. Section B, 제37권, 제1,2호 1995), 페이지 15, 표 6)에 기술됨}, 칸디다, 사카로마이세스 또는 피치아와 같은 효모 또는 아라비돕시스 (arabidopsis), 토마토, 감자, 옥수수, 대두, 종유 유채, 보리, 밀, 호밀, 쌀, 기장, 목화, 사탕 무우, 해바라기, 아마, 삼, 카놀라, 귀리, 담배, 알팔파, 상치 또는 다양한 나무, 너트 및 덩굴종과 같은 식물과 같은 진핵 생물 또는 코리네박테리움, 브레비박테리움, 바실러스, 클로스트리디움, 시아노박터, 에쉐리키아 또는 클렙시엘라와 같은 그램-양성 또는 그램-음성 박테리아과 같은 원핵 생물이다. 바람직한 생물은 코리네박테리움속, 브레비박테리움속, 바실러스속, 에쉐리키아속, 아시비아속, 에레보테시움속, 칸디다속 또는 사카로마이세스속 또는 옥수수, 대두, 종유 유채, 보리, 밀, 감자 또는 토마토와 같은 식물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특히 바람직한 생물은 속 및 종이 아시비아 고씨피, 에레모테시움 아시비, 사카로마이세스 세레비시애, 칸디다 플라베리, 칸디다 파마타, 코리네박테리움 아모니아제네스 또는 바실러스 서브틸리스인 생물이다. 특히 바람직한 식물은 옥수수, 종유 유채, 보리, 밀, 감자 및 토마토이다.
본 발명에 따른 rib 유전자 rib3, rib4 및 rib5의 조합 및/또는 이들 유전자 및 이들의 유전자 생성물의 활성 증가는 현저하게 증가된 리보플라빈 생산성을 유도한다. 상기 유전자들은 원칙적으로 당업자에게 공지된 모든 방법에 의해 사용되는 생물로 도입될 수 있고, 이들은 소위 입자총을 사용하는 형질 전환, 트랜스펙션, 일렉트로포레이션에 의해 또는 마이크로인젝션에 의해 그 생물 또는 세포로 편리하게 도입된다. 당업자들은 미생물에 적합한 방법을 교과서 [샘브룩, 제이. 등, 1989, Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 에프. 엠. 아수벨 등, 1994, Current protocols in Molecular biology, John Wiley and Sons; 디. 엠. 그로버 등, DNA Cloning, 제1권, 1995, IRL Press (ISBN 019-963476-9); 카이저 등, 1994, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press 또는 구트리 등, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in enzymology, 1994, Academic Press]에서 찾을 수 있다. 언급될 수 있는 편리한 방법의 예는 예를 들면 Ura-3 유전자, 특히 독일 특허 출원 DE 19801120.2에 기술된 아시비아 Ura-3 유전자를 이용한 동형 또는 이형 재조합 및/또는 하기 기술된 REMI 방법 (restriction enzyme-mediated integration)에 의해 DNA를 도입하는 것이다.
REMI 기술은 양 말단이 동일한 제한 핵산 중간 분해효소로 잘려진 선형 DNA 구조물을 이 DNA 구조물의 절단에 사용된 제한 핵산 중간 분해효소와 함께 한 생물로 동시 형질 전환시키는 것에 바탕을 둔다. 이 제한 핵산 중간 분해효소는 이후 DNA 구조물이 이 제한 효소와 함께 도입된 생물의 게놈 DNA를 절단한다. 이는 세포 자체의 복구 기전 활성화를 유도한다. 이들 복구 기전은 게놈 DNA에서 핵산 중간 분해효소에 의해 일어난 스트랜드 절단을 복구하고, 여기에는 공형질 전환된 DNA 구조물이 일정 빈도로 게놈으로 혼입되는 것도 수반된다. 제한 절단 부위가 DNA의 양 말단에 보유되는 것이 보통의 경우이다.
이 기술은 진균의 삽입 돌연변이에 대해 문헌 [뵐커 등, Mol Gen Genet, 248, 1995: 547-552]에 기술되었다. 쉬에스틀 및 페트스 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 1991: 7585-7589)는 이형 재조합이 사카로마이세스에서 일어나는지 아닌지를 알아내기 위해 이 방법을 사용하였다. 이 방법은 유도할 수 있는 리포터 유전자의 안정한 형질 전환 및 조절된 발현과 관련하여 문헌 [Mol. Gen. Genet. 2511, 1996: 75-80]에 기술되었다. 이 시스템은 오늘날까지 대사 경로를 최적화하거나 단백질의 상업적 과잉 발현을 위한 유전 공학적 수단으로서 사용되지 않았다.
생합성 유전자가 상기 언급된 생물의 게놈으로 REMI 방법에 의해 합쳐질 수 있다는 것은 리보플라빈 합성예에 의해 보여졌고, 그래서 1차 또는 2차 대사 특히, 생합성 경로, 예를 들면 리신, 메치오닌, 트레오닌 또는 트립토판과 같은 아미노산, 비타민 A, B2, B6, B12, C, D, E 또는 F, S-아데노실메티오닌, 비오틴, 판토텐산 또는 엽산과 같은 비타민, β-카로텐, 리코펜, 칸타크산틴, 아스타크산틴 또는 제아크산틴과 같은 카르테노이드 또는 리파제, 에스테라제, 아미다제, 니트릴라제, 프로테아제와 같은 가수분해 효소와 같은 단백질, 매개체, 예를 들면 MIF, MAF, TNF와 같은 림포킨과 같은 사이토킨, 인터루킨 1과 같은 인터루킨, γ-인터페론과 같은 인터페론, tPA, 호르몬, 예컨대 프로테오호르몬, 글리코호르몬, 바소프레신, 엔돌핀, 엔도스타틴, 안지오스타틴과 같은 올리고- 또는 폴리펩티드 호르몬, 성장 인자, 에리스로포이에틴, 전사 인자, GPIIb/IIIa 또는 αvβIII와 같은 인테그린, 다양한 글루타메이트 수용체와 같은 수용체, 안지오텐신과 같은 혈관 형성 인자의 생합성 경로의 대사 생성물을 생산하기 위한 생산 방법을 최적화하는 것이 가능하다.
REMI 방법은 또한 본 발명에 따른 핵산 단편 또는 상기 언급된 다른 유전자단편이 게놈의 전사-활성 부위에 위치시키기 위해 사용될 수 있다.
핵산은 편의상 게놈으로 도입되는 DNA 구조물로 1개 이상의 리포터 유전자와 함께 클로닝된다. 이 리포터 유전자는 성장, 형광, 화학- 또는 생체 발광 분석법 또는 광도 측정법에 의해 검출을 용이하게 해야 한다. 언급될 수 있는 리포터 유전자의 예는 항생제-내성 유전자, 가수분해 효소 유전자, 형광 단백질 유전자, 생체 발광 유전자, 글루코스 분해효소, 과산화 효소 또는 리보플라빈 유전자, 루시페라제 유전자와 같은 생합성 유전자, β-갈락토시다제 유전자, gfp 유전자, 리파제 유전자, 에스테라제 유전자, 과산화 효소 유전자, β-락타마제 유전자, 아세틸-, 포스포- 또는 아데닐트랜스페라제 유전자이다. 이들 유전자는 그 전사 활성 및 이로 인한 이들 유전자의 발현을 측정하고 정량화하는 것을 쉽게 가능하게 한다. 그러므로 2배까지 증가한 생산성을 보이는 게놈 부위를 동정하는 것이 가능하다 (도 1 참조). 도 1은 유전자 통합 후 얻어진 클론 ITA-GS-15.2, ITA-GS-17.1 및 ITA-GS-01을 보여주는데 이들은 상이한 비타민 B2 (리보플라빈) 생산성을 나타낸다.
생합성 유전자 자체가 검출을 용이하게 하는 경우에는, 예를 들면, 리보플라빈의 경우에서와 같이, 추가적인 리포터 유전자를 배제하는 것이 가능하다.
다수의 유전자가 생물로 도입될 때, 이들 모두를 1개의 리포터 유전자와 함께 단일 벡터에 넣어서, 또는 각각의 개별 유전자를 1개의 리포터 유전자와 함께 1개의 벡터에 넣어서 생물에 도입하는 것이 가능하고, 다양한 벡터를 동시에 또는 연속적으로 도입하는 것이 가능하다. 특정한 활성을 코딩하는 유전자 단편 또한 REMI 기술에서 사용될 수 있다.
원칙적으로, 모든 공지의 제한 효소는 생물의 게놈에 생합성 유전자를 통합시키기 위한 본 발명에 따른 방법에 적합하다. 제한 절단 부위로서 단지 4개의 염기쌍을 인식하는 제한 효소는 이들이 게놈 또는 통합시킬 벡터를 너무 자주 절단하기 때문에 덜 바람직하다; 바람직한 효소는 가능한 효소 중 단지 소수만을 언급하면, BamHI, EcoRI, BgIII, SphI, SpeI, XbaI, XhoI, NcoI, SalI, ClaI, KpnI, HindIII, SacI, PstI, BpnI, NotI, SrfI 또는 SfiI와 같은, 절단 부위로서 6, 7, 8 또는 그 이상의 염기쌍을 인식한다. 사용된 효소가 도입될 DNA에 추가 절단 부위를 가지지 않으면 유익하고, 이는 통합 효율을 증가시킨다. 대체로, 5 내지 500, 바람직하게는 10 내지 250, 특히 바람직하게는 10 내지 100 U의 효소가 REMI 혼합물에 사용된다. 효소는 서당, 트레할로즈 또는 글루코스와 같은 당, 글리세롤 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올과 같은 삼투 안정화를 위한 물질, 트리스, MOPS, HEPES, MES 또는 PIPES와 같은, pH 5 내지 9, 바람직하게는 6 내지 8, 특히 바람직하게는 7 내지 8의 범위로 편리하게 완충시키는 완충액 및/또는 마그네슘, 구리, 코발트, 철, 망간 또는 몰리브데넘의 무기 또는 유기염과 같은, 핵산을 안정화하기 위한 물질을 포함하는 수성 용액으로 사용된다. 경우에 따라서는 EDTA, EDDA, DTT, β-메르캅토에탄올 또는 핵산 가수분해 효소 억제제와 같은 다른 물질들이 존재하는 것이 가능하다. 그러나, 이들을 첨가하지 않고 REMI 기술을 수행하는 것도 가능하다.
본 발명에 따른 방법은 5 내지 80oC, 바람직하게는 10 내지 60oC, 특히 바람직하게는 20 내지 40oC의 온도 범위에서 수행된다. 세포막을 탈안정화하는 모든 공지 방법이, 예를 들면, 일렉트로포레이션, 적재된 소포 융합 또는 리튬, 루비듐 또는 칼슘염과 같은 다양한 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염, 바람직하게는 리튬염을 사용하는 탈안정화와 같은 방법이 본 발명의 방법에 적합하다.
핵산은 본 발명의 방법을 위해 분리 후 직접, 또는 정제 후 사용될 수 있다.
도 2 및 3은 본 발명의 rib 유전자 조합을 통합시키기 위한 본 발명의 방법을 도식적으로 요약한다. 효소 SpeI는 DNA를 절단하기 위해 사용되었고, DNA가 생물로 도입되는 동안 존재하였다. 선별을 용이하게 하기 위해, 카나마이신 내성 유전자 또한 TEF 프로모터 서열 (소위 반복 배열)에 의해 플랜크되도록, 단편에 포함되었다. 내성 유전자는 이들 서열을 통한 재조합에 의해 다시 삭제된다 (도 3 참조).
rib 유전자의 본 발명에 따른 조합의 식물로의 도입은 원칙적으로 당업자에게 알려진 모든 방법에 의해 일어날 수 있다.
외부 유전자가 식물의 게놈으로 전이하는 것은 형질 전환으로 언급된다. 이 경우에, 식물 조직 또는 식물 세포로부터의 식물의 형질 전환 및 재생에 대해 기술된 방법이 일시적이거나 안정한 형질 전환을 위해 사용된다. 적합한 방법은 폴리에틸렌 글리콜-유도 DNA 흡수에 의한 원형질 형질 전환, 유전자 총 사용, 일렉트로포레이션, DNA-함유 용액에서 건조한 배 배양, 마이크로인젝션 및 아그로박테리움-매개 유전자 전이이다. 상기 방법은 예를 들면, 문헌 [비. 젠스 등, Techniques for Gene Transfer; Trabsgenic Plants, 제1권, Engineering and Utilization, 에스. 디. 쿵 및 알. 우, Academic Press (1993), 128-143; Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225]에 기술된다. 이 구조물은 바람직하게는 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 형질 전환하기에 적합한 벡터, 예를 들면 pBin19로 클로닝된다 (비반 등, Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). 아그로박테리움 투메파시엔스로 식물을 형질 전환한 것이 예를 들면 문헌 [회프겐 및 윌미쳐, nucl. Acid Res. (1998) 16, 9877]에 기술된다.
본 발명에 따른 발현 벡터로 형질 전환된 아그로박테리아는 또한 식물 특히 곡류, 옥수수, 대두, 쌀, 목화, 사탕 무우, 카놀라, 해바라기, 아마, 삼, 감자, 담배, 토마토, 종유 유채, 알팔파, 상치 또는 다양한 나무, 너트 및 덩굴종, 및 콩과류와 같은 작용 식물을 예를 들면, 아그로박테리아 용액에 찢어진 잎 또는 잎 조각을 담금으로써 형질 전환하기 위해 알려진 방법으로 사용될 수 있다.
유전학적으로 변형된 식물 세포는 당업자에게 알려진 모든 방법에 의해 재생될 수 있다. 적합한 방법은 에스. 디. 쿵 및 알. 우, 포트리쿠스 또는 회프겐 및 윌미쳐의 상기 언급된 문헌에서 찾을 수 있다.
세포에서 rib 유전자 생성물의 효소 활성을 증가시키기 위한 수많은 가능성이 있다.
한가지 가능성은 이들이 각각 원래 효소와 비교해서 증가된 rib 3, 4 또는 5 활성을 갖는 효소를 코딩하도록 내인성 rib 3, 4 및 5를 변형시키는 것이다. 효소 활성에 있어서의 또다른 증가는 예를 들면, 증가된 기질 변환을 유도하기 위해 촉매 중심을 변화시키거나 또는 효소 억제제의 효과를 파괴함으로써 얻어질 수 있고, 이는 이들이 증가된 비(比)활성을 갖거나 또는 이들의 활성이 억제되지 않음을 의미한다. 또다른 유익한 실시 양태에서, 예를 들면 효소 합성을 억제하는 인자를 제거하거나, 합성 증진을 촉진시키는 인자 또는 조절 요소의 활성을 증가시키거나, 또는 바람직하게는 유전자의 추가 사본을 도입하여 세포내 효소 합성을 증가시킴으로써 증가된 효소 활성이 나타나도록 하는 것이 또한 가능하다. 이러한 방법은 비활성을 변화시키지 않고 세포 내에서 유전자 생성물의 전체 활성을 증가시킨다. 이들 방법을 조합하여 사용하는 것이 또한 가능하다. 즉, 비활성을 증가시키면서 전체 활성을 증가시킬 수 있다. 원칙적으로 이러한 변화를 유전자의 핵산 서열, 조절 요소 또는 이들의 프로모터로 도입하기 위해 당업자에게 알려진 모든 방법을 사용하는 것이 가능하다. 이러한 목적을 위해 핵산 서열에 예를 들면, 문헌 [디. 엠. 글로버 등, DNA Cloning, 제1권, 1995, IRL Press (ISBN 019-963476-9), 제6장, 페이지 193 이하]에 기술된 부위-지향적 돌연변이와 같은 돌연변이를 도입하는 것이 가능하다.
스피 등은 무작위 돌연변이를 위해 dITP를 사용하는 PCR 방법을 문헌 [Nucleic Acids Research, 제21권, 제3호, 1993, 777-778]에 기술한다.
분자 진화를 위해 생체외 제조합 기술을 사용하는 것이 스테머에 의해 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 제91권, 1994, 10747-10751]에 기술된다.
무어 등은 PCR 방법과 재조합 방법의 조합을 문헌 [Nature Biothechnology, 제14권, 1996, 458-467]에 기술한다.
변화된 핵산 서열은 이후 벡터를 통해 생물로 되돌아간다.
효소 활성을 증가시키기 위해 천연 유전자 앞에 변화된 프로모터 영역을 배치하고 그래서 유전자의 발현이 증가되고 이로 인해 마침내 활성이 증가되도록 하는 것이 또한 가능하다. 예를 들면, mRNA 안정성을 증가시키고 이로 인해 번역 증가가 가능하게 하는 서열을 3' 말단에 도입하는 것도 역시 가능하다. 이것 역시 더 높은 효소 활성을 유도한다.
세포에 rib 유전자 3, 4 및 5의 추가 사본을 함께 도입하는 것이 바람직하다. 이들 유전자 사본은 천연적 조절에 따르게 할 수도 있고 변화된 조절이 이루어질 수도 있으며, 후자의 경우에는 천연 조절 영역을 이들이 유전자의 증가된 발현을 가능하게 하도록 변화시키거나, 또는 외부 유전자의 조절 서열 또는 심지어 이형 유전자가 사용될 수 있다.
상기 언급된 방법의 조합이 특히 편리하다.
기능적 유사체는 예를 들면, rib 유전자의 기능적 동족체 또는 이들의 효소 활성의 기능적 동족체, 즉 rib 유전자 효소와 동일한 반응을 촉매하는 효소를 의미한다. 이들 유전자는 또한 리보플라빈 형성의 유익한 증가를 유도한다. 이들 기능적 유사체는 또한 상기 언급된 방법으로 편리하게 돌연변이되거나 또는 변화될 수 있고 이로 인해 이들의 활성이 증가될 수 있다.
기능적 유사체는 편의상 예를 들면, 진핵 또는 원핵 생물로부터 유도된 유전자 또는 유전자 생성물이다. 언급될 수 있는 예는 에레모테시움과 같은, 문헌 [Indian Chem. engr. Section B, 제37권, 제1,2호 1995), 페이지 15, 표 6]에 기술된 진균, 칸디다, 사카로마이세스 또는 피치아와 같은 효모, 또는 아라비돕시스 (arabidopsis), 토마토, 감자, 옥수수, 대두, 종유 유채, 보리, 밀, 호밀, 쌀, 기장, 목화, 사탕 무우, 해바라기, 아마, 삼, 카놀라, 귀리, 담배, 알팔파, 상치 또는 다양한 나무, 너트 및 덩굴종과 같은 식물과 같은 진핵 생물, 코리네박테리아, 브레비박테리아, 바실러스, 클로스트리디움, 시아노박터 또는 에쉐리키아와 같은 그램-양성 또는 그램-음성 박테리아와 같은 원핵 생물이다. 기능적 유사체는 에레모테시움과 같은 진균, 사카로마이세스 또는 칸디다와 같은 효모, 바실러스 또는 코리네박테리아와 같은 그램-양성 박테리아 또는 대장균과 같은 그램-음성 박테리아로부터 편리하게 유도된다. 바람직한 기능적 유사체는 속 및 종이 에레모테시움 아시비, 사카로마이세스 세레비시애, 칸디다 플라베리, 칸디다 파마타, 에쉐리키아 콜라이, 코리네박테리움 아모니아제네스 또는 바실러스 서브틸리스인 생물이다.
서열 번호 1, 서열 번호 3 및 서열 번호 5의 서열을 갖는 유전자 또는 이들의 기능적 균등물의 조합은 본 발명의 방법에서 유익하다.
본 발명에 따른 조합에 사용되고 서열 번호 1, 서열 번호 3 및 서열 번호 5의 서열을 갖는 유전자의 기능적 균등물은 예를 들면, 유도된 아미노산 수준에서 35% 이상의 상동성, 바람직하게는 45% 이상의 상동성, 특히 바람직하게는 45% 이상의 상동성, 특히 매우 바람직하게는 50%의 상동성을 갖는 대립 형질 변이체를 의미한다. 상기 핵산으로부터 유도된 아미노산 서열은 서열 번호 2, 서열 번호 4 및 서열 번호 6에서 찾아지는 것이다. 대립 형질 변이체는 특히 서열 번호 1, 서열 번호 3 및 서열 번호 5에 나타낸 서열에 있는 뉴클레오티드의 삭제, 삽입 또는 치환에 의해 얻어질 수 있는 기능적 변이체를 포함하며, 유도되고 합성된 단백질의 효소 활성은 보유된다.
이러한 형태의 DNA 서열은 서열 번호 1, 서열 번호 3 및 서열 번호 5에 기재된 서열, 또는 이들 서열의 부분에서 출발하여, 예를 들면 통상적인 혼성화 방법 또는 PCR 기술을 사용하여, 아시비아 고씨피 외의 다른 진핵 생물 또는 원핵 생물로부터 상기 언급된 바대로 단리될 수 있다. 이들 DNA 서열은 상기 서열과 표준 조건하에서 혼성화한다. 당업자에게 공지된 방법으로 E. coli와 B. subtilis의 상응하는 유전자와 비교함으로써 동정될 수 있는 보존된 영역의 짧은 올리고뉴클레오티드를 혼성화를 위해 사용하는 것이 유익하다.
표준 조건은 예를 들면, 0.1 내지 5 X SSC (1 x SSC = 0.15 M NaCl, 15 mM 소듐 시트레이트, pH 7.2)의 농도를 갖는 수성 완충액에서 또는 추가적으로 50% 포름아미드 존재하에서 42 내지 58oC 온도 , 예를 들면, 5 X SSC 및 50% 포름아미드 존재하에서 42oC를 의미한다. DNA 혼성화를 위한 실험 조건은 예를 들면, 유전학 관련 교과서 [샘브룩 들, "Molecular Cloning," Cold Spring Harbor Laboratory, 1989]에 기술되어 있다.
서열 번호 1, 서열 번호 3 및 서열 번호 5의 서열의 동족체는 또한 예를 들면, 진핵 또는 원핵 동족체, 절단 서열 또는 단일-스트랜드 DNA를 의미한다.
서열 번호 1, 서열 번호 3 및 서열 번호 5의 동족체는 추가적으로 예를 들면, 프로모터 변이체와 같은 유도체를 의미한다. 언급된 뉴클레오티드 서열의 상류에 있는 프로모터들은 함께 또는 단독으로 1개 이상의 뉴클레오티드 교환, 삽입(들) 및/또는 삭제(들)에 의해, 그렇지만 프로모터의 기능성 또는 활성에 악영향을 미치지 않으면서 변화될 수 있다. 추가의 가능성은 이들 서열을 변화시킴으로써 프로모터의 활성을 증가시키거나, 또는 이들을 심지어 이형 생물로부터 얻은 더욱 활성인 프로모터로 완전히 대체시키는 것이다.
유도체는 또한 편의상 유전자 발현 및/또는 단백질 발현이 변화되고, 바람직하게는 증가되도록 개시 코돈 앞의 뉴클레오티드 서열이 변화된 변이체를 의미한다.
클로스트리디움속, 코리네박테리움속, 브레비박테리움속, 시아노박터속, 바실러스속, 에레모테시움속, 에쉐리키아속, 피치아속, 아시비아속 또는 칸디다속의 미생물, 또는 식물로부터, 특히 바람직하게는 속 및 종이 바실러스 서브틸리스, 코리네박테리움 암모니아게네스, 에쉐리키아 콜라이, 칸디다 플라베리, 칸디다 파마타인 미생물 또는 예를 들면, 에레모테시움 아시바이 또는 아시비아 고씨피와 같은 문헌 [Indian Chem Engr. Section B., 제37권, 제1,2호, 1995, 페이지 15, 표 6]에 기술된 진균, 특히 매우 바람직하게는 속 및 종이 에레모테시움 아시바이 또는 아시비아 고씨피인 미생물로부터 서열 번호 1, 서열 번호 3 및 서열 번호 5의 서열 또는 이들의 기능적 균등물을 분리하는 것이 가능하고 바람직하다. 그러므로, 예를 들면, 바실러스 서브틸리스로부터 얻은, rib 3, 4, 5-동형 유전자 rib A, rib H 및 rib B, 또는 이들 유전자의 단편 또는 E. coli로부터 얻은, rib3, 4, 5-동형 유전자 rib B, rib E 및 rib C, 또는 이들 유전자의 단편은 본 발명에 따른 방법으로 리보플라빈 수율을 증가시키기 위해 원핵계에 편리하게 사용될 수 있다.
생물에서 이형 유전자의 최적 발현을 위해, 생물에 사용된 특정한 코돈 용법에 맞게 핵산 서열을 변화시키는 것이 유익하다. 코돈 용법은 관련 생물에서 다른 공지 유전자를 컴퓨터로 분석하여 용이하게 확인될 수 있다.
rib 3, 4 및 5의 발현은 rib 3, 4, 5 유전자의 사본수를 증가시키고(시키거나) rib 3, 4 및 5 유전자 발현에 유익한 효과를 갖는 조절 요소를 증진시킴으로써 유익하게 증가된다. 그러므로, 조절 요소의 증진은 바람직하게는 프로모터 및 인헨서 (enhancers)와 같은 더욱 강한 전사 신호를 사용함으로써 전사 수준에서 일어날 수 있다. 그러나, 예를 들면, rib 3, 4 및 5 mRNA의 안정성을 개선시키거나, 또는 리보솜상의 이 mRNA의 판독 효율을 증가시킴으로써 번역을 증진시키는 것이 또한 가능하다.
유전자의 사본수를 증가시키기 위해, rib 3, 4 및 5, 또는 동형 유전자는 예를 들면 각각의 rib 유전자에 할당된 조절 유전자 서열, 또는 유사한 효과를 갖는 프로모터 활성을 바람직하게는 함유하는 핵산 단편 또는 벡터로 혼입될 수 있다.
사용된 조절 요소는 특히, 유전자 발현을 증가시키는 것들이다. 선택적으로, 각각의 기술된 유전자가 단일 벡터로 들어가고 특정한 생산자 생물로 형질 전환되는 것이 또한 가능하다.
본 발명에 따른 핵산 단편은 rib 유전자 서열인 서열 번호 1, 서열 번호 3 및 서열 번호 5, 또는 유리하게는 유전자 발현을 증가시키기 위해 1개 이상의 조절 신호에 기능적으로 연결된 이들의 기능적 균등물을 의미한다. 이들 조절 서열은 예를 들면, 인듀서 (inducers) 또는 리프레서 (repressors)가 결합하고 이로 인해 핵산 발현을 조절하게 되는 서열이다. 이러한 신규한 조절 서열에 덧붙여, 또는 이들 서열을 대신하여, 이들 서열의 천연적 조절이 여전히 실제의 구조 유전자 앞에 존재하고, 경우에 따라 천연 조절이 중단되고 유전자의 발현이 증가되도록 유전적으로 변화되는 것이 가능하다. 그러나, 이 유전자 구조물은 또한 추가적 조절 신호가 서열 번호 1, 서열 번호 3 또는 서열 번호 5 또는 이들의 기능적 균등물의 앞에 삽입되지 않았고, 조절 기능을 갖는 천연 프로모터가 삭제되지 않은 더욱 간단한 구조를 가질 수 있다. 대신, 천연 조절 서열은 조절이 더 이상 일어나지 않고 유전자 발현이 증가되는 식으로 돌연변이된 것이다. 이들 변화된 프로모터는 또한 활성을 증가시키기 위해 단독으로 천연 유전자의 앞에 들어갈 수 있다. 유전자 구조물이 프로모터에 기능적으로 연결된 1개 이상의 소위 인헨서 서열을 추가적으로 함유하는 것이 또한 유익하고, 이는 핵산 서열의 증가된 발현을 가능하게 한다. 추가의 조절 요소 또는 터미네이터와 같이, 추가의 유익한 서열이 또한 DNA 서열의 3' 말단에 삽입될 수 있다. rib 유전자는 유전자 구조물에서 1개 이상의 사본으로 존재할 수 있다.
본 발명에 따른 방법을 위한 유익한 조절 서열은, 예를 들면, cos, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, lacIq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6 또는 γ-PR프로모터와 같은 프로모터에, 또는 γ-PL프로모터에 존재하고, 이는 그램-음성 박테리아에 유익하게 사용된다. 추가의 유익한 조절 서열은 예를 들면, 그램-양성 프로모터 amy 및 SPO2에, 효모 또는 진균 프로모터 ADC1, MFα, AC, P-60, CYC-1, GAPDH, TEF, rp28, ADH에 또는 식물 프로모터 CaMV/35S (프랭크 등, Cell 21, 1980, 285-294), PRP1 (와드 등, Plant. Mol. Biol., 22, 1993), SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, LEB4, nos에 또는 유비퀴틴 또는 파세올린 프로모터에 존재한다. 이와 관련하여 예를 들면, 한세눌라로부터 얻은 피루베이트 카르복시 이탈효소 및 메탄올 산화효소의 프로모터 또한 유익하다. 예를 들면, 벤젠설폰아미도-유도 가능한 프로모터 (EP 388186), 테트라사이클린-유도 가능한 프로모터 (가츠 등, 1992, Plant J. 2, 397-404), 아브시스산-유도 가능한 프로모터 (EP 335528) 또는 에탄올- 또는 사이클로헥사논-유도 가능한 프로모터 (WO 9321334)가 추가로 유익하다. 특히 유익한 식물 프로모터는 퓨린 또는 이들의 전구체의 생합성이 일어나는 식물의 조직 또는 부분에서의 발현을 확실하게 해주는 것들이다. 잎에 특이적인 발현을 확실하게 해주는 프로모터가 특히 가치가 있다. 감자로부터 얻는 원형질 FBPase의 프로모터 또는 감자로부터 얻은 ST-LSI 프로모터가 언급되어야 한다 (스톡하우스 등, EMBO J. 8, 1989, 2445-245). 글리신 max (또한 Genebank Accession Number U87999 참조)로부터 얻은 포스포리보실-피로포스페이트 아미도트랜스퍼라제의 프로모터 또는 EP 249676에 있는 또다른 마디 특이적 프로모터를 사용하는 것이 또한 가능하고 유익하다.
원칙적으로 본 발명에 따른 방법을 위해 상기 언급된 것들과 같은 이들 조절 서열을 갖는 모든 천연 프로모터를 사용하는 것이 가능하다. 합성 프로모터를 사용하는 것이 또한 가능하다.
상기 기술된 바대로, 핵산 단편 (= 유전자 구조물)은 또한 생물에 도입될 다른 유전자를 함유할 수 있다. 이들 유전자는 rib 유전자와 분리된 조절 또는 동일한 조절 영역하에 있을 수 있다. 예를 들면, 이들 유전자는 합성 증가를 가능하게 해주는 추가의 생합성 유전자이다.
발현을 위하여, 핵산 단편은 예를 들면, 플라스미드, 파지 또는 다른 DNA와 같은 벡터로 상기 언급된 숙주 생물로 편리하게 삽입되고, 이는 숙주 생물에서 유전자의 최적 발현을 가능하게 해준다. 적합한 플라스미드의 예는 E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-B1, γgt11 또는 pBdCI에, 스트렙토마이세스 pIJ101, pIJ364, pIJ702 또는 pIJ361에, 바실러스 pUB110, pC194 또는 pBD214에, 코리네박테리움 pSA77 또는 pAJ667에, 진균 pALS1, pIL2 또는 pBB116에, 효모 2μm, pAG-1, YEp6, YEp13 또는 pEMBLYe23에 또는 식물 pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 또는 pDH51 또는 상기 언급된 플라스미드의 유도체이다. 상기 플라스미드는 가능한 플라스미드 중에서 선택한 작은 부분을 나타낸다. 추가의 플라스미드가 당업자에게 잘 알려져 있고 예를 들면 책 [Cloning Vectors, 포우웰스 등, Elsevier, Amsterdam-New York-Ocford, 1985, ISBN 0 444 904018]에서 찾을 수 있다. 적합한 식물 벡터는 그중에서도 문헌 ["Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology", CRC Press, 제6/7장, 페이지 71-119]에 기술된다.
핵산 단편은 편의상 존재하는 다른 유전자의 발현을 위해, 발현을 증가시키는 3' 및/또는 5' 말단 조절 서열을 함유하고, 이들은 숙주 생물 및 유전자 또는 선별된 유전자에 의존하여 최적 발현을 위해 선택된다.
이들 조절 서열은 특이적인 유전자 및 단백질 발현을 가능하게 하는 것이 의도된다. 이는 예를 들면, 숙주 생물에 따라, 유전자가 유도 후에만 발현 또는 과잉 발현되는 것, 또는 즉시 발현 또는 과잉 발현되는 것을 의미한다.
조절 서열 또는 인자는 이러한 목적을 위해 바람직하게는 도입된 유전자의 발현에 유익한 효과를 가지고, 이로 인해 발현을 증가시킬 수 있다. 그러므로, 조절 요소의 증가는 편의상 프로모터 및/또는 인헨서와 같은 강한 전사 신호를 사용함으로써, 전사 수준에서 일어날 수 있다. 그러나, 예를 들면, mRNA의 안정성을 개선시킴으로써 번역을 증가시키는 것이 또한 가능하다.
또다른 실시양태의 벡터에서 본 발명에 따른 유전자 구조물은 또한 선형 DNA 형태로 편리하게 미생물로 도입되고, 숙주 생물의 게놈으로 이형 또는 동형 재조합에 의해 통합될 수 있다. 이 선형 DNA는 선형화된 플라스미드 또는 벡터로서 핵산 단편만으로 구성될 수 있다.
벡터로서 세포에서 자율복제를 하는 적합한 플라스미드 (그러나 특히 S. cerevisiae로부터 얻은 2μm 플라스미드의 ori 영역을 갖는 플라스미드)를 사용하는 것이 또한 가능하지만, 또한 상기 언급된 바대로, 숙주 게놈으로 통합하는 선형 DNA 단편을 사용하는 것이 가능하다. 이 통합은 이형 또는 동형 재조합에 의해, 그러나 바람직하게는, 언급된 바대로, 동형 재조합에 의해 일어날 수 있다 (스타이너 등, Genetics, 제140권, 1995, 973-987). rib 3, rib 4 및 rib 5 유전자가 게놈에서 다른 부위에 단독으로 또는 다른 벡터상에 존재하거나, 또는 게놈에 함께 또는 하나의 벡터상에 존재하는 것이 또한 가능하다.
rib 유전자 3, 4 및 5 또는 이들의 기능적 균등물의 조합을 함유하는 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 생물는 증가된 리보플라빈 생성을 보인다.
리보플라빈을 생성하기 위해 사용된 생물는 이들 생물를 성장하게 하는 배지에서 본 발명의 방법으로 배양된다. 이 배지는 합성 또는 천연 배지일 수 있다. 생물에 따라 사용되는 배지는 당업자에게 알려져 있다. 미생물의 성장을 위해, 사용된 배지는 탄소원, 질소원, 무기염 및, 적합하다면, 적은 양의 비타민 및 미량 원소를 함유한다.
유익한 탄소원은 예를 들면, 글루코스, 프럭토스, 만노스, 자일로스, 갈락토스, 리보스, 소르보스, 리불로스, 락토스, 말토스, 슈크로스, 라피노스, 전분 또는 셀룰로즈모노-, 디- 또는 폴리사카라이드와 같은 당, 몰라몰라세와 같은 당원 복합체, 프록토스 1,6-디포스페이트와 같은 당 포스페이트, 만니톨과 같은 당 알코올, 글리세롤과 같은 폴리올, 메탄올 또는 에탄올과 같은 알코올, 시트르산, 락트산 또는 아세트산과 같은 카복실산, 대두유 또는 평지씨유와 같은 지방, 아미노산 혼합물, 예를 들면 소위 카사미노산 (Difco) 또는 글리신 또는 아파르트산과 같은 개별적 아미노산, 또는 아미노 사카라이드와 같은 아미노산이고, 아미노산은 질소원으로도 사용될 수 있다.
무기염의 예는 칼슘, 마그네슘, 소듐, 코발트, 몰리브데넘, 망간, 포타슘, 아연, 커퍼 및 철의 염이다. 특히 언급되는 이들 염에서 음이온은 클로라이드, 설페이트 또는 포스페이트 이온이다. 본 발명에 다른 방법에서 생산성을 증가시키기 위한 증요한 인자는 생성 배지에서의 Fe2+또는 Fe3+이온 농도를 조절하는 것이다.
추가의 성장 인자는 예를 들면, 비오틴, 리보플라빈, 티아민, 엽산, 니코틴산, 판토테네이트 또는 피리독신과 같은 비타민 또는 성장 프로모터, 알라닌, 시스테인, 프롤린, 아스파르트산, 글루타민, 세린, 페닐알라닌, 오로니틴 또는 발린과 같은 아미노산, 시트르산, 포름산, 피멜산 또는 젖산과 같은 카복실산, 또는 디티오트레이톨과 같은 물질과 같은, 적합한 영양 배지에 첨가된다.
상기 영양소의 혼합 비율은 발효의 형태에 의존하고 각각의 경우에 맞게 확정될 것이다. 배지 성분은, 필요하다면 이 성분들이 개별적으로 멸균되거나 함께 멸균된 후, 발효 시작부터 모두 존재될 수 있거나, 또는 그밖에 필요한대로 발효하는 중에 순차적으로 연속적 또는 비연속적으로 첨가될 수 있다.
배양 조건은 생물이 최적으로 성장하고 가능한 가장 좋은 수율이 얻어지도록 확정된다. 바람직한 배양 온도는 15 내지 40oC이다. 25 내지 37oC의 온도가 특히 유익하다. pH는 바람직하게는 3 내지 9 범위에서 유지된다. 5 내지 8의 pH 값은 특히 유익하다. 몇시간 내지 며칠, 바람직하게는 8시간 내지 21일, 특히 바람직하게는 4시간 내지 14일의 배양 시간이면 일반적으로 충분하다. 이 시간 중에, 최대량의 생성물이 배지에 축적된다.
당업자는 배지의 유익한 최적화 가능성을 예를 들면 교과서 [Applied Microbiol Physiology, A Practical Approach, 피. 엠. 로즈, 피. 에프. 스탠버리, IRL-Press, 1997, 페이지 53-73, ISBN 0 19 963577 3]에서 찾을 수 있다. 유익한 배지 및 배양 조건은 예를 들면 문헌 [EP-A-0 405 370, 특히 실시예 9]에 있는 바실러스 및 다른 미생물, 문헌 [WO 88/09822, 특히 표 3]에 있는 칸디다, 및 문헌 [슈미드트 등, Microbiology, 142, 1996, 419-426]에 있는 아시비아에 대해 알려진 것이다.
본 발명의 방법은 연속적으로, 또는 배치 또는 페드-배치 공정으로 배치식으로 수행될 수 있다.
사용된 생물의 생산성의 초기 수준에 상관 없이, 리보플라빈 생산성은 본 발명의 방법에 의해 다양한 정도로 증가될 수 있다. 생산성은 초기 생물과 비교하여 각각의 경우에, 보통 5% 이상, 바람직하게는 10% 이상, 특히 바람직하게는 20%, 특히 매우 바람직하게는 100% 이상까지 편리하게 증가될 수 있다.
아시비아 고씨피 및 사카로마이세스 세레비시애에서 rib 유전자 1, 2, 3, 4, 5 및 7의 분리는 특허 WO 95/26406 및 WO 93/03183 및 특히 실시예에 기술되고, 이에 상응하게 수행되었다. 이들 문헌의 내용은 참고로 본원에 혼입된다.
서열 1은 형질 전환을 위해 필요한 선택 마커 (selection marker)외에, rib 3, rib 4 및 rib 5 유전자 단편을 갖는 DNA 구조물을 나타낸다.
예를 들면, 클로닝, 제한 절단, 아가로스겔 전기 영동, DNA 단편의 연결, 미생물의 형질 전환, 박테리아의 배양 및 재조합 DNA의 서열 분석과 같은 일반적 핵산 공정은 달리 기술되지 않는 한, 문헌 [샘브룩 등, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6]에 기술된 바대로 수행되었다.
재조합 DNA 분자의 서열을 결정하는 생거의 방법 (생거 등, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467)을 사용하여 ABI로부터 레이저 형광 DNA 서열기를 사용하여 일어났다. 폴리머라제 사슬 반응으로부터 얻어진 단편은 서열이 결정되고 발현되는 구조물에서 폴리머라제 에러를 피하기 위해 서열 결정 및 확인되었다.
실시예 1
rib 3, rib 4 및 rib 5 유전자 사본을 함유하는 DNA 구조물 (벡터 Tef-G418 rib3, 4, 5)의 클로닝
rib 유전자의 발현 구조물: rib 3 (벡터 pJR874), rib 4 (벡터 pJR762) 및 rib 5 (벡터 pJR739)가 WO95/26406에 기술된다. 벡터 pAG-110 (스타이너 및 필립센, 1994, Mol. Gen. Genet., 242, 263-271)을 DraIII로 절단하고, 클레노우 폴리머라제 및 데옥시뉴클레오티드로 배양하고 (말단 채우기), 침전시키고 이후 SalI로 절단하였다. Tef 프로모터 및 카나마이신-내성 유전자를 함유하는 DNA 단편을 HindIII- 및 SalI-절단한 벡터 블루스크립트 KS (스트라타겐)에 연결하였고, 이 벡터의 HindIII 말단은 클레노우 폴리머라제로 채워둔 것이다. 벡터 pBS Tef-G418을 얻었다.
pJR874를 두번째 클로닝 단계에서 PvuII 및 SalI로 절단하였다. rib 유전자 단편을 이후 SalI-cut로 연결하고 벡터 pBS Tef-G418로 탈인산화하였다. 단편 및 벡터의 오직 SalI 말단만을 연결할 수 있으므로, 배합가능하지 않은 PvuII 및 SalI 말단을 클레노우 폴리머라제로 채우고 연결하였다. 얻어지는 벡터는 하기에서 Tef-G418-rib3이라 불리운다.
rib 5 유전자를 벡터 Tef-G418-rib3으로 서브클로닝하기 위해, 벡터 pJR739를 NcoI 및 NotI으로 절단하였다. 말단을 클레노우 폴리머라제로 채웠다. rib 5 유전자 단편을 이후 말단이 이와 같이 채워진 SalI-cut 벡터 Tef-G418-rib3로 서브클로닝하였다. 벡터 Tef-G418-rib3, 5를 얻었다.
마지막 클로닝 단계에서 하기 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 벡터 pJR762로부터 rib4 유전자 단편을 얻었다.
5' GATCGATCGATCGCTAGCTGGGAGGATATGTTCTGGG 3'
5' TCCAAGCTTGCTAGCATCTCAAATAAGTGATTAGAAGGACAAGCTGCAAG 3'
PCR 단편을 NheI로 절단하고 NheI-cut 및 알칼리성 포스파타제-처리 벡터 Tef-G418rib3, 5로 서브클로닝하였다.
얻어지는 DNA 구조물은 벡터 Tef-G418-rib3, 4, 5이다.
실시예 2
진균 아시비아 고씨피로의 DNA 구조물의 형질 전환
실시예 1에 기술된 DNA 구조물 (벡터 Tef-G418-rib3)을 제한 효소 SpeI로 완전히 절단하였고 rib 유전자 서열을 갖는 인서트를 아가로스겔 분별에 의해 정제하였다. 형질 전환을 위해 사용된 인서트를 서열 번호 7에 도시한다. 이 인서트에 존재하는 rib 유전자 3, 4 및 5의 유도된 아미노산 서열은 서열 번호 8 (rib 3), 서열 번호 9 (rib 5) 및 서열 번호 (rib 4)에서 알려지는 것이다.
MA2-배지 (10 g/1 박토-펩톤, 1 g/ 1 효모 추출물, 0.3 g/1 미오-이노시톨 및 10g/1 D-글루코스)를 아시비아 고씨피 포자로 접종시켰다. 4oC에서 12시간 동안 배양하였고 이후 28oC에서 13시간 동안 교반하면서 배양하였다. 세포 현탁액을 원심분리하였고 세포 펠렛을 50 mM 포타슘 포스페이트 완충액 (pH 7.5) 및 25 mM DTT 5 ml로 얻었다. 28oC에서 30분 동안 열처리 후, 세포를 다시 원심분리하고 STM 완충액 (270 mM 서당, 10 mM TRIS-HCl pH 7.5, 1 mM MgCl2) 25 ml로 얻었다. 이 현탁액 0.5 ml를 이후 약 3 ㎍의 상기 정제된 인서트 및 40 U의 SpeI 효소와 혼합하고 마이오라드 진 플러서 (100Ω, 200 μF, 1.5 kV)에서 전기 영동하였다. 전기 영동후, 세포를 1 ml의 MA2 배지와 혼합하고 MA2 아가 배양판에 스트리크하였다. 항생제 선별을 위해, 28oC에서 5시간 동안 이 판을 배양한 후 이 판을 항생제 G418 (200 ㎍/ml)을 함유하는 저용융 아가로스 5 ml 층으로 덮었다. 형질 전환체를 현미 조작에 의해 영양 정제하였다 (스타이너 및 피립센, 995, Genetics, 140, 973-987). 구조물의 성공적인 통합을 형질 전환체 게놈 DNA의 PCR 분석에 의해 확인하였다. 게놈 DNA의 분리는 문헌 [칼르 및 올슨, Proc. Natl. Acad. Sci. 1985, 82, 3756-3760 및 롸이트 및 필립슨, Gene, 1991, 109, 99-105]에 기술된 바대로 수행하였다. 이 구조물을 위해 특정한 프라이머를 갖는 PCR은 알. 사이키에 의해 수행되었다 (PCR Protocols, 1990, Academic Press, 13-20). PCR 단편 분석은 아가로스겔위에서 분별에 의해 일어났다). DNA의 형질 전환체로 게놈으로의 성공적인 통합은 하기 프라이머를 사용하여 수행되었다:
프라이머 A: 5'-TCCCTTAATCATTGTCACTGC-3'
프라이머 B: 5'-CCAAGCTTGCTAGCATCTC-3'
프라이머 C: 5'-CTGCCTGAGAAGCTGGAAAGC-3'
프라이머 D: 5'-TGTGAATTAGTAAGCGAAAGG-3'
프라이머 E: 5'-TAAGGGATTAGGCGAAGTTGA-3'
프라이머 F: 5'-GCTGCCACCCCTCTGATTCAC-3'
프라이머 G: 5'-ATAAGCTTTTGCCATTCTCAC-3'
프라이머 H: 5'-CTTTTGCTTTGCCACGGAACG-3'
게놈으로의 성공적인 통합은 모든 형질 전환체에 대해 검출 가능하였다.
실시예 3
재조합 아시비아 고씨피 클론에서의 리보플라빈 결정
아시비아 고씨피 Ita-GS-01 (슈미드트, 쥐., 스타만, 케이.-피., 카에슬러, 비., 및 삼, 에이취., 1996, Microbiology, 142, 419-426) 및 실시예 1에 기술된 구조물로 형질 전환시켜 유도된 스트레인 Ita-GS-01#17.1을 28oC에서 4일 동안 아가 배지에서 배양하였다. 이 판을 배양액 (27.5 g/l 효모 추출물, 0.5 g/l MgSO4, 50 ml/l 대두유, pH 7.0) 10 ml를 갖는 3개의 100 ml 삼각 플라스크 (17.1-1, 17.1-2, 17.1-3)에 접종하기 위해 사용하였다. 180 rpm의 교반기상에서 28oC에서 40시간 동안 배양한 후, 배양 브로스 1 ml를 20 ml의 YPD 배양액 (10 g/l 효모 추출물, 20 g/l 박토펩톤, 20 g/l 글루코스) 20 ml를 함유하는 250 ml 삼각 플라스크에 넣었다. 28oC에서 190시간 동안 배양한 후, 샘플 1 ml를 각각의 플라스크에서 취하고 1 M 과염소산 1 ml와 혼합하였다. 이 샘플을 여과하였고 리보플라빈 함량은 HPLC 분석법에 의해 결정하였다. 이를 위해 리보플라빈 표준품 (10 mg/l, 20 mg/l, 30 mg/l, 40 mg/l, 50 mg/l)으로 보정을 수행하였다.
리보플라빈 결정을 위한 HPLC 방법의 파라미터:
칼럼 ODS 하이퍼실 5 mm 200X 2.1 mm (HP)
용출액 A 인산 (89%) 340 ml를 갖는 물
pH 2.3으로
용출액 B 100% 아세토니트릴
구배 0 - 6분: 2% B 내지 50% B
6 내지 6.5분: 50% B 내지 2% B
정지 시간 10분
유속 0.5 ml/분
검출 280 nm
온도 40oC
주입 2 - 10 ㎕
rib 3, 4 및 5 유전자의 추가적 복제를 함유하는 클론 17의 모든 3개의 배치는 초기 스트레인과 비교하여 증가된 리보플라빈 생산성을 특징적으로 나태낸다 (도 4).
도 4는 다양한 클론으로부터 얻은 리보플라빈 수율을 나타낸다. rib 3, 4 및 5 유전자의 도입은 변화되지 않은 스트레인과 비교하여 150% 이하까지 리보플라빈 수율을 증가시키는 것을 가능하게 하였다.

Claims (17)

  1. 리보플라빈을 합성할 수 있는 생물에서 효소 3,4-디히드록시-2-부타논-4-포스페이트 신타아제, 디메틸-8-리비틸루마진 신타아제 및 리보플라빈 신타아제 또는 이들의 기능적 유사체의 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 리보플라빈을 합성할 수 있는 생물을 사용한 리보플라빈의 생산 증가 방법.
  2. 제1항에 있어서, 효소 3,4-디히드록시-2-부타논-4-포스페이트 신타아제, 디메틸-8-리비틸루마진 신타아제 및 리보플라빈 신타아제 또는 이들의 기능적 유사체를 코딩하는 유전자 조합이 효소의 활성을 증가시키기 위해 상기 생물로 도입되는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 박테리아, 효모, 진균 또는 식물이 상기 생물로서 사용되는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 바실러스속, 클로스트리디움속, 에쉐리키아속, 피치아속, 칸디다속, 시아노박터속, 코리네박테리움속, 브레비박테리움속, 사카로마이세스속, 에레모테시움속 또는 아시비아속, 또는 아라비돕시스, 토마토, 감자, 옥수수, 종유 유채, 밀, 보리, 해바라기, 기장, 호밀, 귀리, 사탕 무우, 콩 변종 또는 대두와 같은 식물로 구성된 군으로부터 선택된 생물이 사용되는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 바실러스속, 코리네박테리움속, 브레비박테리움속, 에쉐리키아속, 칸디다속, 에레모테시움속 또는 아시비아속으로 구성된 군으로부터 선택된 생물이 사용되는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1, 서열 번호 3 및 서열 번호 5를 갖는 유전자 또는 이들의 기능적 균등물이 사용되는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 균등물이 이들 서열에 의해 코딩된 아미노산 수준에서 35% 상동성을 갖는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 효소 3,4-디히드록시-2-부타논-4-포스페이트 신타아제, 디메틸-8-리비틸루마진 신타아제 및 리보플라빈 신타아제 또는 이들의 기능적 유사체를 코딩하는 유전자가 진핵 또는 원핵 생물로부터 유래하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 또는 이들의 균등물이 바실러스, 에쉐리키아, 클로스트리디움, 사카로마이세스, 칸디다, 에레모테시움 또는 아시비아로 구성된 군으로부터 선택된 생물로부터 유래하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 또는 이들의 균등물이 1개 이상의 벡터상에 또는 염색체에서 함께, 또는 따로 위치되는 방법.
  11. 서열 번호 1, 서열 번호 3 및 서열 번호 5를 갖는 유전자 또는 이들의 기능적 균등물을 포함하고 상기 유전자 또는 이들의 기능적 균등물이 1개 이상의 조절 신호에 기능적으로 연결된 핵산 단편.
  12. 제11항의 핵산 단편을 포함하는 발현 벡터.
  13. 제12항에 있어서, 선형 핵산인 발현 벡터.
  14. 1개 이상의 제11항의 핵산 단편 또는 1개 이상의 제12항의 벡터를 포함하는 생물.
  15. 리보플라빈의 생산 증가를 위한, 리보플라빈을 합성할 수 있는 생물에서 효소 3,4-디히드록시-2-부타논-4-포스페이트 신타아제, 디메틸-8-리비틸루마진 신타아제 및 리보플라빈 신타아제 또는 이들의 기능적 유사체를 코딩하는 유전자 조합의 용도.
  16. 제15항에 있어서, 아시비아 고씨피에서의 용도.
  17. 1개 이상의 리보플라빈 합성 유전자를 제한 효소-매개 통합에 의해 생물의 게놈으로 도입시키는 것을 포함하는, 생물의 게놈으로 핵산을 통합시키는 방법.
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