JPH06509942A - アシビヤ・ゴシピィの所望の遺伝的変性法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アシビヤ・ゴシビイの所望の遺伝的変性広本発明は、相同的組換えによる、アシ ビヤ・ゴシビイ（Ａｓｈｂｙａ　ｇｏｓｓｙｐｉｉ）の特異的な遺伝的変性法、 並びにこの方法により変性されたアシビヤ・ゴシビイー菌株に関する。

糸状辛子ａ薗煩アシビヤ・ゴシビイは、例えば、リボフラビン生産微生物として 、極めて重要である。

相同的組換えによる特異的な遺伝的変性法は、５ｔｒｕｈｌ　ｅｔ　ａｌ（Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７６．１０３５−１０３９．１９ ７９）によって、酵母サツカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ ｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）について、記載され、かつその後に、Ｒｏｔｈｓ ｔｅｉｎ（Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　Ｖ。

１．１９４、Ｓ、２８１ｆｆ）によって、拡張された。

糸状子嚢菌頭、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉ　ｌ　Ｉｕｓ）又は＝、 −ｏスポラ（ＮｅｕｒｏＳｐｏｒａ）の場合には、相同的組換えが認められた。

しかしながら、相同的組換えの割合は、非−相同的ｉ換えに比べて、屡々僅少で ある。更に、郁利に又は殆んど独占的に相同的組換えに結びつく確実なパラメー ターは挙げられていない（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｒｅｃｖｓ 　、　５３、１４８−１７０、１９８９）。

従って、相同的組換えによるアシビヤ・ゴシビイの特異的な遺伝的変性を可能と する方法を得ることが課題であった。

それに応じて、アシビヤ・ゴシビイの１つ又はい（つかの遺伝子領域によって側 面に接せられた、組換えすべき新ＤＮＡを含有するベクターで、アシビヤ・ゴシ ビイを形質転換する場合に、相同的組換えによるアシビヤ・ゴシビイの特異的な 遺伝的変性が特に効果的に行なわれることが判明した。アシビヤ・ゴシビイの遺 伝子領域として、翻訳延長因子ＥＦ−１α（ＴＥＦ−遺伝子）の遺伝子座の領域 におけるＤＮＡ−配列が、本発明による方法に有利に使用される。

アシビヤ・ゴシビイの翻訳延長因子ＥＦ−１α（ＴＥＦ）の遺伝子は、４．６ｋ ｂの大きさのＥｃｏＲｒ−ＥｃｏＲＩ−フラグメント及び６．３ｋｂの大きさの Ｂ　ａｍＨＩ−Ｂ　ａｍＨＩ−フラグメント中に含有されていて、これは、アシ ビヤ−ＤＮＡ−遺伝子バンクから、サツカロミセス・セレビジアエよりなるＴＥ Ｆ−プローブを用いるハイブリッド形成（ＥＭＢＯＪ。

３．３３１１−３３１５．１９８４）によって単離されうる（第１２図）。

ＴＥＦ−遺伝子のコード部分は、重複する２、１ｋｂの大きさのＥｃｏＲＴ−Ｂ ａｍＨＩ−フラグメントの内部にあり、その配列は、隣接する配列と一緒に、Ｄ ＮＡ−配列記録ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ○；１に挙げられている。

更に、この方法で変性されたアシビヤ・ゴシビイー菌株微生物は重要な特性を有 することが判明した。

アシビヤ・ゴシビイの形質転換とは、種々の方法で、アシビヤ・ゴシビイー核又 は他のＤＮＡ−保有組織に、組換えされたＤＮＡが転移することである。好適な 転移法は、プロトプラスト−形質転換及びエレクトロボレーシコンである。

プロトプラスト−形質転換は、酵素、例えばチモリアーゼ（Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ ）を用いて、ミセルからプロトプラストを製造する方法で、有利に実施される。

プロトプラストは、カルシウム−イオンを含有する水性緩衝液中で、１〜１０Ｘ ｌＯａ／ｍ１、有利に３〜５ｘｌＯ’／ｍｌの濃度で、＠濁され、かつＭ製ＤＮ Ａと共に恒温保持される。精製ＤＮＡは、プロトプラスト懸濁液１００ｍ１当り 、１〜５０μｇ、有利に１０〜２５μｇの比率で添加される。形質転換されたア シビヤ・ゴシビイー細胞は、栄養培地中で恒温保持され、かつ寒天平板上に塗布 される０選択マーカー、例えば、抗生物貿耐性遺伝子を使用する場合には、効果 的に形質転換された細胞は、抗生物質−含有の栄養培地上での成長によって特に 容易に確認することができる。引続いて、胞子分離を介するクローン精製が有利 である。

形質転換のためのベクターとして、アシビヤ・ゴシビイの１つ又はいくつかの遺 伝子領域によって側面に接せられた、組換えすべき新ＤＮＡを保有する組換え体 ＤＮＡ−構築体を使用する。相同的組換えに特に好適である側面に接する遺伝子 領域は、ＴＥＦ−遺伝子領域である０組換えすべき新ＤＮＡは、例えば、プラス ミドｐＡＧ−１０２及びｐＡＧ−１４５（第４図及び第１１図）中に示されてい るように、側面に接せられる。

組換えすべき新ＤＮＡは、同様に、アシビヤ・ゴシビイから由来し得る；しかじ 、他の生物、原核生物並びに真核生物起源からのＤＮＡ又は合成のＤＮＡを使用 することもできる。

組換えすべき新ＤＮＡとして、アシビヤ・ゴシビイからのＤＮＡを使用する場合 に、例えば、表現の弱いアシビヤ・ゴシビイー遺伝子を、強力なプロモーター（ 例えばＴＥＦ−プロモーター）の制擲下で、塩基対的に正確な組込みによって、 配置すること、かつ従って、異種の表現シグナルを使用する必要なしに、表現増 加を生ぜしめることが可能である。

本発明による方法では、アシビヤ・ゴシビイ以外の生物、例えば遺伝的により良 好に定義された酵母サツカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｓ　Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又は細菌バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ 　５ｕｂｔｉｌｉｓ）、又はニジエリチア・コリ（ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａＣｏ ｌｉ）からのＤＮＡを、特異的に、アシビヤ・ゴシビイ細胞中に導入すること、 及びそこで増殖すること、もしくは場合により表現することも可能である。

組換えすべきＤＮＡとは、コード化ＤＮＡ、又は、非−コード化ＤＮＡのことで あり、コード化ＤＮＡ（Ｃｏｄｉｅｒｅｎｄｅｒ　ＤＮＡ）の使用が有利である 。

本発明による方法で使用されるベクターは、更に他のＤＮＡ配列、例えば選択マ ーカーを保有してよい。

細菌中で複製し、並びにアシビヤ・ゴシビイの形質転換のために使用されるシャ トル−ベクターが有利に使用される。そのために、このベクターは、通例、ＤＮ Ａ−複製の細菌起始点及び１つ又はいくつかの抗生物質−耐性遺伝子を有する。

ベクターとして、プラスミドｐＡＧ−１０２及びプラスミドｐＡＧ−１４５又は それから誘導された誘導体（ｊ１４及び１１図）が特に有利である。誘導体とは 、０４１８−耐性一遺伝子に付加的に、又はその代りに、Ａ、ゴシビイＤＮＡに よって側面に接せられた、他のＤＮＡ−配列を保有するようなプラスミドと解さ れる。

ベクターとして環状ＤＮＡを使用する場合には、これを、アシビヤ・ゴシビイの 形質転換の前に、相同的組換えを導入する末端Ａ、ゴシビイ配列を有するフラグ メントが生じるように、線状化する。

この方法により特異的に変性されたアシビヤ・ゴシビイー菌株は、相同領域（例 えばＴＥＦ−遺伝子座）の前もって決められた位置に、ベクター−ＤＮＡの組込 みが起こったことによって、確認すること力（できる。

これは、例えば、ベクター−プローブを用ｌｖλるサザンープロッテイングによ って、立証すること力（できる。

ベクター−ＤＮＡ中に選択マーカーが保有されてしする場合には、変性されたア シビヤ・ゴシビイー菌株の分離は、特に藺単である。その場合、選択的条件下、 例えば抗生物質−選択によって、最終的４：、変性された菌株を分離することが できる。

プラスミドｐＡＧ−１０２を用し１て、相同的組換えによって遺伝的に変性され た菌株をよ、ＬＵ８３３４〜ＬＵ８３４１と表示される。これらの菌株をよ、Ｄ ｅｕｔｓｃｈｅｎ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅ ｎ　ｕｎｄ　Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ　ＧｍｂＨ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ ｔ二　、次の番号で寄託された。

ＬＵ　８３３４：ＤＳＭ　６６６１ ＬＵ　８３３５：ＤＳＭ　６６６２ ＬＵ　８３３６：ＤＳＭ　６６６３ ＬＵ　８３３７：ＤＳＭ　６６６４ ＬＵ　８３３８：ＤＳＭ　６６６５ ＬＵ　８３３９：ＤＳＭ　６６６６ ＬＵ　８３４０　：　ＤｓＭ　６６６７ＬＵ　８３４１：ＤＳＭ　６６６Ｂ 本発明による方法により、所望の遺伝的変性、例えば塩基対的に正確な挿入、欠 失及び置換を、筒単に、かつ所望に応じて、遺伝的に安定に、又は不安定に、構 築することができる。それによって、例えば相同プロモーターによる遺伝的に安 定な過表現を目指す遺伝技術的方法のための半子嚢薗アシビヤ・ゴシビイが、単 一細胞、酵母Ｓ、セレビシアエのように、良好に得られる。

次の例で本発明を説明する。

例１ アシビヤ・ゴシビイーＴＥＦ−遺伝子領域の単離Ａ、ゴシビイーミセルから単離 されたＤＮＡを、制限−エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨｒで切断し た。ＴＥＦ−遺伝子又はその一部分を有するＤＮＡ−フラグメントを、アガロー ス−ゲル電気泳動での制限フラグメントの大きさによる分離、及び３２ｐ−標識 化の異種のＴＥＦ−遺伝子プローブを用いる後続のハイブリッド形成の後に、同 定した。ＴＥＦ−遺伝子プローブは、Ｓ、セレビジアエＴＥＦ２−遺伝子の１３ ７７ｂｐ長さの開いた読み枠のヌクレオチド３６３〜１２３５を包含する（Ｓｃ ｈｉｒｍａｉｅｒｕｎｄ　Ｐｈ１ｌｉｐｐｓｅｎ、ＥＭＢＯＪ、３（１９８４） 、３３１１−３３１５）、４．６ｋｂ長さのＥｃｏＲＩ−フラグメント及び６． ３ｋｂ長さのＢａｍＨＩ−フラグメントは、異種のＴＥＦ−遺伝子プローブと、 ハイブリッド形成した。この範囲の長さのフラグメントを、アガロース−ゲルか ら溶離させ、ＥｃｏＲＩもしくはＢ　ａｍＨＩで切断されたベクターｐＵＣ８（ Ｖｉｅｉｒａ　ｕｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ。

Ｇｅｎｅ　１９　（１９８２）、２５９−２６８）中にクローン化し、かつＥ、 コリ中に形質転換させた。ＴＥＦ−ＤＮＡを有するクローンは、３２ｐ−標識化 の異種プローブを用いるコロニーハイブリッド形成（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ及びＨ ｏｇｎｅｓｓ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ７２　（１ ９７５）、３９６１−３９６５）によって、確認された。ポジチブのクローンは ４．６ｋｂの長さのＥｃｏＲＩ−フラグメントか、又は６．３ｋｂの長さのＢａ ｍＨＩ−フラグメントを、保有した。２つのクローンは、ＴＥＦ−遺伝子プロー ブとの相同性を有し、かつ配列決定された２、ｌｋｂの領域で重複する。２．１ ｋｂフラグメント及び隣接する領域の配列は、ＳＥＱ　ＩＩ）　ＮＯｌ中に保有 されている。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１は、１３７７ｂｐ　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ ：２）、５’−非コード領域の４３６ｂｐ及び３′−非コード領域の６８６ｂｐ の開放読み枠を保有する。引続いて、プロモーター領域を、３７９ｂｐのほかに 、スタートコドンの前で、更にＴＥＦ−遺伝子の開放読み枠の最初の２４ｂｐを 有する４０３ｂｐ長さのＨｉｎｃｌｒ　ｒ　Ｉ／ＨｉｎｃＩＩ−フラグメントと して、単離し、かつｐＡＧ−１ｏｏの構築のために使用した。

例２ プラスミド構築 ＆）　ベクターｐＡＧ−１（ｊｉ１図）（ＤＳＭ６０１０寄託）、ベクターｐ　 ＥＸ４の誘導体を、Ｅｒｎ５ｔ及びＣｈａｎ、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６３ 　（１９８５）、８−１４に依り、製造した。ｐＡＧ−１は、アミノグリコシド ホスホトランスフェラーゼ（Ａ　Ｐ　Ｒ（３’）Ｉ）に関してコードする、トラ ンスポゾンＴｎ９０３のＧ４１８−耐性遺伝子（Ｇ４１８ｒ）を有する１、７ｋ ｂ　５ａｌＩ−フラグメントを保有する。

起源のｐＥＸ４−構築体中で、先ず、Ｔｎ９０３　（ＯＫａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ 、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１４７（１９８１）、２１７−２２６）の１６９５ｂｐ　 ＰｖｕｌＴ−フラグメントを、補充された５ａｌｌ−切断部位を有するプラスミ ド中に、連結させた。その際、５ａｌＩ−切断部位は保持されたままであり、か つ耐性遺伝子は、１．７ｋｂ　５ａｌｌフラグメントとして分離され得る。ｐＡ Ｇ−１は、サツカロミセス・セレビジアエＡＲ３−エレメントＡＲ３Ｉ及び２μ 　ＡＲ３を保有し、かつ自律的にアシビヤ・ゴシビイ中で復製する。

ｂ）　ｐＡＧ−２（第２図）。Ｇ４１８−耐性遺伝子を育する１、７ｋｂ　５ａ ｌｌ−フラグメントを、ｐＡＧ−１から切り出し、かつＳ、セレビジアエーＥ。

コリシャトルベクターＹＥｐ２４の５ａｉ１−切断部位（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ　ｅ ｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ８（１９７９）、１７−２４；Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢ ｉｏｌａｂｓ　Ｉｎｃ、、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ。

ＵＳＡ、１９８８−１９８９　Ｃａｌａｌｏｇ、１１２−１１３）中に挿入した 。新たに生成したプラスミド−ｐＡＧ−２−の構造を、制限エンドヌクレアーゼ マツピングによって、調べ、その際、１．７ｋｂ　５ａｌＩ−フラグメント中に あるＸｈｏＩ−切断部位を、挿入配向の調査のために利用した。ｐＡＧ−２は、 サツカロミセス・セレビジアエＡＲ３−エレメント２μＡＲ３を含有し、かつ自 律的にアシビヤ・ゴシビイ中で複製する（Ｗｒｉｇｈｔ及びＰｈ１ｌｉｐｐｓｅ ｎ、Ｇｅｎｅ　１０９．９９−１０５（１９９１，）。

ｃ）　ｐＡＧ−１００（第３図）、Ｇ４Ｌ８−耐性遺伝子の翻訳開始の後の３′ 一方向で３０ｂｐにあるｐＡＧ−２のＸｈｏＩ切断部位に、突出末端の補充後に 、プロモーター領域及びＡ、ゴシビイからの翻訳伸長因子ＥＦ−１αのための遺 伝子（ＴＥＦ−遺伝子）の開放読み枠の最初の２４ｂｐを保有する４０３ｂｐ長 さのＨｉｎｃｌＩＩ　Ｉ／）（ｉｎａｌｌ−フラグメントを、挿入した。そうし て生成したプラスミドｐＡＧ−１００中のフラグメントの配向を、制限エンドヌ クレアーゼマツピングによって、ＨｉｎｄＩＩＩを用いて調べた。４０３ｂＰ長 さのフラグメントの挿入によって、ＡＰＨ（３’　）ｒの１０個のＮ−末端アミ ノ酸を、Ａ。

ゴシビイ翻訳延長因子ＥＦ−１αの最初の８個のアミノ酸に代えた。他のアミノ 酸によるＡＰＲ（３”）ｒの最初の１９個のアミノ酸の欠失又は置換は、活性の 損失に結びつかない（Ｃｈｅｎ及びＦｕｋｕｈａｒａ、Ｇｅｎｅ６９　（１９８ ８）、１８１−１９２）、ｐＡＧ−１００は、サツカロミセス・セレビジアエＡ Ｒ３−エレメント２μ　ＡＲ３を保有し、かつ自律的にアシビヤ・ゴシビイ中で 複製する。

ｄ）　ｐＡＧ−１０２（第４図）、開始ベクターは、その中のＢ　ａｍＨＩ一部 位が、切断、補充及び再連結の後に不活性化されたｐＵｃ１９である。ＴＥＦ− 領域の４．６ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−フラグメントは、ｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ一部 位に、クローン化されたく矢印＝ＴＥＦ−遺伝子の開放読取み枠）、引続いて、 ｐＡＧｌｏｏからの２．１ｋｂ　５ａｌＩ−フラグメントを、末端の補充後に、 Ｓｓｐ　Ｉ一部位中にクローンさせた（細い矢印＝０４１８−耐性遺伝子の開放 読み枠、太い白色矢印÷ＴＥＦ−プロモーターＨｉｎｄＩＴ　ｌ−Ｈｌｎｃｒ　 ｒ−７ラグメント）。

ｅ）　ｐＡＧ−１０３の構築（第１Ｏ図）プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　 ＩＩ　ＳＫ−（Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ及び５ｈｏｒｔ＋Ｎｕｃ　Ｉ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１７、９４９４ｆｆ、、１９８９）のＢ　ａｍＨＩ−切 断部位に、Ａ、ゴシビイからのＴＥＦ−遺伝子を有する６、３ｋｂ　ＢａｍＨＩ 　−フラグメントをクローンさせた。このフラグメントの配向を、制限切断によ って、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｃＩＩ及びＨｉｎｄＴＩＩを用いて、調べた（ＴＥＦ −Ａ。

ゴシビイからのＴＥＦ−遺伝子、黒地上の白色矢印冨ＴＥＦ−プロモーター〕。

ｆ）　ｐＡＧ−１２１の構築 ０４１８−耐性遺伝子の３１−末端を有する６６９ｂｐの大きさのＳａｌ　ｌ− Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ−フラグメントを、ｐＡＧ−１００から単離し、かっ５ａｌ Ｉ−Ｈｉｎｄｒｌｌ−切断プラスミドｐＢｌｕｅｓｋｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ＋（ Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ及び５ｈｏｒｔ、１９８９）中に挿入した。

ｇ）　ｐＡＧ−１２２の構築 ｐＡＧ−１２１のＨｉｎｄｒ　Ｉ　Ｉ−切断部位に、ＴＥＦ−プロモーターに融 合したＧ４１８−耐性遺伝子の補完性５′　−末端を有する９４０ｂｐの大きさ のフラグメントを神大した。このフラグメントを、ＨｉｎｄｌｌｒでのｐＡＧ− １００の切断によって得た。このフラグメントの挿入によって、新たに、完全な Ｇ４１８−耐性遺伝子が生じる。

ｈ　）　ｐ　Ａ　Ｇ　−１４５の構築（第１１図）ｐＡＧ−１０３をＨｉｎｄｌ 　Ｉ　ｒで部分的に切断し、かつ線状化プラスミドをアガロースゲルから分離し た。

突出末端を、ＤＮＡ−ポリメラーゼエのフレノウ−フラグメントの使用下で、補 充によって、鈍端に変え、かつＴＥＦ−プロモーターの制御下で、カナマイシン 耐性遺伝子を有するｐＡＧ−１２２がらの１．６４ｋｂの大きさのＢａｍＨＩ／ ５ａｌｒ−フラグメントを、突出末端の補充後に、挿入した。０４１８−耐性遺 伝子の位置及び配向を、制限切断によって調べた（黒地上の白もしくは陰線矢印 −ＴＥＦ−プロモーター（ＨｉｎｄＩｒＩ／１Ｈｉｎｃｌｌ−フラグメント）； 陰線コＧ４１８−耐性遺伝子）、補充された５ａｌｒ−及びＨｉｎｄｌＩＩ−切 断部位の融合は、再びＨｉｎｄＩＩＩ−切断部位を生ずる。

例３ ＴＥＦ−遺伝子領域−ベクターを用いるＡ、ゴシビイの形質転換 形質転換は、次の概要により行なったニー胞子的１−２Ｘ１０’を有するＭＡ２ （２００ｍｌ）を接種する、 一阻板付きフラスコ（Ｓｃｈｉｋａｎｅｎｋｏｌｂｅｎ）中、３５０Ｕｐｍで、 ２７℃で、３２−４０時間、恒温保持する、 一ミセルを吸引濾過で濾別し、かつＨｚ　Ｏ３０ｍ　ｌ中で１ｘ洗浄する、 一新鮮重量を測定する（約２−３ｇ）、−ミセルをＳＤ３０ｍｌ中に＠濁させ、 かつ振盪語中で３０℃で３０分間恒温保持する、 −ミセルを、新鮮重量１ｇ当りＳＰＥＺ５−１０ｍｌ中に懸濁させる、 一水浴振盪器中で、３０℃で恒温保持し、プロトプラスト化を顕微鏡で調べる（ ３０分間後に、９０％以上のプロトプラスト化度が達成しているはずである）− ブロトプラスト！！濁液を、ガラス濾過器（Ｓ　ｃ　ｈ　。

１１、孔度１）を介して濾過する、 −濾液を５分間遠心分離する（Ｓｏｒｖａｌｌ　５Ｍ２４　Ｒｏｔｏｒ、１８０ ０Ｕｐｍ）、−沈殿物をＳＴ２Ｏｍ１中でＩＸ及び３７０２０ｍｌ中でｌｘ洗浄 する、 一プロトプラストを３７０２０ｍｌ中に！！！４させ、かつ計数室で力価を測定 する、 一遠心分離後に、プロトプラストをＳＴＣ中４×１０８／ｍ１の密度まで再！！ ！濁させる、−プロトプラスト懸濁１００ｍ１を、ＴＥ最大１５ｍ１中のＤＮＡ に加え、かつ混合させる（線状化ＴＥＦ−遺伝子領域一ベクターでの組込み形質 転換のためのＤＮＡ−量：１５−１５−２Ｏ、 −室温で１５分間恒温保持する、 −ＰＴＣ４０（１ｍｌ）を慎重に加え、かつ転回によって混合させる、 一５分間遠心分離する（Ｈｅｒａｅｕｓ　Ｂｉｏｆｕｇｅ　Ａ、１５００Ｕｐｍ ）、 一上澄液を慎重に除去し、かつ沈殿をＳＭＴＣＩ　１ｍｌ中に懸濁させる、 一２７℃で３時間恒温保持し、全部で約４５分間、転回によって混合させる、 一遠心分離後に、沈殿物をＳＭ　１ｍｌに懸濁させる、−懸濁液を、５ＭＡ２上 層９ｍｌと混合させ、かつ５ＭＡ２平板上に加える（平板１個当り５ＭＡ２−寒 天２０ｍ１）、 一平板を２７℃で１８時間恒温保持する、−平板を０４１８で被覆する（Ｇ４１ ８［液０．５４ｍ１＋）！、ｏ　ｏ、４６ｍ１＋０．５％アガロース６　ｍｌ　 （Ｈｓ　Ｏ中、４２℃に予備加熱した））、−平板を２７℃で更に恒温保持し、 形質転換体は３−６日間後に可視可能である。

培地及び溶液 培地：ＭＡ２：ペプトン（Ｇｉｂｃｏ、カゼイン加水分解物、Ｎｏ、１４０）＋ 　Ｌｏｇ／ｌ酵母エキス（Ｇｉｂｃｏ）：　Ｉｇ／ｌブドウＷ　、　Ｌｏｇ／ｌ ミオ−イノシトール　０．３ｇ／ｌ ５ＭＡ２−寒天：ソルビトール、　１Ｍペプトン、　Ｌｏｇ／ｌ 酵母エキス：’　１　ｇ　／　１ ブドウ糖　２０　ｇ　／　１ ミオ−イノシトール　０．３ｇ／ｌ 寒天（Ｇｉｂｃｏ））　１２ｇ／ｌ ５ＭＡ２−上層　５ＭＡ２−寒天と同様、寒天の代りに０．８％アガロース 溶液： ＳＤ：ンルビトールＬＭ、ジチオトレイトール５０ｍ５ＰＥＺ　：　／ルビトー ルＬＭ；Ｎａ−燐酸塩、緩衝液’　ｌｏｍＭ　ｐＨ５，８；ＥＤＴＡ１０ｍＭチ モリアーゼ２０７２ｍｇ／ｍｌ”　（Ｓｅ　ｉｋａｇａｋｕ　Ｔｏｇｙｏ　Ｃｏ 、、Ｔ。

ｋｙｏ） ＳＴ：ンルビ）−ル１Ｍ；　トｌＪス−ＨＣｌ　１０ｍＭ、Ｈ８ ５ＴＣ：ソルビト−）Ｌ４Ｍ　；　ト１）ス−ＨＣｌ　１０ｎＭ、ｐＨ８；　Ｃ ａＣｌｚｌ　ＯｍＭ ＴＥＡ）、リス−ＨＣｌ　ｌｏｍＭ；ＥＤＴＡｌｍＭＥＤＴＡ・エチレンジアミ ンテトラ酢酸トリス：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンＳＤＳ・ラウリ ル硫酸ナトリウム ｃｌｄＨ，Ｏ・再蒸留水 ＴＢＥ　：　トリス１００ｍＭ、ｌａｌ酸１００ｍＭ、ＥＤＴＡ２ｍＭ、ｐＨ＝ ８．０ ＰＴＣ４０：　４０％（ｗ　／　ｖ　）ポリエチレングリコール４０００　（Ｍ ｅ　ｒ　ｃｋ）；　トリス−Ｃ１１０ｍＭ　ｐＨ８；ＣａＣ１，１０ ’　ｍＭ ＳＭＴＣ置５０％ＳＭ　（ｆｆｌ記参照）；５０％ＳＴＣ；ミオーイノシトール ０．０３ｇ／Ｉ ＳＭ：５Ｑ％２Ｍソルビトール：５０％ＭＡ２Ｇ４１８−ｒｌＨ：ＨｓＯＣＰＧ ４１Ｂ　２０ｍｇ／ｍ１（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、Ｇｉｂｃｏ） 例４ ｐＡＧ−１０２でのＡ、ゴシビイの形質転換プラスミドｐＡＧ−１０２（第４図 ）は、アシビヤ・ゴシビイーＴＥＦ−＠域（ＴＥＦ−翻訳延長因子ＥＦ−１ａの 遺伝子）からの４．６ｋｂ　ＥｃｏＲＩ　−７ラグメントを保有する。更に、プ ラスミドは、アシビヤ・ゴシビイ形質転換体にアミノグリコシド０４１８に対す る耐性を与えるＴＥＦ−プロモーターの制御下で、Ｇ４１８−耐性遺伝子を有す る。プラスミドは、アシビヤ・ゴシビイ中の自律的複製のためのシグナルヲ持ｔ ＝ｔイ、ｐ　ＡＧ　−１０２ＤＮＡハ、ＴＥＦ−相同領域（ＴＥＦ−遺伝子の３ ′末端）内で、ＢａｍＨＩ一部位で切断され、がつアシビヤ・ゴシビイの形質転 換のために、例３によるプロトプラストを使用する。

それによって、ＴＥＦ−遺伝子の相同の組換え３′が誘発され得る。８つの独立 して得られるＧ４１８−Ｉｉｔｆ％Ｍｌｔ転ａ体（ＬＵ８３３４−ＬＵ８３４１ ．ＤＳＭＢｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇに寄託された）は、クローン精製、及び選択 圧力無しで、その６４１８−耐性を保持していた。ｐＡＧ−１０２ＤＮＡは、ア シビヤ・ゴシビイゲノムに、安定して、組み込まれた。

第５ａ図は、８つの形質転換体及び野性型菌株（中央の軌道）の染色体分画化を 示す。ＴＥＦ−遺伝子は、可視の５つの染色体の最大のものの上にあり、その中 に、全８例において、プラスミドが同様に組み込まれていた（第５ｂ図）。

ＴＥＦ−遺伝子座を有するＢｇｌＩＩ−フラグメントは、野性型８ｇ１１１−フ ラグメントに比較して、全８つの形質転換体において、約１０ｋｂ程長い（第６ 図）ので、この組み込みは、独占的に、ＴＥＦ−遺伝子座で起った。相同ｌＩｒ 換えは、第７図により、４゜６ｋｂ　ＴＥＦ−領域の正確な二重に結びつくはず である。このことは、ＢａｍＦ（Ｉ及びＥｃｏＲＩでの切断後の形質転換体及び 野性型ＤＮＡの分析が示すように、正当である（第８ａ、ｂ図）。

検査のために、染色体及びプラスミドのＮ　Ｄ　Ａの間の“ノベル・ジョインッ （ｎｏｖｅｌ　ｊｏｉｎｔｓ）“を有するＤＮＡ−フラグメントを、８つの形質 転換体の３つから、クローン化した。ＢａｍＨ［部位の領域での配列分析は、野 性型ＤＮＡに比較して、変性を示さなかった。

一７０℃で１年間貯蔵した後に、８つの形質転換体を再び、しかも新たなミセル 成長及び胞子形成後に、分析した。その際、分析されたクローンの３つが、部分 的に配列−置換（Ｕｍｌａｇｅｒｕｎｇ）を伴なう、２つのプラスミドコピー、 及び２つどころか、むしろ３つのプラスミドコピーを有する（′Ｍ９図）ので、 増幅についての指摘がなされた。この置換は、０４１８−耐性遺伝子の縦列置換 になるらしい、この置換についての理由は、多分、プラスミドコピー１つ当り、 ２つのＴＥＦ−プロモーター領域に基因する（第４図参照）。

例５ ｐＡＧ−１４５でのＡ、ゴシビイの形質転換Ａ、ゴシビイーブロトブラストを、 ＢａｍＨＩ−切断プラスミドｐＡＧ−１４５で形質転換した。それによって、Ｔ ＥＦ−遺伝子からの相同組換え５′及び３′が同時に誘発された。５つの形質転 換体をクローン精製Ｉ製し、かつカナマイシン耐性遺伝子の組込みについて、サ ザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）−分析によって、調べた。ＥｃｏＲｒ−切断ＤＮＡの 分析を、各形質転換体の２つのクローン精製菌株で行ない、Ｂ［（ｌＩｒ−切Ｆ ｒＤＮＡの分析を、各形質転換体の１つのクローン精製菌株で行なった。これら の分析の結果は、第１３図及び第１４図に示されていて、データの説明は、第１ ５図中の模型により行なわれる。

全ての形質転換体は、Ｂｇｌｔｌ−サザンにおいて、２つの帯域を示す：約１８ ．６ｋｂの長さを有する大きい方の帯域は、非形質転換野性型には現われない。

それは、Ｇ４１８−耐性遺伝子の組込み後のＴＥＦ−遺伝子座に相応する（第１ ５ｂ図参照）、約１７ｋｂの長さを有する小さい方の帯域は、野性型にも現われ 、これは組込まれる０４１８−耐性遺伝子無しのＴＥＦ−遺伝子座に相応する。

それは、ＴＥＦ−遺伝子座の野性型−コピーから、形成され得るか、又は、組込 み後の二次的現象によって、つまり、２つのＴＥＦ−プロモーターコピーの間の 相同組換えによる０４１８−耐性遺伝子の欠失によって生成されつる（第１５ｃ 図参照）。

このことは、組込まれた異種マーカーが、配列シグナル又は遺伝子の組込みが行 なわれた後に、欠失されなければならないという条件下では有利であろう。

これを調べるために、ＥｃｏＲＩ−切断ＤＮＡでの分析を実施した。０４１８− 耐性遺伝子のＴＥＦ−プロモーターフラグメントの前に、付加的なＥｃｏＲＩ− 切断部位があり、これはｐＡＧ−１２２のポリリンカーから由来し、従ってＴＥ Ｆ−遺伝子のＴＥＦ−プロモーターフラグメントの前には現われない。組込み及 び引続いての欠失により、形質転換体中に１７ｋｂの大きさのＢｇｌｌｌ−フラ グメントが生成される場合には、付加的なＥｃｏＲｒ−切断部位が実証されるは ずであり、なぜならば、それは倍加された領域の前にあり、従って欠失されるは ずがないからである（第１５ｃ図参照）、この場合には、おそらく形質転換体は 、もはや、野性型−遺伝子座の１．５５ｋｂの大きさのＥｃｏＲＩ−フラグメン トを有せず、その代りに、１．３２ｋｂ及び０．２７ｋｂの大きさのフラグメン トを有するにちがいない、形質転換体１．３．４及び５については、１．５５ｋ ｂの大きさのフラグメントの不在、並びに１．３２ｋｂの大きさのフラグメント の出現を示すことができた（第１４図）。

クローン精製形質転換体１〜５を用いて、安定性試験を実施した。ミセルを、非 選択培地上で、６日間恒温保持し、引続いてミセルを各コロニーの縁から、非選 択培地の新しい平板上に、並びに選択培地を有する平板上に移した。非選択培地 上で更に３日間恒温保持した後に、再びミセルを新しい平板上に移した。非選択 性の成長の６日間後に、全ての形質転換体は、未だ０４１８−耐性であった。９ 日間後に、形質転換体ｌ、２及び３は、Ｇ４１８に対するその耐性を失った。そ の損失は、ＴＥＦ−プロモーターフラグメント間の相同組換えによって制限され ていることを、サザンデータは示す、この構築で認められた、異種マーカー（０ ４１８−耐性遺伝子）の比較的に高い欠失頻度は、同時形質転換の場合には、事 情によっては、有利である。

ａ）　アシビヤ・ゴシピイの培養 液体培地中又は平板培地上での培養は、ミセル又は胞子を接種することによって 達成される。

培地：ＭＡ−２（１１）：ペプトン　１ｇ酵母エキス　１ｇ ブドウ糖　ｌｏｇ 寒天　１２ｇ 選択培地：ＭＡ−２−Ｇ４］、８　：ＭＡ−２＋Ｇ４１８（２００ｍｇ＞／ｍ１ ｂ）　ＤＮＡ−分離 １、阻板付きフラスコ中で、ＭＡ−２−培地中の液体培養を調製する。その際、 培地２００ｍ１は、ミセル約１．５ｇを産出する。２７℃で４８時間にわたる恒 温保持。

２、ミセル洗浄　ミセルを吸引ポンプで吸引濾過する。

ミセルをｄ　ｄ　Ｈ！　０３０　ｍ　ｌ中に入れる。

２〜３回繰り返す。

３、次いで、ミセル（約１．５ｇ）を、５ＣＥ−緩衝液３０μｌ中に入れる ＳＥＣ１Ｍ　ソルビトール ０．１Ｍ　クエン酸ナトリウム ６０ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８ ４，２−メルカプトエタノール（１４Ｍ）３０ｍｌの添加 ミセル１．５当り、チモリアーゼ５ｍｇの添加。

５．３７℃で１時間恒温保持 ６、プロトプラスト化を顕微鏡で検査し、力１つ場合１二より、恒温保持時間を 延長する ７、０．５Ｍ　ＥＤＴＡ　ｐＨ７，５（３ｍｌ）の添加ｌＯ％ＳＤ３３ｍｌの添 加 ８、室温で５分間の恒温保持 ９、ミセル１．５ｇ当り、プロテイナーゼに５ｍｇの添加 １０．３７℃で１時間恒温保持 １１、容量の測定 ５Ｍ酢酸アンモニウム−溶液同容量の添加１２、　遠心分１１１５分間−１５０ ００Ｕ／分１３、沈殿物を捨てる １４．２．５倍の容量でエタノール沈殿１５、遠心分離１０分間−１００００Ｕ ／分１６、沈殿物を７０％エタノール中で洗浄し、乾燥させかつＴＥ１０　：　 １　（４ｍｌ）中で再！！濁させる １７、リボヌクレアーゼ０．５ｍｇの添加１８．３７℃で１時間恒温保持 １９、フェノール−抽出 ２０、フェノール−クロロホルム−抽出２１、容量の測定 ２２．５Ｍ酢酸アンモニウム−溶液同容量及びエタノール２．５倍容量でのＤ　 Ｎ　Ａ−沈殿２３、ＴＥＩＯ：　１　（１ｍｌ）中にＤＮＡを再！！濁させる。

Ｃ）　サザンー分析のためのＤＮＡ−切断バッチ毎に、Ｄ　Ｎ　Ａ約１μｇを切 断した。

ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ−二重消化 ＤＮＡ　２０μｌ ｌＯ本ＭＳ−緩衝液　２０μｍ ３７℃で一晩恒温保持 Ａｓ−ＭＩＷｔ液１０μｌの添加 ＥｃｏＲ７１０単位の添加 ３７℃で一晩恒温保持 ＢｇｌＴＩ−消化： ＤＮＡ　２０μｍ １０＊ＭＳ−緩衝液　２０μｍ ３７℃で１晩恒温保持。

引続き。

５Ｍ酢酸アンモニウム−溶液同容量及びエタノール２．５倍容量でのＤＮＡ−沈 殿。

遠心分離１５分間−１５０００Ｕ／分 沈殿物を７０％エタノール中で洗浄 沈殿物を乾燥させ、かつＴＥＩｏ・１（２０μｍ）中で再＠濁させる。

！１ａＩｒ液＋　１　＊Ｍ’５−Ｊｌ＠液：５０ｍＭ　ＮａＣ１１０ｍＭ　Ｍｇ ＣＬ Ａｓ−緩衝液：５００ｍＭ　ＮａＣ１ 経過条件： Ｅｃｏ／Ｂａｍ−消化のため：０．８％アガロースゲル３ｖ／Ｃｍ 連続時間８時間 ＢｇｌＩＩ−消化のため一〇、６％アガロースゲルｌ　Ｖ　／　Ｃｍ 連続時間６６時間 そうして得られるゲルを、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ−膜上０℃で２時間焼いた。ブレノ １イブ１ノ・ソド形成、ノーイブリッド形成及び引続ｔ１ての後洗浄を、厳正な 条ｆ牛下で、非放射性テ実施した（’　Ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｋｔ　ｉｎ’Ａｐ ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　Ｍａｎｕａｌ、Ｂ。

ｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｂｅｓｔｅｌｌｎｕｍｍｅｒ：１０９３ 　６５７）。

ｄ）　０ＰＡＧＥ−調製 １、ミセルの新鮮重量を、Ｍ　Ａ　−２液体培地の吸引濾過後に、測定する ２、ミセル０．５ｇを、５０ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ７゜５　（２ｍｌ）中に再懸 濁させる ３、緩衝液■の添加 ４、低融点アガロース（Ｌｏｗ　Ｍｅｌｔｉｎｇ　Ａｇａｒｏｓｅ）（４０℃） ５ｍｌの慎重な添加５、混合物をベトリシャーレ（直径５ｃｍ）中に入れ、かつ 凝固させる ６、緩衝液ＩＩを上に入れる ７、３７℃で一晩恒温保持する ８、緩衝液ＩＩを吸引濾過し、かつ緩衝液ＩＩＩを添加する ９、５５℃で一晩恒温保持する １０、調製物の保存のために、緩衝液ＩＩＩを吸引濾過し、かつ０．５Ｍ　ＥＤ ＴＡ　ｐＨ８，５（５ｍｌ）と代え、かつベトリシャーレを４℃で保存する。

緩衝液　Ｉ・チモリアーゼ　３ｍｇ ０．５Ｍジチオトレイトール ２０ｍ１ ＳＣＥ　０．９ｍ１ ＩＩ：０．５Ｍ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８，５４，５ｍｌ １Ｍトリス−ＭＣＩ　ｐＨ８ ０ｍ１ ０８５Ｍジチオトレイトール ００ｍ１ ｄ　ｄ　Ｈｚ　０　２５０　ｍ　Ｉ ＩＩＩ　プロティナーゼＫ　５ｍｇ Ｎ−ラウロイルザルコシネート ０ｍｇ ０．５Ｍ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８ ４，５ｍ１ １Ｍトリス−ＭＣＩ　ｐＨ８ ５０μＩ ｄｄＨ，０４５０μｌ 低融点アガＯ−ス：０．１２５Ｍ　ＥＤＴＡ　ｐＨ７゜５中１％ ｅ　）　Ｑ　Ｆ　Ａ　Ｇ　Ｅ−経過（装置：ＲｏｔａｐｈｏｒＯｌＢ　ｉ　ｏｎ ｅ　ｔ　ｒ　ａ） １．０ＰＡＧＥ−調製物から、小塊を切り取る２、５０ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ７ ，５（５ｍｌ）中で室温でｌＩｌｌｌＩＭ、３回洗浄する ３、ゲル袋状物中に小塊を挿入する ゲル：０．４ＩＴＢＥ中１％アガロースゲル４、経過条件、経過時間２０時間 パルス時間　４８秒間 ａｍ液温度　４−９℃ 経過緩衝液　０．４＊、ＴＢＥ 電圧　３００Ｖ 電流の強度　８０８０−９Ｏ 第５〜９図及び第１２〜１４図についての説明第５図ａ　：　０ＰＡＧＥでの染 色体分離左から右へ　ＬＵ８３３４、ＬＵ８３３５、ＬＵ８３３６．　ＬｔＪ８ ３３７．　ＡＴＣＣ１０９８５、ＬＵ８３３８、ＬＵ８３３９、ＬＵ８３４０、 ＬｔＪ８３４１゜ ｂ・分離された染色体のｐＵＣ１９ＤＮＡプローブでのハイブリッド形成。

第６図　菌株のＢｇｌｌｒ切断ＤＮＡの分画化（右から左へ）：ＬＵ８３３４、 ＬＵ８３３５、ＬＵ８３３６、ＬＵ８３３７、ＡＴＣＣ１０９８５、ＬＵ８３３ ８．ＬＵ８３３９、ＬＵ８３４０、ＬＵ８３４１及びｐＡＧ−１０２ＤＮＡプロ ーブでのハイブリッド形成。

第７図　相同組換えを経たプラスミドｐＡＧ−１０２の挿入図、染色体ＤＮＡは 、太い線、プラスミドＤＮＡは細い、又は二重の線によって示されている。

矢印は、ＴＥＦ−読み枠の位置を示す。Ｂ＝ＢａｍＨＩ、Ｅ＝ＥｃｏＲＩ、Ｂｇ ｌ−８ｇ＋１１ 第８図ａ　：　Ｂ　ａｍＨＩプラスＥｃｏＲＩ切断ｐＡＧ−１０２及びアシビヤ ・ゴシビイＤＮＡ並びにＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ及びＥｃｏＲＩ切断切λＤＮＡの分 画化、左から右へ：λ、ｐＡＧ−１０２、ＡＴＣ：ＣＩ　Ｏ８９５、ＬＵ８３３ ４〜ＬＵ８３４１、λ。

ｂ　：　ｐＡＧ−１０２ＤＮＡブローブテノノーイブリツド形成。

Ｃ１露出不足（Ｕｎｔｅｒｅｘｐｏｎｉｅｒｕｎ、　ｇ　＞時のｐＡＧ−１０２ 帯。

第９図：２回クローン精製されたｐＡＧ−１０２形質転換体１〜８のＢｇｌｌｌ −切断ＤＮＡの分析。

２回クローン精製されたｐＡＧ−１０２−形質転換体、並びに非形質転換化の野 性型のＤＮＡを、Ｂｇ　ｌ　ｆ　ｒテ切断し、０．４％のアガロースゲル上で分 画し、かつサザンー実験で、放射性標識化のｐ　ＡＧ−１０２−ＤＮＡに対して 、ハイブリッド形成させた。野性型−コピーに対応した約１７ｋｂの大きさのフ ラグメントは、形質転換体のどれにも出現しなかった。その代りに存在する帯域 は、形質転換体２．３及び６においては、単一の組込みを示し、並びに形質転換 体１．４．５．７及び８においては、二重−もしくは三重の組込みを示し、この ことは、その他の切断によって確認される。形質転換体１〜８は、ＬＵ８３３４ 〜ＬＵ８３４１から誘導される。それらは、これらの菌株に比較して、もう１回 、クローン精製されている（ｗｔ：野性を）。

長さの表示は概数を示す。

第１２図　ｐＡＧ−１０２及びｐＡＧ−１４５の組込みのために使用された相同 領域の対比。

ａ：ｐＡＧ−１０２の相同領域：４．６ｋｂｂ＋ｐＡＧ−１４５の相同領域：６ ．３ｋｂＢ　ａｍＨＩ　− フラグメント 矢印は、相同組換え後の、ゲノム中のどの部位に、異種−ＤＮＡが組込まれてい るかを示す。

第１３図：５つのｐＡＧ−１４５−形質転換体のＢｇＩｌｌ−切断ＤＮＡでのサ ザン Ｓつのクローン精製されたプラスミドｐＡＧ−１４５の形質転換体及び非形質転 換化の出発菌株のゲノムＤＮＡを、Ｂｇｌｌｌで切断し、０．４％のアガロース ゲル上で分画し、かつ放射性標識化のｐＡＧ−１４５−ＤＮＡに対するサザンー 実験でハイブリッド形成させた。全ての形質転換体（帯域１〜５）は、約１７ｋ ｂの長さを有するシグナルを示し、これは野性型−ＤＮＡ帯域６）においても出 現する。全ての形質転換体は、その他に、約１８．６ｋｂの長さのフラグメント を有し、これは１７ｋｂの大きさのＢｇｌＩＩ−フラグメントへのＧ４１８−Ｉ ｔ性遺伝子の組込みを示す。

第１４図、５つのｐＡＧ−１４５−形質転換体のＥｃｏＲＩ−切断ＤＮＡでのサ ザン プラスミドｐＡＧ−１４５の５つの形質転換体の２つずつのクローン精製厘株並 びに非形質転換化の出発菌株のゲノムＤＮＡを、ＥｃｏＲＩで切断し、０．８％ のアガロースゲル上で分画し、かつサザンー実験で、放射性標識化ｐ　ＡＧ　− １０３−ＤＮＡに対して、ハイブリッド形成させた。形質転換体ｌ（帯域１．２ ）、３　（帯域５．６）、４（帯域７．８）及び５（帯域９．１０）は、野性型 −ＤＮＡ　（帯域１１）中に出現する１、５５ｋｂのフラグメントを、もはや持 たないが、その代りに、１．３２ｋｂの大きさのフラグメント及び付加的に１゜ ６ｋｂの大きさのフラグメントを有し、これはＧ４１８−１１を性遺伝子に相応 する。この長さのフラグメントは、ＥｃｏＲＩ−切断ｐＡＧ−１４５−ＤＮＡで の帯域（帯域１２．１３）中にも現われる。形質転換体２（帯域３．４）は、１ ．６ｋｂの大きさのフラグメント（０４１８−耐性遺伝子）及び１．５５ｋｂフ ラグメントを示し、このことは、二倍体化又は遺伝子変換を示す。

従って、相同領域が局在化されている最も大きい染色体について、二倍体化が起 フたかどうかを、０ＰＡＧＥ　（ｏｒｔｈｏｇ。

ｎａｌ　ｆｉｅｌｄ　ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ　ｇｅｔ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏ ｒｅｓｉｓ）に依り検査した。これについて、何の言及も得られなかった。全て の形質転換体において、５．１５ｋｂ及び４，６ｋｂフラグメント及び他のシグ ナルの不在が、相同組換えを証明する。

第１５図、Ａ、ゴシビイのゲノムへのｐＡＧ−１４５からのＢ　ａｍＨｒ−フラ グメントの組込み、並びに引続いての、相同組換えによるＧ４１８−耐性遺伝子 の欠失の模型。

黒横線　ＴＥＦ−プロモーター（ＨｉｎｄｆＩｒ／Ｈｉｎｃｌｒ−フラグメ ント）、 Ｇ４１８ｒ：Ｇ４１８−耐性遺伝子、 ＴＥＦ：Ａ、ゴシビイＴＥＦ−遺伝子、矢印、転写方向。

ＣＴＴ、ＣＣＴＣＧＴ　ＣＣＣＧＣＣＧＧＧＴ　ＣＡＣＣＣＧＧＣＣＡ　ＧＣＧ ＡＣＡπＧＡφＣＣＣＡＧ触Ｔ　ＡＣＣＣＴＣｃπＧ　１２O ＴＧＡＡＴＴＣＴＣＣＣＣ入Ｃｃｃｔ：ｃｃｃ　ＣＣＣＣＴＧＴＡＧＡ　ＣＡＡ ＡＴＡＴＡＡＡ　ＡＧＧＴＴＡＧＧＡＴ　ＴＴＧｃｃＡｃＴfＡ　３６０ ｃｃ７ｒ′ｃＴ’ｒｃｒｒ　ＴＣＡＴＡＴＡＣＴＴ　ＣＣＴｒＴｒＡＡＡＡ　Ｔ ＣＴｒＧＣＴＡＧＧ　ＡＴＡＣＡＧＴｒＣＴ　ＣＡＣＡＴＣ`ＣＡＴ　４２０ ＣＣにＡＡＣＡＴＡＡ　ＡＣＡＡＡＡ　ＡＴＧ　ＧＧＴ渇Ｇ　ＧＡＡ　ＡＡＧ　 ＡＣＴ　ＣＡＣＧＴＴ靜ＣＣ胃Ｇπ　４６９ＭｅＣＧＩＹ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌ ｙＳ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　ＡＳｎ　Ｖａｌ　ＶａＬｌ　５　１０ ＣＴＣＡＴＣＧＧＴ　ＣＡＣＧＴＣＣ；ＡＣＴＣＴ　ＧＧＴ　ＡＡＧ　ＴＣＴ　 ＡＣＴ　Ａｃｅ　ＡＣＣＧＧＴ　ＣＡＣＴＴＧ　５１７ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ 　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　入ｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ 　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　ドｉｓ　ＬｅｕＧＡＧ　ＧＣＴ　ＧＧＴ　ＡＴＣＴＣＣＡＡ Ｇ　ＧＡＣＧＧＴ　ＣＡＧ　Ａｃｅ　’ＡＧＡ　（ＪｃＧ　ＣＡＣＧＣＴ　ＴＴ Ｇ　Ｔ”１℃　W５３ ＴｒＣＧＴｒ　ＣＣＡ　ＡＴＣＴＣＣＧＣ；ＣＴＧＧ　ＡＡＣ（ＪＴ　ＧＡＣＡ ＡＣＡＴＧ　ＡＴｒ　ＧＡＧ　ＧＣＣＡＣＣ１０４５ＡＣＣＡＣＴ　ＧＡＡ　Ｇ ＴＣＡＡＧ　Ｔｃｃ　ＣＴＣＧＡＧ　ＡＴＧ　ＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡＡ　Ｔｒ Ｇ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　１３］３Ｔｈｒ　Ｔｈｘ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｓｅ ｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｍｅｃ　Ｈｉｓ　）ｌｉｓ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｇ ｌｕ　ＧＬ■ ＧＧＴ　ＧＴＣＣＣＡ　ＧＣＴ　ＣＡＣＡＡＣｃｒｒ　ｃｃＴ　ＴＴｃ　入ＡＣ ＧＴＣＡＡＧ　ＡＡＣＧＴＣＴＣＣＧＴＣｌコ８１Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｇ ｌｙ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　ｖａＬ　Ｌｙｓ　Ａ ｓｎ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　ＶａＬＡＡＧ　ＧＡＧ　ＡＴＣＡＧＡ　ＡＧＡ　（、Ｇ Ｔ　ＡＡＣＧＴＴ　’Ｉ’ｊＳＣＧＣＴ　ＧＡＣＴＣＣＡＡＧ　ＡＡＣＧＡＣＣ ＣＡ　１４Q９ Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｍｇ　ＧＬｙ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｇ ｌｙ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　入ｓｎ　Ａｓｐ　Ｐｒ。

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ドイツ連邦共和国　Ｄ　−７９５０ビーベラツバ　マルティンールターーシュト ラーセＩ （７２）発明者　タルト、ローランド ドイツ連邦共和国　Ｄ−６７０３リムブルガーホーフ　ヘルダーシュトラーセ　 ２９（７２）発明者　フィリプゼン、ベータースイス国　ＣＨ−４１２５リーヘ シ　ミューレシュ　ティークシュトラーセ　２８

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．アシビヤ・ゴシピィの１つ又はそれ以上の遺伝子領域によって側面に接せら れた新たに組換えるべきＤＮＡを保持するベクターでアシビヤ・ゴシピィを形質 転換することを特徴とする、相同組換えによるアシビヤ・ゴシピィの特異的な遺 伝的変性法。
2. ２．アシビヤ・ゴシピィの遺伝子領域として、翻訳延長因子ＥＦ−１αの遺伝子 座の範囲のＤＮＡ−配列を使用する、請求項１に記載の方法。
3. ３．ベクターとして、プラスミドＰＡＧ−１０２又はそれから誘導された誘導体 を使用する、請求項１に記載の方法。
4. ４．ベクターとして、プラスミドｐＡＧ−１４５又はそれから誘導された誘導体 を使用する、請求項１に記載の方法。
5. ５．請求項１〜４に記載方法によって得られる遺伝的に変性されたアシビヤ・ゴ シピィ−菌株。
6. ６．ＬＵ８３３４〜ＬＵ８３４１から成る群から選択された、遺伝的に変性され たアシビヤ・ゴシピィ−菌株。