CN113584023A

CN113584023A - 金属离子诱导的米曲霉基因启动子、其制备方法及应用

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Publication number: CN113584023A
Application number: CN202110790343.2A
Authority: CN
Inventors: 张焕欣; 张哲�; 曾斌; 李玉珍; 陈梓铭; 范俊侠
Original assignee: Horticultural Research Institute Jiangxi Academy Of Agricultural Sciences; Jiangxi Science and Technology Normal University
Current assignee: Horticultural Research Institute Jiangxi Academy Of Agricultural Sciences; Jiangxi Science and Technology Normal University
Priority date: 2021-07-13
Filing date: 2021-07-13
Publication date: 2021-11-02
Anticipated expiration: 2041-07-13
Also published as: CN113584023B

Abstract

本发明提供了金属离子诱导的米曲霉基因启动子、其制备方法及应用。米曲霉金属离子诱导基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。该启动子受锌、锰离子诱导表达。在锌、锰离子诱导浓度下，它们对米曲霉无生长抑制，反而促进米曲霉生长。而且诱导物ZnSO₄和MnSO₄价格低廉，有利于在工业生产中广泛使用。

Description

金属离子诱导的米曲霉基因启动子、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及金属离子诱导的米曲霉基因启动子、其制备方法及应用。

背景技术

米曲霉是一种在工业生产上具有重要价值的丝状真菌，被广泛用于食品、酶制剂、医药和化妆品等行业。为了获得高产、性能优越的米曲霉菌株，研究人员开发出来一系列米曲霉分子遗传操作工具，包括同源重组、基因敲除CRISPR系统、RNA干扰技术等。但这些分子遗传操作技术的发展离不开基因表达调控元件的开发，例如诱导型启动子的挖掘。

相比于细菌和酵母较为完善的基因表达调控工具库来说，米曲霉或者丝状真菌的表达调控工具还是比较滞后。一方面源于米曲霉基因调控机制较细菌和酵母要更为复杂，毕竟米曲霉有四个核，而细菌和酵母都是单核生物。另一方面原因是，研究人员对基因表达调控工具开发力度不够。但随着米曲霉的工业产品不断扩展，米曲霉基因表达调控工具也取得了一定的进展，包括诱导型启动子的开发。目前米曲霉诱导型启动子主要分为两类，一类是依赖于碳源的诱导型启动子。其中比较典型的有glaA启动子和amyB启动子，它们在含有淀粉、麦芽糖的培养基中受到强烈诱导表达。另一类是依赖于代谢物的诱导型启动子。其代表是thiA启动子，该启动子受到维生素B1抑制。当培养基中无维生素B1时，thiA启动过表达。尽管米曲霉中这两类启动子已被广泛使用，但它们也有一定的局限性。对于依赖于碳源的诱导型启动子，由于受限于碳源，像葡萄糖抑制现象的发生可能会影响产物的合成。对于依赖于代谢物的诱导型启动子，由于代谢物反馈抑制的发生，可能会抑制微生物自身的生长，进而影响产物的产量，而且，对于thiA启动子，往往会发生维生素B1对thiA启动子抑制效果不明显，从而失去其调控基因表达的作用。此外，诱导物成本不够低廉。

发明内容

为了克服上述诱导型启动子的缺陷，本发明提供了金属离子诱导的米曲霉基因启动子、其制备方法及应用。该启动子受锌、锰离子诱导表达。在锌、锰离子诱导浓度下，它们对米曲霉无生长抑制，反而促进米曲霉生长。而且诱导物ZnSO₄和MnSO₄价格低廉，有利于在工业生产中广泛使用。

为了实现上述技术目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了米曲霉金属离子诱导基因启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

优选地，所述金属离子为锌离子或锰离子。

更优选地，所述锌离子为浓度200μM的Zn²⁺，所述锰离子为浓度200μM的Mn²⁺。200μM即为相应的诱导浓度。

本发明还提供了上述米曲霉金属离子诱导基因启动子的制备方法，包括：以米曲霉RIB40 DNA为模板，对AoNramp1基因的启动子进行PCR扩增。

优选地，PCR扩增引物包括：

PAoNramp1-F：5′-TGTCTTTGCGCTCCATGTAGCT-3′；

PAoNramp1-R：5′-CGTGGTTGTGAACCAGGCG-3′。

优选地，PCR扩增体系为：

优选地，PCR扩增条件：95℃预变性30s，95℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸5min，35个循环，72℃彻底延伸5min。

本发明还提供了米曲霉金属离子诱导基因的重组载体，包含上述启动子。

优选地，所述重组载体采用含有β-葡萄糖醛酸酶(GUS)报告基因的AflII酶切的pEX2B-GUS载体。

本发明还提供了米曲霉金属离子诱导基因的转化体，转化有上述重组载体。

优选地，所述转化体为转化有上述重组载体的米曲霉3.042的尿苷/尿嘧啶营养缺陷型突变体。

本发明还提供了上述米曲霉金属离子诱导基因启动子的应用，包括在米曲霉遗传改造、代谢调控中的应用。

本发明的有益效果如下：

本发明克服了上述米曲霉诱导型启动子的不足，提供了金属离子诱导的米曲霉基因启动子、其制备方法及应用。本发明利用qRT-PCR方法发现米曲霉Nramp转运蛋白基因AoNramp1受金属离子高效诱导表达。进而克隆该基因的上游2000bp启动子序列，将启动子序列连接GUS标签后转化米曲霉，在米曲霉转基因菌株中用GUS染色方法证明其确实可以受金属离子高效诱导表达。因此，该启动子序列可作为金属离子诱导型启动子用于米曲霉的代谢调控、遗传改良等生物应用，将该启动子导入米曲霉，通过添加锌或者锰离子即可诱导基因高效表达，实现对基因的表达调控。克服了现有米曲霉诱导型启动子受碳源、代谢物影响以及诱导物不低廉等不足，对于克服现有米曲霉诱导型启动子的缺陷和基因调控序列资源的不足，丰富米曲霉基因序列资源和提高米曲霉应用价值具有重要意义。

附图说明

图1表示米曲霉在锌、锰离子处理下的表型。

图2表示在锌、锰离子处理下米曲霉金属离子诱导基因AoNramp1表达定量分析。

图3表示米曲霉金属离子诱导基因AoNramp1启动子在锌、锰离子处理下诱导表达β-葡萄糖醛酸酶(GUS)。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例

本实施例的主要步骤如下：

一、米曲霉金属离子诱导基因AoNramp1的表达分析

具体实验方法如下：

1、米曲霉的培养和金属离子处理

将米曲霉3.042孢子转接到不含Fe²⁺的Czapek-Dox(CD-Fe)固体培养基上(2％glucose，0.2％NaNO₃，0.1％KH₂PO₄，0.05％MgSO₄，0.05％KCl，0.05％NaCl，1.5％agar，pH5.5)，30℃培养3天，用于观察金属离子处理对米曲霉生长的影响。CD-Fe培养基含有200μMZnSO₄用于锌离子处理，CD-Fe培养基含有200μM MnSO₄用于锰离子处理。如图1所示，在200μMZn²⁺处理下，米曲霉菌丝变得更厚。在200μM Mn²⁺处理下，米曲霉生长直径相对于对照显著增加。

将米曲霉3.042孢子涂布到铺有玻璃纸的CD-Fe固体培养基上，30℃培养2天、4天和7天后收集菌丝，用于米曲霉总RNA提取。CD-Fe培养基含有200μM ZnSO₄用于锌离子处理，CD-Fe培养基含有200μM MnSO₄用于锰离子处理。

2、米曲霉总RNA提取方法

1)称取50-100mg经液氮研磨成粉末状的真菌样品至1.5mL离心管，立即加600uLRB(加2％β-巯基乙醇)，剧烈涡旋5min。

2)室温14，000g离心5min，小心转移上清至匀浆柱中。14，000g离心2min。

3)转移收集管中的上清(注意不要吸到沉淀)至新离心管，加入0.5倍体积无水乙醇或等体积的70％乙醇，吸打或涡旋混匀。(一般可转移500μL的上清液，可加入250μL无水乙醇)。

4)把RNA柱套在新收集管，转移混合液至RNA柱子。室温10，000g离心30-60秒，弃去滤液。如果出现堵柱现象，提高离心速度至14，000g。

5)加入400μL RNA Wash Buffer I至柱子中，按以上条件离心，弃去滤液和收集管。

6)把柱子套在新收集管，加入500μL RNA Wash Buffer II至柱子，按以上条件离心弃去滤液。

7)把柱子套回收集管，加入500μL RNA Wash Buffer II至柱子，按以上条件离心弃去滤液。

8)10，000g离心空柱2min以上甩干柱子基质。

9)把柱子装在干净的1.5mL离心管上，加入30-50μL DEPC Water(提前65℃水浴)到柱子基质上室温静置2min。10，000g离心2min洗脱出RNA。将洗脱RNA液再次转移到柱子基质上，室温静置2min，10，000g离心2min洗脱出RNA。

3、米曲霉RNA反转成cDNA

首先对上述提取的米曲霉总RNA进行基因组DNA的去除，然后以去除基因组DNA的总RNA为模板进行反转录。

1)去除基因组DNA

总RNA中会混有基因组DNA，为了准确地对基因表达量进行分析，首先需要去除基因组DNA，反应体系如表1所示。

表1基因组DNA去除反应

根据表1的反应体系配制好，42℃反应2min，结束后立即插入冰上。

2)反转录合成cDNA

按照表2反转录反应体系按反应数+1的量配制。将这几种反应液混匀后按每10μL分别加入到反应1管中，吹打混匀后立即放入PCR仪，设置为37℃ 15min，85℃ 5sec，4℃5min，反应结束后将反应液立即插入冰上或放入-20℃冰箱保存。

表2反转录反应体系

4、米曲霉金属离子诱导基因AoNramp1定量分析

以合成的cDNA为模板，以组蛋白H1(AO090012000496)基因作为内参基因，利用CFX96实时PCR检测系统(Bio-Rad)进行荧光定量RT-PCR。每个样品重复3次。

rAoNramp1-F：ACCCGGATGTTGGCGAGGCT

rAoNramp1-R：CCAGAGAGAAGCAGGGCCAGTCC

rH1-F：GACAACATCCAGGGTATCACTAAGC

rH1-R：GGTCTCCTCGTAGATCATGGCA

荧光定量RT-PCR按照表3组分配制PCR反应液，反应液应在冰上进行配制。

表3荧光定量PCR体系

配制好反应液后按照如下程序进行反应

步骤一：预变性

Cycle：1 95℃30sec

步骤二：PCR反应95℃30sec

Cycle：40 95℃5sec

60℃30-60sec

步骤三：离解阶段

95℃15sec

60℃1min

95℃15sec

表达分析显示：在锌处理的2天和4天后，过量锌处理能显著诱导AoNramp1的表达(图1)。在锰处理的条件下，与对照组相比，处理的第2、4和7天AoNramp1的表达受到强烈诱导(图1)。

二、米曲霉金属离子诱导基因AoNramp1启动子序列的克隆

在曲霉基因组数据库(http://www.aspgd.org/)上查找AoNramp1基因，其基因号为AO090003001119。选取该基因起始密码子上游2000bp作为AoNramp1基因的启动子(SEQID NO：1)。

以米曲霉RIB40 DNA为模板，以PAoNramp1-F(TGTCTTTGCGCTCCATGTAGCT)和PAoNramp1-R(CGTGGTTGTGAACCAGGCG)为引物，扩增AoNramp1基因的启动子。

表4.AoNramp1基因的启动子PCR扩增体系(50μL)

PCR扩增条件：95℃预变性30s，95℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸5min，35个循环，72℃彻底延伸5min。

将该启动子(37℃孵育30min)重组连接到含有β-葡萄糖醛酸酶(GUS)报告基因的AflII酶切的pEX2B-GUS载体中，产生pEX2B-PAoNramp1-GUS载体。

三、含米曲霉金属离子诱导基因AoNramp1启动子序列载体的转化

通过PEG-CaCl₂介导的原生质体法将pEX2B-PAoNramp1-GUS质粒转化米曲霉3.042的尿苷/尿嘧啶营养缺陷型突变体中。利用PCR方法鉴定转化子。

PEG-CaCl₂介导的原生质体转化法操作步骤：

1)将500μL米曲霉3.042的尿苷/尿嘧啶营养缺陷型突变体(ΔpyrG)接种于(含有20mM uridine和0.2％uracil的)100mL DPY液体培养基中。在30℃，160rpm，培养20小时。

DPY培养基：2％dextrin，1％polypeptone，0.5％yeast extract，0.5％KH₂PO₄，0.05％MgSO₄·7H₂O，pH 5.5。

2)用双层滤纸过滤收集菌球，用无菌蒸馏水冲洗。

3)将菌球在10mL Yatalase酶裂解液中，孵育3小时，30℃，50rpm。显微观察原生质体形成情况。

Yatalase酶裂解液组分：50mM maleic acid(pH 5.5)，1％Yatalase(TaKaRaT017)，0.5％Lysing enzymes(Sigma L1412)，0.6M(NH₄)₂SO₄

4)用等量的缓冲液稀释原生质体悬液，200目的细胞筛过滤将原生质体从菌丝中分离出来。

缓冲液组分：1.2M sorbitol，50mM CaCl₂·2H₂O，35mM NaCl，10mM Tris-HCl(pH7.5)

5)离心(2000rpm，8min，4℃)，收集原生质体；用5-10mL缓冲液洗涤2次，最后用缓冲液重悬原生质体，浓度为1×10⁷-5×10⁷/mL。

6)将10μg DNA片段与原生质体悬液(200μL)混合，在冰上孵育30min。

7)向DNA-原生质体混合液中分别加入250μL、250μL、850μL PEG溶液，依次混合均匀。室温避光放置20min。

PEG溶液组分：60％(W/V)PEG 4000，50mM CaCl₂·2H₂O，10mM Tris-HCl(pH 7.5)

8)用5-10mL缓冲液稀释PEG处理过的原生质体悬液，离心1000rpm，8min，4℃。小心除去上清。

9)用500μL缓冲液轻轻重悬原生质体。

10)在原生质体悬液加入4mL Top agar(含有0.8％琼脂的MM培养基)，将混合物倒入含有1.2M山梨醇的M+Met琼脂培养基(含有1.5％琼脂的MM培养基)上。

11)30℃培养2-3天后，培养基上可见转化子的菌丝。

12)挑取上述MM培养基长出的转化子菌丝，转移到新的CD固体培养基上，进行二次筛选。经过二次筛选后，挑取菌丝，提取DNA，以此为模板，以PEXB-GUS-F(ATGGTAGATCTGAGGAACCGACGAACTAGTCTGTACC)，PEXB-GUS-R(TCACACGTGATGGTGATGG)为引物，进行PCR扩增验证转化子，获得PAoNramp1-GUS米曲霉工程菌。

四、GUS染色验证启动子能被金属离子诱导表达

为了进一步验证上述启动子能被金属离子诱导，我们将PAoNramp1-GUS米曲霉工程菌株分别用含有200μM的Zn²⁺或Mn²⁺的CD-Fe液体培养基处理，分别处理2天、4天、7天后，收集菌球进行GUS染色。GUS工作液根据下面的方法进行配制，将其加到盛有菌球的离心管内，37℃避光进行显色反应。

GUS染液配制

首先配制以下各组分母液，然后配制GUS染色液工作液，染色液各组分终浓度分别为1mg/mL X-Glu，10mmol/L EDTA，1mmol/L铁氰化钾，1mmol/L亚铁氰化钾，0.1％TritonX-100，50mmol/L磷酸钠缓冲液，避光保存。

各组分母液配方：

1)EDTA(100mmol/L)：3.72gEDTA溶于100mL去离子水中，用1mol/L的氢氧化钠调PH值到8.0，121℃灭菌20min，4℃保存。

2)磷酸钠缓冲液(100mmol/L)：配500mL用量时，3.299g NaH₂PO₄·2H₂O(156.01g/mol)，10.33g Na₂HPO₄·2H₂O(358.14g/mol)(用1mol/L的氢氧化钠调PH值到7.0，121℃灭菌20min，4℃保存)

3)铁氰化钾(100mmol/L)：328mg溶于10mLddH₂O中，0.22nm微膜过滤灭菌。

4)亚铁氰化钾(100mmol/L)：422mg溶于10mLddH₂O中，0.22nm微膜过滤灭菌。

5)X-Glu(10mg/mL)分子量为521.8g/mol，溶于DMF，用铝箔包裹，存于-20℃冰箱。

如图3所示，在对照条件下，培养7天后才检测到GUS信号。Zn²⁺或Mn²⁺处理2天后，PAoNramp1-GUS米曲霉工程菌株即可显示出可检测的GUS活性，并且随着处理时间的延长，GUS信号变得更强。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为更清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方法予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

序列表

<110> 江西省农业科学院园艺研究所

江西科技师范大学

<120> 金属离子诱导的米曲霉基因启动子、其制备方法及应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2000

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgtctttgcg ctccatgtag ctccttagag acttcaggga tacagcgctt ttcgtcttct 60

tgtgcagcgt attcttttcc tgcttaccag gcgacctctg ccgaggcaag ccatactctg 120

cggcgtctcg attcggggca atttcggtca atggctgttg gtctagggcg gcataggcct 180

gatccactgg agaccagaac gtactgcgag ggggctggct ttggtaggga gacctgcaag 240

aggcggcatc gtctgcggag gggttcctct tgtgagcttt ggaagacaaa attcctcgga 300

agacggatgg tttggtcggg acacggctag catcgtcgaa aatattggga ccttgcatgt 360

tgggagccat atctgatcgc ctttaacccg ggactgttag aatgataggc gccaagttag 420

catgctgact gaagataaca ctctggtggt gtcgacaaag tgacgggtag gtacggagga 480

cttacgggga cagcgctcca acgcaaccac caatatgcag gatatttata gacggaagaa 540

gaagaagaag cggatacaaa ggtattaagt ggagcaggaa aaacaacaat atgtattcag 600

atagaaaata aaggcattgg ggaatagtaa ttatcaaaag caagaaggca accaaggagg 660

gaaaaaaacg cccgcgggaa tcagacaacg gcaacaacga tcactgcagt agtgaacaac 720

aggtgggcag accgggaatt tgaagtcttc cgtagcgacg gaggaaagtt aagggcatga 780

tcatccttcc ccccagccta aactaattcg tcaatggcgg tcgtggcaaa cggctggagc 840

tgcagtgcag agaaagcgga ggatgtaaac acattgccgt cattggggtt gccaggcaac 900

cagccacctg gttgttgctg gtggcgggtg cttatcaatt atcaatcagt ccccatcagc 960

tgattgatcg ctctcatttt gtgatgtatg cagattgagt ccccatcaat tcaatgtaga 1020

aaagtggata tctttccccc attcttgtca tcaatggggc atcatcatac aatgtagtat 1080

cgacgataga tcccaatatg atacaacagt ttttctttgc tttttccttt tcttcagatc 1140

ttgtatgatc ggacctagca atgcaagttg aatacctaca tcgggtgttg gtgtctccac 1200

taagtgaaaa attgagatgg ttggaaacca gctaagaaat gtgaagaaat gatataggag 1260

tcactcctat ttgctgggta agagatcaat tattgtatcc aggttccaat aattgaagag 1320

agcatacatg aacattgtgc aaggggaaag cgaacaatgt gattagataa gccgctcgat 1380

cacgggacct ttcatagtga ccattgtgag cataaattcc tgccaaggca gatccgcttt 1440

cttggaaagt cttgggcccg tgggggttgc acattataaa ggtgtctcta gatctatata 1500

tcaaaaagtc cctcagttga tcttgatctc ttactcctct tgcgtagtca ggtaaaatct 1560

agcggagaat accgtctacc ctcttggaca tgctgaataa gatagaccca tttctctctt 1620

cactcacctg ccgagaacag gccagtacta gtcaagatgc cgtcatgggc acagattgaa 1680

cttgttctac ttcttttctg ctagggtact cacacacttc ttaattgtga ttctgcaggt 1740

ttaattgttg aggaaccaac ttggctaggt tgtcctctta ctgcatgtac ccactttgta 1800

gtgaatgtgt cgcactggga ctgggactac cgtagccggg gaaattcggc cattcgttcc 1860

cgcacgttac tcttgatttg gtttccgacg tggtacttac gatttagaat acatcacaag 1920

tacttcacgg agaattctct gcagctgacc acgttgtccc cttctttata gcttacacgg 1980

acgcctggtt cacaaccacg 2000

Claims

1.米曲霉金属离子诱导基因启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的米曲霉金属离子诱导基因启动子，其特征在于，所述金属离子为锌离子或锰离子。

3.根据权利要求2所述的米曲霉金属离子诱导基因启动子，其特征在于，所述锌离子为浓度200μM的Zn²⁺，所述锰离子为浓度200μM的Mn²⁺。

4.权利要求1-3任意一项所述的米曲霉金属离子诱导基因启动子的制备方法，包括：以米曲霉RIB40 DNA为模板，对AoNramp1基因的启动子进行PCR扩增。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，PCR扩增引物包括：

PAoNramp1-F：5′-TGTCTTTGCGCTCCATGTAGCT-3′；

PAoNramp1-R：5′-CGTGGTTGTGAACCAGGCG-3′。

6.米曲霉金属离子诱导基因的重组载体，包含权利要求1-3任意一项所述的米曲霉金属离子诱导基因启动子。

7.根据权利要求6所述的米曲霉金属离子诱导基因的重组载体，其特征在于，所述重组载体采用含有β-葡萄糖醛酸酶报告基因的AflII酶切的pEX2B-GUS载体。

8.米曲霉金属离子诱导基因的转化体，转化有权利要求7所述的米曲霉金属离子诱导基因的重组载体。

9.根据权利要求8所述的米曲霉金属离子诱导基因的转化体，其特征在于，所述转化体为转化有上述重组载体的米曲霉3.042的尿苷/尿嘧啶营养缺陷型突变体。

10.权利要求1-3任意一项所述的米曲霉金属离子诱导基因启动子的应用，包括在米曲霉遗传改造、代谢调控中的应用。