KR20220060455A

KR20220060455A - 대청가시풀 판별용 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20220060455A
Application number: KR1020210049007A
Authority: KR
Inventors: 김주환
Original assignee: 가천대학교 산학협력단; 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장)
Priority date: 2020-11-04
Filing date: 2021-04-15
Publication date: 2022-05-11

Abstract

본 발명은 대청가시풀 식물 엽록체 유전체의 특정 SNP 마커 및 프라이머에 대한 것이다. 보다 상세하게는 대청가시풀 엽록체 유전체에 있어서 확인된 특정 SNP 변이 지역 및 대청가시풀에 대한 민감도를 증대시키기 위하여 임의로 특정 위치의 미스매치를 야기한 후, 이를 기반으로 제작한 프라이머와 이의 조합에 대한 것이며, 본 발명에 따른 프라이머 조합은 대청가시풀에 대하여 특정적으로 증폭되므로 침입 외래종인 대청가시풀을 보다 빠르고 정확하게 판별하여 제거하는데 유용하게 활용될 수 있다.

Description

대청가시풀 판별용 조성물 및 이의 용도{Composition for discriminating Cenchrus longispinus, and use thereof}

본 발명은 대청가시풀 판별용 조성물 및 이를 이용한 판별 방법에 관한 것이다.

세계적으로 유전자원 보유국의 지위인정과 생명자원 보전의 필요성에 대한 관심이 고조되고 있는 추세이며, 세계 각국은 국가 신성장동력 창출의 기본소재이자 자국 식량 안보의 핵심인 식물유전자원의 확보와 보존에 막대한 노력을 경주하고 있다. 이를 위한 활동으로 생물다양성협약(Convention on Biological Diversity, CBD), 멸종위기에 처한 야생동식물 국제거래 협약(Convention on International Trade in Endangered Species of wild fauna and flora, CITES) 등이 있다.

또한 생물유전자원 접근과 이익 공유(Access to genetic resources and Benefit Sharing, ABS)에 대한 적극적 대응과 함께 세계 생명자원전쟁에 대비하여 자원을 확보하고 이용기반을 구축해야 하는 상황이지만 지구 온난화 등 환경 변화에 따른 자원조성 전략의 조정이 필요하다. 이에 있어, 침입 외래종(Invasive Alien Species, IAS)이 20세기 이후 지구의 생물다양성에 가장 위협적인 요소로 제기되고 있다.

특히 기후변화와 연계되어 복합적으로 나타나는 침입 외래종의 문제는 세계 GDP의 10%를 소모시키는 21세기 지구의 가장 주요한 환경문제로 지적되고 있다. 이로 인해, 세계 침입종 프로그램(Global Invasive Species Program, GISP)은 국가 차원에서 기후변화와 침입외래종의 문제를 연계시켜 접근하고 대응해야 함을 지적하고 있으며 최근 유엔은 지속가능개발목표(Sustainable Development Goals, SDG)로 2020년까지 침입외래종의 유입과 피해저감을 설정하고 있다.

우리나라에 있어서, 소나무재선충, 뉴트리아, 황소개구리, 붉은귀거북, 파랑볼우럭(블루길), 큰입배스(배스), 뒤영벌, 솔입혹파리 등 침입 외래종에 의한 국내 생태계 훼손 및 농업, 산업 분야 피해는 이미 주요한 사회이슈로 여겨지고 있다. 더불어 향후 기후변화에 따른 새로운 침입 외래종의 도입과 기존 침입외래종의 확산 등에 의해 생태계 혼란이 가중될 것으로 예측되고 있다.

그러나 기후변화 등에 따른 외래종의 생리, 생태적 변화를 평가하고, 이와 연계하여 외래종의 사전 침입예방 대책 수립은 물론 침입외래종을 관리하는 국가와 지역 차원의 전략수립은 아직까지 이루어지지 않고 있으며, 침입외래종을 선별할 수 있는 특정 방법 또한 확립되어 있지 않은 상태이다.

상기 침입 외래종 중 식물의 판별에 있어서, 지금까지 식물(특히 종자)의 형태학적 특징을 이용한 분류 동정 기법에 크게 의존하고 있으며, 최근 환경부 국립생물자원관과 국립과학수사연구연 (안전행정부) 등을 중심으로 DNA 바코드(barcode)를 이용한 식물자원의 유전자 판별감식에 관한 분자유전학적 연구가 수행되거나 향정신성 식물의 분자마커 개발 등에 관한 연구가 준비 중에 있다.

그러나, 식물군에 따라서는 대표적인 DNA 바코드 구간인 비암호화(noncoding) 지역의 재현성이 현저히 낮거나, 엽록체 DNA의 rbcL, matK 유전자 등이 과내 또는 속내 분류군간에 동일하거나(예, 인동과 등), 해상력이 매우 낮은 문제점이 있다.

따라서 상기 문제점을 극복하여 국내 분포하는 다양한 식물 중에서 타겟하는 침입 외래종 식물을 각각 정확하게 판별할 수 있는 방법의 개발이 필요하다.

본 발명자들은 침입 외래종인 대청가시풀(Cenchrus longispinus, C. longispinus)을 판별할 수 있는 단일염기다형성(Single nucleotide polymorphism, SNP) 마커와 이를 기반으로 프라이머를 제작하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 대청가시풀 판별용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 대청가시풀 판별용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 대청가시풀 판별용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 대청가시풀 판별 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 대청가시풀(Cenchrus longispinus)의 ndhD 유전자의 염기서열 중 696 번째 위치; 대청가시풀(Cenchrus longispinus)의 atpB 유전자의 염기서열 중 432 번째 위치; 및 대청가시풀(Cenchrus longispinus)의 matK 유전자의 염기서열 중 1303 번째 위치; 중 선택되는 하나 이상의 유전자 좌의 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 대청가시풀 판별용 조성물을 제공한다.

또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 9로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 대청가시풀 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는 대청가시풀 판별용 키트를 제공한다.

또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 대청가시풀 판별 방법을 제공한다.

본 발명은 대청가시풀 엽록체 유전체의 특정 SNP 마커 및 프라이머에 대한 것으로, 보다 상세하게는 대청가시풀 엽록체 유전체에 있어서 확인된 특정 SNP 변이 지역 및 임의로 특정 위치의 미스매치를 야기한 후 이를 기반으로 제작한 프라이머와 이의 조합에 대한 것이며, 본 발명에 따른 프라이머 조합은 대청가시풀에 대하여 특정적으로 증폭되므로 침입 외래종인 대청가시풀을 보다 빠르고 정확하게 판별하여 제거하는데 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 대청가시풀(Cenchrus longispinus) 엽록체 유전체의 유전자 지도에 대한 도이다.
도 2는 75개의 엽록체 유전자에서 추론된 Cenchrus 및 관련 분류군의 최대 가능성 가계도(Maximum likelihood tree)를 나타낸 도이다.
도 3은 대청가시풀의 ndhD 염기서열 내 변이 양상 및 특정 SNP 지역을 확인한 도이다.
도 4는 대청가시풀의 atpB 염기서열 내 변이 양상 및 특정 SNP 지역을 확인한 도이다.
도 5는 대청가시풀의 matK 염기서열 내 변이 양상 및 특정 SNP 지역을 확인한 도이다.
도 6은 대청가시풀 유전체에 있어서, 본 발명에 따른 조합의 프라이머 세트를 이용한 네스티드 PCR(Nested polymerase chain reaction, Nasted PCR)을 수행하였을 때 생성되는 단편의 크기를 나타낸 도이다.
도 7은 대청가시풀에 있어서, 확정된 조합의 프라이머쌍의 증폭 여부를 확인한 결과이다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 침입 외래종인 대청가시풀(Cenchrus longispinus, C. longispinus)을 판별할 수 있는 단일염기다형성(Single nucleotide polymorphism, SNP) 마커를 확인하고, 이를 검출할 수 있는 제제인 프라이머를 제작하였다.

따라서 본 발명은 대청가시풀(Cenchrus longispinus)의 ndhD 유전자의 염기서열 중 696 번째 위치; 대청가시풀(Cenchrus longispinus)의 atpB 유전자의 염기서열 중 432 번째 위치; 및 대청가시풀(Cenchrus longispinus)의 matK 유전자의 염기서열 중 1303 번째 위치; 중 선택되는 하나 이상의 유전자 좌의 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 대청가시풀 판별용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, “외래종”은 도입종, 귀화종, 침입종을 통칭하는 용어로 특정한 인위적 목적 여부에 관계없이, 본래의 자생지가 아닌 외부에서 들어와 다른 생물의 서식지를 점유하여 번식하는 생물종을 지칭한다. 또한 “침입 외래종”은 생태계에 도입되고 확산되면서 생물다양성과 연계된 생태계서비스를 위협하거나 또는 악영향을 미치는 외래종을 의미한다.

상기 외래종의 위해성 평가의 기준은 첫째, 외래생물 중 생태계의 균형을 교란하거나 교란할 우려가 있는 생물, 둘째, 외래생물에 해당하지 아니하는 생물 중 특정지역에서 생태계의 균형을 교란하거나 교란할 우려가 있는 생물, 셋째, 유전자의변형을 통하여 생산된 유전자변형생물체 중 생태계의 균형을 교란하거나 교란할 우려가 있는 생물로 규정하고 있다.

상기 침입 외래종은 유전자원의 유용성(availability)을 변화시키거나 침입하는 생태계의 체계(연대)를 교란시켜 생태계의 기능을 변화시키고 토속과 외래종의 교잡을 통해 생태계의 유전자 풀을 변화시키며 토양에서의 물질대사과정을 변화시키고 특히 탄소포획과정에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 특히 토속종간의 위치, 생태학적 지위, 자리 경쟁이 나타나며 토속종의 다양성을 감소시키는 원인이 되고 있다.

본 발명에 있어서, 대청가시풀(Cenchrus longispinus)은 대청가시풀속에 속하는 한해살이풀로 북아메리카(캐나다와 멕시코, 미국) 원산이며, 유럽과 오스트레일리아, 뉴질랜드 및 한국에서 발견되는 종들은 도입종이다. 상기 대청가시풀의 열매는 많은 가시를 가지고 있어 의복, 농기구, 동물 등에 붙어 쉽게 전파된다. 상기 대청가시풀은 농경지에서 농작물 감수피해 및 농작업 방해 및, 가축의 종자 섭취시 소화장애가 발생하는 등 많은 피해를 야기한다. 상기 대청가시풀은 귀화식물(Naturalisation) 또는 생태계교란식물로 불리며, 이는 외국에서 자생하던 종이 침입하거나 재배식물의 씨앗이 야생으로 번진 종들을 의미하고, 토종식물보다 월등히 뛰어난 생장 능력을 가지고 있다. 안정화되어 있던 식물생태계가 외부요인에 의해 변화가 있을 시에 쉽게 유입, 정착, 확산, 우점하여 생태계를 교란하여 피해를 준다.

따라서 상기 대청가시풀의 번식에 의한 다양한 피해 사례가 발생하는 바, 이를 명확하게 판별할 수 있는 판별 방법의 개발이 요구되고 있다.

본 발명에 있어서, “단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)”은 DNA 염기서열에서 하나의 염기서열(A, T, G, C)의 차이를 보이는 유전적 변화 또는 변이를 의미하며, DNA 서열 다형성(polymorphism) 중에서 가장 많이 존재하는 형태이다.

본 발명에 있어서, “다형성(polymorphism)”은 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 말하며 다형성 부위 중에서, 사람에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일염기다형성이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 10% 또는 20% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다.

본 발명에 있어서, "대립유전자(allele)"는 상동염색체의 동일한 유전자 좌 위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 말한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP은 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.

본 발명에 있어서, "마커(marker)"는 유전적으로 불특정 연관된 유전자 좌(genetic locus)를 동정할 때 참고 점으로 사용되는 염기서열을 의미하며, 상기 마커의 유전자 지도 상의 위치는 유전자 좌로 표시할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명의 단일염기다형성 마커는, 대청가시풀(Cenchrus longispinus)의 ndhD 유전자의 염기서열 중 696 번째 염기가 A인 단일염기다형성 마커; 대청가시풀(Cenchrus longispinus)의 atpB 유전자의 염기서열 중 432 번째 염기가 A인 단일염기다형성 마커; 및 대청가시풀(Cenchrus longispinus)의 matK 유전자의 염기서열 중 1303 번째 염기가 A인 단일염기다형성 마커;인 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명의 단일염기 다형성마커를 검출할 수 있는 제제는 단일염기다형성 마커 부위를 포함하는, 10 내지 100 개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화(hybridization)하는 폴리뉴클레오티드인 것이 바람직하다. 또한 상기 폴리뉴클레오타이드는 단염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 프라이머, 프로브 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 종 이상인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 프라이머는 3‘마지막 염기가 단일염기다형성 부위에 상보적으로 결합할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 “프라이머”는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.

상기 프라이머 설계 시, 프라이머의 A, G, C, T 함량비, 프라이머 결합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기서열의 3회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따르며, 그 외에 단독 PCR 반응조건에 있어서 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg²⁺의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다.

상기의 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.

또한 본 발명의 프라이머 서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISA에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.

상기 프라이머는 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang) 등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth, Enzymol. 68:90-99), 보카지(Beaucage) 등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862), 및 미국 특허 제4458066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.

특히 본 발명은 본 발명에서 확인한 SNP 변이 지역을 기반으로, 대청가시풀을 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머를 제작하였다.

따라서 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 9로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 대청가시풀 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

한편, 기존 연구된 바에 따르면 특정종에서만 특이적으로 반응하는 마커의 제작을 위하여 SNP 구역에서 2~3 염기 떨어진 위치에 미스매치(mismatch)를 준 후 이를 기반으로 프라이머를 제작하는 경우, 목표하는 종의 야생형을 특이적으로 판별할 수 있으며 특히 이에 대한 민감도(sensitivity)가 증가되었음이 보고된 바 있다(BMC Bioinformatics 2008, 9:253 참고).

따라서 대청가시풀에 대한 민감도를 증가시키기 위하여, 본 발명의 서열번호 3, 서열번호 6 및 서열번호 9의 프라이머는 도 3 내지 도 5와 같이(빨간색 별표 참고), 각 유전자의 염기서열내 특정 위치에 변화를 줘 미스매치를 야기한 후 이를 기반으로 제작하였다.

상기 도 3 내지 도 5에 있어서, 상기 X는 C, G 및 T로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 보다 바람직하게는 C일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 상기 X를 C로 치환하였다. 보다 구체적으로는 서열번호 3의 프라이머는 ndhD 유전자 염기서열의 694번째(A→C), 서열번호 6의 프라이머는 atpB 유전자 염기서열의 430번째(A→C) 및 서열번호 9의 프라이머는 matK 유전자 염기서열의 1301번째(A→C)에 변화를 준 후 이를 기반으로 제작하였다.

또한 본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 7로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 8으로 이루어진 프라이머쌍, 및 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 9로 이루어진 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 세트이다.

본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 대청가시풀을 판별하는 방법은 당분야에 공지된 어느 방법이든 적용될 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 네스티드 PCR(Nested polymerase chain reaction, Nested PCR)을 수행하여 대청가시풀을 판별하였다.

본 발명에 있어서, 상기 네스티드 PCR이란 타겟(target) 이외의 염기서열에 프라이머가 붙는 비 특이적 결합(non-specific binding)의 증폭을 줄이기 위한 방법이다. 기존 PCR은 타겟 DNA 염기서열 끝에 상보적인 프라이머를 필요로 하며 PCR 산물들은 사이클(cycle)에 따라 증폭된다. 그러나 기존 PCR은 프라이머가 타겟 템플레이트(target template) 염기부분이 아닌 부정확한 염기서열 부위에 부착되어 원치않는 가닥을 만들어내는 문제점을 가지고 있다. 상기 네스티드 PCR은 1차 PCR 반응 및 2차 PCR 반응이 수행되며, 1차 PCR 반응에서 생성되는 단편이 두 번째 PCR 반응의 템플레이트가 된다. 두 번째 PCR에서 프라이머가 어닐링(annealing)되지 않는 특징이 있다. 이를 통해 두 번째 PCR에서 범위를 타겟 시퀀스(target sequence)에 가깝게 더 좁게 잡아준다. 상기 방법은 비특이적 결합의 증폭 가능성이 낮고, 적은 양의 DNA를 사용하더라도 충분한 양의 증폭산물을 얻을 수 있다.

더불어 본 발명은 본 발명에 따른 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는 대청가시풀 판별용 키트를 제공한다.

상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 통상적으로 증폭 반응에 첨가될 수 있는 시약이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 DNA 폴리머라제, dNTPs 또는 버퍼를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

또한 본 발명은 식물 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 대청가시풀 판별 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, “중합효소연쇄반응“은 DNA 사슬 중에서 목적하는 일부분만을 대량으로 증폭시키는 실험법을 의미하며, 예로는 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction), 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응(Allele Specific Polymerase Chain Reaction), Nested-중합효소연쇄반응(Nested-Polymerase Chain Reaction), 다중 중합효소연쇄반응(multiplex Polymerase Chain Reaction, multiplex PCR), 경쟁적 중합효소연쇄반응(competitive Polymerase Chain Reaction), 실시간 중합효소연쇄반응(real-time Polymerase Chain Reaction), 정량적 중합효소연쇄반응(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction), DNA 칩(DNA chip) 및 등온증폭법(Loop-mediated isothermal amplification)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법이며, 상기 판별 방법에 있어서 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 보다 바람직하게는 네스티드 PCR(Nested PCR)을 통해 수행될 수 있다.

상술한 본 발명의 내용은 상호 모순되지 않는 한, 서로 동일하게 적용되며, 당해 기술분야의 통상의 기술자가 적절한 변경을 가해 실시하는 것 또한 본 발명의 범주에 포함된다.

이하 본 발명을 실시예를 통해 상세하게 설명하나 본 발명의 범위가 하기 실시예로만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 샘플 준비 및 실험 방법

1-1. 대상 분류군(taxon) 채취 및 DNA 추출

대청가시풀(Cenchrus longispinus, C. longispinus) 및 미국갯금불초(Cenchrus echinatus, C. echinatus)의 신선한 잎을 대청도(인천, 한국) 및 텍사스(미국)으로부터 수득하였다. 이 샘플들을 총 DNA를 추출하기 전에 실리카겔 겔 파우더를 이용하여 건조하였다.

상기 준비한 샘플로부터 수정된 CTAB 방법을 이용하여 총 DNA를 추출하였다(Phytochemical Bulletin 19:11-15.참고).

준비한 잎을 1-2 cm² 정도의 크기로 절단한 후, 분리 버퍼(Isolation buffer(CIB; 0.35M Sorbitol, 50Mm Tris-HCl, 5mM EDTA, 0.1% BSA (w/v, sigma A4503), 0.01% DL-DTT)를 상기 잎이 잠길 만큼 넣고 혼합하였다. 혼합한 샘플을 먼저 4겹의 거즈를 이용하여 짠 다음, 다시 3겹의 미라클로스(miracloth (CALBIOCHEM Co.))를 이용하여 자연적으로 분리하였다. 그런 후 200g에서 3분간 원심분리하여 상층액을 모아 1,000g에서 7분간 다시 원심분리하였다. 원심분리 후 얻어진 펠렛(pellet)에 소혈청알부민(Bovine serum albumin, BSA)를 제거한 CIB(chloroplast isolation buffer)를 넣어 용해시켰다. 그런 후, 40/80% 퍼콜 구배(Percoll gradient)를 이용하여 3,200g에서 15분간 원심분리하여 엽록체 층을 분리하였다. 엽록체 층만을 수집하여 3배에 해당하는 CIB(BSA를 제거한 buffer)를 첨가한 후 1,700g에서 1분간 원심분리하여 정제된 엽록체로 구성된 펠렛을 수거하였다. 이 펠렛에 BSA를 제거한 CIB를 넣어 용해한 다음, DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN, Cat. No. 69104)를 이용하여 엽록체 DNA를 분리하여 NGS 분석용 템플레이트(template)로 이용하였다.

1-2. 엽록체(chloroplast) 게놈 조립(aseembly) 및 비교

고품질(high-quality) DNA(>200 ng/μl)는 Miseq 플랫폼(Illumina, 서울, 한국)을 통해 NGS 데이터를 구성하기 위하여 사용하였다. 이때 대청가시풀 및 미국갯금불초의 cpDNA(chloroplast genomes)의 조립을 위하여 큰왕풀(Cenchrus purpureus, C. purpureus)의 완전한 엽록체 게놈(Accession number MF594682)을 참조 게놈으로 이용하였다. NGS 데이터를 Geneious 프로그램으로 가져온 후 참조 cpDNA와 95% 이상의 유사성을 갖는 데이터(reads)만 분리하였다. 그런 다음 cpDNA 시퀀스를 완성하기 위해 Geneious에서 드노보 조립 기능(denovo assemble function)을 사용하여 분리된 reads를 조립하였다. 결과적으로, 5,053,948 개의 reads 중 95,386 개(1.9%)를 조립하여 대청가시풀(Accession number MN078361)의 cpDNA를 완성했다(208배의 커버리지(coverage)). 미국갯금불초의 경우, 4,211,108 개의 reads 중 20,267개만으로 전체 cpDNA(Accession number MN078360)를 구축하였다(44.8배의 커버리지). 이전에 발표된 큰왕풀의 cpDNA를 기반으로 Geneious에서 주석(annotation)을 달아 대청가시풀 및 미국갯금불초의 완전한 cpDNA 서열을 완성하였다. 유사성이 95% 이상인 주석을 유지하고 시작 및 중지 코돈(codon)을 수동으로 확인하여 조정하였다. tRNA 서열은 tRNA Scan-SE를 이용하여 확인하였으며 cpDNA의 맵(map)은 OGDraw를 이용하여 설명되었다. Cenchrus 및 관련 분류군의 전체 cpDNA 서열은 Geneious에 포함된 MAUVE를 사용하여 정렬하였다. REPuter 프로그램을 사용하여 최소 반복 길이가 18bp인 엽록체 게놈에서 반복의 위치를 탐색하였다. SSR(simple sequence repeat)의 분석을 위해, Phobos 프로그램을 모노-(mono-), 디-(di-), 트리-(tri-), 테트라-(tetra-) 및 펜타뉴클레오타이드(pentanucleotide) 반복에 대해 최소 반복 시간을 10, 5, 4, 3 및 3으로 설정하여 사용하였다.

1-3. 계통 유전체학적(Phylogenomic) 분석

Cenchrus 및 관련 분류군의 전체 cpDNA 시퀀스는 NCBI에서 다운로드했다. cpDNA의 75개 단백질-코딩 영역(protein-coding regions)를 추출하고 Geneious에 포함된 MSUCLE를 이용하여 정렬하였다. 추가적으로, LSC(large single copy), SSC(small single copy) 및 IR(inverted repeat) 영역을 포함하는 및 3개의 분할 데이터 세트(partition data sets)를 Cenchrus 및 관련 분류군 cpDNA의 상이한 영역의 계통 유전학적 유용성(utility)을 검증하기 위하여 사용하였다. 3개의 영역은 Geneious에 포함된 MUSCLE를 이용하여 정렬하였다. 그런 다음 정렬된 서열을 jModeltest로 가져와 Cenchrus의 계통 발생을 설명하기 위한 최상의 모델을 탐색하였다. 그 결과, TVM+I+G 모델을 향후 분석을 위한 최적의 모델로 선정하였다. 최대 공산(Maximum likelihood, ML) 및 베이지안 추론(Bayesian Inference, BI) 분석은 IQtree 및 MrBayes를 이용하여 수행하였다. ML 분석에 있어서, 부트스트래핑 테스트(bootstrapping test)는 부트스트랩 값(bootstrap value)의 산출을 위하여 1,000번 반복되었다. 그 동안에 BI 분석은 백만 세대에 걸쳐 실행되었다. 계통수(phylogenetic tree)는 FigTree(http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/)를 이용하여 설명되었다.

1-4. 대청가시풀 판별을 위한 분자 마커(molecular markers) 개발

대청가시풀 판별을 위한 분자 마커를 개발하기 위해, 대청가시풀 및 미국갯금불초의 cpDNA를 정렬하여 SNP 부위를 탐색하였다. SNP 사이트를 포함하는 영역을 커버(cover)하는 프라이머쌍은 대청가시풀 및 미국갯금불초의 보존된 영역을 기반으로 설계되었다. 그런 후 한국에 널리 분포되어 있고, Cenchrus와 근연종으로 알려진 붉은수크령(Pennisetum alopecuroides, P.alopecuroides)에 상기 프라이머 쌍을 사용하였다. 그 결과 상기 붉은수크령 샘플에서 PCR 생성물을 생성한 프라이머 쌍을 시퀀싱(sequencing)을 위하여 선택하였다. 대청가시풀의 특정 SNP 부위를 찾기 위해 붉은수크령의 새로운 서열을 Cenchrus의 염기 서열과 정렬하였다. 그 결과, 대청가시풀을 위한 분자 마커 개발을 위하여 atpB, matK 및 ndhD 유전자를 선택하였다. 상기 3개의 유전자의 SNP 영역(도 3 내지 도 5 참고)을 타겟하는 프라이머쌍은 Primer3를 이용하여 설계하였으며, 각 프라이머의 서열을 하기 표 1에 나타내었다.

한편, 기존 연구된 바에 따르면, 일부 염기를 특정 염기로 치환하여 미스매치를 준 후, 이를 기반으로 프라이머를 제작하는 경우, 목표하는 종의 야생형을 특이적으로 선별할 수 있으며 특히 이에 대한 민감도가 증가되었음이 보고된 바 있다.

따라서 본 발명의 서열번호 3의 프라이머는 ndhD 유전자 염기서열의 694번째(A→C), 서열번호 6의 프라이머는 atpB 유전자 염기서열의 430번째(A→C) 및 서열번호 9의 프라이머는 matK 유전자 염기서열의 1301번째(A→C)에 변화를 준 후 이를 기반으로 제작하였다.

프라이머	방향	염기서열(5‘’	위치	서열
Cen_ndhD_F	정방향	GTCTGTATTCAGCTACCAAGTTT	ndhD	1
Cen_ndhD_R	역방향	AATAGCTCCATTTAGTCCAATGT	ndhD	2
Cen_atpB_F	정방향	GTGACTTGTGAGGTACAACAATT	atpB	3
Cen_atpB_R	역방향	GGCTGTTAAACCAACTCTCATAC	atpB	4
Cen_matK_840F	정방향	TGTTCGATATCAAGGAAAGGCAG	matK	5
Cen_matK_1519R	역방향	GATTCACCAGGTCATTGATACGG	matK	6
Cen_ndhD_F1	정방향	ATTGCCAATTATACCTCTACATCCA	ndhD	7
Cen_atpB_F1	정방향	CTGCCTTTATCGAGTTAGATCCA	atpB	8
Cen_matK_F1	정방향	TATCATAGTGGATCTTCGAAAAGAA	matK	9

대청가시풀, 미국갯금불초 및 붉은수크령 샘플에 대하여 본 발명의 프라이머를 이용한 네스티드 PCR(Nested polymerase chain reaction, Nested PCR)을 수행하여 실제 대청가시풀을 정확하게 판별할 수 있는지 확인하였다.

네스티드 PCR을 수행하기 위하여, EmeraldAmp PCR Master Mix(Takara Korea Biomedical Inc.)을 이용하여 각 유전자를 증폭하였다. 상기 네스티드 PCR은 다음과 같은 조건으로 수행하였다: 초기화(Initialization)는 94℃, 2분으로 진행하였고, 변성(Denaturation)은 94℃, 25초; 어닐링(annealing)은 57℃, 40초, 연장(elongation)은 72℃, 3초로 진행하였으며, 상기 변성, 어닐링 및 연장은 30 사이클(Cycles) 진행하였다. 더불어 최종 연신(Final Elongation)을 72℃, 7분으로 진행하였고, 이를 4℃에서 보관하였다. 수득한 PCR 생성물은 1% 아가로즈 겔(agarose gel)과 전기영동법(electrophoresis method)를 이용하여 확인하였다.

실시예 2. 실험 결과

2-1. Cenchrus의 플라스톰 특성(Plastome features) 확인

대청가시풀의 완전한 cpDNA는 80,223 bp의 LSC(Large single copy) 영역, 12,449 bp의 SSC(Small single copy) 영역 및 22,236 bp의 2개의 반전된 반복(inverted repeat, IR) 영역으로 구성된 4분할 구조(quadripartite strcuture)인 것을 확인하였다(표 2 및 도 1).

미국갯금불초의 cpDNA도 유사한 구조를 가졌지만 상기 미국갯금불초의 LSC, SSC 및 IR 영역의 길이는 각각 80,220, 12,439, 및 22,236 bp였다. 세 영역의 길이는 다양했지만 단백질 코딩 유전자 (79 개), tRNA (30 개) 및 rRNA (4 개)의 수는 Cenchrus와 조사 대상 종간에 동일했다(ycf2 및 ycf15 영역이 없는 위치그래스(Panicum capillare) 제외). 세 가지 조사된 Cenchrus 중 대청가시풀은 큰왕풀(97.3 % 쌍형 동일성(pairwise identity))보다 미국갯금불초 (99.9 % 쌍형 동일성)와 더 유사했다. 다른 조사된 종에 비해 대청가시풀 cpDNA의 쌍형 유사성은 95% 미만이었다. IR-LSC 접합(junction)은 rps19와 rpl22 사이의 IGS(intergenic space)에 위치하는 반면, SSR-IR 경계(border)는 Cenchrus 및 관련 분류군의 ndhF 코딩 영역에 있었다. 대청가시풀의 엽록체 게놈에는 56 개의 SSR과 17 개의 정방향 반복(forward repeats)이 있었다. 대부분의 SSR은 A 및 T 뉴클레오타이드(nucleotide)로 구성되었다. 추가적으로, 이러한 SSR은 infA, ndhD, ndhH, ndhK, nps14, rpl22, rpoC2, psbC 및 ycf5에서 발견된 10개의 SSR을 제외하고 비코딩 영역(non-coding regions)에 위치하였다. 마찬가지로, 17개의 정방향 반복은 비코딩(13개 사이트) 및 코딩 영역(5개의 사이트) 모두에 위치하였다. 대청가시풀은 미국갯금불초와 높은 유사성을 보였지만, 두 종간의 반복의 횟수 및 길이는 상이한 것을 확인하였다.

2-2. Cenchrus 및 관련 종의 계통 유전체학적 분석

ML 및 BI 분석은 계통수의 동일한 토폴로지(topology)를 생성했으며, 그 중 Cenchrus의 단계통성(monophyly)이 높은 지원 값(high supporting value)으로 확인되었다(도 2). 기장족(Paniceae)은 단일계통(monophyletic)이었지만, 일부 아족(subtribe)은 다계통성(polyphyletic)이었다. 특히, 화이테오클로아 카필리페스(Whiteochloa capillipes)는 아족 Paniceae에 속해있었지만, Cenchrinae 아족의 구성원임을 확인하였다. 또 다른 다계통성 그룹은 아족 Panicinae이며, 그 중 파니쿰 피그메움(panicum pygmaeum)과 파니쿰 리코포다이오데스(panicum lycopodioides)는 아족 보이비넬라아족(Boivinellinae)의 종과 함께 계통군(clade)에서 나왔다. 더불어, 파니쿰 인콤툼(Panicum incomtum)은 사이리도펩시스 제로필리아(Thyridopepsis xerophila(네우라크네아(Neurachninae) 아종)) 및 방석기장(Dichanthelium acuminatum(디찬더리내(Dichantheliinae) 아족)의 자매(sister)였다. 세 개의 분할 데이터(LSC, SSC 및 IR 영역)은 계통수의 다른 토폴로지를 생성하였다. 그러나 LSC 및 SSC 영역 데이터 세트에서 추론된 Cenchrus 및 관련 분류군의 관계는 파스팔리디움 저미네튬(Paspalidium geminatum) 및 디지타리아 엑실리스(Digitaria exilis)를 제외하고 75 개의 단백질 코딩 유전자의 관계와 매우 유사했다. 대조적으로, IR 지역 기반 계통수는 다른 데이터 세트와 비교하여 Paniceae 족에서 다른 관계를 나타냈다. 그러나, Cenchrus의 단계통성은 모든 데이터 세트에서 강한 지원값과 함께 확인되었다.

2-3. 프라이머의 특이적 증폭 효과 확인

본 발명의 각 조합에 따른 프라이머 쌍이 실제 대청가시풀을 특이적으로 검출할 수 있는지 확인하였다. 그 결과 각 유전자에 대하여 도 6과 같은 크기의 단편을 생산하는 것을 확인하였다. 보다 상세하게는 ndhD 유전자에 대해서 1차 PCR 결과, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍이 518 bp 크기의 단편을 생산하고, 서열번호 2 및 서열번호 7의 프라이머쌍이 325 bp 크기의 단편을 생산하였다. 더불어 atpB 유전자에 대해서 1차 PCR 결과, 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머쌍이 579 bp 크기의 단편을 생산하였고, 서열번호 4 및 서열번호 7의 프라이머쌍이 350 bp 크기의 단편을 생산하였다. 또한 matK 유전자에 대해서 1차 PCR 결과, 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머쌍이 686 bp 크기의 단편을 생산하였고, 서열번호 6 및 서열번호 9의 프라이머쌍이 440 bp 크기의 단편을 생산하였다.

더불어 최종적으로 도 7과 같이, 본 발명의 각 조합의 프라이머는 대청가시풀의 atpB, matK 및 ndhD에 있어서 특정적으로 증폭되는 것을 확인하였다. 반면, 미국갯금불초 및 붉은 수크령에는 각각 atpB, matK 및 ndhD에 대하여 579, 686 또는 518bp의 대조군 밴드를 제외하고는 밴드가 생성되지 않음을 확인하였다.

종합적으로 본 발명은 침입외래종인 대청가시풀(Cenchrus longispinus) 판별용 조성물에 대한 것으로, 보다 상세하게는 대청가시풀 엽록체 유전체에 있어서 확인된 특정 SNP 변이 지역 및 임의로 특정 위치의 미스매치를 야기한 후 이를 기반으로 제작한 프라이머와 이의 조합에 대한 것이며, 본 발명에 따른 프라이머 조합은 대청가시풀에 대하여 특정적으로 증폭되므로 침입 외래종인 대청가시풀을 보다 빠르고 정확하게 판별하여 제거하는데 유용하게 활용될 수 있다.

<110> Gachon University of Industry-Academic cooperation Foundation REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Composition for discriminating Cenchrus longispinus, and use thereof <130> 1-1P-1 <150> KR 10-2020-0145953 <151> 2020-11-04 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cen_ndhD_F <400> 1 gtctgtattc agctaccaag ttt 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cen_ndhD_R <400> 2 aatagctcca tttagtccaa tgt 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cen_atpB_F <400> 3 gtgacttgtg aggtacaaca att 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cen_atpB_R <400> 4 ggctgttaaa ccaactctca tac 23 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cen_matK_840F <400> 5 tgttcgatat caaggaaagg cag 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cen_matK_1519R <400> 6 gattcaccag gtcattgata cgg 23 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cen_ndhD_F1 <400> 7 attgccaatt atacctctac atcca 25 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cen_atpB_F1 <400> 8 ctgcctttat cgagttagat cca 23 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cen_matK_F1 <400> 9 tatcatagtg gatcttcgaa aagaa 25

Claims

대청가시풀(Cenchrus longispinus)의 ndhD 유전자의 염기서열 중 696 번째 위치;
대청가시풀(Cenchrus longispinus)의 atpB 유전자의 염기서열 중 432 번째 위치; 및
대청가시풀(Cenchrus longispinus)의 matK 유전자의 염기서열 중 1303 번째 위치; 중 선택되는 하나 이상의 유전자 좌의 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 대청가시풀 판별용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 단일염기다형성 마커는,
대청가시풀(Cenchrus longispinus)의 ndhD 유전자의 염기서열 중 696 번째 염기가 A인 단일염기다형성 마커;
대청가시풀(Cenchrus longispinus)의 atpB 유전자의 염기서열 중 432 번째 염기가 A인 단일염기다형성 마커; 및
대청가시풀(Cenchrus longispinus)의 matK 유전자의 염기서열 중 1303 번째 염기가 A인 단일염기다형성 마커; 중 선택되는 하나 이상의 유전자 좌의 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 판별용 조성물.
제 1항에 있어서
상기 제제는 단일염기다형성 마커 부위를 포함하는, 10 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화(hybridization)하는 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는, 판별용 조성물.
제 3항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오타이드는 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 프라이머, 프로브 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 판별용 조성물.
서열번호 1 내지 서열번호 9로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 대청가시풀 판별용 프라이머 세트.
제 5항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 7로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 8으로 이루어진 프라이머쌍, 및 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 9로 이루어진 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 세트인 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
제 5항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 네스티드 PCR(Nested polymerase chain reaction, Nasted PCR)에 사용되는 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
제 5항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는 대청가시풀 판별용 키트.
제 8항에 있어서,
상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는, 판별용 키트.
식물 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제 5항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 대청가시풀 판별 방법.
제 10항에 있어서,
상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는, 판별 방법.