CN104946730B - 鉴定鹿茸的pcr特异引物及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于中药及中药材鉴定技术领域，特别涉及到一种能够特异鉴定鹿茸的PCR特异引物及其检测方法。使用此方法鉴别鹿茸的真伪，只通过简单的DNA提取、PCR特异性扩增、荧光检测即可完成对样品真伪的鉴别。具有操作简单、特异性强、重复性好等优点。主要用于鹿茸药材、含有鹿茸的制剂以及鹿茸活体材料的快速鉴定。

Description

鉴定鹿茸的PCR特异引物及其检测方法
技术领域
本发明涉及中药及中药材鉴定技术领域，特别涉及一种能够特异鉴定鹿茸的PCR特异引物及其检测方法。主要用于鹿茸药材、含有鹿茸的制剂以及鹿茸活体材料的快速鉴定。
背景技术
中药材鹿茸为鹿科动物梅花鹿Cervusnippon Temminck或马鹿CervuselaphusLinnaeus的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角。前者习称“花鹿茸”，后者习称“马鹿茸”，具有壮肾阳，益精血，强筋骨，调冲任，托疮毒之功效。
鹿的种类众多，除了药用的马鹿和梅花鹿之外还有驯鹿、赤鹿等，在药材市场上由于利益驱使常出现以驯鹿等冒充正品鹿茸的情况，且由于马鹿与梅花鹿的价格存在显著差异，市场上也常出现两种鹿茸混淆销售的情况。传统鉴别鹿茸的方法包括性状鉴别、显微鉴别、薄层色谱法鉴别、光谱法鉴别、紫外光谱法鉴别等。但是传统的检测方法主要依赖于药材中的化学成分，而化学成分又易受品种及产地的影响。王学勇等使用1对特异性引物建立了鉴别正品鹿茸(包括梅花鹿和马鹿)和其他近源种鹿茸的位点特异性PCR方法(王学勇，刘春生，张蓉等，位点特异性PCR方法的建立及对近源种鹿茸药材的鉴别研究，中国中药杂志，2009，23：3013-3016)，但由于马鹿与梅花鹿的亲缘关系远于其与伪品，因此该方法对于PCR反应条件和退火温度准确性要求比较苛刻，不适宜大范围推广。陈颖等公开了一种用于马鹿茸真伪鉴别的引物及探针、试剂盒和方法(授权号：201010555564.3)，用于梅花鹿茸真伪鉴别的引物及探针、试剂盒和方法(授权号：201010555571.3)，所公开的方法是基于荧光PCR的方法，其成本较高。本发明主要结合常规PCR和荧光检测方法，在较短时间内快速鉴定马鹿和梅花鹿，成本低、适用性好。在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中所提及的PCR引物及方法。
发明内容
本发明提供了一种鹿茸的PCR特异性引物及其检测方法，该方法操作简单、样品量少、能快速准确的鉴定鹿茸药材、粉末制剂以及活体材料，特别适用于鉴定因加工而导致DNA含量极少、形态破碎的中药真伪的鉴定。
1.一种鉴定马鹿的特异引物F1、F2，其序列为：
F1：5′-CTAGAGACATGAAACATCGGAGTGA-3′
F2：5′-GATGGATGAGACTAGGGCTAAGACT-3′。
2.一种鉴定梅花鹿的特异引物F3、F4，其序列为：
F3：5′-TCCTAGCAATACACTATACATCTGGC-3′
F4：5′-GATGGATGAGACTAGGGCTAAGACT-3′；
3.一种鹿茸的PCR鉴定方法，其特征在于，包括下列步骤：
a)从所述材料中提取得到DNA样品；
b)用权利要求1所述的引物进行PCR反应，PCR反应参数为95℃预变性5min后，进行30次循环，循环参数为95℃30s，55-65℃45s，后延伸72℃5min，获得扩增产物；
c)用权利要求2所述的引物进行PCR反应，PCR反应参数为95℃预变性5min后，进行30次循环，循环参数为95℃30s，55-65℃45s，后延伸72℃5min，获得扩增产物；
d)电泳所述扩增产物，如果存在分子量582bp的单一DNA条带，则确定所检材料为马鹿；
e)电泳所述扩增产物，如果存在分子量831bp的单一DNA条带，则确定所检材料为梅花鹿；
f)直接在所述扩增产物中加入2μL20×SYBR Green I染料，振荡30s充分混匀，于365nm紫外灯下检测PCR产物；如果反应产物发出强烈绿色荧光，则确定所检材料为马鹿或梅花鹿。
本发明采用荧光检测方法检测PCR扩增产物，不需电泳使得检测时间大大缩短，且仅需简易紫外灯即可完成操作，不需要使用电泳设备和凝胶成像系统。
综上所述，本发明提供了快速准确鉴定鹿茸的PCR特异性引物及检测方法，以马鹿或梅花鹿DNA为模板，能将其从与其亲缘关系极近的其他的鹿类中，高效、准确地鉴定出来，为鹿茸鉴定提供了一种实用的技术。
附图说明
图1梅花鹿鉴别引物PCR结果。M：DL2000marker；P：阳性对照；N阴性对照；1-2：梅花鹿；3：马鹿；4：驯鹿；5：白唇鹿；6：海南坡鹿；7：水鹿；8：麇鹿。
图2马鹿鉴别引物PCR结果。M：DL2000marker；P：阳性对照；N阴性对照；1-2：马鹿；3：梅花鹿；4：驯鹿；5：白唇鹿；6：海南坡鹿。
图3鹿茸PCR产物荧光鉴别结果。1-2：马鹿；3-4：梅花鹿。
具体实施方式
1.高特异性引物的设计
从GenBank查找正品马鹿、梅花鹿及水鹿，驯鹿，白唇鹿等伪品的Cytb序列。用BioEdit软件进行序列比较，找到差异片段，设计梅花鹿鉴别引物5′-TCCTAGCAATACACTATACATCTGGC-3′和5′-GATGGAT GAGACTAGGG CTAAGACT-3′；马鹿鉴别引物5′-CTAGAGACATGAAACATCGGAGTGA-3′和5′-GATGGATGAGACTAGGGCTAAGACT-3′。
2.高特异性鉴别PCR方法的建立
2.1模板DNA提取
取药材(详见表1)约50mg，置2.0mL离心管中，加入磁珠1枚，使用球磨粉碎机粉碎成粉末。取粉末20mg，分别加入到2mL离心管中；使用柱式骨骼DNA提取试剂盒提取DNA：加入1000μL65℃预热的提取缓冲液，使用漩涡振荡器振荡30s充分混匀；65℃水浴30min；加入300μL缓冲液及200μL氯仿；充分混匀，12000rpm下离心5min；取500μL上清至一新的1.5mL离心管，加入500μL上柱缓冲液，充分混匀；加入DNA纯化柱中，12000rpm下离心1min；弃穿透液；加入洗脱液500μL，12000rpm下离心1min；弃穿透液，加入洗脱液500μL，12000rpm下再离心1min；弃穿透液，离心DNA纯化柱2min；加入50μL无菌双蒸水，室温放置2min后12000rpm下离心1min，取穿透液稀释10倍用于PCR反应。另取鹿茸对照药材约50mg，同法制成对照药材模板D NA溶液。
表1样品表
Figure BSA0000102388540000031
2.2梅花鹿和马鹿PCR反应体系的建立
取DNA分为两份，分别在200μL离心管中进行PCR反应。反应总体积为25μL，包括10×PCR缓冲液2.5μL、dNTP(2.5mmol·L-1)1μL、TaqDNA聚合酶(5U·L-1)0.2μL和模板1μL，其中一份加入梅花鹿上下游鉴别引物(10μmol·L-1)各0.2μL，另一份加入马鹿鉴别引物各0.2μL，用无菌双蒸水补足反应体积。将离心管置PCR仪，梅花鹿鉴别引物PCR反应参数：95℃预变性5min，循环反应30次(95℃30s，60℃45s)，72℃延伸5min，4℃保温结束反应。马鹿鉴别引物PCR反应参数：95℃预变性5min，循环反应35次(95℃30s，64℃45s)，72℃延伸5min，4℃保温结束反应。取5μL反应液经1.5％琼脂糖凝胶电泳，EB染色，接通电源按5V·cm-1恒压进行电泳20min，电泳结束后，将凝胶置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像(图1，图2)。
2.3PCR产物检测及正伪品判读
取PCR反应产物，加入2μL20×SYBR Green I染料，于365nm紫外灯下检测PCR产物，与空白对照相比，发出强烈绿色荧光为阳性(图3)。
Figure ISA0000102388560000011

Claims (2)

1.引物组，由鉴定马鹿的特异引物F1、F2和鉴定梅花鹿的特异引物F3、F4组成；
其中，所述特异引物F1、F2的序列为：
F1：5′-CTAGAGACATGAAACATCGGAGTGA-3′
F2：5′-GATGGATGAGACTAGGGCTAAGACT-3′；
所述特异引物F3、F4的序列为：
F3：5′-TCCTAGCAATACACTATACATCTGGC-3′
F4：5′-GATGGATGAGACTAGGGCTAAGACT-3′。
2.一种鹿茸的PCR鉴定方法，其特征在于，包括下列步骤：
a)从所述材料中提取得到DNA样品；
b)用权利要求1所述的引物F1、F2进行PCR反应，PCR反应参数为95℃预变性5min后，进行30次循环，循环参数为95℃30s，55-65℃45s，后延伸72℃5min，获得扩增产物1；
c)用权利要求1所述的引物F3、F4进行PCR反应，PCR反应参数为95℃预变性5min后，进行30次循环，循环参数为95℃30s，55-65℃45s，后延伸72℃5min，获得扩增产物2；
d)电泳所述扩增产物1，如果存在分子量582bp的单一DNA条带，则确定所检材料为马鹿；
e)电泳所述扩增产物2，如果存在分子量831bp的单一DNA条带，则确定所检材料为梅花鹿；
f)直接在所述扩增产物1或2中加入2μL20×SYBR Green I染料，振荡30s充分混匀，于365nm紫外灯下检测PCR产物；如果反应产物发出强烈绿色荧光，则确定所检材料为马鹿或梅花鹿。
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