CN102251029A - 一种鉴定耐盐棉花的方法及专用ssr标记 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴定耐盐棉花的方法及专用SSR标记。本发明的用于辅助鉴定耐盐棉花的引物组合物，为HAU1918、HAU1058和TMB1288。实验证明，本发明的鉴定方法结果稳定可靠、操作简单、经济高效，相比形态学鉴定法具有高效准确、省时省力、不受季节限制等优点，展示了较好的应用前景，更好地服务于生产实践中棉花耐盐性的鉴定和评价。因此，本发明SSR标记组合物及耐盐棉花鉴定方法在棉花的耐盐性鉴定领域将有广阔的应用前景。

Description

一种鉴定耐盐棉花的方法及专用SSR标记

技术领域

本发明涉及一种鉴定耐盐棉花的方法及专用SSR标记。 

背景技术

棉花的耐盐性是一个十分复杂的性状，涉及多种生理生化代谢途径和诸多基因调控，不但受棉花自身遗传因素影响，还受外界环境条件和栽培措施的影响，而且各栽培种之间、品种之间及同一品种的不同生育阶段、不同组织器官之间耐盐性都存在较大的差异，很可能存在多种不同的耐盐机制，至今尚未形成统一认识，在很多领域尚存在不同看法和争论。棉花耐盐性的复杂给耐盐品种的选育和鉴定带来极大困难。若能筛选到几个与棉花耐盐有关的标记，直接从分子水平上对棉花的耐盐性进行鉴定评价，将是棉花耐盐性鉴定方法的一大突破。 

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于辅助鉴定耐盐棉花的引物组合物。 

本发明所提供的用于辅助鉴定耐盐棉花的引物组合物，为如下中任意一种： 

(1)HAU1918、HAU1058和TMB1288 

(2)HAU1918、NAU1085和HAU773 

(3)HAU1918、HAU1058和NAU1085 

(4)HAU1918、HAU1058和TMB1288 

(5)HAU1918、HAU1058、HAU773和NAU1085 

(6)HAU1918、NAU1085、HAU773和TMB1288 

(7)HAU1918、HAU1058、NAU1085和TMB1288 

(8)HAU1918、HAU1058、HAU773、NAU1085和TMB1288 

(9)HAU1918和TMB1288 

(10)NAU1085和TMB1288 

(11)HAU773和TMB1288 

(12)HAU1058和TMB1288； 

所述HAU1918的一条引物序列如SEQ ID NO：3所示，另一条引物序列如SEQ ID NO：4所示； 

所述HAU1058的一条引物序列如SEQ ID NO：5所示，另一条引物序列如SEQ IDNO：6所示； 

所述TMB1288的一条引物序列如SEQ ID NO：1所示，另一条引物序列如SEQ ID NO：2所示； 

所述NAU1085的一条引物序列如SEQ ID NO：7所示，另一条引物序列如SEQ IDNO：8所示； 

所述HAU773的一条引物序列如SEQ ID NO：9所示，另一条引物序列如SEQ ID NO：10所示。 

上述引物组合物在辅助鉴定耐盐棉花中的应用也属于本发明的保护范围。 

本发明的另一个目的是提供第一种辅助鉴定耐盐棉花的方法。 

本发明所提供的辅助鉴定耐盐棉花的方法，包括如下步骤： 

分别用上述引物组合物中的每对引物对待测棉花单株进行PCR扩增，获得PCR扩增产物，对所述PCR扩增产物进行检测，根据如下方法确认所述待测棉花单株为耐盐棉花还是盐敏感棉花： 

若所述引物组合物对应的所有PCR扩增产物中含有耐盐特征带T且无敏盐特征带S1，则确认所述待测棉花单株候选为耐盐棉花； 

若所述引物组合物对应的所有PCR扩增产物中含有敏盐特征带S1，则确认所述待测棉花候选为盐敏感棉花； 

若所述引物组合物对应的所有PCR扩增产物中不含有敏盐特征带S1也不含有任何耐盐特征带T，则确认所述待测棉花候选为盐敏感棉花； 

所述敏盐特征带S1为60bp的DNA； 

所述耐盐特征带T为T4、T3A、T3B、T5和T2中的至少一种； 

所述T4为210bp的DNA；所述T3A为280bp的DNA；所述T3B为240bp的DNA；所述T5为220bp的DNA；所述T2为160bp的DNA。 

上述第一种鉴定方法中，所述PCR扩增的体系由10×PCR buffer、dNTP、Taq DNA聚合酶、SSR标记中的一条DNA分子、SSR标记中的另一条DNA分子和模板DNA组成；dNTP在体系中的浓度为0.2mmol/L，Taq DNA聚合酶在体系中的浓度为0.05U/μl，SSR标记中的一条DNA分子在体系中的浓度为0.5μmol/l，SSR标记中的另一条DNA分子在体系中的浓度为0.5μmol/l，模板DNA在体系中的浓度为5.0ng/μl。 

上述第一种鉴定方法中，所述对所述PCR扩增产物进行检测的方法为测序或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。 

本发明的另一个目的是提供另一种辅助鉴定耐盐棉花的方法。 

本发明所提供的另一种辅助鉴定耐盐棉花的方法，包括如下步骤： 

取待测棉花的15个单株，按照上述第一种鉴定方法对每株棉花进行检测，若15个单株中有8株以上被鉴定为耐盐棉花，则确认所述待测棉花候选为耐盐棉花；若15个单株中有7株以下被鉴定为盐敏感棉花，则确认所述待测棉花候选为盐敏感棉花。 

上述另一种鉴定方法中，所述待测棉花为棉花常规种或棉花杂交种。 

上述任一所述鉴定方法在耐盐棉花品种的选育中的应用也属于本发明的保护范围。 

上述任一所述鉴定方法在棉花的遗传育种中的应用也属于本发明的保护范围。 

实验证明，本发明的鉴定方法结果稳定可靠、操作简单、经济高效，相比形态学鉴定法具有高效准确、省时省力、不受季节限制等优点，展示了较好的应用前景，更好地服务于生产实践中棉花耐盐性的鉴定和评价。因此，本发明SSR标记组合物及耐盐棉花鉴定方法在棉花的耐盐性鉴定领域将有广阔的应用前景，对其它相关作物的耐盐性鉴定研究具有借鉴作用。 

附图说明

图1为以4个材料的DNA为模板进行的SSR引物筛选(从左至右每4个样品为同一引物的扩增)。 

图2为CSHES149对48份种质资源的扩增图谱。 

图3为HAU773对48份种质资源的扩增图谱。 

图4为HAU1058对48份种质资源的扩增图谱。 

图5为HAU1918对48份种质资源的扩增图谱。 

图6为NAU1085对48份种质资源的扩增图谱。 

图7为TMB1288对48份种质资源的扩增图谱。 

图8为HAU1918对11份鉴定材料的扩增图谱。 

图9为HAU1058对11份鉴定材料的扩增图谱。 

图10为TMB1288对11份鉴定材料的扩增图谱。 

图11为HAU1918、HAU1058和TMB1288对J2的15个单株的扩增图谱。 

图12为HAU1918、HAU1058和TMB1288对J7的15个单株的扩增图谱。 

图13为HAU1918、HAU1058和TMB1288对J8的15个单株的扩增图谱。 

图14为PCT扩增反应程序。 

图中，“√”标出了耐盐和敏盐特征带。 

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 

如下各个实施例中，用标记进行PCR扩增和检测的步骤如下： 

1.棉花育苗。随机选取约30粒供鉴材料的种子，均匀撒播于装有普通大田土壤或沙质的发芽盒中，然后置于30℃左右的光照培养箱中发芽。播种前，棉种最好用清水浸泡一天，可促使棉种吸水提早萌发。 

2.棉花基因组DNA提取。待棉苗长出子叶后，对每个材料的单株分别取2片子叶，装入预先放有1粒小钢珠的2ml离心管。采用改良的CTAB法结合自动磨样机快速磨样，提取每个单株的基因组DNA。由于SSR标记对模板DNA的纯度要求不高，所以不需纯化DNA即可直接进行SSR-PCR扩增。 

3.SSR-PCR扩增和产物检测。由于SSR标记对模板DNA用量要求不高，陈勋基等报道模板浓度为4～12ng/μl时均扩增出条带；陈浩东等的研究表明，模板浓度为1～5ng/μl时均扩增出清晰的条带。因此在进行大批量棉种检测时不需测DNA浓度。DNA风干后，用200μl 1×TE(pH值8.0)或灭菌的双蒸水ddH2O溶解DNA，然后取少量的DNA原液，稀释5倍后，用作PCR扩增的模板。 

PCR扩增体系： 

在实验中不断摸索调试，最终确定SSR-PCR最佳反应体系，反应总体积为10μl，各组分具体浓度见表1。 

表1、PCR反应体系 

具体反应程序如图14所示。 

由于每对SSR引物都有其特定的退火温度，因此扩增程序中的退火温度根据不同引物的实际Tm值而略有改动，其他程序均不变。 

PCR扩增产物的检测：采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染显色。 

如下各个实施例中，盐池鉴定方法的步骤如下： 

盐池鉴定方法：采用0.4％盐量胁迫法(叶武威等，1998)鉴定供试材料的耐盐性。目前已利用该方法对我国棉花种质资源8200余份材料进行了耐盐性鉴定，是行业内通用的方法。具体操作流程如下： 

(1)将供试材料随机排列种植在盐池内(平底水泥池，规格为90m×2m×0.15m)。地尽量整平，每行种1个材料，各设3次重复，对照为耐盐材料中07。 

(2)棉花出苗后定苗，尽量均匀。等到三叶一心期时记载每行有效苗数，同时测定盐池内土壤含盐量。 

(3)扣除土壤中原来含有的盐量，按土壤最终含盐量0.4％的标准，每行均匀撒盐(NaCl)，然后用喷壶均匀喷洒清水，使盐分完全溶解入土。 

(4)撒盐10天后，调查每行成活苗数(以生长点活算作活苗)，计算各材料的成活苗率和相对成活苗率，根据相对耐盐成活苗率(salinity-resistance index，简称SRI)将棉花的耐盐性分为4级(叶武威，2007)。 

计算公式： 

分级标准： 

实施例1、耐盐相关标记筛选 

一、单个标记的筛选 

首先选用4个耐盐性不同的材料(2个典型的耐盐材料中9835和中07，2个典型的盐敏感材料中S9612和新研96-48)进行SSR引物的筛选(图1)。从5053对SSR引物中初步筛选出246对多态性引物，占6.21％。用这246对引物作为进一步研究的候选引物。 

用6个材料：9835、中07、中9806、中S9612、新研96-48和鲁棉研16对初步筛选出的246对SSR进一步复筛，从中挑选95对差异明显、带型清晰易于辨认的引物对48份供试材料进行PCR扩增。通过仔细观察分析电泳条带，发现有5个标记(CSHES149、HAU773、HAU1058、HAU1918、NAU1085)在多数耐盐材料中扩增出在盐敏感材料中没有的特异性片段，1个标记(TMB1288)在多数盐敏感材料中扩增出在耐盐材料中没有的特异性片段。将这6个标记称为耐盐相关标记，将相应的特征带称为耐盐特征带(记为T)和敏盐特征带(记为S)。图2-图7为6个耐盐相关标记对48份材料的扩增图谱。 

TMB1288进行扩增得到的盐敏感特征条带大小为S1(60bp)； 

HAU1918进行扩增得到的耐盐特征条带大小为T4(210bp)； 

HAU1058进行扩增得到的耐盐特征条带为T3A(280bp)和T3B(240bp)； 

NAU1085进行扩增得到的耐盐特征条带为T5(220bp)； 

HAU773进行扩增得到的耐盐特征条带为T2(160bp)。 

各个标记的序列如下： 

TMB 1288：TCTTTGGCGGATACCTTCAC(SEQ ID NO：1)， 

TAAAGCCAACCAATAAGATAAGT(SEQ ID NO：2)； 

HAU1918：TTCCTACTGCTCCTCCTCAG(SEQ ID NO：3)， 

ATATTTGTGAGGGGCAAATG(SEQ ID NO：4)； 

HAU1058：CAGTTCGAGCCTTGTAGGAT(SEQ ID NO：5)， 

CAAGAGCAAAAGTTGCAAAA(SEQ ID NO：6)； 

NAU1085：AGTCGCCCCTTCTCTAATTT(SEQ ID NO：7)， 

TGTAAACCGAACTCGTTGTG(SEQ ID NO：8)； 

HAU773：TAACCTCTACCCGCCTAGTT(SEQ ID NO：9)， 

CCCTTGATGGTTTTTCTTTG(SEQ ID NO：10)。 

将分子标记鉴定结果与盐池鉴定结果相比对，若盐池鉴定为耐盐(或盐敏感)的材料扩增出耐盐特征带T(或敏盐特征带S)，则视为两种鉴定结果相符，表1为单标记鉴定耐盐性结果与盐池鉴定结果的比对。6个标记的鉴定结果与盐池鉴定相符程度在62.50％-72.92％之间，相符率最高的标记是HAU1918，也仅为72.92％。 

表1中48种材料均购自中国农业科学院棉花研究所国家棉花种质库。 

表1、48份棉花种质资源的耐盐鉴定结果 

二、标记组合法鉴定棉花耐盐性 

由于单标记鉴定结果的相符率偏低，故此采用标记组合法鉴定棉花耐盐性。标记组合有两种方式，一是多重PCR技术，是指将两对以上的引物放在同一反应体系中进行PCR扩增；再一种是单一PCR扩增后进行标记组合，其中又包括扩增后多重检测(指的是将两对以上的SSR单一引物扩增产物进行混合，然后电泳检测)和单一引物扩增检测后组合。由于多重PCR技术和扩增后多重检测技术都需要考虑到扩增片段的大小，扩增片段太接近的引物不宜组合，此外多重PCR技术还需考虑各引物的退火温度不宜差别太大，而且各引物之间还可能会产生干扰。所以本实验采用单一引物扩增检测后再组合的方式对棉花耐盐性进行鉴定。 

1、材料：表1中48份材料。 

2、标记组合：如下。 

3、方法： 

随机选取每份材料的1个单株的DNA，然后以此为模板进行SSR-PCR扩增和扩增 产物的检测。 

按照各种标记组合的单株判断标准，确认每株为耐盐株还是盐敏感株。 

标记组合及单株判断标准如下： 

3-1、两标记组合 

(1)HAU1918(T4)和TMB1288(S1)：扩增产物经检测有耐盐特征带T4且无敏盐特征带S1，判断为耐盐株；有S1或无T4，判断为盐敏感株。 

(2)NAU1085(T5)和TMB1288(S1)：扩增产物经检测有耐盐特征带T5且无敏盐特征带S1，判断为耐盐株；有S1或无T5，判断为盐敏感株。 

(3)HAU773(T2)和TMB1288(S1)：扩增产物经检测有耐盐特征带T2且无敏盐特征带S1，判断为耐盐株；有S1或无T2，判断为盐敏感株。 

(4)HAU1058(T3A和T3B)和TMB1288(S1)：扩增产物经检测有耐盐特征带T3A或T3B且无敏盐特征带S1，判断为耐盐株；有S1或无T3，判断为盐敏感株。 

3-2、三标记组合 

(1)HAU1918(T4)、NAU1085(T5)和HAU773(T2)：扩增产物经检测至少有2个耐盐特征带T，判断为耐盐株；只有1个T或无T，判断为盐敏感株。 

(2)HAU1918(T4)、HAU1058(T3A和T3B)和NAU1085(T5)：扩增产物经检测至少有2个耐盐特征带T，判断为耐盐株；只有1个T或无T，判断为盐敏感株。 

(3)HAU1918(T4)、HAU1058(T3A和T3B)和TMB1288(S1)：扩增产物经检测有耐盐特征带T且无敏盐特征带S1，判断为耐盐株；有S1或无T无S1，判断为盐敏感株。 

(4)HAU1918(T4)、NAU1058(T5)和TMB1288(S1)：扩增产物经检测有耐盐特征带T且无敏盐特征带S1，判断为耐盐株；有S1或无T无S1，判断为盐敏感株。 

3-3、四标记组合 

(1)HAU1918(T4)、HAU1058(T3A和T3B)、NAU1085(T5)和HAU773(T2)：扩增产物经检测至少有2个耐盐特征带T，判断为耐盐株；有1个T或无T，判断为盐敏感株。 

(2)HAU1918(T4)、NAU1085(T5)、HAU773(T2)和TMB1288(S1)：扩增产物经检测至少有2个耐盐特征带T同时无敏盐特征带S1，判断为耐盐株。 

(3)HAU1918(T4)、NAU1085(T5)、HAU1058(T3A和T3B)和TMB1288(S1)：扩增产物经检测至少有2个耐盐特征带T同时无敏盐特征带S1，判断为耐盐株；有S1 或少于2T无S1，判断为盐敏感株。 

3-4、五标记组合 

HAU1918(T4)、HAU1058(T3A和T3B)、HAU773(T2)、NAU1085(T5)和TMB1288(S1)：扩增产物经检测至少有2个耐盐特征带T同时无敏盐特征带S1，判断为耐盐株。 

4、结果 

各种标记组合与盐池鉴定的比对结果见表2。 

表2、标记组合法鉴定棉花耐盐性的结果 

实施例2、用标记组合进行耐盐棉花鉴定 

本实施例中使用的11份材料具体如下：J1：中鉴9901；J2：中鉴9902；J3：中鉴9903；J4：中鉴9904；J5：中鉴9905；J6：中鉴9906；J7：中鉴9907；J8：中鉴9908；J9：中鉴9909；J10：中鉴9910；J11：中鉴9911； 

公众可从中国农业科学院棉花研究所国家棉花种质库购买获得上述11份材料。 

(一)单株检测方法 

1、材料：11份材料(J1～J11)。 

2、三标记组合：HAU1918(T4)、HAU1058(T3A和T3B)和TMB1288(S1) 

3、方法： 

随机选取每份材料的1个单株的DNA，然后以此为模板进行SSR-PCR扩增和扩增产物的检测。 

按照HAU1918(T4)、HAU1058(T3A和T3B)和TMB1288(S1)三标记组合的单株判断标准，确认每株为耐盐株还是盐敏感株。 

单株判断标准为：若扩增产物经检测有耐盐特征带T(即含有T4、T3A和T3B中的至少一种)且无敏盐特征带S1，判断为耐盐株；有S1判断为盐敏感株；无T无S1，判断为盐敏感株。 

4、结果： 

检测图谱如图8-图10所示。11份材料的标记组合鉴定结果以及和盐池鉴定结果的比较见表3，结果表明11份材料中有8份是和盐池鉴定结果吻合的，吻合率达72.73％。 

表3、标记组合法和盐池鉴定法鉴定棉花耐盐性的比较结果 

J1

J2

J3

J4

J5

J6

J7

J8

J9

J10

J11

HAU1918(T4)

T4

T4

T4

T4

T4

HAU1058(T3)

T2

TMB1288(S1)

S1

S1

S1

分子鉴定结果

耐盐

盐敏感

盐敏感

耐盐

盐敏感

盐敏感

耐盐

盐敏感

耐盐

耐盐

盐敏感

盐池鉴定结果

耐盐

耐盐

盐敏感

耐盐

盐敏感

盐敏感

盐敏感

耐盐

耐盐

耐盐

盐敏感

(二)多株检测方法 

1、材料：11份材料(J1～J11)。 

2、三标记组合：HAU1918(T4)、HAU1058(T3A和T3B)和TMB1288(S1) 

3、方法： 

每份材料提取15个单株的DNA。将每份材料的15个单株分别进行鉴定。 

按照HAU1918(T4)、HAU1058(T3A和T3B)和TMB1288(S1)三标记组合的单株判断标准，确认每株为耐盐株还是盐敏感株。对于每份材料讲，15株中有8株(即50％)以上鉴定为耐盐株，则确认该材料为耐盐。对于每份材料讲，15株中有7株以下(即 50％)鉴定为盐敏感株，则确认该材料为盐敏感。 

单株判断标准为：若扩增产物经检测有耐盐特征带T(即含有T4、T3A和T3B中的至少一种)且无敏盐特征带S1，判断为耐盐株；有S1或无T无S1，判断为盐敏感株。 

4、结果： 

图11-图13为HAU1918、HAU1058和TMB1288三标记对J2、J7和J8的15个单株的扩增图谱。图11表明在J2的15个单株中有13个是耐盐的，故判断J2为耐盐材料。图12表明在J7的15个单株中有13个是盐敏感的，故判断J7为盐敏感材料。图13表明在J8的15个单株中有11个是盐敏感的，故判断J8为盐敏感材料。将11份材料的单株分子鉴定结果和群体分子鉴定结果与盐池鉴定结果比较(表4)，11份材料的群体分子鉴定结果中有10份是和盐池鉴定结果吻合的，吻合率达90.91％，相比单株分子鉴定结果(吻合率为72.73％)准确性有了很大提高。 

表4、单株分子鉴定、群体分子鉴定和盐池鉴定法鉴定棉花耐盐性的比较结果 

J1

J2

J3

J4

J5

J6

J7

J8

J9

J10

J11

单株鉴定结果

耐盐

盐敏感

盐敏感

耐盐

盐敏感

盐敏感

耐盐

盐敏感

耐盐

耐盐

盐敏感

群体鉴定结果

耐盐

耐盐

盐敏感

耐盐

盐敏感

盐敏感

盐敏感

盐敏感

耐盐

耐盐

盐敏感

盐池鉴定结果

耐盐

耐盐

盐敏感

耐盐

盐敏感

盐敏感

盐敏感

耐盐

耐盐

耐盐

盐敏感

Claims (9)

1.一种用于辅助鉴定耐盐棉花的引物组合物，为如下中任意一种：

(1)HAU1918、HAU1058和TMB1288

(2)HAU1918、NAU1085和HAU773

(3)HAU1918、HAU1058和NAU1085

(4)HAU1918、HAU1058和TMB1288

(5)HAU1918、HAU1058、HAU773和NAU1085

(6)HAU1918、NAU1085、HAU773和TMB1288

(7)HAU1918、HAU1058、NAU1085和TMB1288

(8)HAU1918、HAU1058、HAU773、NAU1085和TMB1288

(9)HAU1918和TMB1288

(10)NAU1085和TMB1288

(11)HAU773和TMB1288

(12)HAU1058和TMB1288；

所述HAU1918的一条引物序列如SEQ ID NO：3所示，另一条引物序列如SEQ ID NO：4所示；

所述HAU1058的一条引物序列如SEQ ID NO：5所示，另一条引物序列如SEQ IDNO：6所示；

所述TMB1288的一条引物序列如SEQ ID NO：1所示，另一条引物序列如SEQ IDNO：2所示；

所述NAU1085的一条引物序列如SEQ ID NO：7所示，另一条引物序列如SEQ IDNO：8所示；

所述HAU773的一条引物序列如SEQ ID NO：9所示，另一条引物序列如SEQ ID NO：10所示。

2.权利要求1所述引物组合物在辅助鉴定耐盐棉花中的应用。

3.一种辅助鉴定耐盐棉花的方法，包括如下步骤：

分别用权利要求1所述引物组合物中的每对引物对待测棉花单株进行PCR扩增，获得PCR扩增产物，对所述PCR扩增产物进行检测，根据如下方法确认所述待测棉花单株为耐盐棉花还是盐敏感棉花：

若所述引物组合物对应的所有PCR扩增产物中含有耐盐特征带T且无敏盐特征带S1，则确认所述待测棉花单株候选为耐盐棉花；

若所述引物组合物对应的所有PCR扩增产物中含有敏盐特征带S1，则确认所述待测棉花候选为盐敏感棉花；

若所述引物组合物对应的所有PCR扩增产物中不含有敏盐特征带S1也不含有任何耐盐特征带T，则确认所述待测棉花候选为盐敏感棉花；

所述敏盐特征带S1为60bp的DNA；

所述耐盐特征带T为T4、T3A、T3B、T5和T2中的至少一种；

所述T4为210bp的DNA；所述T3A为280bp的DNA；所述T3B为240bp的DNA；所述T5为220bp的DNA；所述T2为160bp的DNA。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的体系由10×PCRbuffer、dNTP、Taq DNA聚合酶、SSR标记中的一条DNA分子、SSR标记中的另一条DNA分子和模板DNA组成；dNTP在体系中的浓度为0.2mmol/L，Taq DNA聚合酶在体系中的浓度为0.05U/μl，SSR标记中的一条DNA分子在体系中的浓度为0.5μmol/l，SSR标记中的另一条DNA分子在体系中的浓度为0.5μmol/l，模板DNA在体系中的浓度为5.0ng/μl。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述对所述PCR扩增产物进行检测的方法为测序或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

6.一种辅助鉴定耐盐棉花的方法，包括如下步骤：

取待测棉花的15个单株，按照权利要求3-5中任一所述方法对每株棉花进行检测，若15个单株中有8株以上被鉴定为耐盐棉花，则确认所述待测棉花候选为耐盐棉花；若15个单株中有7株以下被鉴定为盐敏感棉花，则确认所述待测棉花候选为盐敏感棉花。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述待测棉花为棉花常规种或棉花杂交种。

8.权利要求3-7中任一所述方法在耐盐棉花品种的选育中的应用。

9.权利要求3-7中任一所述方法在棉花的遗传育种中的应用。

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