CN111041108A

CN111041108A - 用于鉴定中药材鹿茸的引物、试剂盒和检测方法

Info

Publication number: CN111041108A
Application number: CN202010024178.5A
Authority: CN
Inventors: 孙苓苓; 孔令锋; 王维宁; 田金苗; 马秀
Original assignee: Liaoning Inspection Examination and Certification Centre
Current assignee: Liaoning Inspection Examination and Certification Centre
Priority date: 2020-01-10
Filing date: 2020-01-10
Publication date: 2020-04-21

Abstract

本发明公开了用于鉴定中药材鹿茸的引物、试剂盒和检测方法，本发明公开的SEQ ID No.1和2所示的引物可以对正品鹿茸的基因组DNA进行特异性扩增，利用本发明的引物和含有该引物的试剂盒对中药材鹿茸样品进行检测，能够给出准确有效的鉴定结论，且灵敏度和精确度高，可以作为中药材鹿茸的标准鉴定方法。

Description

用于鉴定中药材鹿茸的引物、试剂盒和检测方法

技术领域

本发明涉及中药材鉴定领域，具体涉及一种用DNA分子检测技术鉴定中药材鹿茸的方法及其引物和试剂盒。

背景技术

鹿茸为我国常用贵细中药材，具有壮肾阳、益精血、强筋骨、调冲任、托疮毒的功效，用于肾阳不足、精血亏虚、阳痿滑精、宫冷不孕、羸瘦、神疲、畏寒、眩晕、耳鸣、耳聋、腰脊冷痛、筋骨痿软、漏带下和阴疽不敛。

《中国药典》(2010年版及2015年版)鹿茸标准规定，其来源为鹿科动物梅花鹿Cervus nippon Temminck或马鹿Cervus elaphus Linnaeus的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角。但按照现行国家药品标准，从外观性状上只能检验完整锯取的圆柱状分枝，即整具鹿茸，对切成段儿的鹿茸样品或切成片儿的鹿茸饮片从外观性状上无法鉴别。鹿茸药材标准鉴别项下也仅有氨基酸的薄层鉴别方法，鹿茸饮片没有鉴别方法，很难区分鹿茸的真伪与优劣。

鹿茸的易混品常为同科动物的嫩角，如驯鹿、红鹿(赤麂)、黇廘等，上述鹿茸虽具药用价值，但与鹿茸(梅花鹿茸和马鹿茸)基源不同，功效不同，价格差异较大。鹿茸伪品有用鹿、羊等多种动物毛皮制成形似鹿茸的囊套，将动物胶质等灌注其内，凝固伪制而成，也有用各种鹿角经过加工处理切制成片，伪充鹿茸片。目前对于市场上切成段儿的鹿茸药材或鹿茸饮片的伪品尚无法进行有效检验与判断。

因此，亟待开发一种有效的鹿茸鉴定方法，以解决多年来鹿茸外观性状难于区分真伪，又没有专属性鉴别的难题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于鉴定中药材鹿茸的引物。

本发明的第二个目的在于提供一种用于鉴定中药材鹿茸的检测试剂盒。

本发明的目的还在于提供一种鉴定中药材鹿茸的检测方法。

为实现上述目的，本发明对正品鹿茸的原动物(梅花鹿和马鹿)、其近缘种(麋鹿、豚鹿、白唇鹿、驼鹿、鬣鹿和水鹿)、伪品鹿茸的原动物(驯鹿、红鹿、黇廘)的基因序列进行大量的分析、设计和实验验证，最终获得能够用于中药材鹿茸的分子检测的引物，该引物的核苷酸序列如下：

上游引物：5’-AACTACACCCCAGCAAATCC-3’；

下游引物：5’-GATGAGACTAGGGCTAAGAC-3’。

进一步，本发明提供含有上述引物的检测试剂盒。

优选地，所述试剂盒还含有探针，所述探针的核苷酸序列如下：5’-ACGCAATCCTACGATCAATTCCCAACA-3’，所述探针的5’端和3’端分别连接荧光基团和淬灭基团。

进一步，本发明提供上述引物和检测试剂盒在鉴定中药材鹿茸中的应用。

本发明还提供鉴定中药材鹿茸的检测方法，其包括以下步骤：

1)提取样品基因组DNA；

2)用权利要求1所述的引物进行PCR扩增；

3)对PCR扩增产物进行检测，并给出鉴定结果。

优选地，步骤2)PCR扩增时所述引物的浓度为250-450nmol/L。

优选地，步骤2)PCR扩增时的退火温度为65℃。

所述鉴定结果可以是定性结论，如果能够扩增出目标产物，表明样品中含有正品鹿茸；如果不能够扩增出目标产物，表明样品中不含有正品鹿茸。在进行PCR扩增时，可以以正品鹿茸的基因组DNA为阳性对照，以双蒸水为空白对照，避免试剂失效、试剂污染或操作失误等影响鉴定结果。扩增产物可以采用电泳、测序等有效方法进行检测。

优选地，步骤2)中所述PCR扩增为实时荧光定量PCR扩增。

优选地，步骤2)中所述PCR扩增时加入所述探针。

加入所述探针进行实时荧光定量PCR扩增，可以检测样品中正品鹿茸的含量，给出定量的鉴定结论。

本发明提供了用于鉴定中药材鹿茸的引物、试剂盒和检测方法，利用本发明的引物和试剂盒对中药材鹿茸样品进行检测，能够给出准确有效的鉴定结论，且灵敏度和精确度高，可以有效区分各种伪品鹿茸，也可以检测产品中正品鹿茸的含量，能够作为中药材鹿茸的标准鉴定方法。

附图说明

图1为实施例1中第1对引物探针对梅花鹿茸和马鹿茸样品基因组DNA的PCR扩增结果，A1为梅花鹿茸样品，A2为马鹿茸样品。

图2为实施例1中第2对引物探针对梅花鹿茸和马鹿茸样品基因组DNA的PCR扩增结果。

图3为实施例2中7种样品基因组DNA的PCR扩增结果，S1为黇鹿茸，S2为驯鹿毛角片，S3为驯鹿茸，S4为马鹿茸，S5为驯鹿茸片，S6为梅花鹿茸，S7为红鹿茸。

图4为实施例3中不同浓度基因组DNA的PCR扩增检测的标准曲线。

图5为实施例4中不同引物探针浓度的PCR扩增结果，C1为150/150nmol/L，C2为250/250nmol/L，C3为350/350nmol/L，C4为450/450nmol/L。

图6为实施例5中不同退火温度的PCR扩增结果，T1为55℃，T2为58℃，T3为61℃，T4为65℃。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。例如，样品基因组DNA的提取、PCR扩增方法等，除特别指明外，本发明对此并无限定。

实施例1引物的设计与验证

1.引物设计

从GenBank下载正品鹿茸的原动物(梅花鹿和马鹿)、其近缘种(麋鹿、豚鹿、白唇鹿、驼鹿、鬣鹿和水鹿)、伪品鹿茸的原动物(驯鹿、红鹿、黇廘)的基因组序列，经过综合分析后，选择种内和种间遗传多样性和进化关系的基因序列设计多对引物和探针，对正品鹿茸的基因组DNA进行PCR扩增验证引物和探针的有效性，最终筛选得到综合性能优良的引物和探针组合，该引物和探针组合能够同时检测梅花鹿和马鹿品种而不会扩增其他品种，具有极强的特异性和良好的灵敏度(SEQ ID NO：1～3)。本例中列举针对相同保守区段的两对引物及探针，其如表1所示。

表1本发明设计的用于鉴定中药材鹿茸的引物和探针序列

其中探针具有荧光标记，其5’端连接荧光基团FAM，3’端连接淬灭基团BHQ。

2.引物的有效性实验

2.1样品采集

梅花鹿茸：于辽宁鹿源参茸饮片有限公司采茸现场收集

马鹿茸：购于东北参茸中草药材市场，按照《中国药典》(2015年版)鹿茸标准及相关文献进行鉴定，确定鹿茸的基源为马鹿。

2.2基因组DNA提取

鹿茸提取参考文献：市售鹿茸片基因组DNA提取方法的比较(于静等，2016)选取文献结果中提取效果最好的提取试剂盒。

2.3PCR扩增和扩增产物检测

采用表1所示的引物和探针，分别以梅花鹿茸和马鹿茸样品的基因组DNA为模板，在实时荧光定量PCR仪上进行PCR扩增和扩增产物检测。其中，PCR扩增的反应体系如下：PCRsupermix为10μl，上下游引物各为0.5μl，探针为0.5μl，水为6.5μl，DNA模板2μl，总20μl。

PCR扩增的反应条件下：95℃3min；94℃15S，65℃45S，40Cycle读荧光。

CR扩增产物的检测结果如图1和2所示，采用本实施例的第1对引物和探针对梅花鹿茸和马鹿茸的基因组均可以进行有效的PCR扩增，荧光扩增信号较高且有清晰的曲线。有意思的是，在相同设计理念及条件下，其他探针引物效果均不理想。如图2所示第2对引物和探针则并不能实现对梅花鹿茸和马鹿茸的有效扩增。以下及各实施例均为第1对引物及探针。

采用上述反应体系和反应条件用第1对引物和探针，用荧光PCR仪对上述梅花鹿茸基因组DNA重复进行4次PCR扩增和测定，测定结果如表2所示，最后计算变异系数为2.55％，表明用该方法扩增梅花鹿茸基因序列的重复性好，检测结果稳定。

表2重复性检测结果(CT值)

实施例2引物的特异性检验

1.样品采集

分别采集以下7种样品：

梅花鹿茸：于辽宁鹿源参茸饮片有限公司采茸现场收集；

红鹿茸：于铁岭神鹿实业集团收集；

马鹿茸、黇鹿茸、驯鹿茸、驯鹿毛角片、驯鹿茸片：购于东北参茸中草药材市场，按照《中国药典》(2015年版)鹿茸标准及相关文献进行鉴定，分别确定其基源。

2.基因组DNA提取

分别提取上述7种样品的基因组DNA，提取方法同实施例1中2.2。

3.PCR扩增和扩增产物检测

采用表1中第1对引物和探针，分别以上述7种样品的基因组DNA为模板，在实时荧光定量PCR仪上进行PCR扩增和扩增产物检测。其中，PCR扩增的反应体系和反应条件同实施例1中2.3。

PCR扩增产物的检测结果如图3所示，马鹿茸和梅花鹿茸样品的DNA得以特异性扩增，其他近缘物种样品及易混样品的DNA均无特异性扩增，表明表1所示的引物和探针能够特异性扩增正品鹿茸(马鹿或梅花鹿)样品的DNA。

实施例3检测方法的灵敏度检验

将实施例1中所提取的梅花鹿茸基因组DNA进行10倍倍比稀释，得到10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5梯度稀释的基因组DNA。

采用表1中第1对引物和探针，对上述每个浓度的基因组DNA重复进行4个实时荧光定量PCR检测，PCR扩增和检测方法同实施例1中2.3。

表3梯度稀释样品DNA的荧光PCR检测结果(CT值)

浓度梯度	检测1	检测2	检测3	检测4	AVG	SD	RSD
								原倍	11.221	10.840	10.546	10.928	10.884	0.28	2.55％
10<sup>-1</sup>	14.321	14.195	13.840	13.670	14.007	0.30	2.16％
								10<sup>-2</sup>	17.808	17.798	17.330	17.387	17.581	0.26	1.47％
10<sup>-3</sup>	21.750	21.491	21.975	21.588	21.701	0.21	0.98％
								10<sup>-4</sup>	27.337	27.027	28.038	27.793	27.549	0.45	1.64％

检测结果如表3和图4所示，样品DNA浓度与CT值线性相关，标准曲线为y＝27.399-3.387x，标准曲线的R²值为0.98，扩增效率为97.35％，动态范围和灵敏度能够满足检测要求，可以用于样品的定量检测。

实施例4PCR检测中引物探针浓度的优化

采用表1中第1对引物和探针，以实施例1中的梅花鹿茸样品基因组DNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增和检测，其中PCR扩增的温度、循环数和时间同实施例1，引物和探针的浓度分别为150/150nmol/L、250/250nmol/L、350/350nmol/L和450/450nmol/L。

检测结果如图5所示，不同的引物探针的浓度扩增信号强度不一，其中250/250nmol/L、350/350nmol/L和450/450nmol/L的荧光信号较高，引物和探针浓度为250/250nmol/L时，CT值比较高，数值比较稳定，所以选取250nmol/L的引物和250nmol/L的探针反应浓度。

实施例5PCR检测中退火温度的优化

采用表1中第1对引物和探针，以实施例2中7种样品的基因组DNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增和检测，其中引物和探针浓度、PCR扩增的循环数和时间同实施例1，退火温度分别为55℃、58℃、61℃、65℃。

检测结果如图6所示，退火温度为55℃、58℃、61℃时有非特异扩增，提高到65℃的退火温度时，没有特异性扩增，所以选择退火温度为65℃。

虽然上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在不偏离本发明精神的基础上所做的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 辽宁省检验检测认证中心

<120> 用于鉴定中药材鹿茸的引物、试剂盒和检测方法

<130> P1910393 5

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

10

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

15

<400> 1

aactacaccc cagcaaatcc 20

<210> 2 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2 25

gatgagacta gggctaagac 20

<210> 3

<211> 27 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acgcaatcct acgatcaatt cccaaca 27 35

<210> 4

<211> 22

<212> DNA 40

<213> 人工序列

<400> 4

tagataaagc aaccctaacc cg 22

5

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列 10

<400> 5

gattttgtct gcgtccgatg 20

15

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

20

<400> 6

acaggatcca acaacccaac aggaa 25

Claims

1.用于鉴定中药材鹿茸的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如下：

上游引物：5’-AACTACACCCCAGCAAATCC-3’；

下游引物：5’-GATGAGACTAGGGCTAAGAC-3’。

2.用于鉴定中药材鹿茸的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述引物。

3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括探针，所述探针的核苷酸序列如下：5’-ACGCAATCCTACGATCAATTCCCAACA-3’，所述探针的5’端和3’端分别连接荧光基团和淬灭基团。

4.权利要求1所述的引物或权利要求2～3任一项所述的检测试剂盒在鉴定中药材鹿茸中的应用。

5.中药材鹿茸的鉴定方法，其包括以下步骤：

1)提取样品基因组DNA；

2)用权利要求1所述的引物进行PCR扩增；

3)对PCR扩增产物进行检测，并判定结果。

6.根据权利要求5所述的鉴定方法，其中步骤2)中PCR扩增为实时荧光定量PCR扩增。

7.根据权利要求6所述的鉴定方法，其中步骤2)中PCR扩增中加入权利要求3所述的探针。

8.根据权利要求5所述的鉴定方法，其中步骤2)PCR扩增中所述引物的浓度为250-450nmol/L。

9.根据权利要求5所述的鉴定方法，其中步骤2)PCR扩增中所述引物的浓度为250nmol/L。

10.根据权利要求5所述的鉴定方法，其中步骤2)PCR扩增中退火温度为65℃。