CN112795602A - 一种前列腺素中间体15α-羟基内酯的不对称还原合成方法 - Google Patents

一种前列腺素中间体15α-羟基内酯的不对称还原合成方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物制药技术领域，具体为一种前列腺素中间体15α‑羟基内酯的不对称还原合成方法。本发明包括：制备羰基还原酶的工程菌；制备工程菌的静息细胞悬浊液，并经过超声破碎或者加压破碎后得到含羰基还原酶的细胞上清液；经过蛋白纯化得到羰基还原酶的纯蛋白酶液；再与底物15‑羰基前列腺素中间体（II）、葡萄糖脱氢酶、助溶剂、葡萄糖、辅因子混合，进行不对称羰基还原反应,制得15α‑羟基前列腺素中间体（I）。所用羰基还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明可催化还原15‑羰基前列腺素中间体（II）生成手性15α‑羟基前列腺素中间体（I），所用生物催化剂方便易得，产物分离收率高、对映选择性优异。

Description

一种前列腺素中间体15α-羟基内酯的不对称还原合成方法
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及前列腺素中间体15α-羟基内酯的合成方法。
背景技术
已知如式（I）所示的15α-羟基内酯是合成前列腺素的关键中间体：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
式中R1为氢， C1-C10烷基或环烷基，苯基，苄基，单取代或多取代芳基或芳烷基，三甲基硅基（TMS），三乙基硅基(TES)，叔丁基二甲基硅基（TBS）,甲基二苯基硅基（TBDPS）,四氢吡喃基（THP），甲酰基，C1-C10烷基酰基，苯甲酰基或联苯甲酰基，单取代或多取代苯甲酰基或联苯甲酰基等。R2为C1-C10烷基或环烷基，烯基，炔基， 苯乙基或取代苯乙基， 苯氧亚甲基或取代苯氧亚甲基。
前列腺素15位羰基还原最早由B. Samuelsson（Angew. Chem. Int. Ed. 1965, 4, 410）报道，在氘代实验中用硼氢化钠以及硼氘化钠对PGE1的代谢产物进行下侧链的羰基还原。E. J. Corey(J. Am. Chem. Soc., 1969, 91, 5675)在原有基础上使用硼氢化锌对前列腺素中间体的15位羰基进行还原，高收率地得到了一对差向异构体，两者比例接近1：1。该方法存在严重的另一半异构体的浪费。
E. J. Corey(J. Am. Chem. Soc., 1971, 93, 1491;J. Am. Chem. Soc., 1972. 94, 8616)采用（+）柠檬烯与噻酚硼烷衍生化而来的三烷基硼烷化合物对前列腺素中间体的15位羰基进行不对称还原，通过对11位的不同取代基筛选，得到最优结果达15α:15β = 92:8，该方法很好地改进了反应的非对映选择性问题，且收率较高，但存在反应条件苛刻的问题，反应需要在-120 --130℃左右进行，这使得该反应在实际操作过程中存在不足。
E. J. Corey(J. Am. Chem. Soc., 1987, 109, 9725)采用了催化量的Corey-Bakshi-Shibata(CBS)催化剂，硼烷作为还原剂对前列腺素中间体的15位羰基进行不对称还原，在室温下就可获得15α: 15β = 90:10的非对映选择性。相比前期的严格条件已取得了重大改进，但非对映选择性的结果依然不理想。
Chisa Ohta（J. Org. Chem. 2009, 74,8298）课题组发现 (-)-二异松蒎基氯硼烷可以很好的还原前列腺素15位的羰基，所得到的非对映选择性结果优于CBS催化剂，能够得到15α: 15β = 95:5的非对映选择性结果。但是该方法也存在上述的不足之处：为了获得优异的非对映选择性结果，该反应需要在-40℃的低温下进行。
在生物催化领域对该反应也有一定的研究。K. Kieslich(US4247635)等发现克勒克酵母菌ATCC 20110(Kloeckera jensenii ATCC 20110)对下侧链取代为苯氧甲基或者取代苯氧甲基的15-羰基前列腺素中间体有较好的羰基还原选择性，产物分离收率达60%。R.Diego （J. Mol. Cat. B: Enzym., 2015, 114, 7）课题组发现异常毕赤酵母（Pichiaanomala）这单一的微生物可以同时完成前列腺素关键中间体的羰基还原、双键还原以及酯基脱保护，最终以82%收率、97%的de值得到比马前列腺素中间体以及62%的收率、97%的de值得到拉坦前列腺素中间体。但是，由于这些酵母野生菌中存在多种催化性能各异的酶催化剂，该类生物转化过程涉及多种不同化学反应，需要对转化过程做系统、精准的调控才能以高选择性、较高收率得到某一目标产物，但不可避免会有不同程度的杂质产生。
发明内容
本发明目的在于克服现有化学还原技术和生物还原技术不足而提供一种条件温和、高立体选择性、高收率的酶催化的前列腺素中间体15α-羟基内酯（I）的还原合成方法。
本发明提供的酶催化的前列腺素中间体15α-羟基内酯（I）的还原合成方法，采用羰基还原酶（KRED）作为催化剂，用于不对称还原15-羰基前列腺素中间体（II），生成15α-羟基前列腺素中间体（I），反应体系包括羰基还原酶（KRED）的纯蛋白酶液、底物15-羰基前列腺素中间体（II）、葡萄糖脱氢酶、助溶剂、磷酸盐缓冲液、葡萄糖、辅因子；不对称羰基还原反应的反应式如下：
Figure 308117DEST_PATH_IMAGE002
式中，R1为氢， C1-C10烷基或环烷基，苯基，苄基，单取代或多取代芳基或芳烷基，三甲基硅基（TMS），三乙基硅基(TES)，叔丁基二甲基硅基（TBS）,甲基二苯基硅基（TBDPS）,四氢吡喃基（THP），甲酰基，C1-C10烷基酰基，苯甲酰基或联苯甲酰基，单取代或多取代苯甲酰基或联苯甲酰基等。R2为C1-C10烷基或环烷基，烯基，炔基， 苯乙基或取代苯乙基，苯氧亚甲基或取代苯氧亚甲基。
具体地，不对称羰基还原反应中，所述底物浓度为1.0-100g/L，羰基还原酶（KRED）的纯蛋白浓度为0.2 g/L-2g/L, 葡萄糖脱氢酶的浓度为0.1 g /L ～ 1 g/L，葡萄糖的浓度为5～750 g/L，辅因子浓度为0～0.5 mM。
作为优选，所述不对称羰基还原反应中，反应温度为20-40oC,反应缓冲液pH为5.0-8.0。更优选，反应温度为25-30℃，反应缓冲液pH为6.5-7.5，缓冲浓度为100-250mM。
所述不对称羰基还原反应中，所用助溶剂为二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺等高介电常数的溶剂；苯、甲苯、乙苯、氯苯、溴苯等芳香族溶剂；正己烷、环己烷等非极性溶剂；乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、1，2-二氯乙烷、甲醇、乙醇、异丙醇等极性溶剂的一种或多种。助溶剂为反应体系体积的8-12%。优选的溶剂为二甲基亚砜作为助溶剂，二甲基亚砜所占体积比为10%。
在整个反应过程中，待反应至SFC检测底物完全耗尽后，用等体积的乙酸乙酯萃取3-4次，合并有机相，用饱和氯化钠洗涤2次，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去有机溶剂，得到目标产物。
本发明中，所述羰基还原酶（KRED）的纯蛋白酶液的具体制备流程如下：
（1）制备含羰基还原酶（KRED）基因的工程菌；
（2）制备上述工程菌的静息细胞悬浊液；
（3）制备含羰基还原酶的细胞上清液；
（4）制备羰基还原酶的纯蛋白酶液；
其中，所述羰基还原酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，或者具有与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示氨基酸序列同源性大于80%的氨基酸序列且保持催化活性的其它羰基还原酶。
其中,所述的工程菌含有质粒pET28-KRED-WZL或者pET28-SyADH，其中羰基还原酶KRED-WZL的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，羰基还原酶SyADH的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)
步骤（3）中，所述细胞上清液的制备方法，包括：将所述的工程菌接种到含卡那霉素的培养基，摇床活化后，扩大至OD600值达到0.6-1.2时，加入诱导剂，继续培养，离心收集细胞，用缓冲液重悬，超声或加压破碎，离心，获得所述的细胞上清液。
作为优选，所述诱导剂为IPTG,诱导剂的浓度为0.05mM-0.8mM。
作为优选，加入诱导剂后的培养条件为：培养温度15-25℃，培养时间8-24h。
作为优选，所述缓冲液为磷酸二氢钾-磷酸氢二钾；缓冲液浓度为30-300mM。
步骤（4）中，所述纯蛋白酶液的制备方法，包括：将所述的细胞上清液与Ni树脂混合，摇床振摇20min后，滤去清液，树脂用2-4倍柱体积的含低浓度咪唑的洗脱剂滤洗，用含高浓度咪唑的洗脱剂洗脱纯蛋白酶，并收集蛋白浓度大于3mg/mL的洗脱液，合并洗脱液即得纯蛋白酶液。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明构建含羰基还原酶的工程菌,将其应用于不对称还原15-羰基前列腺素中间体（II），生成15α-羟基前列腺素中间体（I），为该重要药物中间体的制备提供了一种新的生物催化制造途径；
（2）本发明采用羰基还原酶进行不对称羰基还原反应，反应的非对映选择性优于化学还原，改善了原有化学还原途径中非对映选择性不高的不足；
（3）采用方便易得的羰基还原酶作为催化剂，整个反应体系在温和条件下进行，避免了化学还原过程中所需的低温条件。
（4）与现有生物转化技术相比，本发明采用简单易得的大肠杆菌工程菌实现了对含不同类型下侧链的前列腺素中间体的15位羰基的立体选择性还原，反应条件简单、不需要复杂调控，分离收率优异（80%-97%）、非对映选择性优异（94%-98% de）。
附图说明
图1为基因工程菌诱导表达的KRED-WZL蛋白纯酶以及SyADH蛋白纯酶蛋白质SDS-PAGE电泳图。其中，M:核酸Marker,1：基因工程菌诱导表达的SyADH蛋白纯酶，2：基因工程菌诱导表达的KRED-WZL蛋白纯酶。
图2-1为Racemic-羟基前列腺素中间体(Ia)的HPLC分析图谱。
图2-2为15α-羟基前列腺素中间体(Ia)测dr值的HPLC分析图谱。
图2-3为15α-羟基前列腺素中间体(Ia)的1HNMR谱图。
图2-4为15α-羟基前列腺素中间体(Ia)的13C NMR谱图。
图3-1为Racemic-羟基前列腺素中间体(Ib)的HPLC分析图谱。
图3-2为15α-羟基前列腺素中间体(Ib)测dr值的HPLC分析图谱。
图3-3为15α-羟基前列腺素中间体(Ib)的1HNMR谱图。
图3-4为15α-羟基前列腺素中间体(Ib)的13C NMR谱图。
图4-1为Racemic-羟基前列腺素中间体(Ic)的HPLC分析图谱。
图4-2为15α-羟基前列腺素中间体(Ic)测dr值的HPLC分析图谱。
图4-3为15α-羟基前列腺素中间体(Ic)的1HNMR谱图。
图4-4为15α-羟基前列腺素中间体(Ic)的13C NMR谱图。
图5-1为Racemic-羟基前列腺素中间体(Id)的HPLC分析图谱。
图5-2为15α-羟基前列腺素中间体(Id)测dr值的HPLC分析图谱。
图5-3为15α-羟基前列腺素中间体(Id)的1HNMR谱图。
图5-4为15α-羟基前列腺素中间体(Id)的13C NMR谱图。
具体实施方式
实施例1、羰基还原酶基因工程菌的构建、诱导表达、蛋白纯化
用质粒pET28-KRED-WZL或pET28-SyADH转化表达宿主BL21(DE3).将BL21(DE3)-pET28-KRED-WZL或BL21(DE3)-pET28-SyADH接种到含卡纳霉素抗性的5mL液体LB试管培养基种，置于37℃的摇床活化8小时，将活化后的培养物按1%转接量转接到含卡纳霉素抗性的液体LB摇瓶培养基中，发酵培养基中恒温振荡培养3小时，培养温度为37℃，200rpm.待菌体浓度长到OD600 = 0.8时，加入0.1mM IPTG(终浓度)，18℃诱导18h，8500rpm离心10min收集细胞，用pH7.0，100mM的磷酸钾缓冲液重悬，55%的超声功率破碎15分钟，离心即得含KRED-WZL (或SyADH)的细胞上清，经Ni树脂负载、洗涤、洗脱收集得到含KRED-WZL (或SyADH)的纯蛋白酶液。
实施例2，15α-羟基前列腺素中间体(Ia)的制备
Figure DEST_PATH_IMAGE003
向100 mL圆底瓶中加入15-羰基前列腺素中间体（IIa）103 mg（5mM）,加入DMSO 4mL（10% v/v）,终浓度为10 mM的辅助底物葡萄糖，终浓度为0.2mM的NADP+,加入pH=7.0、100mM的磷酸钾缓冲液26.8 mL使得最终反应体积为40mL,GDH细胞上清液8mL(20% v/v),取实施例1中的KRED-WZL纯蛋白酶液715μL(蛋白浓度：56mg/mL, 反应蛋白浓度为1mg/mL),然后置于30℃的恒温水浴600 rpm搅拌反应33小时。反应结束后用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，有机相用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥。浓缩后粗品用SFC分析，dr值为98:2,柱层析分离得到93.3 mg目标产物，收率：91%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.05 (d, J =8.2 Hz, 2H), 7.66 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.61 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 7.46 (t, J =7.5 Hz, 2H), 7.39 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 7.20 – 7.08 (m, 1H), 6.93 (d, J = 8.3Hz, 1H), 6.90 – 6.80 (m, 1H), 6.78 – 6.66 (m, 1H), 5.84 (dd, J = 15.6, 7.0Hz, 1H), 5.74 (dd, J = 15.6, 5.0 Hz, 1H), 5.31 (q, J = 5.6 Hz, 1H), 5.15 –4.94 (m, 1H), 4.53 (dq, J = 8.1, 4.2 Hz, 1H), 3.93 (dd, J = 9.4, 3.6 Hz, 1H),3.88 – 3.76 (m, 1H), 2.95 – 2.75 (m, 3H), 2.68 – 2.58 (m, 1H), 2.54 (d, J =16.0 Hz, 1H), 2.44 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 2.28 (dd, J = 15.3, 4.1 Hz, 1H).13CNMR (101 MHz, CDCl3) δ 176.33, 165.93, 159.04, 146.11, 139.85, 134.97,130.97, 130.85, 130.33, 130.19, 128.96, 128.25, 128.19, 127.30, 127.21,121.56, 115.02, 113.08, 83.29, 78.98, 71.78, 70.06, 54.26, 42.71, 37.60,34.97.
SFC分析条件：色谱柱：Chiralpak IF-3（4.6mm × 250mm）,流动相：CO2/MeOH=75:25,流速：3mL/min，进样量：10μL,检测波长：275nM, 柱温：30 ℃，SFC备压：140 bar, 消旋体的产物HPLC图谱如图2-1所示，15α-羟基前列腺素中间体(Ia)的保留时间为18.618min, 15β-羟基前列腺素中间体(Ia’)的保留时间为21.765min。酶反应的羰基还原产物HPLC图谱如2-2所示，主要构型确定为15α-羟基前列腺素中间体(Ia)，保留时间为18.834 min。
实施例3、15α-羟基前列腺素中间体(Ib)的制备
Figure 507148DEST_PATH_IMAGE004
向50 mL圆底瓶中加入15-羰基前列腺素中间体（IIb）58 mg（10mM）,加入DMSO 1.2mL（10% v/v）,终浓度为20 mM的辅助底物葡萄糖，终浓度为0.2mM的NADP+,加入pH=7.0、100mM的磷酸钾缓冲液8.05 mL使得最终反应体积为12 mL,GDH细胞上清液2.4 mL(20% v/v),取实施例1中的KRED-WZL纯蛋白酶液300μL(蛋白浓度：20mg/mL, 反应蛋白浓度为0.5mg/mL),然后置于30℃的恒温水浴600 rpm搅拌反应33小时。反应结束后用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，有机相用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥。浓缩后粗品用SFC分析，dr值为97:3,柱层析分离得到51.6 mg目标产物，收率：89%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.06(d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.66 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.61 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 7.52– 7.43 (m, 2H), 7.43 – 7.35 (m, 1H), 7.28 – 7.23 (m, 2H), 7.02 – 6.92 (m,1H), 6.86 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 5.84 (dd, J = 15.7, 6.8 Hz, 1H), 5.75 (dd, J =15.6, 5.0 Hz, 1H), 5.31 (q, J = 5.5 Hz, 1H), 5.17 – 4.97 (m, 1H), 4.61 – 4.46(m, 1H), 3.96 (dd, J = 9.4, 3.6 Hz, 1H), 3.83 (dd, J = 9.4, 7.4 Hz, 1H), 2.96– 2.74 (m, 3H), 2.71 – 2.44 (m, 3H), 2.28 (ddd, J = 15.5, 5.0, 1.9 Hz, 1H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 176.43, 165.95, 158.30, 146.08, 139.87, 131.06,130.74, 130.21, 129.57, 128.96, 128.24, 127.30, 127.20, 121.38, 114.60,83.39, 79.12, 71.55, 70.22, 54.28, 42.70, 37.62, 35.03.
SFC分析条件：色谱柱：Chiralpak AD-H（4.6 mm × 250 mm）,流动相：CO2/MeOH =50:50,流速：2 mL/min，进样量：5μL,检测波长：275 nM, 柱温：30 ℃，SFC备压：130 bar,消旋体的产物HPLC图谱如图3-1所示，15α-羟基前列腺素中间体(Ib)的保留时间为12.190min, 15β-羟基前列腺素中间体(Ib’)的保留时间为11.059 min。酶反应的羰基还原产物HPLC图谱如3-2所示，主要构型确定为15α-羟基前列腺素中间体(Ib)，保留时间为12.427min。
实施例4、15α-羟基前列腺素中间体(Ic)的制备
Figure DEST_PATH_IMAGE005
向50 mL圆底瓶中加入15-羰基前列腺素中间体（IIc）116 mg（20mM）,加入DMSO1.2mL（10% v/v）,终浓度为40 mM的辅助底物葡萄糖，终浓度为0.2mM的NADP+,加入pH=7.0、100mM的磷酸钾缓冲液8.05 mL使得最终反应体积为12mL,GDH细胞上清液2.4mL(20% v/v),取实施例1中的KRED-WZL纯蛋白酶液300μL(蛋白浓度：33 mg/mL, 反应蛋白浓度为0.8 mg/mL),然后置于30℃的恒温水浴600 rpm搅拌反应33小时。反应结束后用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，有机相用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥。浓缩后粗品用SFC分析，dr值为99:1,柱层析分离得到93.2 mg目标产物，收率：80%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.05 (d,J = 8.4 Hz, 2H), 7.65 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.60 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.51 –7.43 (m, 2H), 7.43 – 7.36 (m, 1H), 7.28 – 7.23 (m, 2H), 7.22 – 7.09 (m, 3H),5.70 (dd, J = 15.5, 5.6 Hz, 1H), 5.61 (dd, J = 15.5, 6.8 Hz, 1H), 5.27 (q, J= 5.7 Hz, 1H), 5.13 – 4.94 (m, 1H), 4.14 (q, J = 6.1 Hz, 1H), 2.90 – 2.73 (m,3H), 2.73 – 2.56 (m, 3H), 2.51 (d, J = 17.5 Hz, 1H), 2.26 (ddd, J = 15.4,5.3, 1.9 Hz, 1H), 1.87 – 1.79 (m, 2H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 176.47,165.99, 146.10, 141.59, 139.86, 136.07, 130.20, 128.96, 128.70, 128.45,128.41, 128.25, 128.22, 127.30, 127.21, 125.96, 83.29, 79.06, 71.40, 54.06,42.71, 38.68, 37.57, 34.92, 31.58.
SFC分析条件：色谱柱：Chiralpak IF-3（4.6 mm × 250 mm）,流动相：CO2/MeOH =75:25,流速：3 mL/min，进样量：5μL,检测波长：275 nM, 柱温：30 ℃，SFC备压：130 bar,消旋体的产物HPLC图谱如图4-1所示，15α-羟基前列腺素中间体(Ic)的保留时间为15.418min, 15β-羟基前列腺素中间体(Ic’)的保留时间为12.547 min。酶反应的羰基还原产物HPLC图谱如4-2所示，主要构型确定为15α-羟基前列腺素中间体(Ic)，保留时间为14.928min。
实施例5、15α-羟基前列腺素中间体(Id)的制备
Figure 850667DEST_PATH_IMAGE006
向100 mL圆底瓶中加入15-羰基前列腺素中间体（IId）178 mg（10mM）,加入DMSO 4mL（10% v/v）,终浓度为30 mM的辅助底物葡萄糖，终浓度为0.2mM的NADP+,加入pH=7.0、100mM的磷酸钾缓冲液26.8 mL使得最终反应体积为40 mL,GDH细胞上清液8 mL(20% v/v),取实施例1中的KRED-WZL纯蛋白酶液715μL(蛋白浓度：16.8mg/mL, 反应蛋白浓度为0.3mg/mL),然后置于30℃的恒温水浴600 rpm搅拌反应33小时。反应结束后用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，有机相用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥。浓缩后粗品用SFC分析，dr值为99:1,柱层析分离得到173.2 mg目标产物，收率：97%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.08(d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.69 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.64 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 7.53– 7.45 (m, 2H), 7.45 – 7.37 (m, 1H), 5.69 (dd, J = 15.5, 5.5 Hz, 1H), 5.62(dd, J = 15.5, 6.8 Hz, 1H), 5.30 (q, J = 5.7 Hz, 1H), 5.18 – 5.00 (m, 1H),4.12 (q, J = 6.1 Hz, 1H), 2.97 – 2.73 (m, 3H), 2.70 – 2.59 (m, 1H), 2.55 (d,J = 16.6 Hz, 1H), 2.28 (ddd, J = 15.4, 5.2, 1.9 Hz, 1H), 1.73 (d, J = 15.7Hz, 2H), 1.59 – 1.41 (m, 2H), 1.38 – 1.26 (m, 5H), 0.92 – 0.83 (m, 3H).13C NMR(101 MHz, CDCl3) δ 176.50, 165.97, 146.07, 139.88, 136.37, 130.19, 128.96,128.36, 128.26, 128.23, 127.28, 127.19, 83.35, 79.13, 72.19, 54.05, 42.72,37.58, 37.23, 34.94, 31.69, 24.98, 22.57, 14.02.
SFC分析条件：色谱柱：Chiralpak IF-3（4.6 mm × 250 mm）,流动相：CO2/MeOH =75:25,流速：3 mL/min，进样量：5μL,检测波长：275 nM, 柱温：30 ℃，SFC备压：130 bar,消旋体的产物HPLC图谱如图5-1所示，15α-羟基前列腺素中间体(Id)的保留时间为9.106min, 15β-羟基前列腺素中间体(Id’)的保留时间为8.008 min。酶反应的羰基还原产物HPLC图谱如5-2所示，主要构型确定为15α-羟基前列腺素中间体(Id)，保留时间为9.336min。
实施例6、15α-羟基前列腺素中间体(Id)的制备
Figure DEST_PATH_IMAGE007
向100 mL圆底瓶中加入15-羰基前列腺素中间体（IId）89 mg（5mM）,加入DMSO 4mL（10% v/v）,终浓度为10 mM的辅助底物葡萄糖，终浓度为0.2mM的NADP+,加入pH=7.0、100mM的磷酸钾缓冲液19 mL使得最终反应体积为40 mL,GDH细胞上清液8 mL(20% v/v),取实施例1中的SyADH纯蛋白酶液8.52μL(蛋白浓度：4.7mg/mL, 反应蛋白浓度为1mg/mL),然后置于30℃的恒温水浴600 rpm搅拌反应33小时。反应结束后用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，有机相用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥。浓缩后粗品用SFC分析，dr值为99:1,柱层析分离得到76.6 mg目标产物，收率：86%。1H NMR，13C NMR ,SFC分析条件同实施例5。
实施例7、15α-羟基前列腺素中间体(Ie)的制备
Figure 963986DEST_PATH_IMAGE008
向100 mL圆底瓶中加入15-羰基前列腺素中间体（IIe）750 mg（50mM）,加入DMSO 4mL（10% v/v）,终浓度为150 mM的辅助底物葡萄糖，终浓度为0.2mM的NADP+,加入pH=7.0、100mM的磷酸钾缓冲液26.8 mL使得最终反应体积为40 mL,GDH细胞上清液8 mL(20% v/v),取实施例1中的KRED-WZL纯蛋白酶液715μL(蛋白浓度：84mg/mL, 反应蛋白浓度为1.5 mg/mL),然后置于30℃的恒温水浴600 rpm搅拌反应33小时。反应结束后用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，有机相用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥。浓缩后粗品用SFC分析，dr值为99:1,柱层析分离得到705 mg目标产物，收率：94%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 8.03-7.99 (m, 2H), 7.61-7.54 (m, 1H), 7.49-7.41 (m, 2H), 5.71-5.56 (m, 1H), 5.30-5.04 (m, 2H), 4.14-4.06 (m, 1H), 2.94-2.46 (m, 5H), 2.24 (ddd, 1H, J = 1.7,5.2, 15.2 Hz), 1.70 (s, 1H), 1.56-1.42 (m, 2H), 1.36-1.17 (m,5H), 0.87 (m, J = 6.7 Hz, 3H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ: 176.30, 165.97, 136.31, 133.20,129.50,129.38, 128.36, 128.23,83.24, 78.90, 72.13, 53.84, 42.63, 37.44,37.13, 34.78, 31.64, 24.89, 22.44,13.94.
实施例8、15α-羟基前列腺素中间体(If)的制备
Figure DEST_PATH_IMAGE009
向100 mL圆底瓶中加入15-羰基前列腺素中间体（IIf）3.75 g（70mM）,加入DMSO 4mL（10% v/v）,终浓度为140 mM的辅助底物葡萄糖，终浓度为0.5mM的NADP+,加入pH=7.0、100mM的磷酸钾缓冲液26.8 mL使得最终反应体积为40 mL,GDH细胞上清液8 mL(20% v/v),取实施例1中的KRED-WZL纯蛋白酶液715μL(蛋白浓度：56 mg/mL, 反应蛋白浓度为1mg/mL),然后置于30℃的恒温水浴600 rpm搅拌反应33小时。反应结束后用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，有机相用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥。浓缩后粗品用SFC分析，dr值为99:1,柱层析分离得到3.5 g目标产物，收率：93%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.56 (dd,J = 15.3, 7.4 Hz, 1H), 5.41 (dd, J = 15.3, 8.5 Hz, 1H), 4.88 (td, J = 7.1,3.2 Hz, 1H), 4.01 (q, J = 6.8 Hz, 1H), 3.90 (q, J = 7.8 Hz, 1H), 3.75 (s,1H), 2.94 (s, 1H), 2.70 (dd, J = 18.1, 9.5 Hz, 1H), 2.62 – 2.46 (m, 2H), 2.39(dd, J = 18.1, 1.7 Hz, 1H), 2.22 (q, J = 8.7 Hz, 2H), 1.90 (ddd, J = 14.7,8.1, 3.3 Hz, 1H), 1.63 – 1.49 (m, 1H), 1.49 – 1.39 (m, 1H), 1.36 – 1.20 (m,6H), 0.87 (t, J = 6.7 Hz, 3H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 177.18, 137.01,130.45, 82.55, 76.37, 73.01, 56.26, 42.48, 39.73, 37.18, 34.10, 31.76, 25.25,22.71, 14.15.
实施例9、15α-羟基前列腺素中间体(Ig)的制备
Figure 687614DEST_PATH_IMAGE010
向100 mL圆底瓶中加入15-羰基前列腺素中间体（IIg）56 mg（5 mM）,加入DMSO 4mL（10% v/v）,终浓度为10 mM的辅助底物葡萄糖，终浓度为0.2 mM的NADP+,加入pH=7.0、100 mM的磷酸钾缓冲液26.8 mL使得最终反应体积为40 mL, GDH细胞上清液8 mL(20% v/v),取实施例1中的KRED-WZL纯蛋白酶液715μL(蛋白浓度：28 mg/mL, 反应蛋白浓度为0.5mg/mL),然后置于30℃的恒温水浴600 rpm搅拌反应33小时。反应结束后用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，有机相用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥。浓缩后粗品用SFC分析，dr值为99:1,柱层析分离得到51 mg目标产物，收率：90%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.56(dd, J = 15.3, 7.4 Hz, 1H), 5.41 (dd, J = 15.3, 8.5 Hz, 1H), 4.88 (td, J =7.1, 3.2 Hz, 1H),4.01 (q, J = 6.8 Hz, 1H), 3.90 (q, J = 7.8 Hz, 1H), 3.75 (s,1H), 3.41 (s, 3H), 2.94 (s, 1H), 2.70 (dd, J = 18.1, 9.5 Hz, 1H), 2.62 – 2.46(m, 2H), 2.39 (dd, J = 18.1, 1.7 Hz, 1H), 2.22 (q, J = 8.7 Hz, 2H), 1.90(ddd, J = 14.7, 8.1, 3.3 Hz, 1H), 1.63 – 1.49 (m, 1H), 1.49 – 1.39 (m, 1H),1.36 – 1.20 (m, 6H), 0.87 (t, J = 6.7 Hz, 3H).
实施例10、15α-羟基前列腺素中间体(Ih)的制备
Figure DEST_PATH_IMAGE011
向100 mL圆底瓶中加入15-羰基前列腺素中间体（IIh）69 mg（5 mM）,加入DMSO 4mL（10% v/v）,终浓度为10 mM的辅助底物葡萄糖，终浓度为0.2 mM的NADP+,加入pH=7.0、100 mM的磷酸钾缓冲液26.8 mL使得最终反应体积为40 mL, GDH细胞上清液8 mL(20% v/v),取实施例1中的KRED-WZL纯蛋白酶液715μL(蛋白浓度：67 mg/mL, 反应蛋白浓度为1.2mg/mL),然后置于40℃的恒温水浴600 rpm搅拌反应33小时。反应结束后用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，有机相用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥。浓缩后粗品用SFC分析，dr值为99:1,柱层析分离得到61 mg目标产物，收率：88%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.13-7.33 (m, 2H), 6.80 – 6.98 (m, 3H), 5.56 (dd, J = 15.3, 7.4 Hz, 1H), 5.41 (dd,J = 15.3, 8.5 Hz, 1H), 4.88 (td, J = 7.1, 3.2 Hz, 1H), 4.01 (q, J = 6.8 Hz,1H), 3.90 (q, J = 7.8 Hz, 1H), 3.75 (s, 1H), 2.94 (s, 1H), 2.70 (dd, J =18.1, 9.5 Hz, 1H), 2.62 – 2.46 (m, 2H), 2.39 (dd, J = 18.1, 1.7 Hz, 1H), 2.22(q, J = 8.7 Hz, 2H), 1.90 (ddd, J = 14.7, 8.1, 3.3 Hz, 1H), 1.63 – 1.49 (m,1H), 1.49 – 1.39 (m, 1H), 1.36 – 1.20 (m, 6H), 0.87 (t, J = 6.7 Hz, 3H).
实施例11、15α-羟基前列腺素中间体(Ii)的制备
Figure 103552DEST_PATH_IMAGE012
向100 mL圆底瓶中加入15-羰基前列腺素中间体（IIi）216 mg（15 mM）,加入DMSO4 mL（10% v/v）,终浓度为40 mM的辅助底物葡萄糖，终浓度为0.2 mM的NADP+,加入pH=7.0、100 mM的磷酸钾缓冲液26.8 mL使得最终反应体积为40 mL, GDH细胞上清液8 mL(20% v/v),取实施例1中的KRED-WZL纯蛋白酶液715μL(蛋白浓度：11.2 mg/mL, 反应蛋白浓度为0.2 mg/mL),然后置于40℃的恒温水浴600 rpm搅拌反应33小时。反应结束后用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，有机相用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥。浓缩后粗品用SFC分析，dr值为99:1,柱层析分离得到186 mg目标产物，收率：87%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.23-7.43 (m, 5H), 5.56 (dd, J = 15.3, 7.4 Hz, 1H), 5.41 (dd, J = 15.3, 8.5 Hz,1H), 4.88 (td, J = 7.1, 3.2 Hz, 1H), 4.63 (s, 2H),4.01 (q, J = 6.8 Hz, 1H),3.90 (q, J = 7.8 Hz, 1H), 3.75 (s, 1H), 2.94 (s, 1H), 2.70 (dd, J = 18.1, 9.5Hz, 1H), 2.62 – 2.46 (m, 2H), 2.39 (dd, J = 18.1, 1.7 Hz, 1H), 2.22 (q, J =8.7 Hz, 2H), 1.90 (ddd, J = 14.7, 8.1, 3.3 Hz, 1H), 1.63 – 1.49 (m, 1H), 1.49– 1.39 (m, 1H), 1.36 – 1.20 (m, 6H), 0.87 (t, J = 6.7 Hz, 3H).
实施例12、15α-羟基前列腺素中间体(Ij)的制备
Figure DEST_PATH_IMAGE013
向100 mL圆底瓶中加入15-羰基前列腺素中间体（IIj）71 mg（5 mM）,加入DMSO 4mL（10% v/v）,终浓度为10 mM的辅助底物葡萄糖，终浓度为0.2 mM的NADP+,加入pH=7.0、100 mM的磷酸钾缓冲液26.8 mL使得最终反应体积为40 mL, GDH细胞上清液8 mL(20% v/v),取实施例1中的KRED-WZL纯蛋白酶液715μL(蛋白浓度：56 mg/mL, 反应蛋白浓度为1mg/mL),然后置于20℃的恒温水浴600 rpm搅拌反应33小时。反应结束后用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，有机相用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥。浓缩后粗品用SFC分析，dr值为99:1,柱层析分离得到63 mg目标产物，收率：90%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ5.56 (dd,J= 15.3, 7.4 Hz, 1H), 5.41 (dd, J = 15.3, 8.5 Hz, 1H), 4.88 (td, J = 7.1, 3.2Hz, 1H), 4.50-4.68 (m, 1H),4.01 (q, J = 6.8 Hz, 1H), 3.90 (q, J = 7.8 Hz,1H), 3.75 (s, 1H), 3.64-3.47 (m, 2H), 2.94 (s, 1H), 2.70 (dd, J = 18.1, 9.5Hz, 1H), 2.62 – 2.46 (m, 2H), 2.39 (dd, J = 18.1, 1.7 Hz, 1H), 2.22 (q, J =8.7 Hz, 2H), 1.90 (ddd, J = 14.7, 8.1, 3.3 Hz, 1H), 1.74 – 1.49 (m, 7H), 1.49– 1.39 (m, 1H), 1.36 – 1.20 (m, 6H), 0.87 (t, J = 6.7 Hz, 3H).
实施例13、15α-羟基前列腺素中间体(Ik)的制备
Figure 839427DEST_PATH_IMAGE014
向100 mL圆底瓶中加入15-羰基前列腺素中间体（IIk）76 mg（5mM）,加入DMSO 4mL（10% v/v）,终浓度为10 mM的辅助底物葡萄糖，终浓度为0.2mM的NADP+,加入pH=7.0、100mM的磷酸钾缓冲液26.8 mL使得最终反应体积为40 mL,GDH细胞上清液8 mL(20% v/v),取实施例1中的SyADH纯蛋白酶液715μL(蛋白浓度：56 mg/mL, 反应蛋白浓度为1mg/mL),然后置于25 ℃的恒温水浴600 rpm搅拌反应33小时。反应结束后用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，有机相用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥。浓缩后粗品用SFC分析，dr值为99:1,柱层析分离得到65 mg目标产物，收率：85%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.56 (dd, J =15.5; 5.7 Hz, 1H), 5.45 (dd, J = 15.5; 7.5 Hz, 1H), 4.93 (td, J = 6.9; 2.3Hz, 1H), 4.07 (q, J = 6.1 Hz, 1H), 3.97 (q, J = 5.8 Hz, 1H), 2.84-2.54 (m,2H), 2.52-2.21 (m, 3H), 1.96 (ddd, J = 14.7; 5.4; 2.2 Hz, 1H), 1.67-1.20 (m,8H), 0.88 (m, 12H), 0.04 (s, 6H).
实施例14、15α-羟基前列腺素中间体(Il)的制备
Figure DEST_PATH_IMAGE015
向100 mL圆底瓶中加入15-羰基前列腺素中间体（IIl）62 mg（5 mM）,加入DMSO 4mL（10% v/v）,终浓度为10 mM的辅助底物葡萄糖，终浓度为0.2 mM的NADP+,加入pH=6.0、100 mM的磷酸钾缓冲液26.8 mL使得最终反应体积为40 mL, GDH细胞上清液8 mL(20% v/v),取实施例1中的KRED-WZL纯蛋白酶液715μL(蛋白浓度：56 mg/mL, 反应蛋白浓度为1mg/mL),然后置于25℃的恒温水浴600 rpm搅拌反应33小时。反应结束后用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，有机相用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥。浓缩后粗品用SFC分析，dr值为99:1,柱层析分离得到53 mg目标产物，收率：85%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.56(dd, J = 15.3, 7.4 Hz, 1H), 5.41 (dd, J = 15.3, 8.5 Hz, 1H), 4.88 (td, J =7.1, 3.2 Hz, 1H), 4.01 (q, J = 6.8 Hz, 1H), 3.90 (q, J = 7.8 Hz, 1H), 3.75(s, 1H), 2.94 (s, 1H), 2.70 (dd, J = 18.1, 9.5 Hz, 1H), 2.62 – 2.46 (m, 2H),2.39 (dd, J = 18.1, 1.7 Hz, 1H), 2.22 (q, J = 8.7 Hz, 2H), 2.02 (s, 3H), 1.90(ddd, J = 14.7, 8.1, 3.3 Hz, 1H), 1.63 – 1.49 (m, 1H), 1.49 – 1.39 (m, 1H),1.36 – 1.20 (m, 6H), 0.87 (t, J = 6.7 Hz, 3H).
实施例15、15α-羟基前列腺素中间体(Im)的制备
Figure 133267DEST_PATH_IMAGE016
向100 mL圆底瓶中加入15-羰基前列腺素中间体（IIm）75 mg（5mM）,加入DMSO 4mL（10% v/v）,终浓度为10 mM的辅助底物葡萄糖，终浓度为0.2mM的NADP+,加入pH=8.0、100mM的磷酸钾缓冲液26.8 mL使得最终反应体积为40 mL,GDH细胞上清液8 mL(20% v/v),取实施例1中的KRED-WZL纯蛋白酶液715μL(蛋白浓度：56 mg/mL, 反应蛋白浓度为1mg/mL),然后置于35℃的恒温水浴600 rpm搅拌反应33小时。反应结束后用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，有机相用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥。浓缩后粗品用SFC分析，dr值为99:1,柱层析分离得到61 mg目标产物，收率：80%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 8.03-7.99(m, 2H), 7.61-7.54 (m, 1H), 7.49-7.41 (m, 2H), 5.71-5.56 (m, 1H), 5.30-5.04(m, 2H), 4.14-4.06 (m, 2H), 2.94-2.46 (m, 4H), 1.80 (s, 3H), 1.56-1.42 (m,2H), 1.36-1.17 (m,3H), 0.87 (d, J = 6.7 Hz, 3H).
实施例16、15α-羟基前列腺素中间体(In)的制备
Figure DEST_PATH_IMAGE017
向100 mL圆底瓶中加入15-羰基前列腺素中间体（IIn）296 mg（20mM）,加入DMSO 4mL（10% v/v）,终浓度为70 mM的辅助底物葡萄糖，终浓度为0.2mM的NADP+,加入pH=6.5、100mM的磷酸钾缓冲液26.8 mL使得最终反应体积为40 mL,GDH细胞上清液8 mL(20% v/v),取实施例1中的KRED-WZL纯蛋白酶液715μL(蛋白浓度：56 mg/mL, 反应蛋白浓度为1mg/mL),然后置于30℃的恒温水浴600 rpm搅拌反应33小时。反应结束后用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，有机相用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥。浓缩后粗品用SFC分析，dr值为99:1,柱层析分离得到244 mg目标产物，收率：80%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 8.03-7.99 (m, 2H), 7.61-7.54 (m, 1H), 7.49-7.41 (m, 2H), 5.71-5.56 (m, 1H), 5.30-5.04 (m, 2H), 4.14-4.06 (m, 2H), 2.94-2.46 (m, 4H), 1.75-1.42 (m, 9H) 。
序列表
<110> 复旦大学
<120> 一种前列腺素中间体15α-羟基内酯的不对称还原合成方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 244
<212> PRT
<213> KRED-WZL
<400> 1
Met Asn Phe Thr Asp Lys Asn Val Ile Ile Thr Gly Gly Ser Ala Gly
1 5 10 15
Ile Gly Leu Ala Thr Ala Lys Lys Phe Ile Ala Lys Glu Ala Asn Val
20 25 30
Leu Val Thr Gly Arg Asn Thr Glu Ser Leu Asp Lys Ala Ser Val Thr
35 40 45
Ile Asn Ser Pro Lys Phe Lys Thr Leu Ala Ser Asp Ile Ser Lys Leu
50 55 60
Ala Asp Ile Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ser Glu Ser Gly Lys Lys
65 70 75 80
Val Asp Val Leu Val Leu Asn Ala Gly Ile Ala Lys Gln Phe Ser Ile
85 90 95
Glu Glu Thr Thr Glu Glu Val Phe Asp Asp Leu Phe Asn Ile Asn Val
100 105 110
Lys Gly Leu Phe Phe Thr Leu Gln Lys Leu Ile Pro His Leu Ala Glu
115 120 125
Gly Ala Ser Ile Ile Leu Ile Ser Ser Gly Val Ser Val Ser Gly Tyr
130 135 140
Ala Gln Met Gly Ala Tyr Ala Ala Thr Lys Ser Ala Val Asp Ala Ile
145 150 155 160
Ala Arg Thr Ala Ala Ile Glu Leu Ala Asp Arg Lys Ile Arg Val Asn
165 170 175
Thr Val Ala Pro Gly Leu Thr Asp Thr Pro Met Asn Gln Gln Thr Pro
180 185 190
Glu Asp Ile Lys Asn Ala Ile Ala Ala Ala Val Pro Leu Lys Arg Ile
195 200 205
Gly Glu Ala Glu Glu Ile Ala Asn Ala Ile Val Phe Phe Ala Ser Ser
210 215 220
Glu Ala Ser Tyr Ile Ser Gly Ser Tyr Leu Ser Val Asp Gly Gly Val
225 230 235 240
Thr Ile Arg Arg
<210> 2
<211> 262
<212> PRT
<213> SyADH
<400> 2
Met Thr Thr Leu Pro Thr Val Leu Ile Thr Gly Ala Ser Ser Gly Ile
1 5 10 15
Gly Ala Thr Tyr Ala Glu Arg Phe Ala Arg Arg Gly His Asp Leu Val
20 25 30
Leu Val Ala Arg Asp Lys Val Arg Leu Asp Ala Leu Ala Ala Arg Leu
35 40 45
Arg Asp Glu Ser Gly Val Ala Val Glu Ala Leu Gln Ala Asp Leu Thr
50 55 60
Arg Pro Ala Asp Leu Ala Ala Val Glu Ile Arg Leu Arg Glu Asp Ala
65 70 75 80
Arg Ile Gly Ile Leu Ile Asn Asn Ala Gly Met Ala Gln Ser Gly Gly
85 90 95
Phe Val Gln Gln Thr Ala Glu Gly Ile Glu Arg Leu Ile Thr Leu Asn
100 105 110
Thr Thr Ala Leu Thr Arg Leu Ala Ala Ala Val Ala Pro Arg Phe Val
115 120 125
Gln Ser Gly Thr Gly Ala Ile Val Asn Ile Gly Ser Val Val Gly Phe
130 135 140
Ala Pro Glu Phe Gly Met Ser Ile Tyr Gly Ala Thr Lys Ala Phe Val
145 150 155 160
Leu Phe Leu Ser Gln Gly Leu Asn Leu Glu Leu Ser Pro Ser Gly Ile
165 170 175
Tyr Val Gln Ala Val Leu Pro Ala Ala Thr Arg Thr Glu Ile Trp Gly
180 185 190
Arg Ala Gly Ile Asp Val Asn Thr Leu Pro Glu Val Met Glu Val Asp
195 200 205
Glu Leu Val Asp Ala Ala Leu Val Gly Phe Asp Arg Arg Glu Leu Val
210 215 220
Thr Ile Pro Pro Leu His Val Ala Ala Arg Trp Asp Ala Leu Asp Gly
225 230 235 240
Ala Arg Gln Gly Leu Met Ser Asp Ile Arg Gln Ala Gln Ala Ala Asp
245 250 255
Arg Tyr Arg Pro Glu Ala
260

Claims (8)

1.一种前列腺素中间体15α-羟基内酯（I）的不对称还原合成方法，采用羰基还原酶作为催化剂，用于不对称还原15-羰基前列腺素中间体（II），生成15α-羟基前列腺素中间体（I），反应体系包括羰基还原酶的纯蛋白酶液、底物15-羰基前列腺素中间体（II）、葡萄糖脱氢酶、助溶剂、磷酸盐缓冲液、葡萄糖、辅因子；不对称羰基还原反应的反应式如下：
Figure 92733DEST_PATH_IMAGE001
式中，R1为氢， C1-C10烷基或环烷基，苯基，苄基，单取代或多取代芳基或芳烷基，三甲基硅基，三乙基硅基，叔丁基二甲基硅基,甲基二苯基硅基,四氢吡喃基，甲酰基，C1-C10烷基酰基，苯甲酰基或联苯甲酰基，单取代或多取代苯甲酰基或联苯甲酰基;R2为C1-C10烷基或环烷基，烯基，炔基，苯乙基或取代苯乙基，苯氧亚甲基或取代苯氧亚甲基;
所述羰基还原酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，或者具有与SEQID NO.1或SEQ ID NO.2所示氨基酸序列同源性大于80%的氨基酸序列且保持催化活性的其它羰基还原酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，不对称羰基还原反应中，所述底物浓度为1.0-100g/L，羰基还原酶的纯蛋白浓度为0.2 g/L-2g/L, 葡萄糖脱氢酶的浓度为0.1 g /L～ 1 g/L，葡萄糖的浓度为5～750 g/L，辅因子浓度为0～0.5 mM。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述不对称羰基还原反应中，反应温度为20-40oC,反应缓冲液pH为5.0-8.0，缓冲浓度为100-250mM。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述不对称羰基还原反应中，所用助溶剂选自二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺高介电常数的溶剂；苯、甲苯、乙苯、氯苯、溴苯芳香族溶剂；正己烷、环己烷非极性溶剂；乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、1，2-二氯乙烷、甲醇、乙醇、异丙醇极性溶剂的一种或多种；助溶剂为反应体系体积的8-12%。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在反应过程中，待反应至SFC检测底物完全耗尽后，用等体积的乙酸乙酯萃取3-4次，合并有机相，用饱和氯化钠洗涤2次，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去有机溶剂，得到目标产物。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述羰基还原酶的纯蛋白酶液的具体制备流程如下：
（1）制备含羰基还原酶基因的工程菌；
（2）制备上述工程菌的静息细胞悬浊液；
（3）制备含羰基还原酶的细胞上清液；
（4）制备羰基还原酶的纯蛋白酶液；
其中,所述的工程菌含有质粒pET28-KRED-WZL或者pET28-SyADH，其中羰基还原酶KRED-WZL的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，羰基还原酶SyADH的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3) 。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述细胞上清液的制备方法，包括：将所述的工程菌接种到含卡那霉素的培养基，摇床活化后，扩大至OD600值达到0.6-1.2时，加入诱导剂，继续培养，离心收集细胞，用缓冲液重悬，超声或加压破碎，离心，获得所述的细胞上清液；
所述诱导剂为IPTG,诱导剂的浓度为0.05mM-0.8mM；
加入诱导剂后的培养条件为：培养温度15-25℃，培养时间8-24h；
所述缓冲液为磷酸二氢钾-磷酸氢二钾；缓冲液浓度为30-300mM。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述纯蛋白酶液的制备方法，包括：将所述的细胞上清液与Ni树脂混合，摇床振摇20min后，滤去清液，树脂用2-4倍柱体积的含低浓度咪唑的洗脱剂滤洗，用含高浓度咪唑的洗脱剂洗脱纯蛋白酶，并收集蛋白浓度大于3mg/mL的洗脱液，合并洗脱液即得纯蛋白酶液。
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