SK280049B6 - Spôsob prípravy (s)-2-(3-benzoylfenyl)propiónovej - Google Patents

Description

Oblasť vynálezu

Vynález sa týka spôsobu delenia enantiomérov arylalkánových kyselín, najmä kyseliny 2-(3-benzoylfenyl) propiónovej (ketoprofén).

Doterajší stav techniky

Množstvo 2-arylpropiónových kyselín je dobre známych ako protizápalové činidlá. Príklady zahrnujú ibuprofén, naproxén a ketoprofén. Tieto zlúčeniny sú chirálne a uznáva sa, že ich hlavná terapeutická aktivita spočíva v (S)-enantiomére.

Je známych niekoľko spôsobov na získanie (S)-enantioméru bez kontaminujúceho (R)-enantioméru. Tieto zahrnujú asymetrické chemické syntézy a chemické rozlišovanie, ako stoichiometrická kryštalizácia diastereomérnych solí tvorených s rôznymi chirálnymi amínmi.

Alternatívny prístup je biokatalytický, s použitím biokatalyzátora na selektívnu hydrolýzu esteru kyseliny 2-arylpropiónovej. Použitím biokatalyzátora so správnou stereošpecificitou možno identifikovať reakčnú zmes obsahujúcu nezreagovaný ester jedného enantioméru plus možno získať kyselinový produkt iného enantioméru. Separácia a znovuzískanie produktu sú potom relatívne jednoduché. Nezreagovaný ester môže byť racemizovaný a znovu použitý v ďalšej reakcii, pričom zabezpečuje takmer kompletnú konverziu racemického substrátu na požadovaný jednotlivý enantiomérový produkt.

EP-A-0227078 opisuje použitie niekoľkých extracelulámych, komerčne dostupných mikrobiálnych lipáz pri takomto biokatalytickom rozlišovaní. Vo všeobecnosti však boli požadované veľké množstvá enzýmu a reakcia trvala 2 až 6 dní. Takéto reakcie by preto boli nákladné z hľadiska uskutočňovania. Najlepším identifikovaným enzymatickým práškom bol prášok z Candida cylindracea (tiež známej ako Candida rugosa); ale v EP-A-O4O7O33 sa ukázalo, že tento prípravok, nakoľko má malú aktivitu, obsahoval viac ako jeden enzým s esterázovou aktivitou. Ďalej, aby sa získal ketoprofén s vysokým ee, bolo nevyhnutné prípravok purifikovať.

EP-A-0233656 opisuje izoláciu a klonovanie génu esterázy z Bacillus thai. Tento enzým selektívne hydrolyzuje etyl a metyl estery naproxénu i ibuprofénu, aby vznikla (S)-kyselina zodpovedajúcich zlúčenín. Ukázalo sa tiež, že klonovanie enzýmu vyústilo do prípravy poskytujúcej vyšší ee produkt ako výsledok minimalizácie vedľajších aktivít enzýmu.

WO-A-9323547 opisuje množstvo kmeňov, ktoré tiež produkujú esterázu, ktorá selektívne hydrolyzuje estery naproxénu. Kmeňom, ktorý' najlepšie vyhovoval bola Zopfiella latipes, z ktorej bola klonovaná esteráza.

WO-A-9304189 opisuje organizmus Trichosporon sp., ktorý je schopný selektívne hydrolyzovať (S)-enantiomér etylketoprofénu, aby vznikol (S)-kyselinový produkt s ee > 90 %. Enzým, ktorý uskutočňuje túto biotransformáciu, je intracelulámy. Keďže je ťažké získať stabilné bezbunkové prípravky, je tiež ťažké zvyšovať biokatalytické aktivity génovým klonovaním alebo klasickou mutagenézou.

Predmetom predkladaného vynálezu je získať biokatalyzátor, ktorý má dobrú aktivitu proti rôznym esterom ketoprofénu, ktorý poskytuje dobrý ee produkt kyseliny ketoprofénu a ktorý by bol vhodný na klonovanie a hyperexpresiu napríklad v E. coli, čo by umožnilo udržať náklady na katalyzátor na minime.

Skríning mikroorganizmov zo širokej škály rôznych zdrojov prekvapujúco ukázal, že askomycéta Ophiostoma novo-ulmi (tiež známa ako Ceratocystis ulmi) produkovala intracelulámy hydrolytický enzým, ktorý by mohol uskutočňovať požadovanú reakciu. Ďalšie testy ukázali, že na rozdiel od kmeňa zisteného vo WO-A-9304189 bolo možné dosiahnuť stabilnú bezbunkovú aktivitu, a preto bola vhodná na klonovanie a potenciálne použitie v bezbunkových biotransformáciach. Ophiostoma novo-ulmi je rastlinným patogénom známym ako virulentné ctiologické činidlo Dutch Elm choroby. Je známe, že úzko súvisí s menej virulentnými kmeňmi Ophiostoma novo-ulmi a tiež s O. piceae.

Sledovaním primárnych zistení podložených predkladaným vynálezom sa zistilo, že stereošpecifická aktivita esterázy je prítomná v alternatívnych kmeňoch Ophiostoma novo-ulmi v Ophiostoma ulmi (niekedy tiež označených ako Ceratocystis ulmi) a Ophiostoma piceae (tiež niekedy známej ako Ceratocystis piceae) a z izolátov zozbieraných z rôznych lokalít USA, Európy, Stredného východu a Uzbekistanu. Na doplnenie sa z IMI, Eghamu, Surrey, UK získali alternatívne kmene Ceratocystis sp. a boli sledované z hľadiska aktivity.

Zistilo sa, že aktivita je prítomná tiež v kmeňoch C. coronata (napríklad IMI 176533), C. ips (napríklad IMI 212114), C. tetropii (napríklad IMI 212117), C. cainii (napríklad IMI 176523), C. arborea (napríklad IMI 176529) a C. stenoceras (napríklad IMI 268494). Aktivita sa preto javí ako rozsiahla v rozmedzí alternatívnych kmeňov Ceratocystis .zozbieraných z rôznych lokalít sveta.

Kmeň pôvodného sledovaného izolátu, tu označený ako AJ3, bol uložený v IMI 15. febr. 1993, s prírastkovým číslom IMI 356050, na základe Budapeštianskej dohody. Tento kmeň poskytuje dobrý príklad pre aktivitu; akokoľvek z hľadiska širokosiahlej povahy aktivity v rozsiahlej škále príbuzných kmeňov, nie je rozsah vynálezu zvlášť limitovaný na tento organizmus. Vynález je tiež rozšírený na použitie enzymatickej aktivity izolovanej vhodnou technikou z týchto organizmov.

Podstata vynálezu

V súlade s predkladaným vynálezom možno mikroorganizmy rodu Ophiostoma a ich enzymatickú aktivitu použiť na stereoselektívnu hydrolýzu racemických alkylesterov ketoprofénu, aby sa získala kyselina podstatne obohatená (S)-enantiomérom, napríklad 93 až 96 % prevaha enantiomčru alebo viac, pri 15 až 25 % konverzii, aby sa uvoľnil zvyškový ester obohatený (B)enantiomérom. Reakcia môže byť uskutočňovaná v akejkoľvek zmesi enantiomérov esteru, hoci takouto zmesou je obvykle racemát. Alkylová skupina esteru obsahuje výhodne 1 až 3 atómy uhlíka. Reakcia sa výhodne uskutočňuje pri pH 8 až 11, výhodnejšie 9,5 až 10,5, najvýhodnejšie okolo 10, Obyčajne sa používa organické rozpúšťadlo ako cyklohexán.

Štandardné chemické postupy potom možno použiť na oddelenie produktu kyseliny od esteru. Kde je to nevyhnutné, možno zvýšiť optickú čistotu kyseliny použitím chirálneho amínu, ako napríklad (B)-a-metylbenzylamínu. Ester, ktorý zostal nekonvertovaný, môže byť racemizovaný, na ďalšie použitie.

Nasledovné príklady ilustrujú vynález.

SK 280049 Β6

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Biotransformácia racemického etylketoprofénu pomocou AJ3.

Na rast organizmu bolo použité nasledovné médium:

(NH₄)₂SO₄ (g/1)0,5

MgSO₄.7H₂O (g/1)0,25

CaCl₂.2H₂O (g/1)0,1

KH₂PO₄ (g/1)8,0 kvasinkový extrakt (g/1)10,0 glukóza (g/1)5,0 roztok stopových prvkov (pl/l) 100 pH(sNaOH)6,5

Roztok stopových prvkov predstavoval:

CaCl₂.2H₂0 (g/1)3,57

ZnO (g/1)2,0

CuCl₂.2H₂O (g/1)0,85

Na₂Mo0₄.2H₂0 (g/1)4,8

MnCl₂.4H₂O (g/1)2,0

FeCl₃.6H₂O (g/1)5,4

H₃BO₄ (g/1)0,3

CoCl₂.6H₂O (g/1)2,4

HCl (ml/1)250

Bunky AJ3 boli inokulované z agarovej platne so sladovým extraktom do 30 ml rastového média v 250 ml miešacej banke. Táto bola pretrepávaná počas 30 hodín pri 23 °C a potom sa 2,5 ml prenieslo do druhej 250 ml zachytávacej banky s obsahom 30 ml média. Po čase rastu 40 hodín bol pri 23 °C za pretrepävania do bujónu pridaný racemický etylketoprofén až do koncentrácie 20 g/1. Potom sa 120 hodín nechala prebiehať biotransformácia, po ktorej sa HPLC analýzou dokázala 18,2% hydrolýza pridaného esteru. Enantioméma prevaha vytvorenej kyseliny ketoprofénu predstavovala 96% v prospech (S)-enantioméru.

Príklad 2

Účinok organického rozpúšťadla

Pripravil sa surový roztok enzýmu s použitím toho istého rastového média ako v príklade 1, bez glukózy a pri pH 6,0. Bunky AJ3 boli inokulované do 100 ml média v 1 litrovej miešacej banke. Táto kultúra rástla za miešania pri 30 °C 48 hodín. 10 ml sa potom prenieslo do 90 ml čerstvého média v 1 1 miešacej nádobe a rástla ďalších 8 hodín, pri 30 °C za pretrepávania. Táto banka bola použitá na inokuláciu 2,8 1 laboratórneho fermentátora s 1,5 1 média plus 5 g/1 glukózy a 0,5 ml/1 silikón/PPG antipeny (XFO371, Ivanhoe Chemicals, 111., USA). Na tento fermentátor sa pôsobilo 48 hodín premiešavaním a aeráciou, regulovanými tak, aby sa udržalo DOT > 50 % saturácie vzduchu, pri teplote 30 °C a pri pH 6,0.

Po ukončení fermentácie sa bunky zozbierali centrifugáciou a peleta resuspendovala pri 10 % w/v (hmotnosť na celkový objem) (na základe hmotnosti vlhkých buniek) v pufri lýzy, t. j. 0,1 M uhličitane sodnom v 5 % vodnom roztoku Tritonu X-100. Lýza sa uskutočňovala cez noc pri 8 °C s pretrepávaním, po ktorej bol centrifugáciou oddelený lyzát obsahujúci enzymatickú aktivitu od bunkového zvyšku.

Racemický etylketoprofén bol rozpúšťaný v každom zo 4 organických rozpúšťadiel: toluén, cyklohexán, metanol a MTBE (metyl terc.butyléter) na koncentráciu 20 g/1. 2 ml každého z týchto roztokov sa pridali k 5 ml surového enzymatického roztoku v sklených ampulkách. Kontrolná vodná biotransformácia obsahujúca 5 ml surového enzymatického roztoku, 400pl 50 % racemického etylketoprofénu, 0,5 % w/v zásobného roztoku Tweenu 80 a 2,5 % w/v Tritonu x-100 sa tiež pripravovala v sklenených ampulkách. Reakcie všetkých vzoriek prebiehali za miešania 48 hodín pri 25 °C. Analýzou vodnej fázy každej reakčnej zmesi sa získali výsledky uvedené v tab. 1

Tab. 1 Hydrolýza racemického etylketoprofénu v dvojfázových biotransformáciách.

rozpúšťadlo vzorky	prod. kyselina ( mg/ml)	konverzia %
vodné	2,3	6,2
toluén	0,1	1,3
cyklohexán	1,1	14,1
metanol	0,4	4,6
MTBE	0,7	8,3

Zistilo sa, že biotransformácia prebieha v určitom rozsahu v prítomnosti cyklohexánu alebo MTBE ako rozpúšťadiel, ale je dosť silno inhibovaná toluénom za týchto podmienok.

Príklad 3

Účinok alkylovej skupiny

Rôzne estery racemického ketoprofénu boli rozpustené v cyklohexáne na koncentráciu 20 g/1. Použitými estermi boli metyl, etyl, n-propyl, n-butyl, n-pentyl, n-hexyl. V prípade metylesteru bola z dôvodov malej solubility esteru suspenzia pripravená v cyklohexáne.

K 5 ml podielu roztoku surového enzýmu v sklenených ampulkách boli pridané 2 ml každého zo 6 spomenutých roztokov racemického esteru ketoprofénu. Vodná kontrolná biotransformácia sa tiež pripravila v sklenenej ampulke obsahujúcej 5 ml surového enzymatického roztoku, 200 pl 50% racemického etylketoprofénu, 0,5 % zásobného roztoku Tweenu 80 a 2,5 % w/v Tritonu x-100. Reakcie sa uskutočňovali za miešania počas 24 hodín pri 25 °C. HPLC analýzou vodnej fázy každej biotransformácie sa získali výsledky uvedené v tab. 2.

Tab. 2 Hydrolýza racemických esterov ketoprofénu v dvojfázových biotransformáciách.

ester ketoprofénu	produk. kyselina (mg.mľ1)	konverzia (%)	EE (%)(S)-enant.
vodná kontrola	4,6	22,9	90
metyl	1,7	42,3	90
etyl	1,1	27,5	100
n-propyl	1,0	25,6	86
n-butyl	0,3	8,0	N/D
n-pentyl	0,18	4,4	N/D
n-hexyl	0,09	2,3	N/D

N/D = neurčené kvôli malej akumulácii kyseliny.

SK 280049 Β6

Príklad 4

Príprava AJ3 lyzátu

AJ3 lyzát narástol do 500 1 povlaku s použitím nasledovnej technológie.

AJ3 bol naočkovaný do 100 ml média (ako v príklade 1) v 1 1 v označenej zachytávacej nádobe. Po raste 48 hodín za krúživého miešania pri 25 °C (300 rpm, 25 mm výchylka) bol 1 ml prenesený do každej z troch litrových zachytávacích nádob, z ktorých každá obsahovala 100 ml média. Kultúry potom rástli ďalších 48 hod. za podobných podmienok prv, než boli spojené a použité na naočkovanie 750 1 fermentátora obsahujúceho 500 1 média.

Bolo použité nasledovné médium:

MgSO₄.7H₂O

CaCl₂.2H₂O

KH₂PO₄

Kvasinkový extrakt

Roztok stopových prvkov Antipena (XFO-371) pH (s NaOH)

0,4 g/1

0,1 g/1

8,0 g/1

30,0 g/1

200 μΐ/ΐ (ako v príklade 1)

0,5 ml/1

6,0

Toto médium bolo sterilizované pri 121 °C 50 minút pred pridaním 15 1 50 % w/v sterilného roztoku glukózy.

Kontrolné podmienky boli: teplota 25 °C, pH 6,0 pridaním kyseliny fosforečnej alebo hydroxidu sodného a DOT > 50% saturácie vzduchu kontrolované miešaním a aeráciou. Po 64 hod. rastu sa bunky usmrtili na podporu lýzy. Toto sa uskutočnilo znížením teploty na 15 °C a pridaním hydroxidu sodného, aby sa získalo pH 10. Po 50 minútach priebehu, sa rastové médium nastavilo opäť na pH 7 kyselinou fosforečnou a bunky sa zozbierali do spojitej centrifúgy. Zozbierané bunky boli rozdelené do rôznych zberných nádob a uchovávali sa pri teplote -20 °C podľa potreby.

Zmrazené bunky sa rozmrazili a resuspendovali pri 25 % w/v (na základe hmotnosti vlhkých buniek) v 50 mM KH2PO4, pH 6,5. Po 30 minútovom miešaní sa bunky zozbierali centrifugáciou. Bunky potom resuspendovali pri 25 % w/v (na základe hmotnosti vlhkých buniek) v lýzovom pufri, t.j. 0,3 M Na₂COj, pH 10,5.

Lýza sa uskutočňovala cez noc pri 4 °C za miešania, potom bol lyzát vyčírený centrifugáciou na oddelenie bunkového zvyšku od supematantu. Enzymatický roztok (t.j. supematant lyzátu) bol sledovaný na aktivitu s použitím štandardných podmienok biotransformácie, t.j. 1 ml enzymatického roztoku vhodne zriedeného v 0,1 M Na₂COj, pH 10,0, 40μ 50 % racemického etylketoprofénu , 0 až 5 % zásobného roztoku Tweenu 80, 2,5% w/v Tritonu X-100. Biotransformácie sa uskutočňovali v uzatvorených 20 ml sklenených ampulkách, za miešania 1 hodinu pri 25 °C. Aktivita je vyjadrená ako U/ml aktivita, kde 1 jednotka (U) = 1 mg kyseliny ketoprofénu produkovanej za hodinu pri 25 °C.

Enzymatické roztoky boli považované za vhodne riedené, ak stanovená aktivita bola v rozmedzí od 1 do 5 U/ml.

% zásobný roztok racemického etylketoprofénu bol pripravený nasledovne: 25 g racemického etylketoprofénu a 0,25 g Tweenu 80 sa pridalo k 10 ml destilovanej vody a táto zmes bola sonifikovaná počas 5 min. (15 amplitúda pm, 10 sekúnd on/10 sekúnd off cyklus). Objem bol potom doplnený destilovanou vodou na 50 ml a zásobný roztok sa sterilizoval v autoklávc na umožnenie dlhšieho času skladovania.

Typická aktivita lyzátu bola 1,5 U/ml.

Príklad 5

Izolácia a purifikácia hydrolytickej aktivity

Vyčírený lyzát (príklad 4) bol diafiltrovaný oproti destilovanej vode (Amicon DC2 ultrafiltračná jednotka používajúca duté vláknité patróny s orezanou hranou s molekulovou hmotnosťou 30.000) až kým konduktivita lyzátu dosiahla konduktivitu 20mM Na₂COj, pH 9,2 pufra (Pufer A). Roztok bol potom 4 až 5 násobne koncentrovaný a typicky si zachovával > 90 % počiatočnej aktivity. Enymatická aktivita sa po dávkach nanášala na rovnovážne nastavenú QA52 výmennú aniónovú živicu (Pharmacia) 1 hod. pri laboratórnej teplote, nanášaním 7 až 10 U aktivity na ml vlhkého QA52 gélu. Nanesený gél bol naplnený do kolóny pri lineárnej rýchlosti toku 200 mm/hod. Následne sa uskutočňovala chromatografia pri 4 °C.

Kolóna bola premytá do základnej línie pufrom A. Elúcia sa uskutočňovala s použitím 10 objemového gradientu kolóny 0 až 05 M NaCI v pufri a zozbierali sa frakcie zodpovedajúce 1/35 objemového gradientu. Typicky získané elučné profily sú uvedené v tab. 3.

Tabuľka 3 Elučný profil 1. prechodu QA52 chromatografiou

Frakcia	Celková aktivita (U.)	Výťažok (%)
Náplň	99	-
Prietok	0	0
Premytie	0	0
1	0	0
5	0,3	0,3
6	2,0	2,0
7	6,6	6,7
8	19.5	19,7
9	22,2	22,4
10	10,0	10,1
11	2,5	2,5
13	1,0	1,0
17	0,3	0,3

Aktivita bola eluovaná v NaCI v rozmedzí koncentrácie 0,12 - 0,18 M. Frakcie 7 až 10 boli spojené, aby dali: získanú aktivita spojenej frakcie = 63,5% získaný spojenný proteín = 15,8%

Spojená aktivita bola koncentrovaná s použitím YM 30 membrány v miešacej bunkovej ultrafíltračnej jednotke (AMICON) bez straty aktivity a bola dialyzovaná proti pufru A, až kým sa dosiahla konduktivita 3,2 až 3,6 mS. Aktivita bola potom znova re- chromatografovaná na QA52 živici s výsledkami, ktoré uvádza tab. 4.

Tabuľka 4 Elučný profil 2. prechodu QA52 chromatografiou

Frakcia	Celková aktivita (U.)	Výťažok (%)
Náplň	3111	-
Prietok	0	0
Premytie	0	0
13	60	1,9
14	193	6,2
15	407	13,1
16	828	26,6
17	890	28,6
18	445	14,3
19	152	4,9
20	81	2,6

SK 280049 Β6

V tomto druhom prechode sa aktivita eluovala v NaCl v koncentrácii NaCl v rozmedzí 0,2 až 0,25 M NaCl. Frakcie 15 až 17 boli spojené. Zozbieraná vzorka bola sledovaná na aktivitu a proteínový obsah.

Aktivita = 27,8 U.ml.|

Totálna aktivita = 2599 U

Totálny výťažok aktivity = 83,5%

Proteín ( biuretová metóda) = 1,34 mg.ml.j

Totálny proteín = 125 mg

Totálny výťažok aktivity = 5,5%

Spojené frakcie boli ďalej purifikované s použitím Pharmacia ΜΟΝΟ p HR 5/5 aniónmeničovej FPLC . Podmienky chromatografie boli nasledovné:

Nízkoslaný pufer = 20 mM Etanolamín-HCl pH 9,0 Vysokoslaný pufer = 20 mM Etanolamín-HCl + 0,3 M NaCl pH 9,0

Rýchlosť toku = 1 ml/min.

Gradientový profil

Čas Koncentrácia NaCl

0-5 min. 0 M

5-7 min.

7-20 min.

- 22 min.

- 23 min.

- 25 min.

0-0,1 M

0,1-0,3 M

0,3 M

0,3 - 0 M 0M

Objem vzorky = 1 ml

Objem frakcie = 1 ml

Spojené frakcie z 2. prechodu QA52 chromatografie boli 10- násobne skoncentrované cez ultrafiltračnú membránu s molekulovou hmotnosťou 30,000 a výsledný koncentrát odsolený do nízkoslaného pufra pre HPLC, použijúc gélovú filtračnú kolónu Pharmacia G-25 PD 10. Približne 5 mg totálneho proteínu bolo nanesených na HPLC kolónu pri každom meraní. Získal sa nasledovný elučný profil (tab.5):

Tabuľka 5 Elučný profil z mono P anionóvo výmennej HPLC

Frakcia (min.)	Aktivita (U-mľ1)	Výťažok (%)
Náplň	104,0	-
8	5,7	5,5
9	63,8	61,3
10	28,3	27,2
11	7,5	7,2
12	1,9	1,8
13	0,0	0,0

Frakcie 9 a 10 boli spojené, aby sa získal totálny výtažok aktivity 88,5%. Táto zozbieraná aktivita bola ďalej purifikovaná vylučovacou chromatografiou na základe veľkosti molekúl.

Analgélová TSK G3000SWXL 30 cm x7,8 mm kolóna vylučovacej HPLC na základe veľkosti molekúl bola použitá pri nasledovnej separácii. Použili sa nasledovné podmienky chromatografie:

pufer - 0,1 M K₂HPO₄ + 20mM Na₂EDTA pH 7,0 Rýchlosť toku = 0,4 ml.min. j

Objem vzorky = 200μ1

Objem frakcie = 400μ1

Spojené frakcie z ΜΟΝΟ P Iónovo výmennej HPLC boli koncentrované 1,5- násobne cez ultrafiltračnú membránu s molekulovou hmotnosťou 10,000. Koncentrovaná vzorka bola odsolená do pufra HPLC na rozlíšenie veľkosti molekúl, použijúc gélovú filtračnú kolónu Pharmacia G-25 PD 10. Získal sa nasledovný elučný profil (tab. 6):

Tab. 6 Elučný profil z vylučovacej HPLC na rozlíšenie veľkosti molekúl

Frakcia (min.)	Aktivita (U.mľ1)	Výťažok (%)
Náplň	131,0	-
17,5	0,0	0
18,5	0,0	0
19,5	1,5	2,3
20,5	13,3	20.3
21,5	7.5	11,5
22,5	2,6	4,0
23,5	0,8	1,2

Stanovenie molekulovej hmotnosti našej AJ3 racemickej etylketoprofén esterázy sa vykonalo pomocou SDS-PAGE (elektroforézy na sodium dodecylsulfát polyakrylamidových géloch). Odliata 12 % homogénna SDS PAGE na minigéli (BDH) prebehla s použitím predfarbených proteínových štandardných markerov molekulovej hmotnosti (BISCS) na porovnávanie molekulovej hmotnosti. Použitý pufer bol Electrograd pufer TTS (BDH).

Elektroforéza sa uskutočňovala za konštantnej voltáže (200 V) a limitujúceho prúdu (40 mA na gél), až kým pás modrého sfarbenia kompletne prešiel cez gél. Proteín bol vizualizovaný pomocou Coomassie Blue farbenia.

Pás proteínu zodpovedajúci esteráze bol identifikovaný porovnávaním proteínového pásu v aktívných a inaktívnych vzorkách. Porovnaním relatívnych migračných vzdialeností aktívneho proteínu s proteínovými štandardami označovaný nový denaturovaný proteín mal molekulovú hmotnosť väčšiu ako 32,500 Da marker.

Príklad 6

Účinok pH na hydrolytickú aktivitu pH profil biotransformácie bol testovaný s použitím spojeného opísaného materiálu, po 4-mesačnom uskladnení pri -20 °C. Množstvo bolo rozmrazené pri laboratórnej teplote a desaťnásobne zriedené destilovanou vodou ( zriedený enzymatický roztok) 1,1 M zásobné pufrové roztoky boli pripravené pri nasledovnom pH, s použitím označených solí (pH bolo v prípade potreby pridávané použitím NaOH alebo HC1):

pH 6,0 : NaH₂PO₄ pH 7,0 : NaH₂PO₄ pH 8,0 : NaH₂PO₄ pH 9,0 : glycín-HCl pH 10 : glycín-HCl pH 11 : NaH₂PO₄

Biotransformačné reakcie sa spustili v zazátkovaných ampulkách nasledovne:

ml zriedeného enzymatického roztoku,

100 μΐ relevantného 1,1 M pH zásobného pufrovacieho roztoku μΐ 50 % zásobného roztoku racemického etylu, 2,5 % w/v Tritonu x-100.

Na biotransformáciu pri pH 12,0 sa priamo pridal IM roztok NaOH k reakčnej zmesi s pH U, až kým sa nedosiahlo správne pH. Všetky biotransformácie sa uskutočňovali podvojné v reakciách počas 1 hodiny za miešania pri 25 °C. Hlavné výsledky reakcií uvádza tab. 7. Maximálna aktivita sa zistila pri pH 10.

Tab. 7 AJ3 biotransformačný pH profil

Biotransformácia PH	Aktivita (U.ml1)	Normalizovaný výťažok (%)
6	1,32	27,6
7	1,97	41,2
8	2,47	51,7
9	2,95	61,7
10	4,78	100,0
11	2,35	49,2
12	0,36	7,5

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (7)

1. Spôsob prípravy prevažne kyseliny (S)-2-(3-benzoylfenyljpropiónovej zo zmesi enantiomérov alkyl esteru kyseliny 2-(3-benzoyl)propiónovej, vyznačujúci sa tým, že ako biokatalyzátor sa použije mikroorganizmus rodu Ophiostoma alebo Ceratocystis, alebo materiál, ktorý má od nich odvodenú enzymatickú aktivitu.

2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že poskytuje kyselinu (S)-2-(3-benzoylfenyl) propionovú v najmenej 93 % enantionierickom nadbytku, pri konverzii 15 až 25 %.

3. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že biokatalyzátorom je Ophiostoma novo ulmi, IMI 356050.

4. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa t ý m , že alkylester má 1 až 3 atómy uhlíka.

5. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa t ý m , že alkylesterom je etylester.

6. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že reakcia sa uskutočňuje pri pH 8 až 11.

7. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že reakcia sa uskutočňuje pri pH 9,5 až 10,5.