CN107653238A

CN107653238A - 一种羰基还原酶基因工程菌固定化细胞及其应用

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Publication number: CN107653238A
Application number: CN201710965085.0A
Authority: CN
Inventors: 柳志强; 郑裕国; 张晓健; 姚丹凯; 王亚军; 郑玲; 王文重
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2017-10-17
Filing date: 2017-10-17
Publication date: 2018-02-02
Anticipated expiration: 2037-10-17
Also published as: CN107653238B

Abstract

本发明提供了一种利用固定化大肠杆菌(E.coli)工程菌细胞催化合成他汀类药物手性中间体(3R,5S)‑6‑氯‑3,5‑二羟基己酸叔丁酯与(3R,5R)‑6‑氰基‑3,5‑二羟基己酸叔丁酯的方法。包括含羰基还原酶大肠杆菌工程菌的培养、固定化细胞的制备、固定化细胞催化新型药物手性中间体(3R,5S)‑6‑氯‑3,5‑二羟基己酸叔丁酯与(3R,5R)‑6‑氰基‑3,5‑二羟基己酸叔丁的合成。本发明方法采用固定化生物大肠杆菌工程菌细胞为催化剂，稳定性好，使用寿命长，有机溶剂耐受性好，可多次重复利用，并且无需昂贵的外源辅酶添加，可在有机相反应体系中催化他汀药物中间体的合成，产品产率与纯度高，并可大幅度降低生产成本，简化工艺步骤，减少“三废”排放，在他汀类药物手性中间体的工业化生产中具有极高应用价值。

Description

一种羰基还原酶基因工程菌固定化细胞及其应用

(一)技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种固定化含羰基还原酶微生物细胞的方法及以固定化细胞为催化剂，合成他汀类药物中间体(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯和(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法。

(二)背景技术

进入新世纪以来，心脑血管疾病已经成为我国乃至全球范围内危害人类生命健康的首要疾病。他汀类药物可通过抑制HMG-CoA还原酶，有效降低血脂水平，防止动脉粥样硬化和冠心病的发生，是国内外心脑血管疾病防治的重大基础药物。(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯和(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯参与构筑他汀类药物的主要药效基团，是新型他汀类药物瑞舒伐他汀钙、阿托伐他汀钙与匹伐他汀钙合成的关键手性中间体，在新型他汀类药物的合成中占有重要地位。目前工业上对(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯或(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的合成主要是采用化学法羰基底物不对称还原法制备。具体是以硼氢化物为还原剂，利用手性噁唑硼烷、过渡金属配合物等手性催化剂催化潜手性底物的羰基不对称还原。该技术立体专一性控制困难，反应过程非对映诱导不充分，产物光学纯度低；且反应需在深冷条件下加氢，设备要求高；所用手性催化剂价格昂贵，生产成本高；硼氢化物易燃易爆，安全隐患大，反应产生的硼化物废物处理困难，不符合绿色化学的理念。

生物催化法因其具有高立体专一性、原子经济性、生产过程绿色等优势，在手性医药中间体合成中具有极大的开发价值。羰基还原酶(Carbonyl reducatase)可催化潜手性羰基的不对称还原，具有高化学、区域和立体选择性的突出优势，并且反应条件温和、原子经济性高、环境友好。利用羰基还原酶生物催化羰基不对称还原已成为近年来开发(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯和(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯新型合成技术的研究热点，目前已有多种不同来源(Saccharomyces cerevisiae、Pichia angusta、Pichia haplophila、Beauveriabassiana等)的羰基还原酶可用于上述产品的合成。采用羰基还原酶与葡萄糖还原酶共表达工程菌细胞，进行催化反应，可以实现辅酶NAD(P)H循环，无需额外昂贵辅酶添加，进行(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯和(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的高底物浓度与高时空产率合成。Kizaki等利用来源于CandidamagnoliaIFO 0705的羰基还原酶基因与Bacillus megaterium IA1030中得到的葡萄糖脱氢酶基因在大肠杆菌中进行共表达，底物(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯浓度为200g/L，反应24h，(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯产率达97.2％，d.e.值98.5％。Codexis公司对来源于Saccharomyces cerevisiae的一株羰基还原酶(GenBank No.NP010159.1)进行了分子改造并与葡萄糖脱氢酶共表达并用于(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的合成，在不添加外源性辅酶的情况下，反应7h，产物d.e.值大于99.5％，时空产率达到120g/(L·d)。

利用固定化技术对细胞处理，可增强酶与细胞的稳定性，提高细胞对有机溶剂、机械剪切力耐受，避免细胞破裂后内容物释放至反应体系，降低对产物纯化工艺造成的影响。Sun等人以利用瓜尔胶、CaCl2与海藻酸钠对含羰基还原酶酿酒酵母Saccharomycescerevisiae CGMCC No.2233进行包埋处理，所获固定化细胞用于催化还原制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯，底物浓度50g/L，转化时间24-72h，转化率为100％，e.e.值达99％。固定化细胞可重复使用15次。王爽等以介孔分子筛材料SBA-15为固定化载体，固定化羰基还原酶-葡萄糖脱氢酶融合蛋白CR2-GDH，不对称还原制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。酶活回收率达到78.1％，固定化酶在水相中连续使用7批次，残余酶活30％以上。

目前国内外在固定化细胞/酶催化他汀类药物手性中间体合成领域研究较少，相关研究存在着总酶活回收率低、固定化酶制备成本高、催化活力不理想、稳定性差、底物浓度不高、有机溶剂耐受性差等问题，严重限制了固定化生物催化剂在他汀药物关键中间体(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯和(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生产中的应用。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种羰基还原酶基因工程菌固定化方法，即以活性炭为吸附载体，以聚乙烯亚胺、戊二醛为交联剂对含羰基还原酶基因大肠杆菌E.coli细胞进行固定化的方法，以及该固定化细胞在制备他汀类药物手性中间体(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯与(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯中的应用。本发明方法联合使用吸附与共价交联技术，可实现羰基还原酶细胞的高效制备，所得固定化细胞酶活回收率高，稳定性好，有机溶剂耐受性好。将所得固定化细胞应用于水-有机相反应体系或者均一水相反应体系中，催化(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯和(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯合成，提高底物浓度、时空产率等主要指标。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种羰基还原酶基因工程菌固定化细胞，所述固定化细胞按如下方法制备：将羰基还原酶基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体用pH7.0、100mM磷酸盐缓冲液悬浮，获得菌悬液；向菌悬液中加入活性炭，在室温(20-30℃)，500rpm条件下水浴搅拌30min；再加入质量浓度5％聚乙烯亚胺水溶液，在室温，500rpm条件下水浴搅拌交联1-2h；然后加入质量浓度50％戊二醛水溶液，在室温，500rpm条件下水浴搅拌交联1-2h，抽滤，滤饼用pH7.0、100mM磷酸盐缓冲液清洗两次，抽滤去除缓冲液，即获得羰基还原酶基因工程菌固定化细胞；所述羰基还原酶基因工程菌是由SEQ ID NO.1所示核苷酸序列(编码蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示)以大肠杆菌为宿主菌构建而成；所述菌悬液中湿菌体含量为100g/L；所述活性炭加入量以菌悬液体积计为6-24g/L(优选18g/L)；所述50％聚乙烯亚胺水溶液体积用量以菌悬液体积计为2-5％(优选4％)；所述戊二醛水溶液体积用量以菌悬液体积计为1-5％(优选3％)。

所述活性炭为颗粒活性炭，在加入前先进行预处理，所述预处理方法为：将活性炭过40目筛，再加入1M盐酸中，50℃搅拌1h，抽滤，用蒸馏水清洗滤液至中性(pH值为6.9-7.1)，滤饼烘干，即为预处理后的活性炭。

进一步，本发明所述催化剂按如下方法制备：将羰基还原酶基因工程菌接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养8h，再以体积浓度1％接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD₆₀₀达0.6～0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下诱导培养10h后，4℃、8000rpm离心10min，弃去上清液，收集湿菌体。

本发明涉及一种羰基还原酶基因工程菌固定化细胞在不对称还原制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯中的应用，具体所述应用为：以羰基还原酶基因工程菌固定化细胞为催化剂，加入以(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯或(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，以异丙醇为辅助底物，以pH7的磷酸钾缓冲液(优选pH 7.0、100mM磷酸钾缓冲液)或正己烷为反应介质构成反应体系(以pH7.0的缓冲液为反应介质构成水-有机相反应体系，以正己烷为反应介质构成均一有机相反应体系)，在20-40℃、200-600rpm(优选30℃、250rpm)条件下反应15h，反应完全后，获得含(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯或(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的混合液；将混合液抽滤回收固定化细胞，滤液分离纯化，得到产物(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯或(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯。

进一步，所述催化剂用量为80-200g/L反应体系，异丙醇体积用量为10-50％(优选40％)，底物终浓度200g/L反应体系。

进一步，所述滤液分离纯化方法为下列之一：(1)当反应介质为磷酸钾缓冲液时，则将混合液抽滤回收固定化细胞，滤液先旋蒸至无液体流出，获得浓缩物，将浓缩物用乙酸乙酯萃取两次，合并有机层并用无水硫酸钠干燥、过滤获得滤液，将滤液旋蒸至无液体流出，干燥，获得(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯或(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯；(2)当反应介质为正己烷时，则将混合液抽滤回收固定化细胞，滤液用无水硫酸钠干燥、过滤，获得滤液，将滤液旋蒸至无液体流出，干燥，获得(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯或(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯。

进一步，所述底物为(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯时，其反应式见图1所示，具体地，所述的反应为：以羰基还原酶基因工程菌固定化细胞为催化剂，以(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，以异丙醇为辅助底物，以pH 7.0的磷酸钾缓冲液(优选pH7.0、100mM磷酸钾缓冲液)或正己烷为反应介质构成反应体系，在30℃、250rpm条件下反应完全后，获得含(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的混合液，将混合液抽滤回收固定化细胞，滤液分离纯化，即为产物(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯；所述催化剂用量为80-200g/L反应体系，异丙醇体积用量为10-50％(优选40％)，底物终浓度50-200g/L反应体系。

进一步，所述底物为(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯时，其反应式见图2所示，具体地，所述反应为：以羰基还原酶基因工程菌固定化细胞为催化剂，以(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯(式Ⅲ)为底物，以异丙醇为辅助底物，以pH 7.0磷酸钾缓冲液(优选pH 7.0、100mM磷酸钾缓冲液)或正己烷为反应介质构成转化体系，在30℃、250rpm条件下反应完全后，获得含(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯(式Ⅳ)的混合液，将混合液抽滤回收固定化细胞，滤液分离纯化，即为(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯；所述催化剂用量为80-200g/L转化体系，异丙醇体积用量为10-50％(优选40％)，底物终浓度50-200g/L转化体系。

固定化酶酶活的定义：在30℃、150rpm条件下，以(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物催化反应10min，每分钟内催化生成1μmol产物(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。

本发明中产物的检测方法：液相色谱柱：ZORBAX SB-C8，4.6×150mm，5-Micron，流动相：30％乙腈，流速：1.0mL/min，柱温：40℃，保留时间：产物(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯：7.0min；底物(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯：11.7min，检测波长：210nm。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种固定化羰基还原酶基因工程菌微生物细胞的方法，所得固定化细胞总酶活回收>80％。以固定化的大肠杆菌E.coli细胞做为生物催化剂分别进行(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯和(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物催化制备，底物浓度200g/L，反应10h，产物得率均在98％以上，e.e.＞99％，d.e.＞99.5％。将固定化细胞回收利用，重复反应20批次，酶活没有明显下降，各批次底物转化率均大于95％。本发明反应过程无需外源辅酶添加，底物浓度、时空产率均优于文献水平，产品产率与纯度高，在他汀类药物手性中间体的工业化生产中具有极高应用价值。且本发明开发了新型有机相生物催化制备他汀药物关键中间体技术，重复反应8批次，各批次底物转化率均大于95％，并且可简化工艺步骤，减少“三废”排放。

(四)附图说明

图1为(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯合成方程式。

图2为(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯合成方程式。

图3为表达质粒pET28b-CR1图谱。

图4为辅酶(NADPH)对反应进程的影响。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：活性炭预处理

活性炭(购自上海凌峰化学试剂有限公司，药用级)经40目筛子过筛处理。称取10g过筛后的活性炭加入100mL、1M盐酸中，50℃搅拌1h。抽滤，用蒸馏水清洗活性炭并冲洗至滤液接近中性(pH值为6.9-7.1)，活性炭放入烘箱烘干，即为预处理后的活性炭10g，保存待用。

实施例2：羰基还原酶基因工程菌细胞的培养

(1)羰基还原酶基因工程菌的构建：

根据基因序列SEQ ID NO.1(编码蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示)设计引物1(CCGCATATGACTGATCGTTTAAAAG)、引物2(TTGCTCGAGTTATTGAGCAGTGTATCC)，并分别在引物1和引物2中引入了Nde I和Xho I限制性酶切位点(下划线标记)。以拟布氏乳杆菌(Lactobacillus parabuchneri)菌基因组DNA为模板，在引物1和引物2的引发下，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行PCR扩增，获羰基还原酶CR1基因序列，测序后利用Nde I和Xho I限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理，并利用T4DNA连接酶(TaKaRa)将该片段同用相同的限制性内切酶处理的商业化载体pET28b(Invitrogen)进行连接，构建表达载体pET28b-CR1(Liu Z-Q,et al.Biotechnology Progress,2017,DOI 10.1002/btpr.2460.)(图3)。将构建的表达载体pET28b-CR1转化至大肠杆菌BL21(DE3)(Invitrogen)中(42℃，90s)，涂布于含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB平板，37℃下培养8-12h，随机挑取克隆抽提质粒进行测序鉴定，筛选获得含有表达重组质粒pET28b-CR1的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b-CR1。

(2)将羰基还原酶基因工程菌BL21(DE3)/pET28b-CR1接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养8h，再以1％(v/v)接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD₆₀₀达0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下诱导培养10h后，4℃、8000rpm离心10min，弃去上清液，收集沉淀，即获得羰基还原酶基因工程菌湿菌体。该菌体可直接作为生物催化剂或者用于固定化。

实施例3：羰基还原酶基因工程菌细胞固定化

用蒸馏水配制pH 7.0的磷酸钾盐(K₂HPO₄-KH₂PO₄)缓冲液(摩尔浓度为100mM)，称取100g实施例2方法制备的羰基还原酶基因工程菌湿菌体加入到1L、pH 7.0、100mM磷酸钾盐缓冲液中，得到菌悬液1L。准确称取18g(干重)实施例1预处理后的活性炭(18g/L)添加到1L菌悬液进行混合，在室温(20-30℃)，500rpm条件下，水浴搅拌浆搅拌吸附30min；再加入40mL质量浓度5％聚乙烯亚胺水溶液(按体系总体积1L的4％添加)，在室温，500rpm条件下，水浴搅拌浆搅拌交联1h；然后加入30mL质量浓度50％戊二醛水溶液(按体系总体积1L的3％添加)，在室温，500rpm条件下，水浴搅拌浆搅拌交联1h，固定化结束；抽滤除去上清液，所得滤饼用磷酸钾盐缓冲液(pH7.0、100mM)清洗两次，抽滤除去多余水份后，获得羰基还原酶基因工程菌固定化细胞，置4℃冰箱保存备用。

实施例4：(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯与(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的液相检测方法及羰基还原酶基因工程菌固定化细胞的活力测定：液相色谱仪器：Shimadzu LC-20AD系统-SPD-20紫外检测器。

检测转化率的液相色谱柱为ZORBAX SB-C8(4.6×150mm，5-Micron)，流动相：30％乙腈，流速1.0mL/min，检测波长210nm，柱温：40℃。保留时间：产物((3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯)：7.0min；底物(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯：11.7min。

以实施例3方法得到的羰基还原酶基因工程菌固定化细胞用于催化底物(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，催化体系(10mL)组成及催化条件如下：6

mL磷酸盐缓冲液(100mM、pH 7.0)，羰基还原酶基因工程菌固定化细胞1g(用量100g/L)，2g底物(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯(终浓度200g/L)，4mL异丙醇构成反应体系。30℃，150rpm条件下反应10min，取样检测酶活。同样条件下，以羰基还原酶基因工程菌湿菌体细胞作为对照。

酶活单位(U)定义为：在30℃、pH 7.0条件下，1min内生成1μmol产物(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯所需的酶量定义为1U。(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生成量采用高效液相色谱在210nm下测定。根据体系中(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生成量计算固定化含羰基还原酶细胞的酶活。

实施例5：羰基还原酶基因工程菌固定化细胞的活性炭优化

(1)取1g实施例2方法制备的羰基还原酶基因工程菌湿菌体加入到10mL磷酸钾盐缓冲液(100mM、pH 7.0)中，再分别加入0.06g，0.12g，0.18g，0.24g(干重)实施例1预处理后的活性炭，混合，在室温，500rpm条件下，水浴搅拌浆搅拌吸附30min；再加入0.3mL质量浓度5％聚乙烯亚胺水溶液(按体系的3％添加)，在室温，500rpm条件下，水浴搅拌浆搅拌交联1h；然后加入0.1mL质量浓度50％戊二醛水溶液(按体系的1％添加)，在室温，500rpm条件下，水浴搅拌浆搅拌交联1h，固定化结束；抽滤除去上清液，滤饼用100mM、pH 7.0磷酸盐缓冲溶液清洗两次，抽滤除去多余水份后，分别获得固定化细胞，置4℃冰箱保存备用。采用实施例4方法测定相对酶活(以游离工程菌细胞活性为100％)结果见表1所示，所得优选活性炭添加量为18g/L。

表1不同活性炭添加量对固定化细胞相对酶活的影响

实施例6：羰基还原酶基因工程菌固定化细胞的聚乙烯亚胺优化

取1g实施例2方法制备的羰基还原酶基因工程菌湿菌体加到10mL磷酸钾盐缓冲液(100mM、pH 7.0)中，再加入0.18g(干重)实施例1预处理后的活性炭混合，在室温，500rpm条件下，水浴搅拌浆搅拌吸附30min；分别加入0.1mL，0.2mL，0.3mL，0.4mL，0.5mL质量浓度5％聚乙烯亚胺水溶液(分别按体系的1％，2％，3％，4％，5％(v/v)添加)，在室温，500rpm条件下，水浴搅拌浆搅拌交联1h；再加入0.1mL质量浓度50％戊二醛水溶液(按体系的1％添加)，在室温，500rpm条件下，水浴搅拌浆搅拌交联1h，固定化结束；抽滤除去上清液，滤饼用100mM、pH 7.0磷酸钾盐缓冲溶液清洗两次，抽滤除去多余水份后，获得固定化细胞，置4℃冰箱保存备用。取样采用实施例4方法液相检测相对酶活，并称量固定化细胞回收质量结果见表2所示，所得优选5％聚乙烯亚胺水溶液添加量为4％(v/v)。

表2不同聚乙烯亚胺添加量对固定化细胞酶活影响

实施例7：羰基还原酶基因工程菌固定化细胞的戊二醛优化

取1g实施例2方法制备的羰基还原酶基因工程菌湿菌体溶解到10mL(100mM、pH7.0)磷酸钾盐缓冲液中，再加入0.18g(干重)实施例1预处理后的活性炭，混合，在室温，500rpm条件下，水浴搅拌浆搅拌吸附30min；再加入0.4mL质量浓度5％聚乙烯亚胺水溶液(按体系的4％(v/v)添加)，在室温，500rpm条件下，水浴搅拌浆搅拌交联1h；分别加入0.1mL，0.2mL，0.3mL，0.4mL，0.5mL质量浓度50％戊二醛水溶液(分别按体系的1％，2％，3％，4％，5％(v/v)添加)，在室温，500rpm条件下，水浴搅拌浆搅拌交联1h，固定化结束；抽滤除去上清液，滤饼用100mM、pH 7.0磷酸盐缓冲溶液清洗两次，抽滤除去多余水份后，分别获得固定化细胞，置4℃冰箱保存备用。

采用实施例4方法测定上述固定化细胞相对酶活，催化体系组成及催化条件如下：6mL磷酸盐缓冲液(100mM、pH 7.0)中分别加入1g上述方法制备的固定化细胞(用量100g/L)，2g底物(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯(终浓度200g/L)，4mL异丙醇构成反应体系10mL。30℃，转速150rpm条件下反应4h，反应结束后抽滤回收固定化细胞，将固定化细胞投入下一批次反应，共反应3批。每一批次取样采用实施例4方法液相检测相对酶活(取均值)，结果见表3所示，所得优选50％戊二醛水溶液添加量为3％(v/v)。

表3不同戊二醛添加量对固定化细胞酶活影响

实施例8：羰基还原酶基因工程菌固定化细胞反应体系中辅底物异丙醇浓度优化

以实施例3方法得到的羰基还原酶基因工程菌固定化细胞用于催化底物(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原。催化体系组成及催化条件如下：5个分别有18mL，16mL，14mL，12mL，10mL的磷酸盐缓冲液(100mM，pH7.0)中加入3.2g固定化细胞(用量160g/L)，2g底物(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯(终浓度100g/L)，分别加入异丙醇2mL，4mL，6mL，8mL，10mL构成反应体系20mL。30℃，转速150r/min条件下反应6h。取样采用实施例4方法液相检测2h底物转化率，结果见表4所示，所得优选异丙醇的添加量为40％(v/v)。

表4不同异丙醇浓度对反应转化率的影响

实施例9：羰基还原酶基因工程菌固定化细胞反应体系辅酶添加量优化转化体系：

催化体系组成及催化条件如下：磷酸钾缓冲液(100mM，pH 7.0)16mL，固定化细胞20g/L(实施例3制备)，底物(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯1.2g(终浓度250mM)，异丙醇4mL(终浓度20％)，NADPH浓度0，0.25,0.5mM)。30℃反应，转速150r/min条件下反应6h。每小时取样用实施例4方法液相检测底物转化率，结果见图4所示，辅酶NADPH的添加对反应的无明显影响。结果表明固定化含羰基还原酶细胞催化底物的反应，在细胞内存在辅酶循环系统。添加的NADPH对反应转化率基本没有影响，本反应体系不需要额外添加辅酶，建立辅酶循环系统。

实施例10：羰基还原酶基因工程菌固定化细胞在水-有机相体系中制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的应用

以实施例3中获得的固定化细胞作为生物催化剂，以(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，进行生物转化反应制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯。催化体系组成及催化条件如下：60mL磷酸钾缓冲液(pH 7.0、100mM)中加入40mL异丙醇和(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯20g(终浓度为200g/L)，16g固定化细胞(用量160g/L)构成反应体系100mL。30℃，转速250r/min条件下反应16h，取样检测转化率。反应结束后，抽滤回收固定化细胞，将滤液先旋蒸至无液体流出去除剩余异丙醇、丙酮等有机溶剂；后用乙酸乙酯萃取两次，合并有机层并用无水硫酸钠干燥，过滤，旋转蒸发仪浓缩至无液体流出除去乙酸乙酯，干燥，得到产物(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯。底物转化率>98％，产物e.e.值>99％，d.e.值>99.5％。(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯与(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的液相检测方法与实施例4相同。

实施例11：羰基还原酶固定化细胞在水相体系中制备(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的应用

以实施例3中获得的羰基还原酶固定化细胞作为生物催化剂，以(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，进行生物转化反应制备(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯。催化体系(100mL)组成及催化条件如下：60mL磷酸钾缓冲液(pH 7.0、100mM)中加入40mL异丙醇和(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯20g(终浓度为200g/L)，16g固定化细胞(用量160g/L)。30℃，转速250r/min条件下反应16h，取样检测转化率。反应结束后，抽滤回收固定化细胞，将滤液先旋蒸至无液体流出去除剩余异丙醇、丙酮等有机溶剂；后用乙酸乙酯萃取两次，合并有机层并用无水硫酸钠干燥，过滤，旋转蒸发仪浓缩至无液体流出除去乙酸乙酯，干燥，得到产物(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯。底物转化率>98％，，产物e.e.值>99％，d.e.值>99.5％。

(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯与(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的液相检测方法。

液相色谱仪器：Shimadzu LC-20AD系统-SPD-20紫外检测器。

检测转化率以及ee时色谱柱均为Hypersil ODS2C18(4.6mm×250mm,2.5μm)，流动相:乙腈:水＝1:3，流速1mL/min，检测波长220nm。(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯、(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯以及(3R,5S)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的保留时间分别为：11.4min、9.4min和9.8min。

实施例12：羰基还原酶固定化细胞制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯反应的批次反应

以实施例3中获得的羰基还原酶固定化细胞作为生物催化剂，以(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，进行生物转化反应制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯。

催化体系(100mL)组成及催化条件如下：60mL磷酸钾缓冲液(pH 7.0、100mM)中加入40mL异丙醇和(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯20g(终浓度为100g/L)，16g固定化细胞(用量160g/L)。30℃，转速150r/min条件下反应16h，取样检测转化率。反应结束后，抽滤回收固定化细胞，将滤液先旋蒸至无液体流出去除剩余异丙醇、丙酮等有机溶剂；后用乙酸乙酯萃取两次，合并有机层并用无水硫酸钠干燥，过滤，旋转蒸发仪浓缩至无液体流出除去乙酸乙酯，干燥，得到产物(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯。将回收的固定化细胞继续投入下一批次反应，连续反应20个批次。各批次底物转化率均保持在95％以上(表5)，产物e.e.值>99％，d.e.值>99.5％。

表5固定化细胞回收批次对细胞回收与底物转化率的影响

实施例13：羰基还原酶固定化细胞均一有机相催化体系反应介质筛选

以实施例3方法得到的羰基还原酶基因工程菌固定化细胞用于催化底物(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原。催化体系(20mL)组成及催化条件如下：分别取不同类型有机溶剂(四氢呋喃、乙酸乙酯、对二甲苯、正己烷、环己烷、正庚烷、氯仿)12mL，加入3.2g固定化细胞(用量160g/L)，1g底物(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯(终浓度50g/L)，分别加入异丙醇8mL构成反应体系20mL。30℃，转速250r/min条件下反应2h。取样采用实施例4方法液相检测2h底物转化率，结果见表6所示，不同反应介质下，2h反应转化率13.17-78.15％，所得优选反应介质为正己烷。

表6不同反应介质对反应转化率的影响

实施例14：卤醇脱卤酶固定化细胞均一有机相催化体系反应

根据基因序列SEQ ID NO.3(编码蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示)设计引物3(CGCCATATGATGCCTGTCACCGACACCGC)、引物4(ATTTGCGGCCGC TTACGGCCAGCCGCCGGTG)，并分别在引物3和引物4中引入了Nde I和Not I限制性酶切位点。以Tistrella mobilis菌基因组DNA为模板，以实施例2方法得到卤醇脱卤酶工程细胞，以实施例3方法对细胞进行固定化。

将固定化卤醇脱卤酶工程菌细胞用于催化底物1,3-二氯-2-丙醇合成环氧氯丙烷，催化体系(20mL)组成及催化条件如下：正己烷20mL，加入3.2g固定化细胞(用量160g/L)，1g底物1,3-二氯-2-丙醇(终浓度50g/L)。另进行水相介质对比实验，以等体积磷酸钾缓冲液(pH 9.0、100mM)代替正己烷，其它相同。两组实验均在30℃，转速250r/min条件下反应1h。各取1mL反应液加入3mL的乙酸乙酯的进行萃取15min，取有机相无水硫酸钠干燥后，进行气相检测。检测条件为：岛津GC-14A气相分析仪，色谱柱BGB-175，载气为氦气，流量为1.6mL/min，分离比为40:1，FID检测器，进样口和检测器的温度均为220℃。90℃保留7min。经分析，反应1h后，水相介质反应中，1,3-二氯-2-丙醇转化率达88.71％，有机相反应中，丙酮酸转化率为7.47％，卤醇脱卤酶活性损失严重，反应不能有效进行。

实施例15：转氨酶固定化细胞均一有机相催化体系反应

根据基因序列SEQ ID NO.5(编码蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示)设计引物5(CGCCAT ATGGCTTTTAG)、引物6(ATTTGCGGCCGCAATCTCGAGTCAATG)，并分别在引物5和引物6中引入了Nde I和Not I限制性酶切位点。以Arthrobacter sp.Knk168菌基因组DNA为模板，以实施例2方法得到转氨酶工程细胞，以实施例3方法对细胞进行固定化。

将固定化转氨酶工程菌细胞用于催化底物苯乙胺合成丙氨酸，催化体系(20mL)组成及催化条件如下：正己烷20mL，加入3.2g固定化细胞(用量160g/L)，0.176g底物丙氨酸(终浓度8.8g/L)，氨基供体异丙胺1mL。另进行水相介质对比实验，以20mL磷酸钾缓冲液(pH7.0、100mM)代替正己烷，其它相同。两组实验均在40℃，转速250r/min条件下反应8h。各取100μL的反应液分别加入200μL的含30mM的1-氟-2,4-二硝基苯基-5-L-丙氨酰胺(氨基酸衍生试剂)丙酮终止反应。加入40μL的1M碳酸氢钠溶液，混匀，在40℃加热1h，冷却至室温后，加入20μL的2M盐酸溶液。衍生完成后，进行高效液相色谱检测。检测条件为：液相色谱仪器：Shimadzu LC-20AD系统-SPD-20紫外检测器，色谱柱Eclipse XDB-C18column(4.6mm×150mm，Agilent)，流动相为三乙胺溶液(50mM三乙胺，磷酸调节pH至3.0)∶乙腈＝62.5∶37.5，等度洗脱，流速为0.8mL/min，检测波长为340nm。经检测，反应8h，水相介质反应中，丙酮酸转化率达92.13％，有机相反应中，丙酮酸转化率为6.75％，转氨酶活性损失严重，反应不能有效进行。

实施例14与实施例15说明，本发明所涉及的细胞固定化技术与有机相反应体系不适用于羰基还原酶外的其他酶与相关反应。本发明仅适用于羰基还原酶工程菌细胞的高效固定化与催化他汀侧链的不对称合成。

实施例16：羰基还原酶基因工程菌固定化细胞在均一有机相体系中制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的应用

以实施例3中获得的固定化细胞作为生物催化剂，以(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，以环己烷为溶剂与反应介质，进行有机相中生物转化反应制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯。催化体系(100mL)组成及催化条件如下：60mL正己烷中加入40mL异丙醇和(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯10g(终浓度为100g/L)，16g固定化细胞。30℃，转速250r/min条件下反应16h，取样检测转化率。反应结束后将混合液抽滤回收固定化细胞，滤液用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液旋蒸至无液体流出，取浓缩物干燥，即获得(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯。底物转化率>98％，产物e.e.值>99％，d.e.值>99.5％。

实施例17：羰基还原酶基因工程菌固定化细胞在均一有机相体系中制备(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的应用

以实施例3中获得的固定化细胞作为生物催化剂，以(S)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，以环己烷为溶剂与反应介质，进行有机相中生物转化反应制备(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯。

催化体系(100mL)组成及催化条件如下：60mL正己烷中加入40mL异丙醇和(S)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯10g(终浓度为100g/L)，16g固定化细胞。30℃，转速250r/min条件下反应16h，取样检测转化率。反应结束后将混合液抽滤回收固定化细胞，滤液用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液旋蒸至无液体流出，取浓缩物干燥，即获得(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯。底物转化率>98％，产物e.e.值>99％，d.e.值>99.5％。

实施例18：羰基还原酶固定化细胞在均一有机相中制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的批次反应

以实施例3中获得的羰基还原酶固定化细胞作为生物催化剂，以实施例16的方法，采用(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，进行生物转化反应制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯。

催化体系(100mL)组成及催化条件如下：60mL正己烷中加入40mL异丙醇和(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯10g(终浓度为100g/L)，16g固定化细胞(用量160g/L)。30℃，转速250r/min条件下反应16h，取样检测转化率。反应结束后，抽滤回收固定化细胞，将滤液先旋蒸至无液体流出去除剩余异丙醇、丙酮等有机溶剂；后用乙酸乙酯萃取两次，合并有机层并用无水硫酸钠干燥，过滤，旋转蒸发仪浓缩至无液体流出除去乙酸乙酯，得到产物(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯。将回收的固定化细胞继续投入下一批次反应，连续反应8个批次。各批次底物转化率均保持在95％以上(表7)，产物e.e.值>99％，d.e.值>99.5％。

表7固定化细胞回收批次对底物转化率的影响

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种羰基还原酶基因工程菌固定化细胞及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 759

<212> DNA

<213> 拟布氏乳杆菌(Lactobacillus parabuchneri)

<400> 1

atgactgatc gtttaaaagg caaggttgct attgtaactg gtggaacact tggaatcggc 60

ttggcaattg ccgacaagtt tgttgaagaa ggcgcaaaag ttgtgattac tggccgccat 120

gctgatatcg gtgaaaaagc cgcaaaatca atcggtggac cagacgttat tcgattcgtt 180

caacacgatg cttctgatga agcaggttgg actgagttat ttgatacaac cgaaaacgca 240

tttggaccgg ttaccactgt tgtgaacaat gccggaattg cggttagcaa gagtgttgag 300

gaaacaacga ctgaagaatg gcgtaagcta ctctctgtca acttagacgg tgtcttcttt 360

ggaacacgtt tgggtatcca acggatgaaa aacaagggcc tcggcgcttc aatcatcaac 420

atgtcttcta ttgaaggctt tgtcggcgac ccaactttgg gtgcttacaa tgcttcaaag 480

ggtgcggtta gaattatgtc aaaatcagcc gctttggact gtgctttaaa ggactacgac 540

gtccgagtta atacggttca cccaggctac atcaagacac cactggttga tgatcttgaa 600

ggtgccgaag aaatgatgtc acaacggaca aagaccccaa tgggccacat tggtgagcct 660

aacgatattg cttggatctg cgtttacttg gcatcagatg aagccaaatt cgcaactgga 720

gcagaattcg ttgttgatgg tggttacact gctcaataa 759

<210> 2

<211> 252

<212> PRT

<213> 拟布氏乳杆菌(Lactobacillus parabuchneri)

<400> 2

Met Thr Asp Arg Leu Lys Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr

1 5 10 15

Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala

20 25 30

Lys Val Val Ile Thr Gly Arg His Ala Asp Ile Gly Glu Lys Ala Ala

35 40 45

Lys Ser Ile Gly Gly Pro Asp Val Ile Arg Phe Val Gln His Asp Ala

50 55 60

Ser Asp Glu Ala Gly Trp Thr Glu Leu Phe Asp Thr Thr Glu Asn Ala

65 70 75 80

Phe Gly Pro Val Thr Thr Val Val Asn Asn Ala Gly Ile Ala Val Ser

85 90 95

Lys Ser Val Glu Glu Thr Thr Thr Glu Glu Trp Arg Lys Leu Leu Ser

100 105 110

Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg

115 120 125

Met Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile

130 135 140

Glu Gly Phe Val Gly Asp Pro Thr Leu Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys

145 150 155 160

Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu

165 170 175

Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Tyr Ile Lys

180 185 190

Thr Pro Leu Val Asp Asp Leu Glu Gly Ala Glu Glu Met Met Ser Gln

195 200 205

Arg Thr Lys Thr Pro Met Gly His Ile Gly Glu Pro Asn Asp Ile Ala

210 215 220

Trp Ile Cys Val Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ala Lys Phe Ala Thr Gly

225 230 235 240

Ala Glu Phe Val Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln

245 250

<210> 3

<211> 747

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

atgcctgtca ccgacaccgc gccccgcgtg gcgctggtta ccaatgcgac caaatatgcc 60

ggcgccccca cggtggcggc gcttgccagc cagggctggc agatcatcgc ccatgacgca 120

tccttcaccg acgtggcggc ccgtgccgcc tgggaggcgg acaaccaggg catgaccgcc 180

gccgaggctc aggatccggc cgggttgatc gccgaagtgc gcgaccggat gggcgggctg 240

cacggtatcg tttccaacga cgcctatccc gcgatccgtc gccgtatcga agagaccgag 300

gcggaggcgc tgcgcgagat gctggaggcg ctgaccgtct tccccttcgc gctcgcctcg 360

gcagtgaccc cacacctgaa ggcgcagggc gccggcgcca tcgtgatggt cacctccgca 420

tcgccgcgcc gtccctaccc ggggttcgcg atgtacgcaa ccgcccgctc ggcctcgacc 480

gggcttgcca aggcactggc gaacgagctg gcgccccatg gcatccgggt gaatgccgtg 540

gcgccgaact tcctctacag cgagacctat tacccgcgcg ccaaatggat cgacgatccc 600

gccggtgccg cccgggtgcg cgagatggta ccgctcggcc gtctgggccg gcccgaggag 660

atcggtgaac tgattgcttt cctgctgtcc gacaaggccg gctttgtggt cggcgagacc 720

gtgggcttca ccggcggctg gccgtaa 747

<210> 4

<211> 248

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

Met Pro Val Thr Asp Thr Ala Pro Arg Val Ala Leu Val Thr Asn Ala

1 5 10 15

Thr Lys Tyr Ala Gly Ala Pro Thr Val Ala Ala Leu Ala Ser Gln Gly

20 25 30

Trp Gln Ile Ile Ala His Asp Ala Ser Phe Thr Asp Val Ala Ala Arg

35 40 45

Ala Ala Trp Glu Ala Asp Asn Gln Gly Met Thr Ala Ala Glu Ala Gln

50 55 60

Asp Pro Ala Gly Leu Ile Ala Glu Val Arg Asp Arg Met Gly Gly Leu

65 70 75 80

His Gly Ile Val Ser Asn Asp Ala Tyr Pro Ala Ile Arg Arg Arg Ile

85 90 95

Glu Glu Thr Glu Ala Glu Ala Leu Arg Glu Met Leu Glu Ala Leu Thr

100 105 110

Val Phe Pro Phe Ala Leu Ala Ser Ala Val Thr Pro His Leu Lys Ala

115 120 125

Gln Gly Ala Gly Ala Ile Val Met Val Thr Ser Ala Ser Pro Arg Arg

130 135 140

Pro Tyr Pro Gly Phe Ala Met Tyr Ala Thr Ala Arg Ser Ala Ser Thr

145 150 155 160

Gly Leu Ala Lys Ala Leu Ala Asn Glu Leu Ala Pro His Gly Ile Arg

165 170 175

Val Asn Ala Val Ala Pro Asn Phe Leu Tyr Ser Glu Thr Tyr Tyr Pro

180 185 190

Arg Ala Lys Trp Ile Asp Asp Pro Ala Gly Ala Ala Arg Val Arg Glu

195 200 205

Met Val Pro Leu Gly Arg Leu Gly Arg Pro Glu Glu Ile Gly Glu Leu

210 215 220

Ile Ala Phe Leu Leu Ser Asp Lys Ala Gly Phe Val Val Gly Glu Thr

225 230 235 240

Val Gly Phe Thr Gly Gly Trp Pro

245

<210> 5

<211> 1011

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 5

atggctttta gcgctgatac tccggaaatc gtttacactc atgataccgg tctggactac 60

atcacctact ccgatcacga actggacccg gcgaaccctc tggctggcgg cgctgcgtgg 120

attgaaggtg cgttcgtacc gccgtctgaa gcgcgcattt ccatcttcga ccagggcttt 180

tatacttccg atgcgactta caccaccttc catgtttgga acggcaacgc tttccgcctg 240

ggcgatcata tcgagcgtct gttctctaac gcagagtcta tccgtctgat tccaccgctg 300

acccaggatg aagtaaaaga aatcgcgctg gaactggtgg cgaaaaccga gctgcgtgaa 360

gcgatggtaa ctgttaccat cactcgtggt tactcttcta ctccgttcac ccgtgatatc 420

accaaacatc gtcctcaggt gtacatgtct gcatgtccgt accagtggat cgttcctttc 480

gatcgtattc gtgacggcgt tcacctgatg gtcgcccaga gcgtgcgtcg ttctccgcgc 540

tccagcatcg acccgcaagt gaaaaacttc cagtggggtg atctgattcg tgctatccag 600

gaaacccacg accgcggctt cgaactgcct ctgctgctgg attgcgataa cctgctggcg 660

gaaggtccgg gtttcaacgt agtagtgatt aaagacggtg ttgtgcgttc tcctggtcgc 720

gctgcgctgc cgggtatcac ccgtaaaacg gttctggaaa ttgcagaatc cctgggccat 780

gaagcaatcc tggccgacat tacgccggct gaactgtacg atgctgacga agtactgggt 840

tgctccacgg gcggcggcgt ctggccgttt gtgtctgttg atggcaatag catctctgac 900

ggtgtaccgg gcccagttac ccagtccatt attcgtcgtt actgggagct gaacgtagaa 960

ccgagcagcc tgctgacgcc tgtgcactac catcatcatc atcaccattg a 1011

<210> 6

<211> 330

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 6

Met Ala Phe Ser Ala Asp Thr Pro Glu Ile Val Tyr Thr His Asp Thr

1 5 10 15

Gly Leu Asp Tyr Ile Thr Tyr Ser Asp His Glu Leu Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Leu Ala Gly Gly Ala Ala Trp Ile Glu Gly Ala Phe Val Pro Pro

35 40 45

Ser Glu Ala Arg Ile Ser Ile Phe Asp Gln Gly Phe Tyr Thr Ser Asp

50 55 60

Ala Thr Tyr Thr Thr Phe His Val Trp Asn Gly Asn Ala Phe Arg Leu

65 70 75 80

Gly Asp His Ile Glu Arg Leu Phe Ser Asn Ala Glu Ser Ile Arg Leu

85 90 95

Ile Pro Pro Leu Thr Gln Asp Glu Val Lys Glu Ile Ala Leu Glu Leu

100 105 110

Val Ala Lys Thr Glu Leu Arg Glu Ala Met Val Thr Val Thr Ile Thr

115 120 125

Arg Gly Tyr Ser Ser Thr Pro Phe Thr Arg Asp Ile Thr Lys His Arg

130 135 140

Pro Gln Val Tyr Met Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Trp Ile Val Pro Phe

145 150 155 160

Asp Arg Ile Arg Asp Gly Val His Leu Met Val Ala Gln Ser Val Arg

165 170 175

Arg Ser Pro Arg Ser Ser Ile Asp Pro Gln Val Lys Asn Phe Gln Trp

180 185 190

Gly Asp Leu Ile Arg Ala Ile Gln Glu Thr His Asp Arg Gly Phe Glu

195 200 205

Leu Pro Leu Leu Leu Asp Cys Asp Asn Leu Leu Ala Glu Gly Pro Gly

210 215 220

Phe Asn Val Val Val Ile Lys Asp Gly Val Val Arg Ser Pro Gly Arg

225 230 235 240

Ala Ala Leu Pro Gly Ile Thr Arg Lys Thr Val Leu Glu Ile Ala Glu

245 250 255

Ser Leu Gly His Glu Ala Ile Leu Ala Asp Ile Thr Pro Ala Glu Leu

260 265 270

Tyr Asp Ala Asp Glu Val Leu Gly Cys Ser Thr Gly Gly Gly Val Trp

275 280 285

Pro Phe Val Ser Val Asp Gly Asn Ser Ile Ser Asp Gly Val Pro Gly

290 295 300

Pro Val Thr Gln Ser Ile Ile Arg Arg Tyr Trp Glu Leu Asn Val Glu

305 310 315 320

Pro Ser Ser Leu Leu Thr Pro Val His Tyr

325 330

Claims

1.一种羰基还原酶基因工程菌固定化细胞，其特征在于所述固定化细胞按如下方法制备：将羰基还原酶基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体用pH 7.0、100mM磷酸盐缓冲液悬浮，获得菌悬液；向菌悬液中加入活性炭，在20-30℃，500rpm条件下水浴搅拌30min；再加入质量浓度5％聚乙烯亚胺水溶液，在20-30℃，500rpm条件下水浴搅拌交联1h；然后加入质量浓度50％戊二醛水溶液，在20-30℃，500rpm条件下水浴搅拌交联1h，抽滤，滤饼用pH 7.0、100mM磷酸盐缓冲液清洗两次，抽滤去除缓冲液，即获得羰基还原酶基因工程菌固定化细胞；所述菌悬液中湿菌体含量为100g/L；所述活性炭加入量以菌悬液体积计为6-24g/L；所述聚乙烯亚胺水溶液体积用量以菌悬液体积计为1-5％；所述戊二醛水溶液体积用量以菌悬液体积计为1-5％。

2.如权利要求1所述羰基还原酶基因工程菌固定化细胞，其特征在于所述羰基还原酶基因工程菌是由SEQ ID NO.1所示核苷酸序列以大肠杆菌为宿主菌构建而成。

3.如权利要求1所述羰基还原酶基因工程菌固定化细胞，其特征在于所述活性炭为颗粒活性炭，在加入前先进行预处理，所述预处理方法为：将活性炭过40目筛，再加入1M盐酸中，50℃搅拌1h，抽滤，用蒸馏水清洗滤液至中性，滤饼烘干，即为预处理后的活性炭。

4.如权利要求1所述羰基还原酶基因工程菌固定化细胞，其特征在于所述湿菌体按如下方法制备：将羰基还原酶基因工程菌接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养8h，再以体积浓度1％接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD₆₀₀达0.6～0.8，加入终浓度为0.1mM的异丙基硫代半乳糖苷，28℃下诱导培养10h后，4℃、8000rpm离心10min，弃去上清液，收集湿菌体。

5.一种权利要求1所述羰基还原酶基因工程菌固定化细胞在不对称还原制备他汀类药物中间体中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用以羰基还原酶基因工程菌固定化细胞为催化剂，以(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯或(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，以异丙醇为辅助底物，以pH 7的磷酸钾缓冲液或正己烷为反应介质构成反应体系，在20-40℃、200～600rpm条件下反应完全后，获得含(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯或(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的混合液；将混合液抽滤回收固定化细胞，滤液分离纯化，即获得(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯或(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述催化剂用量为80-200g/L反应体系，异丙醇体积用量以反应体系总体积计为10-50％，底物终浓度50-200g/L反应体系。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述滤液分离纯化方法为下列之一：(1)当反应介质为磷酸钾缓冲液时，则将混合液抽滤回收固定化细胞，滤液先旋蒸至无液体流出，获得浓缩物，将浓缩物用乙酸乙酯萃取两次，合并有机层并用无水硫酸钠干燥、过滤获得滤液，将滤液旋蒸至无液体流出，干燥，获得(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯或(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯；(2)当反应介质为正己烷时，则将混合液抽滤回收固定化细胞，滤液用无水硫酸钠干燥、过滤，获得滤液，将滤液旋蒸至无液体流出，干燥，获得(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯或(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯。