CN108359746B

CN108359746B - 检测由Hela细胞引起的细胞交叉污染的方法及引物

Info

Publication number: CN108359746B
Application number: CN201810252672.XA
Authority: CN
Inventors: 林峻
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2018-03-26
Filing date: 2018-03-26
Publication date: 2021-10-22
Anticipated expiration: 2038-03-26
Also published as: CN108359746A

Abstract

本发明公开了检测由Hela细胞引起的细胞交叉污染的方法及引物，包括A组引物对和B组引物对，所述方法为：1）以待检细胞培养物上清液作为第一轮PCR模板，以Hela细胞纯培养的上清液作为PCR阳性对照，用A组引物对进行第一轮PCR；2）以第一轮PCR产物作为第二轮PCR模板，用B组引物对进行第二轮PCR；3）琼脂糖凝胶电泳检测第二轮PCR产物，判断待检细胞是否被Hela细胞污染。本发明耗时短、成本低，灵敏度高，传统的STR鉴定法灵敏度低，在作为污染源的细胞数量低于总细胞数量的10%时，STR无法检测到细胞污染，而本发明灵敏度提高到了1%，是STR的10倍。本发明无需提取核酸，无需破坏细胞，可以直接检测，是“无损无创”的检测方法。

Description

检测由Hela细胞引起的细胞交叉污染的方法及引物

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及检测由Hela细胞引起的细胞交叉污染的引物及方法。

背景技术

Hela细胞是细胞生物学和医学、药学研究中的常用细胞，其增殖异常迅速，亦是细胞交叉污染的重要来源之一。目前已经被证明污染并完全取代了许多其他细胞系。

HeLa细胞株是一种具有无限增殖能力的细胞系，其来源于1952年一位美国黑人妇女的宫颈癌组织。作为第一个被确定能够在体外培养的人宫颈癌细胞系，HeLa细胞广泛应用于宫颈癌的研究，并且在宫颈癌细胞生物学研究和宫颈癌的诊治中发挥着重要作用。此外，HeLa细胞还作为细胞生物学的研究模型，广泛地应用于基础生物学研究。

HeLa细胞不同于其他细胞系的特征之一就是其增殖异常迅速，此外，Hela细胞非常容易养活，它可以很容易适应不同的培养基和生长条件，如DMEM、MEM、RMPI1640、DMEM/F12K培养基等等。因此，HeLa细胞是细胞交叉污染的重要污染源之一。从1969年到2004年，PubMed数据库中的220篇出版物被发现使用了HeLa污染的细胞系。根据ATCC最新统计显示，ATCC细胞库中已有116个细胞系被HeLa细胞污染并完全取代。使用错误和污染的细胞系进行研究实验，将导致研究结果错误，进而造成巨大的经济损失和社会损失。例如，在药学研究中，如果原先计划开发针对肺癌的药物，但是细胞实验时，肺癌细胞被Hela细胞(宫颈癌)污染了，得到的实验结果是无效的，必然造成研究经费的浪费，如果没有发现污染，而直接将研究结果用于临床人体试验，那么后果十分可怕。

目前检测细胞交叉污染的方法很多，STR分析法(Analysis of Short tandemrepeat sequence)是较常用的一种检测方法。STR是串联重复的DNA短序列，在人类基因组中是高度多态的，通常长度为2-6bp。STR分析时，先要提取细胞样品基因组，随后用带有荧光基团标记的引物进行PCR，每一个STR位点均能被扩增且扩增产物标记上不同颜色的荧光。通过毛细管电泳分离后得到不同大小的片段，将片段大小转换为等位基因(Allele)峰图，通过峰图与参考数据库中的图谱进行比对后即能分析是否存在细胞交叉污染。通过STR分析，可以鉴定出发生交叉污染的人类细胞系。

但是，STR分析需要大型仪器，过程相对复杂，其耗时长，成本高，精度低。尤为重要的一点是，根据文献(Masters JR,Thomson JA,Daly-Burns B et al.(2001)Short tandemrepeat profiling provides an international reference standard for human celllines.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 98,8012-8017.)报道，在作为污染源的细胞数量低于总细胞数量的10％时，STR无法检测到细胞污染。

人乳头瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)是一种小的、无包膜的双链DNA病毒，归属于乳头瘤病毒科。1984年Boshart M等人在HeLa细胞中检测到HPV18基因的存在。作为HPV 18阳性人宫颈癌细胞系，HeLa细胞中存在两个HPV18基因，长度分别为7.8kb和6.9kb。而绝大部分人类细胞系不含HPV18病毒。

目前尚未有任何报道提出将HPV病毒作为生物标记物，来检测Hela细胞造成的人类细胞系交叉污染。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种无需损坏细胞直接快速检测由Hela细胞引起的细胞交叉污染的方法及引物。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

检测由Hela细胞引起的细胞交叉污染的引物，包括A组引物对和B组引物对，所述A组引物对的序列如下：

A组上游引物：5’GGTGCCAGAAACCGTTGAATC 3’；

A组下游引物：5’CGTCGGGCTGGTAAATGTTGA 3’；

所述B组引物对的序列如下：

B组上游引物：5’CAACCGAGCACGACAGGAA 3’；

B组下游引物：5’ATTGCTCGTGACATAGAAGG 3’。

基于本发明提供的引物检测由Hela细胞引起的细胞交叉污染的方法，包括以下步骤：

1)以待检细胞培养物上清液作为第一轮PCR模板，以Hela细胞纯培养的上清液作为PCR阳性对照，用A组引物对进行第一轮PCR；

2)以第一轮PCR产物作为第二轮PCR模板，用B组引物对进行第二轮PCR；

3)琼脂糖凝胶电泳检测第二轮PCR产物，判断待检细胞是否被Hela细胞污染。

所述第一轮PCR的反应体系为：2X Taq Master Mix(CW Biotech,CW0682,China)12.5μL，上清液模板5μL，A组上游引物1μM，A组下游引物1μM，补水到25μL；反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸20s，35个循环，72℃终延伸2min。

所述第二轮PCR的反应体系为：2X Taq Master Mix(CW Biotech,CW0682,China)12.5μL，第一轮PCR产物0.5μL，B组上游引物1μM，B组下游引物1μM，补水到25μL；反应条件如为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30，72℃延伸15s，35个循环，72℃终延伸2min。

本发明采用以上技术方案，通过检测HPV18基因序列，将其作为生物标记物，从而间接探测HeLa细胞是否存在，以判断目标细胞系是否被Hela细胞污染。本发明具有以下有益效果：

1、传统的STR鉴定法灵敏度低，在作为污染源的细胞数量低于总细胞数量的10％时，STR无法检测到细胞污染，而本发明灵敏度提高到了1％，是STR的10倍。

2、传统的STR鉴定方法和传统的HPV病毒鉴定，都需要破坏细胞，从中提取出核酸，本发明无需提取核酸，无需破坏细胞，可以直接检测，是“无损无创”的检测方法。

3、本发明只要用最简单和廉价的琼脂糖凝胶电泳，无需使用昂贵的荧光染料，无需使用荧光PCR、毛细管电泳仪、激光扫描等昂贵大型设备，耗时短、成本低。

附图说明

图1为实施例1的琼脂糖凝胶电泳图；

图2为实施例1的PCR扩增产物测序结果；

图3为实施例2的STR鉴定图谱。

具体实施方式

以下的实施例便于更好的理解本发明，但并不限定本发明。

序列说明：

SEQ ID NO.1-4分别是A组上游引物、A组下游引物、B组上游引物、B组下游引物。

实施例1

PCR引物的设计、筛选、对比实验及验证

从NCBI的Genbank数据库获取Human papillomavirus-18序列(Gene Bank ID:NC_001357)，根据分子生物学的PCR引物设计原理，通过生物信息学计算筛选得到了7条评分较高的PCR上游引物序列，和7条评分较高的下游引物序列，如表1所示。

人工合成引物，将这些上游引物和下游引物进行随机配对，之后用PCR实验和琼脂糖凝胶电泳，筛选能够实现本发明目的的引物对。筛选原则是：排除掉无法扩增得到PCR产物的引物对，排除有非特异性扩增的引物对，得到能够高效且特异性扩增得到目的HPV序列的引物对。

表1

上游引物	下游引物
		5'CCATAGTGAAACACAAAGAACA 3'	5'ACACAAAAGCAAAATAAAAAAA 3'
5'AGTGAAACACAAAGAACAAAAT 3'	5'ATACACAAAAGCAAAATAAAAA 3'
		5'AGTGAAACACAAAGAACAAAAT 3'	5'ACAAAAGCAAAATAAAAAAATA 3'
5'GCTGTGTGTATTCTCCCTCTCC 3'	5'TTGTTATGACCCTGTGCCTTAT 3'
		5'GTGGTTCTGTGTGTTATGTGGT 3'	5'TAAAATGGATGCTGTAAGGTGT 3'
5’GGTGCCAGAAACCGTTGAATC 3’	5’CGTCGGGCTGGTAAATGTTGA 3’
		5’CAACCGAGCACGACAGGAA 3’	5’ATTGCTCGTGACATAGAAGG 3’

发明人先用HPV DNA阳性质控DNA作为PCR模板，进行PCR引物验证，将上述引物随机配对，均可以实现特异性的PCR扩增得到目的条带。

发明人再用提纯的Hela细胞的DNA作为PCR模板，进行PCR引物筛选及验证引物配对的有效性，发现，在所有的随机配对中，只有当引物配对按照表1中同一行搭配为上下游引物时，可以实现特异性的PCR扩增得到目的条带。

发明人采用Hela细胞和其它细胞混合培养样品的上清液作为PCR模板，进行PCR引物筛选，发现仅有表格里最后两行的引物(按照同一行搭配为上下游引物)，可以实现特异性的PCR扩增得到目的条带。

由实施例1的实验结果可得出以下结论：1，按照公知的分子生物学知识和PCR引物设计原理和相关法则，所设计的引物绝大部分是不能用于PCR获得目的条带，需要做搭配筛选验证和对比实验。2、能够从HPV DNA阳性质控DNA和提纯的Hela细胞DNA中PCR得到目的条带的引物，绝大部分是不能用于直接从混合Hela细胞和其它细胞后培养的培养液上清中PCR获得目的条带，也需要筛选验证和对比实验，也就是说，能够从HPV DNA阳性质控DNA和提纯的Hela细胞DNA中PCR得到目的条带的引物，并不能直接用于本发明目的，即检测待检细胞是否被Hela细胞污染。

实施例1使用的细胞系及操作方法如下：

实验细胞：HepG2、AGS、A549、HCT-116、HGC-27、NCI-N87、SNU-216、Hela，均为在使用前2周，从中科院上海细胞库购买，上海细胞库在货物出库前，会对细胞做严格的质量检测，发明人收到细胞后，在使用前，再用权威的STR法又对它们做过细胞鉴定，确定细胞无误且无污染。

细胞的培养方法，均按照美国ATCC官方网站和中国科学院上海细胞库官方网站或该细胞原始论文提供的标准方法进行细胞培养。实验采用24孔板培养细胞，铺板细胞密度为1X 10⁵个细胞/孔。将HepG2、AGS、A549、HCT-116、HGC-27、NCI-N87、SNU-216这7种细胞，与Hela细胞按照一定比例混合后，再开始培养。每种细胞的每个混合孔中，Hela细胞所占的比例分别为0％，1％，10％，50％。细胞在37℃，5％CO₂的条件下培养24h，取上清液，高速离心(12000g，10分钟)，再取离心后上清液，作为PCR检测的模板。

另外，做一孔纯培养的Hela细胞，作为PCR的阳性对照。

PCR过程具体如下：

1)第一轮PCR：

25μL体系：包含12.5μL的2X Taq Master Mix(CW Biotech,CW0682,China)，5μL上清液模板，1μM上游引物，1μM下游引物，补水到25μL。

上下游引物分别是：

上游引物：5’GGTGCCAGAAACCGTTGAATC 3’；

下游引物：5’CGTCGGGCTGGTAAATGTTGA 3’；

PCR反应条件：94℃预变性5min，(94℃/30sec,54℃/30sec,72℃/20sec)做35个循环，72℃2min终延伸。

2)第二轮PCR：

从第一轮PCR的产物中，取0.5μL作为第二轮PCR的模板。

25μL体系：包含12.5μL的2X Taq Master Mix(CW Biotech,CW0682,China)，0.5μL第一轮PCR产物，1μM上游引物，1μM下游引物，补水到25μL。

上下游引物分别是：

上游引物：5’CAACCGAGCACGACAGGAA 3’；

下游引物：5’ATTGCTCGTGACATAGAAGG 3’；

PCR反应条件：94℃预变性5min，(94℃/30sec,50℃/30sec,72℃/15sec)做35个循环，72℃2min终延伸。

3)将第二轮PCR产物在2.5％琼脂糖凝胶电泳上检测，用EB染色并在UV下观察拍照。

结果如图1所示：根据marker指示，图1上所有亮带的位置均为约150bp。+号表示阳性对照，使用Hela细胞纯培养的上清液作为PCR阳性对照。-号表示阴性对照。0％表示该细胞在培养时，不添加Hela细胞。

根据图1的结论，当把7种细胞，分别与Hela细胞混合培养时，当Hela细胞在初始培养物中的数量，低至1％时，均能用上述方法，检测出Hela细胞的存在。

对上述PCR扩增产物，用Sanger法测序，结果如图2所示，该sanger测序结果，能够完全匹配Hela细胞中的HPV DNA序列，说明扩增产物是正确的。

实施例2

传统的STR鉴定法与本发明方法的灵敏度对比

将99％AGS细胞+1％Hela细胞的混合物，99％HGC-27细胞+1％Hela细胞的混合物，99％SNU-216细胞+1％Hela细胞的混合物，用传统的STR鉴定法，进行细胞纯度鉴定，

STR鉴定图谱如图3所示，与国际STR数据库比对后可知，上述被初始量为1％Hela细胞污染的细胞系，仍然被错误地鉴定为AGS、HGC-27、SNU-216细胞的纯品，

而实施例1中，HepG2、AGS、A549、HCT-116、HGC-27、NCI-N87、SNU-216这7种细胞，分别与Hela细胞混合培养时，当Hela细胞在初始培养物中的比例低至1％时，均能用本发明的方法，检测出Hela细胞的存在，实施例1与实施例2的结果说明采用传统的STR鉴定法检测细胞是否被Hela细胞污染时，其检测精度不如本发明方法。

实施例3

基于本发明筛选的引物对检测由Hela细胞引起的细胞交叉污染的方法该方法使用的引物包括A组引物对和B组引物对，所述A组引物对的序列如下：

A组上游引物：5’GGTGCCAGAAACCGTTGAATC 3’；

A组下游引物：5’CGTCGGGCTGGTAAATGTTGA 3’；

所述B组引物对的序列如下：

B组上游引物：5’CAACCGAGCACGACAGGAA 3’；

B组下游引物：5’ATTGCTCGTGACATAGAAGG 3’。

反应体系为：2X Taq Master Mix(CW Biotech,CW0682,China)12.5μL，上清液模板5μL，A组上游引物1μM，A组下游引物1μM，补水到25μL；

反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，54℃退火30，72℃延伸20s，35个循环，72℃终延伸2min。

反应体系为：2X Taq Master Mix(CW Biotech,CW0682,China)12.5μL，第一轮PCR产物0.5μL，B组上游引物1μM，B组下游引物1μM，补水到25μL；

反应条件如为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30，72℃延伸15s，35个循环，72℃终延伸2min。

序列表

<110> 福州大学

<120> 检测由Hela细胞引起的细胞交叉污染的方法及引物

<130> 2018

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggtgccagaa accgttgaat c 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgtcgggctg gtaaatgttg a 21

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caaccgagca cgacaggaa 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

attgctcgtg acatagaagg 20

Claims

1.基于引物检测由Hela细胞引起的细胞交叉污染的方法，其特征在于：所述引物包括A组引物对和B组引物对，所述A组引物对的序列如下：

A组上游引物：5’ GGTGCCAGAAACCGTTGAATC 3’ ；

A组下游引物：5’ CGTCGGGCTGGTAAATGTTGA 3’ ；

所述B组引物对的序列如下：

B组上游引物：5’ CAACCGAGCACGACAGGAA 3’ ；

B组下游引物：5’ ATTGCTCGTGACATAGAAGG 3’ ；

所述方法包括以下步骤：

1）以待检细胞培养物上清液作为第一轮PCR模板，以Hela细胞纯培养的上清液作为PCR阳性对照，用A组引物对进行第一轮PCR；

第一轮PCR的反应体系如下：2 X Taq Master Mix 12.5μL，上清液模板5 μL，A组上游引物1 μM，A组下游引物1 μM，补水到25μL；

2）以第一轮PCR产物作为第二轮PCR模板，用B组引物对进行第二轮PCR；

第二轮PCR的反应体系如下：2 X Taq Master Mix 12.5μL，第一轮PCR产物0.5 μL，B组上游引物1 μM，B组下游引物1 μM，补水到25μL；

3）琼脂糖凝胶电泳检测第二轮PCR产物，判断待检细胞是否被Hela细胞污染。

2.根据权利要求1所述的基于引物检测由Hela细胞引起的细胞交叉污染的方法，其特征在于：所述第一轮PCR的反应条件如下：94℃ 预变性 5 min，94℃变性30 s，54℃退火30s，72℃延伸20 s，35个循环，72℃终延伸 2 min。

3.根据权利要求1所述的基于引物检测由Hela细胞引起的细胞交叉污染的方法，其特征在于：所述第二轮PCR的反应条件如下：94℃ 预变性 5 min，94℃变性30 s，50℃退火30s，72℃延伸15s，35个循环，72℃终延伸 2 min。