CN101586101A - 氯化锂诱变赤灵芝原生质体选育高产胞外多糖菌株的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种灵芝多糖的制备方法，具体是涉及一种氯化锂诱变赤灵芝原生质体选育高产胞外多糖菌株的制备方法，属遗传技术领域。它以赤灵芝为菌种，经马铃薯葡萄糖琼脂培养基活化、淀粉液体摇瓶培养后，利用溶壁酶、蜗牛酶和纤维素酶水解赤灵芝菌丝体，在恒温下振荡，制备赤灵芝原生质体。经氯化锂诱变后，胞外多糖含量比原始菌株提高了8～10倍。诱变菌株经过传代后，胞外多糖含量比原发菌株提高了6～8倍，且遗传性状较稳定，该工程菌株可用于工业化生产灵芝多糖。

Description

氯化锂诱变赤灵芝原生质体选育高产胞外多糖菌株的制备方法

技术领域

本发明涉及一种灵芝多糖的制备方法，具体是涉及一种氯化锂诱变赤灵芝原生质体选育高产胞外多糖菌株的制备方法，属遗传技术领域。

背景技术

目前在食用菌的培育、开发技术领域，食用菌的品种繁多，品质各异，赤灵芝多糖是赤灵芝中最具开发价值的有效成分，具有提高肌体耐缺氧能力、清除自由基、提高机体免疫力、抗肿瘤等广泛的药理活性。但是赤灵芝多糖产率普遍不高且难以工业化生产。而原生质体诱变技术是一种行之有效的微生物育种新方法。2001年李刚等采用紫外诱变灵芝原生质体，选育出了两株高产胞内多糖的菌株，其多糖含量比原始菌株分别提高了39.29％和26.92％，3吨规模的中试试验多糖含量比原始菌株提高了10.15％。目前原生质体诱变基本采用物理紫外诱变，获得诱变菌株活性物质产量较低，诱变效果较差。

发明内容

本发明的目的是为克服上述现有技术的不足之处，提供一种氯化锂诱变赤灵芝原生质体选育高产胞外多糖菌株的制备方法，它以赤灵芝为菌种，经马铃薯葡萄糖琼脂培养基活化、淀粉液体摇瓶培养后，利用溶壁酶、蜗牛酶和纤维素酶水解赤灵芝菌丝体，在恒温下振荡，制备赤灵芝原生质体。经氯化锂诱变后，胞外多糖含量比原始菌株提高了8～10倍。诱变菌株经过传代后，胞外多糖含量比原发菌株提高了6～8倍，且遗传性状较稳定，该诱变菌株可用于工业化生产灵芝多糖。

本发明是以如下技术方案实现的：一种氯化锂诱变赤灵芝原生质体选育高产胞外多糖菌株的制备方法，其特征是：它以赤灵芝为菌种，经马铃薯葡萄糖琼脂培养基活化、淀粉液体摇瓶培养后，利用复合酶液水解灵芝菌丝体，在28～32℃下振荡1.5～4h，制备原生质体，采用0.02％～0.3％浓度的氯化锂作为诱变剂，加入到再生培养基中，诱变灵芝原生质体，经再生培养、摇瓶深层发酵获得胞外多糖发酵液，用醇沉法提取多糖，苯酚-硫酸法测定多糖含量。

所述的一种氯化锂诱变赤灵芝原生质体选育高产胞外多糖菌株的制备方法，其特征是：它以赤灵芝为菌种，经马铃薯葡萄糖琼脂培养基活化、淀粉液体摇瓶培养后，利用复合酶液水解灵芝菌丝体，所述复合酶液为溶壁酶、蜗牛酶和纤维素酶。

一种制备权利要求1所述的氯化锂诱变赤灵芝原生质体选育高产胞外多糖菌株的方法，其特征是：按如下步骤进行：

(1)菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基培养基上活化1～2次，取菌块接种于摇瓶可溶性淀粉液体培养基中，27～29℃进行摇瓶培养4～5天。

(2)取液体培养的菌丝，过滤收集菌丝球，用无菌水冲洗2～3次，再用甘露醇冲洗2～3次，转入巯基乙醇中，恒温摇床振荡30～60min，过滤收集菌丝球，用甘露醇冲洗2～3次，离心分离取沉淀为菌丝体，取菌丝体以1∶10～20的比例加入复合酶液，恒温下振荡酶解2～4h，过滤后滤液于500～1000r/min离心3～5min，取上清液于3000～4000r/min，离心5～10min，沉淀即为原生质体，用甘露醇冲洗并用甘露醇把原生质体稀释10倍。

(3)将0.02％～0.3％浓度的氯化锂添加到再生培养基中，取稀释后的原生质体涂布在再生培养基上，恒温培养6～8天。

(4)将再生菌落接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，恒温下培养6～7天得第一代诱变菌株，将其接种新的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，恒温下培养6～7天得第二代诱变菌株，并接种新的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，恒温下培养得第三代诱变菌株，接种第二代、第三代菌块于摇瓶可溶性淀粉液体培养基中，恒温摇床培养。

(5)取发酵液过滤后离心取上清液，80～90℃水浴浓缩成原体积的0.2～0.25倍，加入4～5倍体积95％乙醇，4℃静置，浓缩液离心，用无水乙醇洗涤沉淀两次，烘干至恒重，得胞外粗多糖。

(6)将粗多糖稀释10～1000倍，测定吸光度，根据标准曲线求出多糖含量。

(7)诱变菌株放置石蜡油或砂土管中，4℃保存，每一年传代一次。

本发明的优点是：采用该技术所获得的赤灵芝诱变菌株通过深层发酵后在培养液中生产胞外多糖，经提取、分离后可作为医药产品及食品添加剂，广泛应用于医疗工业和食品工业。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明：

实施例1、

赤灵芝菌株在28℃下保温培养活化菌种7天，取活化后的菌块接种于三角瓶的淀粉液体培养基中，28℃温度下在摇床上培养5天，过滤收集菌丝体，用甘露醇冲洗后，转入0.3％巯基乙醇中，振荡40min，过滤收集菌丝体，用甘露醇冲洗过滤，1200r/min离心8min。取0.5g菌丝体以1∶15的比例加入复合酶液，在28℃下振荡酶解菌丝体3h，滤液用1000r/min离心3min，2次。上清液采用3000r/min离心10min制得原生质体。采用0.02％的氯化锂添加到再生培养基中，取原生质体1ml涂布在再生培养基上，恒温培养7天。取活化后的菌块接种于三角瓶可溶性淀粉液体培养基中，置于28℃摇床培养5天。发酵液经过滤后离心，取上清液在80℃水浴中浓缩至原体积的0.2倍，加入4倍体积95％乙醇，4℃静置12h，然后4500r/min离心5min，用无水乙醇洗涤沉淀2次，70℃烘干至恒重，得胞外粗多糖。采用苯酚硫酸法测定多糖含量。诱变菌株胞外多糖含量比原始菌株提高9倍，经传代后多糖含量仍能提高7倍。

实施例2、

在27℃下活化赤灵芝菌株，接种活化后的菌块于250ml摇瓶中，27℃摇床培养5天。过滤收集菌丝体，用无菌水、甘露醇冲洗，转入0.2％巯基乙醇中，摇床振荡30min，温度28℃，过滤收集菌丝体，甘露醇冲洗过滤，菌丝体用1500r/min离心10min分离菌丝体。取1g菌丝体以1∶20的比例加入复合酶液(溶壁酶+蜗牛酶+纤维素酶)，在30℃下振荡酶解4h，滤液用600r/min离心5min，2次。上清液用4000r/min离心5min得原生质体。将0.2％浓度的氯化锂添加到再生培养基中，取原生质体1.5ml涂布在再生培养基上，27℃培养6天。将活化后的菌块接种于250ml摇瓶可溶性淀粉液体培养基中，置27℃摇床培养5天。发酵液用无菌纱布过滤，滤液在4000r/min离心10min，取上清液，90℃水浴浓缩成原体积的0.25倍，加入5倍体积95％乙醇，4℃过夜。离心后用无水乙醇洗涤沉淀2次，60℃真空干燥后称重，得胞外粗多糖，测定诱变株胞外多糖含量比原始菌株提高10倍。

实施例3、

在29℃下活化赤灵芝菌株7天，将活化后的菌块接种于150ml摇瓶的可溶性淀粉液体培养基中，29℃摇床培养4天。过滤收集菌丝体，用Tris缓冲液和甘露醇溶液冲洗，转入0.2％巯基乙醇中，摇床振荡60min，温度28℃，过滤收集菌丝体，Tris缓冲液冲洗，菌丝体用1000r/min离心5min。取1g菌丝体以1∶10的比例加入复合酶液，32℃下振荡酶解2h，无菌纱布过滤，滤液用600r/min离心5min，2次，上清液用3500r/min，离心10min得原生质体。将0.04％浓度的氯化锂添加到再生培养基中，取原生质体2ml涂布于再生培养基上，29℃培养6天，将活化菌株取小块接种于250ml摇瓶80ml可溶性淀粉液体培养基中，置于29℃摇床培养5天。发酵液过滤后用4800r/min离心5min，取上清液，90℃水浴浓缩成原体积的0.2倍，加入4倍体积95％乙醇，4℃静置12h以上。浓缩液4000r/min离心10min，用无水乙醇洗涤沉淀2次，70℃真空干燥、恒重，得胞外粗多糖。按苯酚硫酸法测定胞外多糖含量，诱变菌株传代3代后，多糖含量比原始菌株提高6倍。诱变菌株用石蜡油斜面保存。

Claims (3)

1、一种氯化锂诱变赤灵芝原生质体选育高产胞外多糖菌株的制备方法，其特征是：它以赤灵芝为菌种，经马铃薯葡萄糖琼脂培养基活化、淀粉液体摇瓶培养后，利用复合酶液水解灵芝菌丝体，在28～32℃下振荡1.5～4h，制备原生质体，采用0.02％～0.3％浓度的氯化锂作为诱变剂，加入到再生培养基中，诱变灵芝原生质体，经再生培养、摇瓶深层发酵获得胞外多糖发酵液，用醇沉法提取多糖，苯酚-硫酸法测定多糖含量。

2、根据权利要求1所述的一种氯化锂诱变赤灵芝原生质体选育高产胞外多糖菌株的制备方法，其特征是：它以赤灵芝为菌种，经马铃薯葡萄糖琼脂培养基活化、淀粉液体摇瓶培养后，利用复合酶液水解灵芝菌丝体，所述复合酶液为溶壁酶、蜗牛酶和纤维素酶。

3、一种制备权利要求1所述的氯化锂诱变赤灵芝原生质体选育高产胞外多糖菌株的方法，其特征是：按如下步骤进行：

(1)菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基培养基上活化1～2次，取菌块接种于摇瓶可溶性淀粉液体培养基中，27～29℃进行摇瓶培养4～5天。

(2)取液体培养的菌丝，过滤收集菌丝球，用无菌水冲洗2～3次，再用甘露醇冲洗2～3次，转入巯基乙醇中，恒温摇床振荡30～60min，过滤收集菌丝球，用甘露醇冲洗2～3次，离心分离取沉淀为菌丝体，取菌丝体以1∶10～20的比例加入复合酶液，恒温下振荡酶解2～4h，过滤后滤液于500～1000r/min离心3～5min，取上清液于3000～4000r/min，离心5～10min，沉淀即为原生质体，用甘露醇冲洗并用甘露醇把原生质体稀释10倍。

(3)将0.02％～0.3％浓度的氯化锂添加到再生培养基中，取稀释后的原生质体涂布在再生培养基上，恒温培养6～8天。

(4)将再生菌落接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，恒温下培养6～7天得第一代诱变菌株，将其接种新的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，恒温下培养6～7天得第二代诱变菌株，并接种新的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，恒温下培养得第三代诱变菌株，接种第二代、第三代菌块于摇瓶可溶性淀粉液体培养基中，恒温摇床培养。

(5)取发酵液过滤后离心取上清液，80～90℃水浴浓缩成原体积的0.2～0.25倍，加入4～5倍体积95％乙醇，4℃静置，浓缩液离心，用无水乙醇洗涤沉淀两次，烘干至恒重，得胞外粗多糖。

(6)将粗多糖稀释10～1000倍，测定吸光度，根据标准曲线求出多糖含量。