CN107805664B - GeXP多重PCR鉴别鹿种的组合物、试剂盒和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及马鹿、驯鹿、麋鹿、黇鹿、白唇鹿5种鹿成分的GeXP多重PCR方法。本发明还涉及用于所述方法的寡核苷酸引物探针组合物。本发明还涉及包含所述组合物的GeXP多重PCR试剂盒。使用本发明的组合物进行GeXP多重PCR检测，能够通过一次检测，简单、快速、特异且灵敏地检测多种鹿种成分。

Description

GeXP多重PCR鉴别鹿种的组合物、试剂盒和方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及用于定性检测多种鹿种成分的GeXP多重PCR方法，用于所述方法的寡核苷酸引物探针组合物，以及包含所述组合物的试剂盒。
背景技术
鹿类动物及其产品自古被认为食用保健之上等品。2000年，梅花鹿和马鹿被列入《中华人民共和国药典》正品药材，此后鹿类动物及其产品在食品药品保健品中的应用逐渐增多，如鹿茸、鹿角、鹿角胶等。鹿肉也是肉品中的高端产品，具有较高的营养价值。因此，鹿成分掺假成为重要的食品检验项目。目前，国内外进行物种鉴定的方法主要有：一是以传统形态学检测方法和显微、光谱、色谱、传感器、质谱技术等为代表的理化鉴别方法；二是生物学鉴定方法，如蛋白质免疫电泳、免疫凝集技术，和基于药理学的生物药效评价法；但这两种方法易受产品状态影响，如成熟度不同成分复杂难辨、外观性状相似混淆不清、加工程度大致使理化性质改变等而失去准确性。目前基于分子生物学的现代分子检测技术发展迅速，如PCR或实时荧光PCR技术，但受到通量的限制，一次只能检测一种鹿种， 而普通的多重PCR技术一方面分辨率不足，另一方面存在严重的扩增偏好性，而且传统的电泳技术操作繁琐，重现性较低。
GeXP技术是多重PCR领域的突破性技术，该技术将毛细管电泳分离技术和高灵敏的激光诱导技术相结合，采用特异性嵌合引物在同一反应体系而引发目的基因扩增的技术，其中嵌合引物包含了基因特异性引物序列，从而保持反应体系中各模板DNA的比例在扩增过程中不变，克服了多重扩增偏爱性的问题，同时实现多重PCR产物检测目的。该技术可对多个基因进行系统、全面、准确的检测与鉴定，且操作快速、简单，具有很高的特异性和灵敏度，适用于多个基因的同时检测，克服单重通量不高的局限性外可大大提高检测效率，同时避免多重扩增偏爱性，降低检测成本、缩短检测周期，具有显著的经济与社会效益等。
发明内容
本申请提供了马鹿、驯鹿、麋鹿、黇鹿、白唇鹿5种鹿种成分GeXP多重PCR检测方法，以鹿种线粒体D-loop，cytb基因为目标，在各鹿种相互特异的基因区段分别设计驯鹿、麋鹿、黇鹿、白唇鹿的特异性引物，筛选得到的特异性检测引物，同时从文献筛选到一对马鹿特异性引物，通过GeXP多重基因表达分析系统分析平台进行检测，依据产物片段大小和峰值来确定靶基因，有助于提高检测特异性；系统使用的毛细管电泳和荧光标记目的片段则可以提高分辨率和灵敏度；根据片段大小可同时检测相差至少5bp以上的多个靶基因。
该技术解决了其他技术存在的通量受限、扩增偏好性等问题。
在本发明的一个方面，提供了驯鹿成分的特异性寡核苷酸引物上游驯鹿-F（5’-GTAGGCATGAGCATGGCAGT-3’）和驯鹿-R（5’-AAGATTGTGGGGTTGAACCGT-3’）。该引物可特异性识别驯鹿的D-loop序列，扩增片段长度70 bp。
在本发明的一个方面，还提供了麋鹿成分的特异性寡核苷酸引物上游麋鹿-F（5’-AAAATCAAGAACTTTATCAG-3’）和麋鹿-R（5’-CATTATGTGTCTTGTTGTATAGC-3’）。该引物可特异性识别麋鹿的D-loop序列，扩增片段长度120 bp。
在本发明的一个方面，还提供了黇鹿成分的特异性寡核苷酸引物上游黇鹿-F（5’-AAAATCAAGAACTTTATCAG-3’）和黇鹿-R（5’-AAGCGTAGGGTTGTATCACA-3’）。该引物可特异性识别黇鹿的D-loop序列，扩增片段长度130 bp。
在本发明的一个方面，还提供了白唇鹿成分的特异性寡核苷酸引物上游白唇鹿-F（5’ -CATCGCAGCACTTGCCATAG-3’）和白唇鹿-R（5’-GAAGAGTACCAGAAGTAGGATGCC-3’）。该引物可特异性识别白唇鹿的cytb序列，扩增片段长度150 bp。
以上5组引物最适反应条件：95℃预变性10min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。扩增产物以2%琼脂糖电泳检测，以分子凝胶成像系统观察结果。
在本发明的另一个方面，提供了GeXP多重PCR检测马鹿、驯鹿、麋鹿、黇鹿、白唇鹿5种鹿种成分的特异性嵌合引物。这5对特异性嵌合引物则分别是在原有特异性引物的基础上，将上游引物的 5’端连接上通用标签AGGTGACACTATAGAATA，将下游引物的 5’端连接上通用标签GTACGACTCACTATAGGGA，该标签使得5种鹿种扩增片段长度增长37 bp。
GeXP多重PCR反应条件：95℃预变性10 min；94℃变性30s，60℃退火30s，68℃延伸1 min，共35个循环；4℃保存。扩增产物用GeXP多重分析表达仪进行片段分析。
在本发明的另一个方面，提供了包含上述寡核苷酸序列的组合物。
在本发明的另一个方面，提供了用于4种鹿成分单重PCR、5种鹿成分多重PCR及GeXP多重PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包含所述寡核苷酸序列或所述组合物。
本发明提供的试剂盒包括本发明的用于单重PCR、多重PCR及GeXP多重PCR检测马鹿、驯鹿、麋鹿、黇鹿、白唇鹿5种鹿特异性引物和使用说明书。在一个实施方案中，本发明的马鹿、驯鹿、麋鹿、黇鹿、白唇鹿5种鹿特异性引物分别根据基因鹿种线粒体D-loop，cytb基因序列设计。在一个实施方案中，所述试剂盒中包含驯鹿特异性扩增靶序列为: GTAGGCATGAGCATGGCAGTCAATGGTAGCAGGACATAATTATTATTTCACGGTTCAACCCCACAATCTT (SEQ No.1)。麋鹿特异性扩增靶序列为: AAAATCAAGAACTTTATCAGTATTAAATTTCCAAAAATTTTAATAATTTAATACAGCTTTCTACTCAACACCCAATTTACATTTTTATATACCACTAGCTATACAACAAGACACATAATG (SEQNo.2)。黇鹿特异性扩增靶序列为: AAAATCAAGAACTTTATCAGTATTAAATTTTTAAAAATTTCTAATAATTTAATACAGCTTTCCACTCAACATCCAATTTACATTTTATATCCATTAATTACACAGCAAAACATGTGATACAACCCTACGCTT (SEQ No.3)。白唇鹿特异性扩增靶序列为: CATCGCAGCACTTGCCATAGTACACTTACTCTTCCTTCACGAGACAGGATCCAATAACCCAACAGGAATCCCATCAAACGCAGACAAAATCCCCTTCCATCCTTACTACACCATTAAAGATATCTTAGGCATCCTACTTCTGGTACTCTTC (SEQ No.4)。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的使用说明书中包括对用于单重PCR、多重PCR及GeXP多重PCR检测马鹿、驯鹿、麋鹿、黇鹿、白唇鹿5种鹿特异性引物和扩增条件的描述。在一个具体的实施方案中，本发明的用于检测马鹿、驯鹿、麋鹿、黇鹿、白唇鹿5种鹿成分的试剂盒还包括对照品。优选地，对照品包括阳性对照品和阴性对照品。在一个实施方案中，阴性对照为无菌双蒸水。
在一个实施方案中，所述GeXP多重PCR检测方法对5种鹿成分的最低检测DNA浓度为：马鹿0.005 ng、驯鹿0.005 ng、麋鹿0.005 ng、黇鹿0.02 ng、白唇鹿0.02 ng。
本发明的GeXP多重PCR检测方法通过特异性嵌合引物分别识别马鹿、驯鹿、麋鹿、黇鹿、白唇鹿5种鹿成分基因特异序列，GeXP多重PCR扩增后，扩增产物通过GeXP多重基因表达分析系统分析平台进行检测，依据产物片段大小和峰值来确定靶基因，从而对样品中5种鹿成分进行定性检测。
本发明使用一种基于GeXP多重PCR的技术，本发明即基于该技术原理，设计马鹿、驯鹿、麋鹿、黇鹿、白唇鹿5种鹿成分特异性引物，优化技术条件，建立了能够通过一次实验同时可鉴别样品中马鹿、驯鹿、麋鹿、黇鹿、白唇鹿5种鹿成分的定性检测技术。实现对多个样品多个基因同时简单、快速、特异且灵敏的多重检测，克服单重通量不高的局限性外可大大提高检测效率，同时避免多重扩增偏爱性，降低检测成本、缩短检测周期，很大程度地提高方法通量。
附图说明
图1是使用马鹿、驯鹿、麋鹿、黇鹿、白唇鹿5种鹿引物特异性电泳检测结果。A：马鹿引物，B：驯鹿引物，C：麋鹿引物，D：黇鹿引物，E：白唇鹿引物，1：梅花鹿，2：马鹿，3：驯鹿，4：水鹿，5：麋鹿，6：黇鹿，7：白唇鹿，8：空白，M：分子量标准（至上而下2000 bp、1000 bp、750bp、500 bp、200 bp、100 bp）。
图2是GeXP五重PCR扩增体系优化后的检测结果。
Figure 966403DEST_PATH_IMAGE001
：驯鹿特征峰；
Figure 352648DEST_PATH_IMAGE002
：麋鹿特征峰；
Figure 619681DEST_PATH_IMAGE003
：黇鹿特征峰；④：马鹿特征峰；⑤：白唇鹿特征峰。
图3是GeXP多重PCR特异性交叉验证检测结果。A：剔除马鹿DNA；B：剔除驯鹿DNA；C：剔除麋鹿DNA；D：剔除黇鹿DNA；E：剔除白唇鹿DNA；
Figure 880898DEST_PATH_IMAGE001
：驯鹿特征峰；
Figure 549777DEST_PATH_IMAGE002
：麋鹿特征峰；
Figure 605457DEST_PATH_IMAGE003
：黇鹿特征峰；④：马鹿特征峰；⑤：白唇鹿特征峰。
图4是5种鹿成分GeXP多重PCR最低灵敏度检测结果。
Figure 422104DEST_PATH_IMAGE001
：驯鹿特征峰（0.005 ng）；
Figure 424695DEST_PATH_IMAGE002
：麋鹿特征峰（0.005 ng）；
Figure 511862DEST_PATH_IMAGE003
：黇鹿特征峰（0.005 ng）；④：马鹿特征峰（0.02 ng）；⑤：白唇鹿特征峰（0.02 ng）。
具体实施方式
通过实施例的方式对本发明作进一步的说明，但是本发明并不仅仅局限于以下实施例。
实施例1
本实施例对马鹿、驯鹿、麋鹿、黇鹿、白唇鹿5种鹿引物特异性、灵敏度和特异性交叉反应进行验证。
GeXP多重PCR特异性嵌合引物序列由美国Invitrogen公司合成，这5对特异性嵌合引物则分别是在原有特异性引物的基础上，将上下游引物的 5’端连接上通用标签，该标签使得5种鹿种扩增片段长度增长37 bp。具体序列见下表1。
表 1 GeXP特异性嵌合引物及其相关信息
Figure 676127DEST_PATH_IMAGE004
注：下划线表示通用标签碱基序列。
1. 基因模板提取：
鹿毛样品DNA提取：采用快速提取法提取含毛囊的鹿毛样本DNA，裂解液=1×ExTaq 缓冲液：20 mg/mL蛋白酶K=1000:1，反应条件：65℃ 30min，95℃ 15min，4℃ 10min。鹿肉样本采用德国Nucleospin®Food核酸提取试剂盒，根据产品说明书提取肉样品中总DNA。
2. GeXP多重PCR检测主要步骤：
1)采用特异性嵌合引物进行PCR扩增，GeXP单重PCR扩增体系如下表2，采用GeXP多重PCR反应条件进行反应，反应条件为：95℃预变性10 min；94℃变性30s，60℃退火30s，68℃延伸1 min，共35个循环；4℃保存。
表2 GeXP单重PCR体系
Figure 980069DEST_PATH_IMAGE006
2)将-20℃存放的甲酰胺置于室温使其完全融化，取 1 μL PCR 产物加入 9μL 甲酰胺制成PCR产物稀释液。
3)在 96 孔上样板中每孔分别加入 38.5 μL 甲酰胺、0.5 μL DSS400（分子量内标-400）及 1 μL的PCR产物稀释液，避光进行。漩涡震荡 30s充分混合均匀，各加一滴石蜡油防止样品挥发。
4)在缓冲液板与上样板对应孔内加入约3/4体积的分离缓冲液，GeXP上机检测。
3. GeXP多重PCR体系建立与优化
依照Beckman Coulter 公司的GenomeLab 片段分析系统，根据单重 GeXP 体系的反应体系及条件，摸索建立 10μL 的多重 GeXP 反应体系，验证马鹿、驯鹿、麋鹿、黇鹿、白唇鹿这5种DNA为扩增模板（以上DNA浓度均在10~50ng/μL），上下游特异性嵌合引物均为5种特异性嵌合引物按照不同比例混合，确定最优反应体系，扩增产物上机GeXP多重基因表达分析系统分析仪进行片段分析。
结果如图1所示，经优化，5种引物的最佳扩增Tm 值为60℃，在该温度下5种特异性引物均出现明显特异性扩增，条带单一，扩增条带与目的条带的大小基本相符。
该结果表明，本发明的方法可以对5种鹿种的目标基因进行检测，5种特异性引物能对目的条带进行特异性的扩增，目的条带单一，无非特异性扩增，条带的大小与预期吻合。
4. 最低灵敏度检测
按照上述基因模板制备方法提取5种鹿毛基因组DNA，并将DNA样本梯度稀释后进行GeXP单重PCR，扩增产物进行片段分析，最低检测限结果如下表3，其相应扩增产物GeXP片段分析图如下5。
表3 五重PCR灵敏度检测。
Figure 520772DEST_PATH_IMAGE008
虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本领域技术人员应认识到，在不偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种改变与修饰。因而，本发明意欲涵盖落在权利要求书及其同等物范围内的所有这些改变与修饰。

Claims (2)

1.一种特异性寡核苷酸引物对组合物在制备通过GeXP多重PCR检测方法鉴别五种鹿成分的试剂中的应用，其特征在于，所述五种鹿为马鹿、驯鹿、麋鹿、黇鹿和白唇鹿；所述特异性寡核苷酸引物对组合物包括马鹿、驯鹿、麋鹿、黇鹿和白唇鹿成分的特异性寡核苷酸引物对；其中，
马鹿成分的特异性寡核苷酸引物对上游引物为马鹿-F：5’-CATGTATAACAGTACATGAGTTAGCG-3’；下游引物为马鹿-R：5’-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’；
驯鹿成分的特异性寡核苷酸引物对上游引物为驯鹿-F：5’-GTAGGCATGAGCATGGCAGT-3’；下游引物为驯鹿-R：5’-AAGATTGTGGGGTTGAACCGT-3’；
麋鹿成分的特异性寡核苷酸引物对上游引物为麋鹿-F：5’-AAAATCAAGAACTTTATCAG-3’；下游引物为麋鹿-R：5’-CATTATGTGTCTTGTTGTATAGC-3’；
黇鹿成分的特异性寡核苷酸引物对上游引物为黇鹿-F：5’-AAAATCAAGAACTTTATCAG-3’；下游引物为黇鹿-R：5’-AAGCGTAGGGTTGTATCACA-3’；
白唇鹿成分的特异性寡核苷酸引物对上游引物为白唇鹿-F：5’-CATCGCAGCACTTGCCATAG-3’；下游引物为白唇鹿-R：5’-GAAGAGTACCAGAAGTAGGATGCC-3’。
2.一种特异性嵌合寡核苷酸引物对组合物在制备通过GeXP多重PCR检测方法鉴别五种鹿成分的试剂中的应用，其特征在于，所述五种鹿为马鹿、驯鹿、麋鹿、黇鹿和白唇鹿；所述特异性嵌合寡核苷酸引物对组合物包括马鹿、驯鹿、麋鹿、黇鹿和白唇鹿成分的特异性嵌合寡核苷酸引物对；所述马鹿、驯鹿、麋鹿、黇鹿和白唇鹿成分的特异性嵌合寡核苷酸引物对是分别在权利要求1所述的马鹿、驯鹿、麋鹿、黇鹿和白唇鹿成分的特异性寡核苷酸引物对的基础上，将各上游引物的5’端连接上通用标签AGGTGACACTATAGAATA，将各下游引物的5’端连接上通用标签GTACGACTCACTATAGGGA。
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