CN104531728A - 一种宇佐美曲霉环氧化物水解酶基因的克隆及异源表达方法 - Google Patents

一种宇佐美曲霉环氧化物水解酶基因的克隆及异源表达方法 Download PDF

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李兴倩
胡蝶
李剑芳
余涛
朱利娟
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Abstract

本发明提出了一种源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的一种环氧化物水解酶cDNA基因序列的克隆方法，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1，命名为Aueh1，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2，该酶命名为AuEH1。本发明还公开了AuEH1工程菌的构建以及重组AuEH1的异源表达和活性测定的方法。以20mM消旋体环氧苯乙烷为底物，重组AuEH1工程菌全细胞催化，获得(S)-SO的对映体过量率ee>94％。AuEH1具有较高的催化活性和手性选择性，有较大的工业化生产和应用潜力及经济价值。

Description

一种宇佐美曲霉环氧化物水解酶基因的克隆及异源表达方法
技术领域
本发明涉及来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的一种环氧化物水解酶基因cDNA序列的克隆及异源表达，属于生物工程技术领域。
背景技术
手性环氧化物是有机合成中的重要中间体，在医药、农药、香料等方面有着重要的应用价值。如(S)-苯基环氧乙烷是重要的手性药物中间体，在抗癌药与驱虫药levamisole等的合成上具有重要的应用价值；手性苯基-2,3-环氧酸乙酯可用于合成紫杉醇；(S)-芳基缩水甘油醚可用于合成阿替洛尔。手性环氧化物的合成方法主要有化学法与生物催化法。用传统的化学法合成具有光学活性的环氧化合物和邻位二醇的反应条件较为苛刻，难以得到高对映体纯度的目的产物；而生物合成法是利用来源于动物、植物及微生物的环氧化物水解酶(EpoxideHydrotase,EH)催化外消旋环氧化物立体选择性水解来制备。与化学法相比，生物法具有众多的优点：高效性、高对映选择性、高区域选择性、反应条件温和、适用范围广及环境友好等。因此，生物法制备手性环氧化物及其二醇产物成为近年来研究的热点。
一些具有环氧化物水解酶活性的菌种，如鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)、红球菌(Rhodococcus sp.)、黑曲霉(Aspergillus niger)等先后被分离。Liu等将黑曲霉的环氧化物水解酶基因导入大肠杆菌中表达并获得成功，该酶以对硝基氧化苯乙烯为底物，酶活力达到104.5U/mg。Furstoss等发现A.niger(LCP 521)和Beauveria bassiana(ATCC 7159)产生的酶有很高的立体选择性，并且酶的区域选择性相反。随着生物信息学的发展、基因序列信息的积累以及基因工程技术的进步，快速获得新的EH基因已成为可能，且来源于真菌A.niger和细菌Agrobacterium radiobacter ADI的EH分子的微观结构已通过x-射线分析，为EH的基因工程研究提供了条件。
发明内容
本发明的目的是提供一种宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001新型环氧化物水解酶基因序列克隆，环氧化物水解酶工程菌的构建以及重组环氧化物水解酶的异源表达和活性测定的方法。来源于A.usamii E001的一种新型环氧化物水解酶，命名为AuEH1，其相应的基因命名为Aueh1。AuEH1具有较高的催化活性和手性选择性，有较大的工业化生产和应用潜力及经济价值。
A.usamii E001菌株的新型Aueh1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。由cDNA序列推导的AuEH1氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
重组AuEH1的活性测定方法：在1.5mL的EP管中加入100μL酶液和800μL磷酸盐缓冲液(pH＝6.8)，35℃预热2min；加入100μL 200mM的环氧苯乙烷(styrene oxide,SO)并立即计时，准确反应30min后，取200μL反应液加入800μL乙酸乙酯中混匀，10000r/min离心5min后，取上层于新的EP管中，加入适量无水MgSO4，进行手性气相色谱分析。酶活性单位定义：在本测定条件下，以每分钟消耗1μmol外消旋环氧苯乙烷所需的酶量定义为1个环氧化物水解酶活性单位(U)。
AuEH1成熟肽cDNA序列的克隆和表达方法：
(1)根据菌株同源性高的黑曲霉(Aspergillus niger)M200的环氧化物水解酶基因序列，设计一对特异性引物，引物序列如下：
AuEH1-F：5’-CATATGTCTGCTCCGTTCGGCAAG-3’，含Nde I酶切位点。
AuEH1-R：5’-GCGGCCGCCTACTTCTGCCACACCTGCTC-3’，含Not I酶切位点。
按照TaKaRa RNA PCR Kit(Ver.3.0)使用说明书进行RT-PCR。以Oligo dT-Adaptor Primer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链；以AuEH1-F和M13Primer M4为引物进行第一轮PCR扩增；以AuEH1-F和AuEH1-R为引物进行第二轮PCR扩增。将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T载体连接(pUCm-T-Aueh1)，转化入E.coliJM109中，经菌液PCR鉴定正确后送上海生工测序。
(2)将测序结果正确的pUCm-T-Aueh1与pET-28a(+)质粒均用Nde I和Not I进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET-28a(+)-Aueh1(图1)，并对重组质粒进行序列测定。
(3)E.coli BL21(DE3)/Aueh1的构建、表达及活性测定：将pET-28a(+)-Aueh1转化入E.coliBL21(DE3)中，经含有Kan的抗性平板筛选后，挑取阳性转化子于2mL含Kan的抗性LB液体培养基中，37℃220r/min摇床振荡培养14～16h。按1％的接种量转接于30mL相同培养基中，37℃220r/min摇床振荡培养至对数生长中期(OD600＝0.6～0.8)，加入IPTG至终浓度为150μM，16℃220r/min诱导培养10h。对照组分别用仅含空pET-28a(+)和无IPTG的工程菌在相同条件下培养。诱导结束后，离心收集菌体并用磷酸盐缓冲液(pH＝6.8)洗涤数次，利用手性气相色谱测定AuEH1活性。
本发明的有益效果：本发明提供了一种A.usamii E001菌株新型环氧化物水解酶基因序列克隆，环氧化物水解酶工程菌的构建以及重组环氧化物水解酶的异源表达和活性测定的方法，并对序列进行生物信息学分析。来源于A.usamii E001的一种新型环氧化物水解酶，命名为AuEH1，其相应的基因命名为Aueh1。AuEH1具有较高的催化活性和手性选择性，有较大的工业化生产和应用潜力及经济价值。
附图说明
图1：重组质粒pET-28a(+)-Aueh1的构建示意图
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
实施例1AuEH1成熟肽cDNA序列的克隆
提取A.usamii E001的总RNA，按照TaKaRa RNA PCR Kit(Ver.3.0)使用说明书进行RT-PCR。以Oligo dT-Adaptor Primer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链。以AuEH1-F和M13Primer M4为引物进行第一轮PCR扩增，PCR条件为：94℃5min；94℃30s，51℃30s，72℃2min，30个循环；72℃10min。以AuEH1-F和AuEH1-R为引物进行第二轮PCR扩增，PCR条件为：94℃4min；94℃30s，56℃30s，72℃1min 30s，30个循环；72℃10min。将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T载体连接(pUCm-T-Aueh1)，转化入E.coli JM109中，经菌液PCR鉴定正确后送上海生工测序，得到AuEH1成熟肽cDNA序列。
实施例2AuEH1成熟肽基因在E.coli BL21(DE3)中的表达
将测序结果正确的pUCm-T-Aueh1与pET-28a(+)质粒均用Nde I和Not I进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET-28a(+)-Aueh1，并对重组质粒进行序列测定。将pET-28a(+)-Aueh1转化入E.coli BL21(DE3)中，经含有Kan的抗性平板筛选后，挑取阳性转化子于2mL含Kan的抗性LB液体培养基中，37℃215r/min摇床振荡培养14～16h。按1％的接种量转接于30mL相同培养基中，37℃215r/min摇床振荡培养至对数生长中期(OD600＝0.6～0.8)，加入IPTG至终浓度为150μM，16℃215r/min诱导培养10h。对照组分别用仅含空pET-28a(+)和无IPTG的工程菌在相同条件下培养。以20mM消旋体环氧苯乙烷为底物催化，重组AuEH1全细胞催化，获得(S)-SO的对映体过量率ee>94％。

Claims (4)

1.一种源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株的新型环氧化物水解酶基因(Aueh1)，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
2.由权利要求1所述的环氧化物水解酶基因(Aueh1)编码的新型环氧化物水解酶(AuEH1)，其完整的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
3.AuEH1成熟肽cDNA序列的克隆：
根据同源性高的黑曲霉(Aspergillus niger)M200环氧化物水解酶基因序列，设计一对特异性引物，引物序列如下：
AuEHA-F：5’-CATATGTCTGCTCCGTTCGGCAAG-3’，含Nde I酶切位点
AuEHA-R：5’-GCGGCCGCCTACTTCTGCCACACCTGCTC-3’，含Not I酶切位点
提取A.usamii E001的总RNA，按照TaKaRa RNA PCR Kit(Ver.3.0)使用说明书进行RT-PCR；以Oligo dT-Adaptor Primer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链；以AuEH1-F和M13Primer M4为引物进行第一轮PCR扩增；以AuEH1-F和AuEH1-R为引物进行第二轮PCR扩增；将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T载体连接(pUCm-T-AuehA)，转化入E.coli JM109中，经菌液PCR鉴定正确后送上海生工测序，得到AuEH1成熟肽cDNA序列。
4.AuEH1成熟肽基因在E.coli BL21(DE3)中的表达：
将测序结果正确的pUCm-T-Aueh1与pET-28a(+)质粒均用Nde I和Not I进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET-28a(+)-Aueh1，并对重组质粒进行序列测定；将pET-28a(+)-Aueh1转化入E.coli BL21(DE3)中，经含有Kan的抗性平板筛选后，挑取阳性转化子于2mL含Kan的抗性LB液体培养基中，37℃220r/min摇床振荡培养14～16h；按1％的接种量转接于30mL相同培养基中，37℃220r/min摇床振荡培养至对数生长中期(OD600＝0.6～0.8)，加入IPTG至终浓度为150μM，16℃215r/min诱导培养10h，对照组分别用仅含空pET-28a(+)和无IPTG的工程菌在相同条件下培养；以20mM消旋体环氧苯乙烷为底物，重组AuEH1工程菌全细胞催化，获得(S)-SO的对映体过量率ee>94％。
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