CN102605098A - 一种快速检测鹿产品的多重pcr试剂盒及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种快速检测鹿产品的多重PCR试剂盒，用于快速准确识别鹿产品，同时还公开了该试剂盒的制备方法，采用多重PCR技术扩增梅花鹿、马鹿、塔里木马鹿、赤鹿以及驯鹿和猪、牛、羊、鸡的各线粒体DNA的特异分子片段制成试剂盒，用于检测被检样品中是否含有上述各动物成分，能检测混合样品；具有操作简单、灵敏度高，速度快特点。
Description
技术领域：
本发明公开一种快速检测鹿产品的多重PCR试剂盒，用于快速准确识别鹿产品，同时还公开了该试剂盒的制备方法，属于生物检测试剂盒技术领域。
背景技术：
鹿产品是鹿的一些组织或者器官，主要包括有：鹿茸，鹿心，鹿肾，鹿胎，鹿筋，鹿鞭，鹿尾，鹿肉和鹿血等。由于鹿产品大多为名贵中药材，价格昂贵，所以市场上屡见用伪劣产品来冒充名贵的鹿产品。
目前，鹿产品的鉴定大多采用传统方法，主要包括性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定。虽然传统鉴定方法简单、快捷、成本低，但影响传统鉴定方法的因素很多（如人为因素、环境因素、营养因素），因而不能准确地判断鹿产品的伪劣情况。比如在鹿产品的加工过程中，其性状、显微结构、理化性质等常常发生改变，利用传统鉴定方法来鉴定鹿产品可能会出现误判。然而，分子鉴定方法（基于DNA的方法）不受这些因素的影响，且具有准确性大、灵敏度高、稳定性好、通用性强等特点。
发明内容：
本发明提供一种快速检测鹿产品的多重PCR试剂盒，解决了梅花鹿、马鹿、塔里木马鹿、驯鹿及赤鹿以及猪、牛、羊、鸡等常见假冒混合产品的快速检测问题。
本发明还提供了上述快速检测鹿产品的多重PCR试剂盒的制备方法，通过两个多重PCR方法反应体系（鹿源性反应：梅花鹿，马鹿，塔里木马鹿，赤鹿和驯鹿；猪、牛、羊、鸡源性反应：猪、牛、羊、鸡），采用一步反应来鉴别鹿产品中的其他动物成分。
本发明提供的快速检测鹿产品的多重PCR试剂盒，其特征在于：
包括DNA提取液、鹿源性多重PCR反应液和猪、牛、羊、鸡源性多重PCR反应液和阴性标准品：
1、所述的DNA提取液：
（1）低盐缓冲液（pH 7.6-7.8）：12-13份Tris碱（三羟甲基氨基甲烷），32-35份 Na2EDTA（乙二胺四乙酸二钠），7-8份MgCl2，4-5份NaCl,余份为水；
（2）细胞裂解液：4-6份 SDS十二烷基硫酸钠，4-6份Triton X-100(聚乙二醇对异辛基苯基醚)，1000份低盐缓冲液；
（3）蛋白酶K：2份蛋白酶K,100份水；
2、所述的鹿源性多重PCR反应液：
ddH2O、10×PCR Buffer、dNTPs、引物DF、引物CCF、引物CYF、引物DR、引物RTF、引物RTR、Taq酶：
具体引物序列为：
1）梅花鹿、马鹿、塔里木马鹿、赤鹿和驯鹿特异mtD-loop：
DF（上游）：5’-CAAAGCACGTGATATAACCTTATG-3’
DR（下游）：5’-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
2）马鹿特异mtD-loop：
CCF（上游）：5’-CATGTATAACAGTACATGAGTTAGCG-3’
DR（下游）：5’-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
3）塔里木马鹿特异mtD-loop:
CYF（上游）：5’-CTCAACATCCATTTTACATCTTACATTA-3’
DR（下游）：5’-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
4）驯鹿线粒体特异mt16S rDNA:
RTF（上游）：5’-GGAGTAATCCAGGTCGGTTTCTATC-3’
RTR（下游）：5’-TAGGGCGGGATATGTTTGTGTATC-3’ ；
3、猪、牛、羊、鸡源性多重PCR反应液：
ddH2O、10×PCR Buffer、dNTPs、引物SSF、引物SSR、引物OAF、引物OAR、引物GGF、引物GGR、引物BTF、引物BTR、Taq酶；
具体引物序列为：
①猪特异mt12S rRNA-tRNA-Val：
SSF（上游）：5’-CTACATAAGAATATCCACCACA-3’
SSR（下游）：5’-ACATTGTGGGATCTTCTAGGT-3’
②牛特异tRNA-Val-16S rRNA：
BTF（上游）：5’-GTGCTTGGATAAATCAAGATATAGC-3’
BTR（下游）：5’-CTTGGTTGTTTAGTCGAGAGGG-3’
③羊特异tRNA-Lys-ATP8：
OAF（上游） 5’- TTAAAGACTGAGAGCATGATA-3’
OAR（下游）：5’- ATGAAAGAGGCAAATAGATTTTCG-3’
④鸡特异12S rRNA：
GGF（上游）：5’- TGAGAACTACGAGCACAAAC-3’
GGR（下游）：5’-GGGCTATTGAGCTCACTGTT-3’
4、阴性标准品：为无菌双蒸水。
本发明所述快速检测鹿产品的多重PCR试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
1）鹿源性多重PCR反应液
（1）引物设计：
设计梅花鹿，赤鹿，马鹿，塔里木马鹿和驯鹿的特异性引物；其中包括一个共同的下游引物（DR），一个上游引物（DF）和两个物种特异性上游引物（赤鹿CCF，塔里木马鹿CYF）；
①梅花鹿、马鹿、塔里木马鹿、赤鹿和驯鹿特异mtD-loop：
DF（上游）：5’-CAAAGCACGTGATATAACCTTATG-3’
DR（下游）：5’-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
②马鹿特异mtD-loop：
CCF（上游）：5’-CATGTATAACAGTACATGAGTTAGCG-3’
DR（下游）：5’-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
③塔里木马鹿特异mtD-loop。
CYF（上游）：5’-CTCAACATCCATTTTACATCTTACATTA-3’
DR（下游）：5’-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
④驯鹿线粒体特异mt16S rDNA：
RTF（上游）：5’-GGAGTAATCCAGGTCGGTTTCTATC-3’
RTR（下游）：5’-TAGGGCGGGATATGTTTGTGTATC-3’
（2）鹿源性多重PCR反应液：
ddH2O 8.7ul，10 × PCR Buffer 1.5ul，dNTPs(100 uM) 2.0ul，引物DF(20 uM) 0.2ul，引物CCF(20 uM) 0.2ul，引物CYF(20 uM) 0.2ul，引物DR(20 uM) 0.4ul，引物RTF(20 uM) 0.3ul，引物RTR(20 uM) 0.3ul，Taq酶(5U/ul) 0.2ul。
（3）阴性标准品：为无菌双蒸水；
2）猪、牛、羊、鸡源性多重PCR反应液
（1）引物设计：
猪、羊、鸡的特异性引物：
①猪特异mt12S rRNA-tRNA-Val：
SSF（上游）：5’-CTACATAAGAATATCCACCACA-3’
SSR（下游）：5’-ACATTGTGGGATCTTCTAGGT-3’
②牛特异tRNA-Val-16S rRNA：
BTF（上游）：5’-GTGCTTGGATAAATCAAGATATAGC-3’
BTR（下游）：5’-CTTGGTTGTTTAGTCGAGAGGG-3’
③羊特异tRNA-Lys-ATP8：
OAF（上游） 5’- TTAAAGACTGAGAGCATGATA-3’
OAR（下游）：5’- ATGAAAGAGGCAAATAGATTTTCG-3’
④鸡特异12S rRNA：
GGF（上游）：5’- TGAGAACTACGAGCACAAAC-3’
GGR（下游）：5’-GGGCTATTGAGCTCACTGTT-3’
(2) 猪牛羊鸡源性多重PCR反应液：
ddH2O 8.1ul，10 × Buffer 1.5ul，dNTPs(100 uM) 2.0ul，引物SSF(20 uM) 0.1ul，引物SSR(20 uM) 0.1 ul，引物OAF(50 uM) 0.5ul，引物OAR(50 uM) 0.5 ul，引物GGF(20 uM) 0.2ul，引物GGR(20 uM) 0.2 ul，引物BTF(20 uM) 0.3ul，引物BTR(20 uM) 0.3 ul， Taq酶 0.2ul。
（3）阴性标准品：为无菌双蒸水。
本发明的多重PCR检测的使用方法：
（1）从待检样品中提取基因组DNA；
（2）制备多重PCR反应体系：
①取步骤1中的DNA 1ul和阴性对照加入到鹿源性多重PCR反应液中，用PCR仪进行扩增；
②取步骤1中的DNA 1ul和阴性对照加入到猪牛羊鸡源性多重PCR反应液中，用PCR仪进行扩增；
（3）设定反应程序进行PCR扩增，鹿源性多重PCR和猪牛羊鸡源性多重PCR反应程序均如下：
94°C 5 min；94°C 30s，56°C 30s，67°C 1min；67°C 5min，扩增30个循环。
（4）将PCR扩增结果分别在1%琼脂糖凝胶电泳进行分析，紫外灯下观察结果，综合分析鹿源性多重PCR和猪牛羊鸡源性多重PCR结果，即得出待检样品中含有的动物成分。
结果判定：如果只扩增出307bp的特异性片段，说明含有梅花鹿成分；如果同时扩增出307 bp和246 bp两个特异性片段，说明含有马鹿成分；如果扩增出272bp的特异性片段，说明含有塔里木马鹿成分；如果扩增出141bp的特异性片段，说明含有驯鹿的成分；如果扩增出290bp的特异性片段，说明含有猪的成分；如果扩增出225bp的特异性片段，说明含有羊的成分；如果扩增出183bp的特异性片段，说明含有鸡的成分；如果扩增出124bp的特异性片段，说明含有牛的成分。
本发明的积极效果在于：采用多重PCR技术，扩增梅花鹿、马鹿、塔里木马鹿、赤鹿以及驯鹿和猪、牛、羊、鸡的各线粒体DNA的特异分子片段，制成试剂盒，用于检测被检样品中是否含有上述各动物成分，能检测混合样品；具有操作简单、灵敏度高，速度快特点。
附图说明
图1为鹿源性多重PCR反应的种间特异性；
图2为鹿源性多重PCR反应的种内通用性；
图3为猪牛羊鸡源性多重PCR反应的种间特异性。
具体实施方式
下面结合具体实施实例，进一步阐述本发明：
实施例1：试剂盒的组成与配制
1）DNA提取液的配制
（1）低盐缓冲液（pH 7.6）：800ml蒸馏水溶解1.21gTris碱（三羟甲基氨基甲烷）、3.38g Na2EDTA（乙二胺四乙酸二钠）、0.76g MgCl2、0.47gNaCl。加浓盐酸调pH至所需值，加蒸馏水定容至1L。
（2）细胞裂解液：200ml低盐缓冲液中加入1g SDS（十二烷基硫酸钠）,1ml Triton X-100(聚乙二醇对异辛基苯基醚)。
（3）蛋白酶K: 将100 mg蛋白酶K溶于5 ml无菌去离子水中，-20℃保存。
提取方法：200ul抗凝血和400ul低盐缓冲液加入到1.5ml离心管中，充分混匀后1000RPM离心10min，弃上清；加入500ul低盐缓冲液，混匀后于室温下1000RPM离心5min，重复一次；小心吸出上清，加入300ul细胞裂解液，混匀后于65℃水浴10min，加入75ul饱和NaCl，充分混匀后12000RPM离心5min，将上清转移到新的1.5ml离心管中，加入2倍体积无水乙醇，充分混匀后于10000RPM离心2min，弃上清，加入500ul冰浴70%乙醇，颠倒混匀数次后于10000RPM离心1min，弃上清；65℃烘箱中干燥5min，加入100ul ddH2O后于65℃水浴溶解15min。
2）鹿源性多重PCR反应液
（1）引物设计：
根据GenBank数据库中已公布的线粒体D-loop区序列采用Bioedit 7.0.9.0软件进行序列比对。然后在梅花鹿(AB378372)的D-loop区上，利用Oligo 6.0软件设计梅花鹿，赤鹿，马鹿，塔里木马鹿和驯鹿的特异性引物。其中包括一个共同的下游引物（DR），一个上游引物（DF）和两个物种特异性上游引物（赤鹿CCF，塔里木马鹿CYF）；
①梅花鹿、马鹿、塔里木马鹿、赤鹿和驯鹿特异mtD-loop：
DF（上游）：5’-CAAAGCACGTGATATAACCTTATG-3’
DR（下游）：5’-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
②马鹿特异mtD-loop：
CCF（上游）：5’-CATGTATAACAGTACATGAGTTAGCG-3’
DR（下游）：5’-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
③塔里木马鹿特异mtD-loop。
CYF（上游）：5’-CTCAACATCCATTTTACATCTTACATTA-3’
DR（下游）：5’-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
④驯鹿线粒体特异mt16S rDNA：
RTF（上游）：5’-GGAGTAATCCAGGTCGGTTTCTATC-3’
RTR（下游）：5’-TAGGGCGGGATATGTTTGTGTATC-3’
(2) 鹿源性多重PCR反应液：
ddH2O 8.7ul，10 × Buffer 1.5ul，dNTPs(100 uM) 2.0ul，引物DF(20 uM) 0.2ul，引物CCF(20 uM) 0.2ul，引物CYF(20 uM) 0.2ul，引物DR(20 uM) 0.4ul，引物RTF(20 uM) 0.3ul，引物RTR(20 uM) 0.3ul，Taq酶(5U/ul) 0.2ul，
（3）阴性标准品：为无菌双蒸水；
3）猪、牛、羊、鸡源性多重PCR反应液
（1）引物设计：
猪、羊、鸡的特异性引物：
①猪特异mt12S rRNA-tRNA-Val：
SSF（上游）：5’-CTACATAAGAATATCCACCACA-3’
SSR（下游）：5’-ACATTGTGGGATCTTCTAGGT-3’
②牛特异tRNA-Val-16S rRNA：
BTF（上游）：5’-GTGCTTGGATAAATCAAGATATAGC-3’
BTR（下游）：5’-CTTGGTTGTTTAGTCGAGAGGG-3’
③羊特异tRNA-Lys-ATP8：
OAF（上游） 5’- TTAAAGACTGAGAGCATGATA-3’
OAR（下游）：5’- ATGAAAGAGGCAAATAGATTTTCG-3’
④鸡特异12S rRNA：
GGF（上游）：5’- TGAGAACTACGAGCACAAAC-3’
GGR（下游）：5’-GGGCTATTGAGCTCACTGTT-3’
(2) 猪牛羊鸡源性多重PCR反应液：
ddH2O 8.1ul，10 × Buffer 1.5ul，dNTPs(100 uM) 2.0ul，引物SSF(20 uM) 0.1ul，引物SSR(20 uM) 0.1 ul，引物OAF(50 uM) 0.5ul，引物OAR(50 uM) 0.5 ul，引物GGF(20 uM) 0.2ul，引物GGR(20 uM) 0.2 ul，引物BTF(20 uM) 0.3ul，引物BTR(20 uM) 0.3 ul， Taq酶 0.2ul；
（3）阴性标准品：为无菌双蒸水。
实施例2：试剂盒的特异性试验
1、鹿源性多重PCR反应中各引物对的种间特异性和种内通用性。
（1）证明鹿源性多重PCR反应中各引物对具有种间特异性。
①按照实施例1的方法分别从血液中提取了梅花鹿、马鹿、塔里木马鹿、赤鹿、驯鹿、水鹿、坡鹿、白唇鹿、麋鹿、黇鹿、猪、牛、羊、鸡的基因组DNA。提取的DNA分别用于制备下列反应体系，无菌水为阴性对照。
②制备反应体系：步骤①提取的DNA 1.0ul加入到实施例1中鹿源性多重PCR反应液中。
③按照程序：94°C 5 min；94°C 30s，56°C 30s，67°C 1min；67°C 5min，扩增30个循环。进行PCR扩增。
④结果（如图1）：1：梅花鹿；2：马鹿；3：塔里木马鹿；4：赤鹿；5：驯鹿；6：水鹿；7：坡鹿；8：白唇鹿；9：麋鹿；10：黇鹿；11：猪；12：牛；13：羊；14：鸡；15：阴性对照；M：Marker I（600，500，400，300，200，100 bp）；梅花鹿基因组DNA样品扩增出307 bp的特异性片段，与单一PCR一致；马鹿基因组DNA样品扩增出307 bp和246 bp两个特异性片段，这是因为引物对DF/DR和CCF/DR都能够扩增出马鹿特异性片段，也与单一PCR一致；塔里木马鹿和驯鹿基因组DNA样品分别只扩增出272 bp的特异性片段和141 bp的特异性片段，这是因为在多重PCR时，对同一模板来说，反应强的引物能够抑制反应弱的引物对其进行扩增，DF/DR对塔里木马鹿和驯鹿的PCR扩增较弱，反应强的引物对CYF/DR和RTF/RTR能够抑制DF/DR对各自目的模板的PCR扩增；赤鹿基因组DNA样品扩增出230 bp的特异性片段；其他基因组DNA和对照组均为阴性。
（2）证明鹿源性多重PCR反应中各引物对具有种内通用性。
①按实施例1方法提取了9个梅花鹿（3个左家梅花鹿、3个东丰梅花鹿、3个兴凯湖梅花鹿）血液DNA、3个塔里木马鹿血液DNA、3个赤鹿血液DNA、3个驯鹿血液DNA、15个马鹿（3个东北马鹿、3个青海马鹿、3个甘肃马鹿、3个阿尔泰马鹿、3个天山马鹿）血液DNA，分别制备下列反应体系，无菌双蒸水为阴性对照。
②制备反应体系：步骤①提取的DNA 1.0ul加入到实施例1中鹿源性多重PCR反应液中。
③按照程序：94°C 5 min；94°C 30s，56°C 30s，67°C 1min；67°C 5min，扩增30个循环。进行PCR扩增。
④结果（如图2）：A：梅花鹿（N1-3：左家梅花鹿；N4-6：东丰梅花鹿；N7-9：兴凯湖梅花鹿）；B：塔里木马鹿（Y1-3），赤鹿（E1-3），驯鹿（R1-3）；C：马鹿（C1-3：东北马鹿；C4-6：青海马鹿；C7-9：甘肃马鹿；C10-12：阿尔泰马鹿；C13-15：天山马鹿）；0：阴性对照；M：Marker I（600，500，400，300，200，100 bp）；9个梅花鹿基因组DNA均扩增出307bp的特异性片段；15个马鹿基因组DNA样品扩增出307 bp和246 bp两个特异性片段；3个塔里木马鹿基因组DNA均扩增出272 bp的特异性片段；3个驯鹿基因组DNA均扩增出141 bp的特异性片段；3个赤鹿基因组DNA均扩增出230 bp的特异性片段。均与目的条带大小相符。
2、证明猪牛羊鸡源性多重PCR反应中各引物对具有种间特异性。
①为证明猪牛羊鸡源性多重PCR反应中的各引物对具有种间特异性，按照实施例1的方法分别提取了猪、牛、羊、鸡的血液DNA ，无菌双蒸水为阴性对照，制备下列反应体系。
②制备反应体系：步骤①提取的DNA 1.0ul加入到实施例1中猪牛羊鸡源性多重PCR反应液中。
③按照程序：94°C 5 min；94°C 30s，56°C 30s，67°C 1min， 67°C 5min，扩增30个循环。进行PCR扩增。
④结果（如图3）：1：猪；2：羊；3：鸡；4：牛；5：阴性对照；M：Marker I（600，500，400，300，200，100 bp）；猪、羊、鸡、牛基因组DNA样品分别扩增出了290 bp、225bp、183bp、124bp的特异性片段，均与单一PCR时的特异性片段一致。
实施例3：多重PCR的灵敏性。
1、评估鹿源性多重PCR反应的灵敏性。
（1）按照实施例1的提取方法分别提取了梅花鹿、马鹿、塔里木马鹿、赤鹿和驯鹿的血液基因组DNA。分别进行梯度稀释，稀释情况如下：10、5、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02 ng。
（2）分别制备反应体系： 步骤（1）提取的DNA 1.0ul加入到实施例1中鹿源性多重PCR反应液中。
（3）按照程序：94°C 5 min；94°C 30s，56°C 30s，67°C 1min，67°C 5min，扩增30个循环。进行PCR扩增。
（4）结果：梅花鹿、马鹿、塔里木马鹿、赤鹿和驯鹿基因组DNA样品的最小检测限度分别为0.05、0.05、0.1、0.5和0.02 ng。
2、评估猪牛羊鸡源性多重PCR反应的灵敏性。
（1）按照实施例1的提取方法分别提取猪、牛、羊、鸡的血液基因组DNA，分别进行梯度稀释，稀释情况如下： 10、5、1、0.5、0.2 ng。
（2）分别制备反应体系：步骤（1）提取的DNA 1.0ul加入到实施例1中猪牛羊鸡源性多重PCR反应液中。
（3）按照程序：94°C 5 min；94°C 30s，56°C 30s，67°C 1min，67°C 5min，扩增30个循环。进行PCR扩增。
（4）结果：猪、牛、羊和鸡基因组DNA样品的最小检测限度分别为1、0.5、1和5 ng。
以下实验表明本发明的有效性和可行性
实验例1 鹿产品DNA的提取。
为了了解市场上鹿产品的欺诈情况，从市场上随机购买了71个鹿产品：24个鹿茸产品、12个鹿胎产品、8个鹿鞭产品、7个鹿筋产品、7个鹿尾产品、7个鹿血粉产品、6个其他鹿产品（鹿肾、鹿心、鹿心丸、鹿肉干）。
1、DNA提取
将各种鹿产品取少量在液氮中研磨，越细越好。取50mg处理好的产品装于1.5ml离心管中，加入500ml细胞裂解液，再加入蛋白酶K 10ul，充分混匀，55℃水浴消化过夜；加入等体积酚：仿（1:1），充分混匀，室温12000RPM离心5min，抽提2次，加入2倍体积无水乙醇，混匀直至出现絮状沉淀，室温12000RPM离心2min，弃上清；加入500ul冰浴70%乙醇，颠倒混匀数次，10000RPM离心1min，弃上清，65℃烘箱干燥5min，加入100ul ddH2O，65℃水浴15min溶解。
实验例2 鹿产品的检测。
1、多重PCR反应体系的制备。
①鹿源性多重PCR反应体系：实验例1中提取的鹿产品DNA 1.0ul加入到实施例1中鹿源性多重PCR反应液中。
②猪、牛、羊、鸡源性多重PCR反应体系：实验例1中提取的鹿产品DNA 1.0ul加入到实施例1中猪牛羊鸡源性多重PCR反应液中。
2、均设定反应程序：94°C 5 min；94°C 30s，56°C 30s，67°C 1min，67°C 5min，扩增30个循环。扩增结果在1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下综合鹿源性多重PCR反应体系和猪牛羊鸡源性多重PCR反应体系结果进行分析。结果如表1,2,3,4,5,6,7。
3、结果：表1中可知，市场中大部分的鹿茸产品为驯鹿茸，绝大多数深加工的鹿茸产品如鹿茸丸、鹿茸（软）胶囊、鹿茸粉为伪品，5个产品中还包含猪或/和羊源性成分，伪品检出率达到79%。表2可知，鹿胎产品的伪品检出率达到83%，其中梅花鹿胎粉经检测没有梅花鹿源性成分却含有马鹿源性成分，新西兰赤鹿胎经检测为梅花鹿胎，鹿胎软胶囊经检测只含有牛源性成分。表3可知，鹿鞭产品的伪品检出率达到100%，其中新西兰赤鹿鞭经检测为梅花鹿鞭，新西兰赤鹿鞭片经检测含有马鹿源性成分，还有的产品含有牛和/或鸡源性成分。表4可知，鹿筋产品的伪品检出率为57%，其中一个经检测为牛筋制成。表5可知，鹿尾产品的伪品检出率较小，为28.5%，其中新西兰鹿尾经检测为马鹿尾。表6可知，鹿血产品的伪品检出率也较高，达到57%，7个样品中有3个含有牛源性成分。表7可知，其中3个鹿肾经检测只有1个是梅花鹿肾，鹿心产品经检测为猪心，鹿肉干也不是由梅花鹿肉制成，而是由马鹿肉和赤鹿肉制成。
表1 鹿茸产品的检测结果
表2 鹿胎产品的检测结果
表3 鹿鞭产品的检测结果
表4 鹿筋产品的检测结果
表5 鹿尾产品的检测结果
表6 鹿血产品的检测结果
表7 其他鹿产品的检测结果
Claims (3)
1. 一种快速检测鹿产品的多重PCR试剂盒，其特征在于包括以下引物：
1）梅花鹿、马鹿、塔里木马鹿、赤鹿和驯鹿特异mtD-loop：
DF（上游）：5’-CAAAGCACGTGATATAACCTTATG-3’
DR（下游）：5’-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
2）马鹿特异mtD-loop：
CCF（上游）：5’-CATGTATAACAGTACATGAGTTAGCG-3’
DR（下游）：5’-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
3）塔里木马鹿特异mtD-loop:
CYF（上游）：5’-CTCAACATCCATTTTACATCTTACATTA-3’
DR（下游）：5’-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
4）驯鹿线粒体特异mt16S rDNA:
RTF（上游）：5’-GGAGTAATCCAGGTCGGTTTCTATC-3’
RTR（下游）：5’-TAGGGCGGGATATGTTTGTGTATC-3’。
2. 权利要求1所述的快速检测鹿产品的多重PCR试剂盒，其特征在于包括DNA提取液、鹿源性多重PCR反应液和猪、牛、羊、鸡源性多重PCR反应液和阴性标准品：
所述的DNA提取液：
（1）低盐缓冲液（pH 7.6-7.8）：12-13份Tris碱（三羟甲基氨基甲烷），32-35份 Na2EDTA（乙二胺四乙酸二钠），7-8份MgCl2，4-5份NaCl,余份为水；
（2）细胞裂解液：4-6份 SDS十二烷基硫酸钠，4-6份Triton X-100(聚乙二醇对异辛基苯基醚)，1000份低盐缓冲液；
（3）蛋白酶K：2份蛋白酶K，100份水；
所述的鹿源性多重PCR反应液：
ddH2O、10×PCR Buffer、dNTPs、引物DF、引物CCF、引物CYF、引物DR、引物RTF、引物RTR、Taq酶；
具体引物序列为：
1）梅花鹿、马鹿、塔里木马鹿、赤鹿和驯鹿特异mtD-loop：
DF（上游）：5’-CAAAGCACGTGATATAACCTTATG-3’
DR（下游）：5’-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
2）马鹿特异mtD-loop：
CCF（上游）：5’-CATGTATAACAGTACATGAGTTAGCG-3’
DR（下游）：5’-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
3）塔里木马鹿特异mtD-loop:
CYF（上游）：5’-CTCAACATCCATTTTACATCTTACATTA-3’
DR（下游）：5’-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
4）驯鹿线粒体特异mt16S rDNA:
RTF（上游）：5’-GGAGTAATCCAGGTCGGTTTCTATC-3’
RTR（下游）：5’-TAGGGCGGGATATGTTTGTGTATC-3’ ；
猪、牛、羊、鸡源性多重PCR反应液：
ddH2O、10×PCR Buffer、dNTPs、引物SSF、引物SSR、引物OAF、引物OAR、引物GGF、引物GGR、引物BTF、引物BTR、Taq酶；
具体引物序列为：
1）猪特异mt12S rRNA-tRNA-Val：
SSF（上游）：5’-CTACATAAGAATATCCACCACA-3’
SSR（下游）：5’-ACATTGTGGGATCTTCTAGGT-3’
2）牛特异tRNA-Val-16S rRNA：
BTF（上游）：5’-GTGCTTGGATAAATCAAGATATAGC-3’
BTR（下游）：5’-CTTGGTTGTTTAGTCGAGAGGG-3’
3）羊特异tRNA-Lys-ATP8：
OAF（上游） 5’- TTAAAGACTGAGAGCATGATA-3’
OAR（下游）：5’- ATGAAAGAGGCAAATAGATTTTCG-3’
4）鸡特异12S rRNA：
GGF（上游）：5’- TGAGAACTACGAGCACAAAC-3’
GGR（下游）：5’-GGGCTATTGAGCTCACTGTT-3’
阴性标准品：为无菌双蒸水。
3. 权利要求2所述快速检测鹿产品的多重PCR试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
1）鹿源性多重PCR反应液
（1）引物设计：
设计梅花鹿，赤鹿，马鹿，塔里木马鹿和驯鹿的特异性引物；其中包括一个共同的下游引物（DR），一个上游引物（DF）和两个物种特异性上游引物（赤鹿CCF，塔里木马鹿CYF）；
①梅花鹿、马鹿、塔里木马鹿、赤鹿和驯鹿特异mtD-loop：
DF（上游）：5’-CAAAGCACGTGATATAACCTTATG-3’
DR（下游）：5’-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
②马鹿特异mtD-loop：
CCF（上游）：5’-CATGTATAACAGTACATGAGTTAGCG-3’
DR（下游）：5’-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
③塔里木马鹿特异mtD-loop：
CYF（上游）：5’-CTCAACATCCATTTTACATCTTACATTA-3’
DR（下游）：5’-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
④驯鹿线粒体特异mt16S rDNA：
RTF（上游）：5’-GGAGTAATCCAGGTCGGTTTCTATC-3’
RTR（下游）：5’-TAGGGCGGGATATGTTTGTGTATC-3’
（2）所述的鹿源性多重PCR反应液：
ddH2O、10×PCR Buffer、dNTPs、引物DF、引物CCF、引物CYF、引物DR、引物RTF、引物RTR、Taq酶：
2）所述的DNA提取液：
（1）低盐缓冲液（pH 7.6-7.8）：12-13份Tris碱（三羟甲基氨基甲烷），32-35份 Na2EDTA（乙二胺四乙酸二钠），7-8份MgCl2，4-5份NaCl,余份为水；
（2）细胞裂解液：4-6份 SDS十二烷基硫酸钠，4-6份Triton X-100(聚乙二醇对异辛基苯基醚)，1000份低盐缓冲液；
（3）蛋白酶K：2份蛋白酶K，100份水；
3）猪、牛、羊、鸡源性多重PCR反应液
（1）引物设计：
猪、羊、鸡的特异性引物：
①猪特异mt12S rRNA-tRNA-Val：
SSF（上游）：5’-CTACATAAGAATATCCACCACA-3’
SSR（下游）：5’-ACATTGTGGGATCTTCTAGGT-3’
②牛特异tRNA-Val-16S rRNA：
BTF（上游）：5’-GTGCTTGGATAAATCAAGATATAGC-3’
BTR（下游）：5’-CTTGGTTGTTTAGTCGAGAGGG-3’
③羊特异tRNA-Lys-ATP8：
OAF（上游） 5’- TTAAAGACTGAGAGCATGATA-3’
OAR（下游）：5’- ATGAAAGAGGCAAATAGATTTTCG-3’
④鸡特异12S rRNA：
GGF（上游）：5’- TGAGAACTACGAGCACAAAC-3’
GGR（下游）：5’-GGGCTATTGAGCTCACTGTT-3’
（2）PCR反应液：
Taq酶 5U/μl，10×PCR buffer，dNTPs 100 μM，引物OAF、OAR 50 μM，引物SSF、SSR、GGF、GGR、BTF、BTR均为20 μM；
4）阴性标准品：为无菌双蒸水。
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